Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo - 1 - IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491 YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS TRABAJO DE GRADO Presentado Como requisito parcial para optar por el título de MICROBIOLOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. 2001
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Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
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IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN
PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491
YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA
LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado Como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. 2001
Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
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IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN
PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491
YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA
LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS
DIRECTOR
JUAN CARLOS ESPARRAGOZA QUÍMICO FARMACÉUTICO
CODIRECTOR P.U.J.
JANETH ARIAS BACTERIOLOGA MSc.
ASESOR
JAZMÍN RIVERA QUIMICO FARMACEÚTICO
ASESOR
AMPARO JARAMILLO BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. 2001
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IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN
PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491
YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA
LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS
JURADO
JURADO
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. 2001
Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
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IMPLEMENTACIÓN Y ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA
MICROBIOLÓGICA PARA LA DETERMINACIÓN DE MIO-INOSITOL EN
PREPARACIONES MULTIVITAMINICAS UTILIZANDO
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491
YENNY CAROLINA BELTRÁN MENDOZA
LICETH ALEJANDRA CABREJO CÁRDENAS
CARLOS CORREDOR Ph. D DECANO ACADÉMICO
FACULTAD DE CIENCIAS
AURA ROSA MANASCERO MSc DIRECTORA DE CARRERA
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. 2001
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"La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
alumnos en sus tesis de grado" Artículo 23 de la resolución número 13 de Julio de 1946
AGRADECIMIENTOS
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Agradecemos al Doctor Juan Carlos Esparragoza,
Gerente de Aseguramiento de Calidad quién nos brindó su
apoyo para cumplir con los objetivos planteados en este
proyecto; al personal del departamento de Control de
Calidad de Merck Colombia S.A. especialmente a Jazmín
Rivera quien nos orientó para llevar una metodología en el
desarrollo de este proyecto, a Amparo Jaramillo por
facilitarnos el desarrollo experimental en el área de
microbiología, a Elisita, Marlencita y Amparito por su
colaboración. A todas las personas que de alguna manera
nos brindaron su apoyo, sus conocimientos y su paciencia
para llevar acabo este proyecto.
Yenny y LicethYenny y Liceth
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DEDICATORIA
Hoy quiero darle gracias a Dios por la sabiduría que me ha dado
durante toda la vida, y porque ha sido este don, el que ha permitido que
todos los conocimientos recibidos durante mi carrera hayan sido
aplicados en este trabajo de grado y en mi futura vida profesional. A
mi papi por su amor, su apoyo y si interés por formar en mi una persona
útil para la humanidad y por que hoy se ven los resultados de ese gran
ideal. A mi Mami por su sabiduría, apoyo y comprensión, porque ha
sido un modelo de mujer y madre en mi vida. A mis hermanos a quienes
hoy reto para que luchen por conseguir lo que quieren, por su amor y
apoyo durante el desarrollo de este trabajo. A mi abuelita por su guía
espiritual que ha sido una herramienta valiosa en mi formación .
Javier, gracias por tu amor, por tu comprensión y tu apoyo
incondicional.
Liceth A.
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DEDICATORIADEDICATORIA
A las dos personas que son mi razón de existir, mi Madre y mi hijo. Ya
que de alguna forma con este logro puede corresponder a su amor y a
su apoyo.
Madre, gracias por tu confianza, amor, comprensión y
tolerancia; gracias por escucharme y aconsejarme en los
momentos difíciles de mi vida por que gracias a tu
compañía he conseguido ser una mejor persona, amiga y
madre.
Hijo, aquí se refleja el esfuerzo que he hecho para lograr el
éxito de mi carrera y así poderte brindar un mejor futuro.
Que Dios los bendiga.
Los Amo,
Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
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Yenny
RESUMENRESUMEN
Para la industria farmacéutica es di vital importancia el control
de calidad de cada uno de sus productos, para alcanzar esta
calidad existen herramientas como las buenas prácticas de
manufactura las cuales incluyen un control en cada una de las
etapas de producción y en si al producto terminado. Este
control se basa en métodos analíticos que valoran la cantidad
de principios activos declarados en los envase, por esta razón
se implementó y estandarizó una técnica analítica para la
determinación de Mio-inositol en productos multivitamínicos
empleando Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491.
Se empleo este microorganismo debido a su auxotrofía por
esta vitamina, es decir a que su crecimiento es directamente
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proporcional al logaritmo natural de la concentración de
Mio-inositol.
Se utilizó la prueba estadística t student para determinar la
linealidad de la curva patrón encontrando que para un nivel
de confianza del 95% no se cumple con el parámetro del
intercepto, ya que se presenta variabilidad en el blanco
empleado para ajustar la línea base del espectrofotómetro,
debido a que el microorganismo siempre crece diferente, unas
veces presenta un alto crecimiento y otras veces bajo
crecimiento, pues depende de las condiciones ambientales.
Lo cual indica no se puede obtener una sola curva patrón si
no que por el contrario es necesario que en cada ensayo se
realice una curva patrón. Se determino la selectividad de
Schizosaccharomyces pombe exponiéndola a los diferentes
componentes del producto (Vitaminas del grupo B) ya que
se consideran factores de crecimiento para los
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microorganismos en general. Obteniendo como resultados de
interferencia porcentajes menores al 5%, concluyendo de esta
manera que S. pombe solo dará respuesta debido
únicamente a la presencia de Mio-inositol y no a la presencia
de los demás componentes del producto.
La técnica fue retada con dos lotes diferentes de producto
los cuales mostraron un porcentaje de recuperación alto ,
presentándose coeficientes de variación menores al 3%
indicándonos que con esta técnica podemos obtener datos
confiables para determinar Mio-inositol en producto.
INTRODUCCIÓN
Las vitaminas son compuestos orgánicos requeridos para el crecimiento
normal y el mantenimiento de la vida de los animales, incluido el hombre. Estos
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compuestos son efectivos en pequeñas cantidades, no aportan energía y no son
utilizados como unidades estructurales del organismo, sino que son esenciales para
la transformación de la energía y para la regulación del metabolismo de las
unidades estructurales (Gennaro, A., 1998)
Las vitaminas son diferentes unas de otras en la composición química y en la
función. Solo se asemejan en que no pueden ser sintetizadas por los organismos en
absoluto o por lo menos, no a una velocidad adecuada en los tejidos de animales y
seres humanos. Las funciones que cumplen caen dentro de dos categorías: el
mantenimiento de la estructura normal y el mantenimiento de las funciones
metabólicas normales (Gennaro, A., 1998) Por ejemplo, la D(+)-Biotina está
vinculada a la síntesis de ácidos grasos, fijación de CO2 y metabolismo de los
aminoácidos (Curtis, 1993), mientras que el inositol es precursor del
fosfatidilinositol el cual promueve la transmisión de señales neurales y es un factor
de crecimiento (Davidson, M. 2000)
Las vitaminas se clasifican en dos grupos, liposolubles e hidrosolubles. Las vitaminas
A, D, E y K tienen poco en común en su estructura, pero todas son insolubles en
agua, se disuelven en grasas y pueden ser extraídas con solventes no polares, se
encuentran en las fracciones lipídicas de los tejidos animales. Las vitaminas
hidrosolubles son el ácido ascórbico, inositol y las vitaminas del grupo B, que
poseen funciones biológicas como cofactores enzimáticos y no se almacenan en los
tejidos corporales, razón por la cual deben incluirse en la dieta para mantener los
niveles adecuados (Wilbraham, et al. 1989)
La caracterización de las vitaminas como factores metabólicos esenciales con
estructuras químicas diferentes, exigió su aislamiento en forma pura de fuentes
naturales y su posterior síntesis en el laboratorio. La síntesis química o
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microbiológica comercial, son la fuente principal de las vitaminas empleadas, en la
actualidad, en preparados farmacéuticos, suplementos dietéticos y alimentos
fortificados (Gennaro, A. 1998), en estos preparados la potencia de las vitaminas se
mide por tres tipos principales de métodos: biológicos en los que ratas, ratones,
cobayos y pollos sirven como animales de ensayo; químicos, que usan un color
característico o una reacción sensible específica para los compuestos, existen para
la mayoría de las vitaminas en mezclas sencillas, las separaciones cromatográficas
seguidas de diversas técnicas de detección brindan medios alternativos de
cuantificación. Los Métodos microbiológicos emplean microorganismos que
requieren algunas vitaminas hidrosolubles, son rápidos, específicos y precisos; estos
métodos se utilizan para la fabricación y el control de laboratorio de la producción
de algunas vitaminas (Gennaro, A. 1998)
1. JUSTIFICACIÓN
Para la Industria Farmacéutica es de vital importancia el Control de Calidad de cada
uno de sus productos; para asegurar esta calidad existen las buenas prácticas de
manofactura (BPM), las cuales se refieren tanto a la producción como al Control de
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Calidad; Algunos de los requisitos básicos de éste, son la validación de los métodos
de prueba para valorar el contenido de ingredientes activos que deben cumplir con
la composición autorizada y declarada en los envases (Botero. 2000).
El Control de Calidad de productos terminados se realiza mediante ensayos de tipo
fisicoquímico y microbiológico. El análisis de vitaminas por procedimientos
fisicoquímicos es dispendioso, debido a la concentración excepcionalmente baja en
la que se encuentran en las preparaciones farmacéuticas (Strohecker, R. 1967).
En estos casos, la microbiología juega un papel importante ya que brinda
herramientas que permiten el desarrollo de nuevas alternativas mediante el uso de
microorganismos que requieren ciertos compuestos para su crecimiento; tal es el
caso de Schizosaccharomyces pombe, que necesita Mio-Inositol, como componente
primordial en el medio de cultivo para su desarrollo, por consiguiente y debido a
esta característica, son un medio de cuantificación del contenido de esta vitamina.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
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Implementar y estandarizar la técnica para la determinación de Mio-inositol
utilizando un método microbiológico basado en el uso del microorganismo
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, para su cuantificación en preparaciones
farmacéuticas.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Comparar los parámetros cinéticos de crecimiento de Schizosaccharomyces
pombe mediante el desarrollo de curvas de crecimiento a diferentes
concentraciones de mio-inositol para evaluar su auxotrofía.
• Obtener una curva patrón para determinación de mio-inositol mediante la
evaluación de linealidad por análisis estadístico.
• Cuantificar la concentración Mio-Inositol en un producto multivitamínico
producido por Merck en otros países.
3. MARCO TEÓRICO
3.1. DEFINICIÓN DE INOSITOL
Existen sustancias que actúan en el organismo como vitaminas, pero no cumplen
criterios para ser denominados como ellas. Una de estas sustancias es el Mio-
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inositol que es un azúcar de tipo ciclitol; se encuentra en forma libre o combinada
en los tejidos de los riñones de todas las especies animales y en microorganismos.
Mio-inositol está en forma de fosfolípidos y juega un papel importante en el
metabolismo de las grasas. Naturalmente, se encuentra en el hígado, extracto de
levadura, hojuelas de maíz, frutas, nueces, avena, entre otros (Tolonen, 1990).
FIGURA 1.FIGURA 1. Fórmula Estructural de Mio-inositol ( Colodny, 2001)
Existen ocho diferentes isómeros cis-trans del hexa-hidroxi-ciclohexano. Dentro del
grupo de los ciclitoles se encuentran el Mio-inositol biológicamente activo y
ópticamente inactivo 1L-Mio-inositol-1-fosfato (formado desde glucosa-6-fosfato
en la biosíntesis de inositol), y 1D-Mio-inositol-1-fosfato (Constituyente de
fosfolípidos e inositol polifosfatos) que son activamente biológicos y ópticamente
inactivo (Queen, 1998). Otros nombres que han sido usados para señalar al Mio-
inositol son: inosita, ciclohexanohexanol, bios I, factor antialopecia entre otros
(Hofmann, 1972). Su fórmula empírica es C6 H12O6 y su fórmula estructural es la
siguiente (Queen, 1998).
1 2
3
4
5 6
OH
OH
OH OH OH
OH
MIO - INOSITOL
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1D-MIO-INOSITOL 1-FOSFATO
12
3
4
56
OH
OH
OH
OH OH
P-O
OH
OH
OH
OH
OH
65
4
3
2 1
P - O
1L-MIO-INOSITOL 1-FOSFATO
FIGURA 2.FIGURA 2. Formas Ópticamente activas de Mio-inositol (Colodny,2001)
3.2. FUNCIONES METABÓLICAS Y APLICACIONES CLÍNICAS DEL
INOSITOL
METABOLICAS
El metabolismo de fosfoinosítidos tiene una función en la acción hormonal que
depende del calcio: Alguna señal debe proporcionar la comunicación entre
receptor de la hormona sobre la membrana plasmática y los reservorios
intracelulares de Ca2+. Los receptores de superficie celular, como aquellos para
acetil colina y catecolaminas son activadores de fosfolipasas C cuando están
ocupados con sus respectivos ligandos. La fosfolipasa cataliza la hidrólisis de 4,5-
bifosfato de fosfatidilinositol a trifosfato de inositol y 1,2 diacilglicerol. El trifosfato
de inositol es un liberador eficaz de calcio desde sus sitios de almacenamiento
intracelular como el retículo sarcoplasmático y mitocondrias. Así, la hidrólisis de 4,
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5- bifosfato de fosfatidilinositol conduce a la activación de proteína cinasa C y
promueve un incremento del calcio iónico citoplasmático (Murray, et al. 1994)
Un cambio en las concentraciones de inositol en el sistema nervioso central
puede producir alteraciones en la señalización y eventualmente permitir el
desarrollo de desordenes neurológicos. Se ha evaluado la eficacia del inositol en
tratamientos de depresión, enfermedad de Alzheimers, desordenes compulsivos de
obesidad, autismo, desordenes de estrés y el control del dolor. Recientemente se ha
indicado que el inositol tiene efectos psicoactivos por su interacción con sistemas de
segundos mensajeros ya que regula la concentración de calcio en el citosol y su
movilización en el retículo endoplasmático, la cual puede ser efectiva en el
tratamiento de las enfermedades mencionadas anteriormente (Colodny, 2001).
CLINICAS
El promedio de requerimiento diario de mio-inositol es un gramo. El inositol es
absorbido desde los intestinos, una proporción de este llega a ser azúcar y otra se
queda en el músculo cardiaco, el cerebro y otros órganos. Los niveles de inositol en
plasma son usualmente cercanos a 5 mg por litro. Existe una muy pequeña cantidad
de inositol en la orina de las personas saludables pero en diabéticos estos niveles se
incrementan (Hofmann, 1972).
Experimentos en ratones han demostrado que la deficiencia de mio-inositol, en
ellos causa perdida de cabello, reducción de crecimiento y secreción de leche,
excema, constipación, y defectos congénitos visuales. Para los ratones el inositol es
una vitamina B, por que es un factor dietético esencial para ellos. Otros
experimentos han demostrado además que el inositol tiene un efecto de tipo colina
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en el metabolismo, inhibe la acumulación de grasa en el hígado y otros órganos y
participa en la construcción de membranas celulares (Hofmann, 1972).
El inositol es un ingrediente fundamental de las membranas celulares como se
había mencionado anteriormente, y es necesario para proveer funciones
musculares, cerebrales y nerviosas. El inositol es lipotrófico y trabaja junto con
Vitaminas como la B 6, B12. colina, betaina y metionina para prevenir la
acumulación de grasas en el hígado. El inositol existe como un componente de fibra
llamado ácido fÍtico, el cual ha sido estudiado por sus propiedades anticancerígenas,
ya que dietas abundantes en inositol hexafosfato en fibra esta asociada con la baja
incidencia de ciertos cánceres, además ciertos neurotransmisores tales como
serotina y acetilcolina en el cerebro dependen del inositol (Gegerson, et al. 2000).
3.3. MÉTODOS CUANTITATIVOS PARA DETERMINACIÓN DE MIO-
INOSITOL
La determinación de mono y disacáridos es una de los más frecuentes análisis
requeridos en alimentos y tienen una considerable aplicación en estudios
nutricionales y bioquímicos. Dentro de los métodos convencionales para el análisis
de inositol se encuentran:
Métodos enzimáticosMétodos enzimáticos donde al azúcar que se va a analizar se le realiza un
tratamiento con una enzima apropiada y luego se determina la reacción del
producto, por espectrofotometría (Folkes, et al. 1998).
Métodos cromatográficos:Métodos cromatográficos: La más empleada es la HPLC (Cromatografía
Líquida de alta eficiencia), mediante la cual se determinan azúcares en
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alimentos. Aunque esta técnica es de alta sensibilidad, en preparaciones
farmacéuticas no es tan efectiva pues no alcanza a detectar las pequeñas
cantidades que se encuentran en las formulaciones de este tipo. Es un método
costosos (Folkes, et al. 1998). Otro tipo de cromatografía utilizada para la
cuantificación de mio-inositol es la GLC (Gas Liquid Chromatography), la
reactividad de Mio-inositol, proporciona su separación cromatográfica gaseosa
solo en forma de ésteres volátiles o éteres, como en el caso de otros ciclitoles y/o
azúcares. Mio-inositol ha sido determinado como el correspondiente hexaéter
en hidrolizados de levadura, preparaciones multivitamínicas, fosfolípidos y
tejidos animales, algunos de los otros inositoles importantes biológicamente y
otros ciclitoles tales como el mio-inositol-fosfato, en mezclas con azúcares
fosfatos, pueden ser también determinados por GLC como trimetilsilil éteres
(Davidek. et al. 1990).
Métodos biológicos:Métodos biológicos: Se basan en el consumo de Mio-inositol por hepatocitos
de ratones in vitro, empleando células de hígado las cuales predominan en el
metabolismo de fosfolípidos. Se ha demostrado mediante este método que la
cantidad de inositol es medida por la velocidad de consumo y el inositol
intracelular presente en cantidades que van desde 0.1 a 4.8mM. Estas
cantidades no son empleadas en el ámbito farmacéutico, por lo tanto, este
método no es sensible para estas determinaciones (Chi-po, et al. 1979).
Métodos MicrobiológicosMétodos Microbiológicos Liebig postuló por primera vez en 1871, un factor
de crecimiento requqerido por levaduras, el cual fue nombrado como “Bios” por
Wildiers en 1901y posteriormente, en 1911 Funk lo denomino vitamina . El
Mio-inositol fue el primer constituyente de “Bios” en ser aislado y caracterizado,
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representando así una herramienta para la investigación de ensayos
microbiológicos (Freed, 1966). Se ha estudiado la utilización de inositol en
Saccharomyces carlsbergensis y Schizosaccharomyces pombe, microorganismos auxotróficos
para inositol. Los métodos microbiológicos se basan en principios fotométricos y
espectrofotométricos para determinar una relación directamente proporcional
entre la cantidad de mio-inositol consumida por el microorganismo y su
crecimiento (Yarbrough, et al, 1956).
3.4. LEVADURAS "...ninguna clase de microorganismos ha estado más íntimamente asociada con el progreso y desarrollo de la raza humana como las levaduras” Tanner (Citado por Herrera, 1990).
Las levaduras son microorganismos unicelulares de formas y dimensiones diversas.
Pueden ser esféricas, ovales, elípticas, cilíndricas, cortas o alargadas, con extremos
redondeados o apiculados. Como son polimorfas adoptan distintas formas dentro de
la misma especie y aún en el mismo cultivo, lo cual depende de diversos factores,
especialmente del sustrato en que viven y de la edad de los cultivos. Debido a esta
circunstancia, la forma no siempre debe tomarse como característica taxonómica
(Herrera, 1990).
En muchos casos, al reproducirse las células, quedan unidas formando pequeñas o
largas cadenitas que son los pseudomicelios; asimismo, algunas de ellas pueden
desarrollar largos filamentos que constituyen un micelio verdadero (Herrera,
1990)
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Las dimensiones más comunes de las células varían entre 2 y 4 µm de ancho y 2 a
8µm de largo; sin embargo, se encuentran levaduras alargadas que tienen 10, 15 o
25µm de longitud, y aquellas que constituyen filamentos llegan a tener hasta 50, 70
y más micrómetros.
Las levaduras prosperan normalmente en hábitat con abundante azúcar, algunas
viven en simbiosis con animales, especialmente insectos y unas pocas son patógenas
para animales y hombres. (Brock, et al. 1993)
Las levaduras presentan las partes de una célula completa: Pared celular y
protoplasma; este último comprende la membrana fundamental (plasmalema), el
citoplasma y el núcleo. La pared celularLa pared celular o cápsula de secreción es delgada o gruesa
según la edad de la célula y la especie de levadura; esta formada principalmente de
polisacáridos constituidos por mananos, β-(1---3 y 1—6) glucanos y algo de
quitina (Shematek, et al. 1980); la pared primaria, cuando la célula de la levadura
se divide, casi siempre está compuesta de quitina, pero después, en las células
maduras, son más abundantes los otros des polisacáridos mencionados. El El
citoplasmacitoplasma es transparente y presenta varias estructuras metaplasmáticas, así como
granulaciones. Entre las metaplasmáticas están las mitocondrias, el retículo
endoplasmático y las vacuolas; a las segundas corresponden el glucógeno, los
glóbulos de grasa y los gránulos metacromáticos. El citoplasma esta involucrado en
eventos como el crecimiento polar de las levaduras (Herrera, 1990).
Las mitocondriasLas mitocondrias son corpúsculos refringentes constituidos por lipoídes y
nucleoproteínas que contiene ácido ribonucleíco y desoxírribonucleíco. La actividad
fermentadora de muchas levaduras esta ligada al desarrollo de estos corpúsculos
(Herrera, 1990).
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El retículo endoplasmáticoEl retículo endoplasmático, esta constituido por numerosas membranas tubulares
lisas. La vacuola contiene el jugo celular, formado principalmente por agua con
diversas sustancias de reserva, de secreción y excreción, así como cristales de sales
y de ácidos orgánicos. El glucógeno es casi siempre abundante en las levaduras que
se desarrollan en medios óptimos ricos en glúcidos, se encuentra en vacuolas
especializadas; los glóbulos de grasa se encuentran dispersos en el citoplasma
(Herrera, 1990).
Los gránulos metacromáticosLos gránulos metacromáticos constituidos por la volutina (polimetafosfatos)
representan las sustancias de reserva del citoplasma, principalmente en las
vacuolas, como inclusiones con movimiento browniano. El núcleo está delimitado
por una doble membrana que presenta numerosos poros y que en su interior
contiene el nucleoplasma o jugo celular. La membrana nuclearLa membrana nuclear permanece intacta
durante la mitosis, y juega dos papeles muy importantes: Fusión y secreción de
vesículas y síntesis de polisacáridos de pared, especialmente síntesis de glucanos
(Takeo, 1987). El núcleo varía según el grupo taxonómico (Herrera, 1990).
3.5. GENERALIDADES DE Schizosaccharomyces pombe
En 1983, P. Lindner fue el primero en describir la fisión de Schizosaccharomyces
pombe. Él aisló la levadura desde cerveza africana donde observó células
homotálicas coloreadas de ambos tipos de apareamiento + y -, los cuales al unirse
dan origen a ascas que contienen cuatro ascosporas. Lindner escogió el nombre
Schizosaccharomyces, por un lado, para dar una expresión significativa a la
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diferencia esencial que existe desde el punto de vista morfológico a la relación del
género Saccharomyces, y por otro lado, para tener en cuenta características
comunes tales como la formación de esporas y la capacidad fermentativa
(Hochstenbach, et al. 1997).
3.5.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA (Webster, 1970; Barnnet, et al. 1993)
3.5.2. CICLO DE VIDA CELULAR DE Schizosaccharomyces pombe (Hochstenbach, et al. 1997) Durante el ciclo normal de vida, las células de la levadura son haploides,
principalmente las que solo tienen una copia de cada cromosoma y, así, una copia
de todos los genes. Las células haploides se multiplican asexualmente a través de
mitosis. Nuevamente nacen células en la punta del bastón en forma cilíndrica.
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Cuando han crecido hacia una longitud las células producen septos en la mitad de
las células. El septo divide la célula madre en dos células hijas iguales. En medio
rico las células hijas se separan para comenzar el ciclo celular haploide. Cada ciclo
celular haploide toma acerca de 3 horas.
FIGURA 3.FIGURA 3. Células Haploides de Schizosaccharomyces pombe (Hostenbach, 1997)
Schizosaccharomyces pombe es una levadura dimórfica, ésta puede tomar
morfologías de forma de bastón hasta morfologías pseudohifales, en las cuales las
células hijas permanecen unidas. El crecimiento pseudo-hifal permite que las
células se extiendan más eficazmente y proveer mejor los nutrientes.
FIGURA 4.FIGURA 4. Células pseudohifales de Schizosaccharomyces pombe
(Hostenbach et al, 1997)
Schizosaccharomyces pombe tiene dos tipos de apareamiento opositivos, es decir,
apareamiento + y -. Cuando condiciones ricas son requeridas por condiciones de
inanición, la forma de las células haploides de la levadura del apareamiento de tipo
opuesto se conjugaran en pares contrarios y fusionaran sus puntas.
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FIGURA 5. FIGURA 5. Conjugación de células de S. pombe (Hostenbach et al , 1997)
Subsecuentemente, el núcleo se fusiona para formar células diploides,
llamadasZigotos.
FIGURA 6. FIGURA 6. Formación del Zigoto (Hostenbach et al, 1997)
Usualmente, los zigotos sometidos a meiosis inmediatamente, de esporulación,
formación de esporas, y ascas zigoticas, sufren autolisis de la pared de las ascas
liberando las esporas del asca haploide con las cuales son capaces de sobrevivir a
largos períodos de estrés.
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FIGURA 7.FIGURA 7. Formación de ascas zigóticas (Hostenbach et al, 1997)
Cuando las condiciones del ambiente no son favorables para el crecimiento, las
esporas germinan y el ciclo celular de las células haploides comienza de nuevo. Si
los zigotos se encuentran en buenas condiciones favorables, ellos infrecuentemente
bajo meiosis y mitosis entran al ciclo celular diploide.
FIGURA 8.FIGURA 8. Ascosporas (Hostenbach et al, 1997)
Las células diploides de dividen mediante fisión, pero son más largas y más anchas
que las células haploides.
FIGURA 9.FIGURA 9. Células diploides (Hostenbach et al, 1997)
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TABLA 1- Medida de células haploides
FIGURA 10FIGURA 10. . Comparación de tamaño entre células haploides y diploides
(Hostenbach et al, 1997)
Las células diploides continúan el crecimiento mitótico hasta agotar nutrientes.
Luego ellas continúan en meiosis y formación de ascas azigoticas, conteniendo
cuatro ascosporas haploides. La espora germina y comienza el ciclo celular
haploide.
TIPO DE CELULASTIPO DE CELULAS ETAPA/MicrómetrosETAPA/Micrómetros
Cuando Nacen: 7-8µm Haploides
En división: 7-12 µm de largo
3-4 µm de ancho
Cuando nacen: 11-14 µm Diploides
En división: 20-25 µm de largo
4-5 µm de ancho
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FIGURA 11. FIGURA 11. Ascas azigóticas (Hostenbach et al, 1997)
MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA:MORFOLOGÍA MACROSCÓPICA: Colonias crema a color canela,
butirácea.
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA:MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA: Su reproducción es vegetativa por fisión,
no filamentosa, ascos evanescentes, contienen 1 a 4 ascosporas redondas y
ovaladas (Barnett, 1993)
TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO:TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO: Schizosaccharomyces pombe
es un microorganismo mesofílico que crece entre 25– 35ºC con una
temperatura óptima de 32ºC (Barnnet, et al. 1993).
TIEMPOS DE DUPLICACIÓN:TIEMPOS DE DUPLICACIÓN: Las células haploides de S. Pombe crecen con
los siguientes tiempos de generación en Medio Mínimo (Hochstenbach, et al.
1997).
TEMPERATURATEMPERATURA TIEMPO DE GENERACIONTIEMPO DE GENERACION
25°c 4 Horas
29°C 3 Horas 30 minutos
32°C 2 Horas 30 minutos
35.5°C 2 Horas 20 minutos
TABLA 2. TABLA 2. Tiempos de Generación según la temperatura de crecimiento (Hostenbach
et al, 1997)
pHpH: Generalmente los medios de cultivos empleados para el crecimiento de
S. pombe varían de acuerdo a la composición del medio, para medios mínimos
como agar extracto de malta es de pH 5,0 +/- 2 y en medios complejos varia
desde 4.8 hasta 7.0 (Mc Veigh, et al. 1995).
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AUXOTROFÍA:AUXOTROFÍA: Schizosaccharomyces pombe es un microorganismo
auxotrófico natural de inositol. Un factor crítico para el control del ciclo celular
de S. pombe es la cantidad exógena de mio-inositol adicionada al medio,
diferentes concentraciones estimulan el apareamiento y la esporulación en
medios mínimos (Niederberger, et al. 1998), Estudios han encontrado que el
crecimiento óptimo de esta levadura es obtenido al adicionar al medio 8µg/ml
de inositol. (Mc Veigh, et al. 1955). Este microorganismo también presenta
auxotrofía para ácido pantotenoíco, adenina, ácido glutámico, histidina, leucina,
lisina y uracilo (Hochstenbach, et al. 1997)
CULTIVOS LÍQUIDOS: CULTIVOS LÍQUIDOS: Cuando está en fase exponencial,
Schizosaccharomyces pombe crece entre 2x 106 y 1 x 107 células por ml. La
densidad óptica (DO) a 595 nm de un cultivo puede usarse para medir la
concentración de células, donde DO595 nm = 0.1 para aproximadamente 2 x 106
células por ml (Esta longitud de onda mide la dispersión de la luz). La relación
entre la DO y el número de células es lineal a DO 595 = 1 (Hochstenbach, et al.
1997).
3.5.3. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES
3.5.3.1. FACTORES ORGÁNICOS DE CRECIMIENTO
Todas las especies de levaduras están reportadas para utilizar glucosa
aeróbicamente y cerca de la mitad de estas la fermentan anaeróbicamente,
probablemente a CO2 y etanol. Por contraste, muchas especies crecen
aeróbicamente sobre disacáridos, solo un poco pueden fermentar estas
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aeróbicamente. Por ejemplo, más de las especies de levaduras pueden usar sustratos
tales como maltosa, trehalosa, celobiosa aeróbicamente (Barnnet, et al. 1982)
El transporte de azúcares como la D-glucosa en Schizosaccharomyces pombe se
realiza mediante el transporte de H+, presentándose un recirculamiento de protones
por la ATPasa H+ de la membrana plasmática (Hofer, et al. 1987).
Schizosaccharomyces pombe crece en concentraciones bajas de glucosa en
presencia de etanol de manera diaúxica, fenómeno que se presenta cuando las dos
fuentes de energía están presentes simultáneamente y la enzima necesaria para la
utilización de una de ellas esta sujeta a una represión catabólica, el organismo crece
primero sobre una fuente, habiendo a continuación un pequeño lapso de
tiempo de no crecimiento, para a continuación, volver a crecer utilizando
ahora la segunda fuente de energía (Brock, et al 1993).
Etanol y acetato son secuencialmente producidos desde glucosa y son utilizados en
secuencia. La principal ruta del catabolismo de D-glucosa en levaduras de S. pombe
es la vía glicolítica para la formación de piruvato. S. Pombe es facultativo capaz de
metabolizar aeróbicamente el piruvato por vía fermentativa y respirativa (Tsai, et al.
1992).
S. pombe no crece en cultivos con etanol o acetato como fuente de carbono, sin
embargo la fisión de levaduras utiliza etanol y acetato en presencia de D-glucosa. A
altas concentraciones de D-glucosa, la represión de la respiración resulta en la
producción aeróbica de etanol. La depleción de D-glucosa represa el metabolismo
respiratorio permitiendo la oxidación de etanol con acumulación de acetato (Tsai, et
al. 1987).
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El ciclo activo del glioxilato es dependiente de D-glucosa y es fundamental para que
se lleve a cabo la gemación de las levaduras, este proceso puede utilizar acetato o
etanol solo en presencia de este azúcar, el cual es importante para que se lleve a
cabo la germinación de esporas (Blázquez, et al. 1994).
S. pombe crece en presencia de azúcares análogos a la D-glucosa como la 2-Deoxy-
glucosa formando paredes celulares frágiles, generando la muerte celular por lisis,
ya que este análogo inhibe algunas reacciones en la síntesis de polisacáridos
capsulares (Magnet, 1965).
3.5.3.2. IONES INORGÁNICOS CONSIDERADOS COMO
MACRONUTRIENTES
Los iones inorgánicos necesarios en considerables cantidades son el fosfato:fosfato:
requerido para la síntesis de ácidos nucléicos y fosfolípidos, el potasioel potasio requerido por
varias enzimas incluidas en el proceso de síntesis de proteínas; el magnesio,el magnesio,
estabiliza los ribosomas, las membranas celulares, los ácidos nucléicos y también es
empleado para el funcionamiento de algunas enzimas. El calcio,El calcio, ayuda a estabilizar
la pared. El hierroEl hierro es considerado como un macronutriente, ya que juega un papel
fundamental en la respiración celular, siendo un componente clave de los
citocromos y de las proteínas que contienen hierro y azufre implicadas en el
transporte de electrones (Brock, et al. 1993). El sulfato de amonio (NHEl sulfato de amonio (NH44))22 SO SO44 puede
utilizarse como única fuente de nitrógeno para el crecimiento de S. pombe (Mc
Veigh, et al. 1955).
3.5.3.3. MICRONUTRIENTES
Son metales muchos de los cuales forman parte de las enzimas que son catalizadores
celulares.
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Cobalto:Cobalto: Necesario para la vitamina B12,
CobreCobre:: Ciertas proteínas, como son las implicadas en la respiración, como
citrocromo c oxidasa. Según un estudio de los requerimientos nutricionales de S.
pombe se requiere en concentraciones de 0,04 ppm. (Mc Veigh, et al. 1955).
ManganesoManganeso: Activador de muchas enzimas, presentes en algunas superóxido
dismutasas.
Molibdeno:Molibdeno: Presente en varias enzimas que tienen flavina, también en
nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxidasa, oxotransferasas y formato
deshidrogenasa (Brock, et al. 1993).
Níquel:Níquel: La mayoría de las deshidrogenasas, coenzima F y biosíntesis de
ureasa lo emplean en cantidades trazas (Eitinger, et al. 2000).
Zinc:Zinc: Cantidades de 0,18ppm están presentes en medios mínimos de S.
pombe debido a su requerimiento para la formación enzimas anhidrasa
carbónica, alcohol deshidrogenasa, RNA y DNA polimerasa.
Hierro:Hierro: Citocromos, catalasas, peroxidasas, proteínas con hierro y azufre.
Este micronutriente se requiere en concentraciones de 0,2ppm. (Mc Veigh, et al.
1955).
3.5.3.4. FACTORES DE CRECIMIENTO
Son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy
pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento
incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. La mayor parte de las
vitaminas funcionan como coenzimas (Brock, et al. 1993). En el caso de
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Schizosaccharomyces pombe son empleados como factores de crecimiento los
siguientes compuestos:
TIAMINA TIAMINA: Empleada para α-descarboxilaciones y trancetolizaciones. La
concentración de esta vitamina en medios de cultivo de S. pombe es de 0,6mg/l. Sin
tiamina el crecimiento de la levadura se reduce en un 50% del crecimiento máximo
que presenta esta levadura (Mc Veigh, et al. 1955).
PIRIDOXINA: PIRIDOXINA: Se requieren cantidades de 0,6mg/l de piridoxina para el
crecimiento de S. pombe, en ausencia de este compuesto el crecimiento se reduce
en un 35% aproximadamente del crecimiento máximo que se presenta, ya que es
necesario para llevar a cabo reacciones de transformación de aminoácidos y
trancetolaciones. (Mc Veigh, et al. 1955).
ÁCIDO NICOTÍNICO ÁCIDO NICOTÍNICO:: Es un componente del NAD y NADP. Nicotinamida y Ácido
nicotínico, son nutricionalmente equivalentes cuando son asimilados para
propósitos de la síntesis de NAD(P).
PANTOTENATO DE CALCIO: PANTOTENATO DE CALCIO: EL crecimiento de S. pombe muestra una relación
lineal, a medida que se va incrementando la concentración de pantotenato de
calcio. Desde 0,0 hasta 0,05µg /ml (Mc Veigh, et al. 1955).
BIOTINA: BIOTINA: Empleada en la biosíntesis de ácidos grasos, B-descarboxilaciones, y
fijación de CO2. El consumo de biotina es estimulado por el transporte de glucosa
mediante sistemas de ATPasa; altos niveles de biotina en el medio reducen la tasa
de catálisis de consumo de biotina (Stolz, et al. 1999). La cantidad de biotina
requerida para el crecimiento máximo de S. pombe es de 0,001µg/ml (Mc Veigh,
et al. 1955).
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MIO MIO--INOSITOL:INOSITOL: Muchos trabajos han encontrado que mio-inositol es un
factor de crecimiento para ciertos animales y microorganismos. Este
requerimiento es aparentemente específico para la forma ópticamente inactiva de
mio-inositol. Cuando el mio-inositol es adicionado al medio, la recuperación de
este y de las células de Schizosaccharomyces pombe es de 85-100%, demostrando
así que el inositol no es empleado para reacciones catabólicas, si no que es
utilizado como una molécula intacta( McVeigh, et al. 1955).
El inositol juega un papel general en el metabolismo de fosfolípidos, en la
gemación de levaduras de Schizosaccharomyces pombe. En este organismo, el
inositol puede ser sintetizado a partir de glucosa 6-fosfato en una reacción
catalizada por el enzima fosfato sintetasa. El inositol es utilizado en la síntesis de
fosfatidil inositol, fosfolípidos de membrana y actúa como un regulador en la
síntesis de fosfolípidos por niveles de represión de fosfatidil inositol y
fosfatidilcolina, y de las enzimas dependientes de Inositol 1-fosfato sintetasa, CDP-
diacilglicerol CDP-DG sintasa, Fosfatidilserina sintasa y descarboxilasa. De esta
manera se ha demostrado que existe una vía para síntesis de novo de fosfolípidos
en la fisión de levaduras de S. pombe (Roxann, et al. 1991).
La composición de los fosfolípidos de membrana de S. pombe es afectada por la
disponibilidad de precursores de fosfolípidos. En particular cantidades relativas
de fosfatidilinositol (PI), principal fosfolípido aniónico, y fosfatidil serina (PS)
varia en respuesta a la concentración exógena de inositol. Así, cuando la
concentración de inositol es baja, el contenido de PI decrece mientras el contenido
de PS incrementa. El precursor para la síntesis de PI y PS es CDP-diacilglicerol. Este
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liponucleotido es un importante intermediario en la síntesis de fosfolípidos en
levaduras (Gaynor, et al. 1992)
Se ha demostrado que la concentración de Inositol P6 en S. pombe es regulada
por estrés, y que la enzima (1,4,5) P3 6-quinasa de esta levadura es una quinasa
multifuncional que fosforila Inositol (1,4,5) P3 a Inositol (1,4,5,6) P4 y Inositol
(1,3,,4,5,)P4 , estos compuestos son importantes en la señalización celular
especialmente el Inositol (1,4,5) P3 ya que incrementa la concentración de iones
Ca2+. Cuando se presenta una disrupción en la formación de Inositol (4,5) P2 5-
fosfatasa genera aberraciones en la formación de vacuolas, morfología en la
membrana plasmática, sensibilidad osmótica y crecimiento (Ongusaha, et al.
1998) y además es considerado un activador de los receptores de superficie
celular (Ongusaha, et al. 1997).
Los fosfolípidos de inositol son vitales para el control de las funciones celulares
participando como feromonas que controlan el apareamiento de las células de S.
pombe durante el ciclo celular, específicamente por la acumulación de
diacilglicerol y fosfolipasa C (Stuart, et al. 1995).
3.5.4. METABOLISMO DEL MIO-INOSITOL EN LEVADURAS
3.5.4.1. REACCIONES DE SÍNTESIS DE FOSFOLÍPIDOS EN LEVADURAS
(Carman, et al. 1989)
A partir de Glucosa:A partir de Glucosa:
Las reacciones de síntesis de inositol a partir de glucosa se realizan en la siguiente
El Gliceraldehído-3P obtenido al final de la degradación se integra al ciclo de las
pentosas fosfato.
3.5.4.3. METABOLISMO DEL INOSITOL TRIFOSFATO EN
Schizosaccharomyces pombe
El inositol -1,4,5-trifosfato es liberado por la fosfolipasa c a partir del fosfatidil-
inositol-5,6-difosfato. Es hidrosoluble y pasa al citoplasma. Si el inositol trifosfato
no se fija a una de sus proteínas receptoras, es rápidamente degradado por
hidrólisis de sus radicales fosfato, indispensables para su actividad biológica.
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- 39 -
MEMBRANA CELULARMEMBRANA CELULAR INTERIOR DE LA CÉLULASINTERIOR DE LA CÉLULAS
ATPATP ADPADP
ÁCIDO FOSFATIDICO
CDP-DIACILGLICEROL
FOSFATIDIL INOSITOL
FOSFATIDIL-INOSITOL 5P
FOISFATIDIL-INOSITOL 4,5,DIFOSFATO
DIACILGLICEROL
ATPATP
ATP A D PA D P
A D PA D P
CTPCTP
C D PC D P
ACCIÓN DE SEGUNDO MENSAJERO
INOSITOL
INOSITOL1-FOSFATO
INOSITOL1,4 DIFOSFATO
INOSITOL-1,4,5,- TRIFOSFATO
FOSFOLIPASA C
GLICEROL ÁCDO ARAQUIDÓNICO ÁCIDO GRASO
PG
INOSITOL FOSFOMONOESTEARASA
4- FOSFOINOSITOL FOSFOMONOESTEARASA
5-FOSFOINOSITOL FOSFOMONOESTEARASA
FIGURA 12FIGURA 12.. Metabolismo degradativo del Inositol-trifosfato (Borel et al , 1989)
Una enzima específica, la 5-fosfoinositol-fosfomonoestearasa, quita el fosfato en 5.
Una segunda fosfomo-noestearasa específica quita el residuo fosfato en 4 y deja el
inositol-1-fosfato que es a su vez desfosforilado en inositol por una fosfatasa. El
Inositol así liberado es rápidamente reutilizado para volver a formar fosfatidil-
inositol. El diacil glicerol reacciona con el ATP (diacilglicerol quinasa), formando
un ácido fosfatídico que es activado a su vez por una reacción con CTP, lo que da el
CDP-diacil-glicerol, que reacciona con el inositol para volver a formar el fosfatidil-
inositol (Figura 12) (Borel, et al. 1989).
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4. DISEÑO EXPERIMENTAL
4.1. PROCEDIMIENTO (Rieth. 1999)
4.1.1. MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIONES REACTIVAS
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Solución De Solución De Cloruro de Sodio:Cloruro de Sodio: Pesar 9,00 gramos de cloruro de sodio y llevar a
volumen de 1000ml con agua desmineralizada. Esterilizar en autoclave por 15
minutos a 121ºC.
Medio de conservación:Medio de conservación: Disolver en 200 ml de agua desmineralizada 20 g de
extracto de malta, 0,4 de extracto de levadura y 4 g de agar-agar. Calentar en baño
maría hasta disolución completa ; Ajustar el pH con ácido láctico a 5,0. Se dividió
en porciones de diez mililitros en tubos tapa rosca, esterilizar 15 minutos a 121ºC, y
dejar solidificar en posición oblicua.
Medio de inoculación:Medio de inoculación: Utilizar dos tubos de 10 ml de agar extracto de malta de
Merck solidificado en forma oblicua, y esterilizar a 121ºC por 15 minutos.
Medio de prueba:Medio de prueba: Preparar según la técnica de Merck Alemania, las siguientes
soluciones nutritivas preparadas por separado.
• Solución nutritiva 1Solución nutritiva 1: Disolver en 100 ml de agua las siguientes sustancias bajo
calentamiento, en la secuencia descrita: 4 g de sulfato de amonio, 3 g de di-
hidrogeno fosfato de potasio 0,5 g de sulfato de magnesio heptahidratado.
• Solución nutritiva 2Solución nutritiva 2: Disolver en 100 ml de agua 20 mg de Tiamina clorhidrato,
Piridoxina clorhidrato, Ácido nicotínico, Pantotenato de calcio.
• Solución nutritiva 3Solución nutritiva 3: Disolver 20 mg de biotina en 80 ml de agua adicionando
gota a gota hidróxido sódico 0,1 N hasta observar la completa disolución de la
biotina y diluir con agua hasta 100 ml.
• Solución nutritiva 4Solución nutritiva 4: Disolver 100 mg de extracto de levadura en 100 ml de
agua.
• Solución nutritiva 5Solución nutritiva 5: Disolver bajo calentamiento 200 mg de ácido bórico, 54
mg de sulfato de zinc heptahidratado, 58 mg de sulfato de cobre
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pentahidratado, 60 mg de sulfato de manganeso monohidratado, 38 mg de
Heptamolibdato de amonio tetrahidratado en 100ml de agua. Realizar una
dilución 1:100
• Solución nutritivaSolución nutritiva 6: 6: Disolver 0,5 g de cloruro de calcio dihidratado en 100ml
de agua.
Medir los siguientes volúmenes de soluciones nutritivas en un balón aforado de
1000 ml colocando 200 mililitros de agua:
100 ml de solución nutritiva 1
5 ml de solución nutritiva 2
4 ml de solución nutritiva 3
100 ml de solución nutritiva 4
10 ml de solución nutritiva 5.
Ajustar el pH a 4,8 con solución volumétrica de ácido clorhídrico 1N o con solución
volumétrica de Hidróxido de sodio 0,1N, posteriormente adicionar la solución
nutritiva 6 agitando fuertemente, diluir con agua hasta 1000ml.
Disolver 20,0 g de glucosa monohidrato en 500ml de medio básico y diluir con agua
hasta 900ml. Esterilizar 15 minutos a 121°C. Mantener en nevera máximo 6 meses a
+/- 4°C.
4.1.2. MICROORGANISMO DE PRUEBA
Se utilizó Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, levadura dependiente de Mio-
inositol para crecimiento. Para la conservación de la levadura, se realizaron
transferencias cada dos semanas a nuevo medio de conservación el
microorganismo. Incubar 20 horas a 32ºC y refrigerar a 4ºC.
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- 43 -
4.1.3. PREPARACIÓN SOLUCIÓN DE ESTÁNDAR DE MIO-INOSITOL
Pesar 25,25 mg de Mio-inositol de pureza 99,0% y se disolvieron en 100ml de agua
desmineralizada estéril en balón aforado para obtener un estándar de referencia de
concentración 250 µg de mio-inositol/ml. A partir de la solución de referencia se
preparan cinco soluciones de calibración de cconcentraciones 4, 6, 8, 10 y 12 µg de
Mio-inositol/ml (Anexo 1).
4.1.4. PREPARACIÓN DEL CULTIVO DE INOCULACIÓN
A partir de un tubo del cultivo de conservación transferir una asada de
Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491 a dos tubos del medio de inoculación,
incubar durante 16h a 32ºC y recoger las células de levadura con solución salina
0,9%, separar las células centrifugando durante 2 minutos a 3000 rpm,
resuspender el sedimento agitando circularmente con 10 ml de solución de cloruro
de sodio y centrifugar de nuevo. Después de repetir dos veces este proceso, tomar el
último sedimento en 20 ml de solución salina 0,9% y diluirlo de tal manera que al
medir en el espectofotómetro a 660nm se obtenga un 10% de transmitancia, se
realizó recuento en cámara de neubauer de la suspensión ajustada para determinar
la concentración aproximada de células por ml, utilizando una pipeta pasteur se
llenó la cámara con la suspensión ajustada y se contó al microscopio con el objetivo
de 10X el número de células en cinco cuadrados del cuadro central de las dos
cuadrículas de recuento, los datos obtenidos para cada cuadrícula fueron
promediados y se aplico la siguiente fórmula:
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CÉLULAS/ CÉLULAS/ µµl DE SUSPENSIÓN l DE SUSPENSIÓN =. Células contadas . superficie (5cuadrados) * Profundidad cámara * dilución
Superficie de cinco cuadros= 0,2 mm2
Profundidad de la cámara = 0,1mm
4.1.5. DESARROLLO DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE
Schizosaccharomyces pombe
Para determinar las características de crecimiento (velocidad de crecimiento y
tiempo de duplicación) de Schizosaccharomyces pombe ATCC 16491, el
microorganismo fue cultivado en el medio de prueba tratado con diferentes
concentraciones de Mio-inositol.
Transferir a 12 frascos schott 190 ml del medio de prueba y a cada dos frascos
adicionar10 ml de la solución estándar correspondiente a las concentraciones 4, 6,
8, 10 y 12 µg de mio-inositol/. Como blanco utilizar el medio de ensayo diluido
con 10 ml de agua desmineralizada. Esterilizar a 105ºC durante 10 minutos y
después del enfriamiento a temperatura ambiente, inocular todos los frascos con un
ml de suspensión de levadura previamente ajustada a 10%T, realizar por
duplicado.
Incubar durante 96 horas a 32ºC, tomando muestras cada tres horas para realizar
lectura espectrofotométrica a 535 nm de longitud de onda; ajustar el cero con el
medio libre de vitamina y de inóculo.
4.1.6 DESARROLLO DE LA CURVA PATRÓN
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- 45 -
Realizar una curva relacionando el crecimiento de Schizosaccharomyces pombe
medo como absorbancia, con diferentes concentraciones de Mio-inositol en el
medio de prueba.
Adicionar 19 ml de medio de prueba a cada tubo y 1ml del estándar a cada serie de
tres tubos; los tubos blanco no llevan solución estándar si no 1 ml de agua
desmineralizada, esterilizar 10 minutos a 105°C.
Después del enfriamiento a temperatura ambiente, inocular cada tubo con 0,1ml de
la suspensión de levadura ajustada, excepto el tubo blanco sin inóculo. Incubar
todos los tubos durante 48 horas a 32 °C
Empleando el vortex, agitar los tubos y a cada uno adicionarle 3 ml de alcohol
etílico al 95% (Mc Veigh, 1955), dejar en reposo hasta que liberen todo el CO2
producido durante la incubación. Agitar nuevamente y tomar las lecturas de
turbidez en espectrofotómetro a 535 nm de longitud de onda. Utilizar el tubo
blanco sin inoculo para ajustar el cero y medir el valor de turbidez del tubo blanco
inoculado, tomar este como blanco para ajustar el cero y medir los valores de
turbidez de la curva patrón.
Promediar los valores de turbidez de cada una de las concentraciones y elaborar
una curva graficando los promedios de crecimiento microbiano como absorbancia
en las ordenadas y el valor de las concentraciones en abscisas.
A partir de esta grafica determinar el modelo de crecimiento y si es necesario
transformar alguna de las variables para convertirla hacia un modelo lineal y
evaluar parámetros de intercepto, pendiente, y coeficiente de correlación, datos
necesarios para determinar la concentración de Mio-inositol en producto.
Comprobar la linealidad de la curva mediante test estadísticos de acuerdo a las
hipótesis planteadas bajo un nivel de confianza del 95% .
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Hipótesis para la pendiente: Hipótesis para la pendiente:
Ho: Pendiente =0
Hi: Pendiente ≠ 0
Hipótesis para el interceptoHipótesis para el intercepto
Ho: Intercepto =0
Hi: Intercepto ≠ 0
Hipótesis para el coeficiente de corHipótesis para el coeficiente de correlaciónrelación
Ho: Existe asociación entre las variables X y Y
Hi: No existe asociación entre las variables X y Y
4.4. EVALUACIÓN DE LA SELECTIVIDAD DE LA TÉCNICA
La selectividad se define como la capacidad del método analítico para dar una
respuesta debida únicamente a la presencia del analito, sin la interferencia de
sustancias que pueden encontrarse en la matriz de la muestra; precursores
sintéticos, excipientes, enantiómeros, y productos de degradación.
La evaluación de la selectividad que tiene la técnica para determinar Mio-Inositol,
se realizó utilizando placebo que fue fabricado haciendo la mezcla de los
excipientes del recubrimiento, excipientes del núcleo y principios activos presentes
en el producto.
Se preparó el medio de prueba tal como se describió anteriormente, la curva patrón
y cada uno de los principios activos, placebo cubierta, placebo núcleo, se trabajaron
en las mismas condiciones y a la dilución que se trabaja en producto.
Para hallar los porcentajes de interferencia de los principios activos y excipientes
por separado y en conjunto se utilizó la siguiente fórmula:
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Absorbancia de Analito para interferenciaAbsorbancia de Analito para interferencia x 100 x 100 Absorbancia de Estándar [8mg/20ml]Absorbancia de Estándar [8mg/20ml]
4.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE MIO-INOSITOL
EN PRODUCTO
Pesar cinco grageas cuyo contenido de mio-inositol es de 20 mg de mio-inositol/
gragea y disolver en 100 ml de agua desmineralizada estéril para obtener una
solución de concentración 1 mg de mio-inositol/ml; llevar a calentamiento en baño
María a 50ºC durante 30 minutos. A partir del sobrenadante de esta solución,
realizar diluciones en serie hasta obtener una solución de concentración supuesta
de 8µg de mio-inositol/ml (Anexo 2), de esta solución tomar 1ml y adicionarlo a
19 ml del medio de prueba previamente esterilizado. Inocular 0,1 ml de la
suspensión de levadura ajustada a 10%T e incubar 48 horas a 32ºC. Tomar los
valores de turbidez obtenidos de la preparación por triplicado de la dilución y
promediar. Mediante la ecuación de la recta obtenida de la curva patrón, obtener
las concentraciones reales de Mio-inositol en el producto despejando X:
Y = bX + aY = bX + a
Donde Y = Absorbancia, X = Ln de la concentración de inositol, b es la pendiente de
la recta y al intercepto con el eje Y.
El Valor hallado de X corresponde al Ln de la concentración real de inositol en la
dilución ensayada. Se efectúa la conversión al valor de concentración aplicando ex.
Con el valor hallado de X se aplica la siguiente fórmula para obtener el contenido
de mio-inositol por gragea:
CONTENIDO DE INOSCONTENIDO DE INOSITOL/ GRAGEA =ITOL/ GRAGEA = X X x 25 25
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El valor obtenido mediante el análisis anterior es dividido por el valor del contenido
supuesto de Mio-inositol en el producto para obtener el porcentaje de recuperación.
% RECUPERADO = % RECUPERADO = Contenido Inositol/Gragea Contenido Inositol/Gragea x 100 x 100 C Contenido declarado/ Grageaontenido declarado/ Gragea
5. RESULTADOS
5.1. CURVA DE CRECIMIENTO DE Schizosaccharomyces pombe 5.1.1. CRECIMIENTO EN AUSENCIA DE MIO-INOSITOL
CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm)CRECIMIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm) TIEMPOTIEMPO REPLICA 1 REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 2 PROMEDIO PROMEDIO
0 0,010 0,016 0,013
3 0,031 0,038 0,035
6 0,067 0,097 0,082
9 0,086 0,107 0,097
12 0,093 0,113 0,103
15 0,096 0,114 0,105
Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
- 49 -
18 0,096 0,112 0,104
21 0,096 0,114 0,105
24 0,095 0,116 0,105
27 0,092 0,117 0,104
30 0,090 0,116 0,103
33 0,095 0,116 0,105
36 0,100 0,110 0,105
39 0,092 0,108 0,100
42 0,089 0,098 0,094
45 0,073 0,088 0,080
48 0,064 0,081 0,073
51 0,059 0,069 0,064
54 0,059 0,061 0,060
57 0,059 0,065 0,062
60 0,060 0,070 0,065
63 0,059 0,070 0,065
66 0,061 0,088 0,075
69 0,076 0,106 0,091
72 0,087 0,114 0,100
75 0,096 0,131 0,114
78 0,097 0131 0,114
81 0,097 0,128 0,112
84 0,098 0,130 0,114
87 0,098 0,130 0,114
90 0,106 0,142 0,124
93 0,116 0,140 0,128
96 0,118 0,141 0,129
5.1.2. CRECIMIENTO EN PRESENCIA DE 4µµg DE MIO-INOSITOL/20ml
CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )CRECMINIENTO MICROBIANO (Absorbancia a 535nm )
FIGURA 13.FIGURA 13. Curvas de crecimiento de s. pombe
CONCENTRACIÓN DE MIOCONCENTRACIÓN DE MIO--INOSITOLINOSITOL AUSENCIAAUSENCIA 4 4 µµg/20 mlg/20 ml 6 6 µµg/20 mlg/20 ml 8 8 µµg/20 mlg/20 ml 10 10 µµg/20 mlg/20 ml 12 12 µµg/20 mlg/20 ml
Velocidad Crecimiento (Horas -1)
0,002 0,017 0,024 0,030 0,032 0,034
Intercepto 0,059 0,034 0,105 0,085 0,010 -0,005
Coeficiente de correlación
0,683 0,971 0,941 0,958 0,967 0,965
Tiempo de duplicación (minutos)
436,243 41,468 28,464 22,915 21,996 20,220
TABLA 3.TABLA 3. Parámetros de crecimiento de Schizosaccharomyces pombe
Yenny Beltrán &Liceth Cabrejo
- 56 -
FIGURA 14. Gráfico comparativo del crecimiento de schizosaccharomyces pombe a diferentes concentraciones de mio-inositol
Al comparar el comportamiento de Schizosaccharomyces pombe cuando crece a
diferentes concentraciones de Mio-inositol, se observa que en ausencia de esta
vitamina, S. pombe no alcanza un desarrollo óptimo pues a la hora nueve se
detiene el crecimiento, como lo demuestra la gráfica, posiblemente debido a la falta
de inositol; Mientras en las demás curvas la fase exponencial continúa hasta la hora
39 donde se estabiliza. El máximo crecimiento microbiano observado para cada
curva demuestra que a medida que aumenta la concentración de inositol hay un
aumento proporcional de la población microbiana medida en absorbancia, esto se
demuestra en el incremento de la velocidad de crecimiento y en la disminución del
tiempo de duplicación (Tabla 3).
CURVAS DE CRECIMIENTO Schizosaccharomyces pombe A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE MIO-INOSITOL