Immunoistochimica automatizzazione all'ICP · legarsi a più molecole enzimatiche (segnale amplificato). Metodo indiretto Patient tissue Primary antibody Biotin Secondary Antibody

Immunoistochimica

Automatizzazione all’ICP

Lara Lunghi Etienne

Programma

� Elenco processi automatizzati� Analisi dei vantaggi e degli svantaggi

dell’automatizzazione

Processi automatizzati

� Sparaffinatura e idratazione dei tessuti� Smascheramento degli antigeni� Visualizzazione� Controcolorazione

• Postazioni indipendenti

• Incubazioni a differentitemperature

• Data base

• Protocolli e reagentiidentificati tramite bar code

Dati importanti:

Benchmark XT

Sparaffinatura e idratazione

� Automatico: incubazione direttamentenell’apparecchio 15’ a 75°C con EZ Prepsolution.

� Manuale: incubazione nella stufa a 60°C per 1 ora, 2 x 5’ in xilene, 2 x 5’ in alcool 100%, 5’ in alcool 95%, 5’ in alcool 70%, 5’ in acqua.

La fissazione dei tessuti: un problema per l’immunoistochimica

� I fissativi possono bloccare, modificare, mascherare o distruggere gli epitopi.

� La formalina tamponata al 10 % è uno dei fissativi piùutilizzati perché non preclude nessun esame nell’ambito istologico. Purtroppo tende a mascherare gli epitopi.

� Un tessuto troppo fissato o un tessuto nel quale i processi autolitici hanno preceduto una fissazione corretta, sono difficili da correggere.

� Il mantenimento della struttura dell’antigene è una fase critica per l’immunoistochimica.

Smascheramento degli antigeni

� La prima fase importante di un’analisi di immunoistochimica su un materiale fissato in formalina è quella di “correggere” le alterazioni degli epitopi causati dalla fissazione. Questo passaggio è cruciale per la riuscita della reazione immunologia.

� Esistono due metodi per smascherare gli antigeni:� Digestione enzimatica� Trattamento termico

Digestione enzimatica

Trattamento termico

Visualizzazione

Sistemi di visualizzazione- Le reazioni immunoistochimiche mirano a rendere visibile la presenza di antigeni nei tessuti.- Sono utilizzate molecole che producono un segnalevisibile per individuare le reazioni antigene-anticorpo.- Le molecole maggiormente utilizzate sono florescenti o enzimatiche.- Queste molecole possono essere attaccateall’anticorpo primario tramite un metodo diretto o un metodo indiretto.

Metodo indiretto avidina-biotina

- Sono utilizzate due proteine che hanno una fortissima affinità l’una con l’altra: l’avidina e la biotina.

- E’ utilizzato un anticorpo secondario per agganciare l’anticorpo primario al resto delle molecole utilizzate per il rilevamento.

- E’ sfruttata la capacità dell’avidina e della biotina di legarsi a più molecole enzimatiche (segnale amplificato).

Metodo indiretto

Patient tissue

Primary antibody

Biotin

Secondary Antibody

enzyme

Avidin

H2O2 DAB

Incubazione dell’anticorpo

Amplificazione

Bloccante delle biotine endogene

Controcolorazione

Vantaggi automatizzazione

� Tempistiche 7-12 ore �3,5 ore (2 volte al giorno)

� > Riproducibilità dei risultati �>standardizzazione

� Tutti i processi sono automatizzati in un solo apparecchio � < impiego di risorse umane

� > Controllo sui reagenti utilizzati (ISO/IEC 17025 e ISO 15189

Svantaggi automatizzazione

� Reagenti, tempi di incubazione e temperature limitati.

� Standardizzazione dei protocolli: difficoltà nel correggere e nel trattare i casi limite, i casi speciali!

� Costi molto alti!� Organizzazione del lavoro: orari da rispettare.

Grazie per l’attenzione