IMAGING MASS SPECTROMETRY - web.medicina.unimib.itweb.medicina.unimib.it/magni/Corsi di Laurea in Biotecnologie Mediche... · (formalin-fixed paraffin-embedded) rimozione della paraffina

IMAGING MASS SPECTROMETRY

m/z 10165

m/z 4554

m/z 4940

Veronica Mainini PhD Biomedical Technologies Post-DOC researcher Clinical Proteomics Unit Dept. Of Health Science Università degli studi di Milano-Bicocca

Mainini V., Angel PM, Magni F., Caprioli RM. Rapid Communications in Mass Spectrometry 2011 25(1):199-204

IMAGING MASS SPECTROMETRY (IMS)

• Tecnologia che permette di analizzare componenti sia endogeni che esogeni presenti nei tessuti, mantenendo nel contempo la loro orientazione spaziale .

IMS

• Rileva analiti di varia natura

• Analisi condotta direttamente sul campione nativo

• Non necessita di marcatori, purificazioni, etc…

• Fornisce informazioni relative alla distribuzione spaziale

• Combina le informazioni molecolari ottenute mediante MS con informazioni derivanti dalla microscopia ottica.

• Spettrometro (TOF, TOF-TOF, orbitrap, synapt, FT-ICR, Q-TOF...)

• Ionizzazione

• Risoluzione Spaziale

Ø area colpita

• Range di Massa

• Velocità dell’acquisizione Frequenza del laser 200Hz – 2kHz

IMS: quale spettrometro???

MALDI

SIMS

DESI

MALDI

SIMS

DESI

MALDI

SIMS

Proteine, peptidi, lipidi, farmaci

Piccole molecole, elementi

Piccole molecole, lipidi

10 µm -200 µm

100 nm – 10 µm

300 µm - 500 µm

0-30 K m/z– fino 150 K m/z

< 1000 m/z

DESI < 3000 m/z

Ec = ½ mv2

Ec = zeV zeV = ½ mv2 t = L √ m/2zeV v = √ 2zeV/m

m/z 4554

INTENSITY SCALE

0% 100%

m/z 4940

MALDI-TOF Imaging/Profiling

Large Droplets (µL)

Small Droplets (pL)

Uniform Coating (spray)

LOW HIGH SPATIAL RESOLUTION

MATRIX

IMAGING PROFILING

A

B

C

Find discriminatory patterns Proteins/peptides spatial distribution

Wild Type IRF6 -/-

Manuscript in press

3 mm

PROFILING IMAGING

PROFILING RESULTS….

IMAGING RESULTS!

IMS_Tecnologia

Campione:

• Spessore della sezione: 5-20 µm ↑spessore = ↓ conduttività

• Tipologia di campione:

-qualsiasi tipo di cellula o tessuto (cellule da coltura,

colonie batteriche, tessuti, biopsie…)

-tessuti freschi o FFPE

•Degradazione del campione

•Inclusione in polimero OCT (Optimal Cutting Temperature,

polyvinyl alcohol + polyethylene glycol ) o altre resine.

•Lavaggi per eliminare interferenti

con OCT

no OCT

Matrice:

•tipo di matrice:

•Preparazione

della matrice !

4. Ferulic acid [(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)prop-2-enoic acid] has been

recently reported for the detection of high molecular weight proteins on thin tissue

sections.

Matrice:

•Deposito: automatizzato/manuale

Kaletas KB, et al Proteomics 2009; 9 (10):2622-33

AUTOMATED SPOTTING

SHIMADZU ChIP Chemical Inkjet Printer

LABCYTE PORTRAIT 630 Spotter Acustico

VANTAGGI - riproducibilità - buona qualità spettri SVANTAGGI - cristallizzazione della mx - costo elevato - ris. spaziale limitata - tempistiche lunghe

SPRAY MANUALE Ris. Spaziale: 50-150 µm VANTAGGI - Basso costo

- Elevata risoluzione spaziale SVANTAGGI: Scarsa riproducibilità

TLC Sprayer

Airbrush

SPRAY AUTOMATIZZATO Ris. Spaziale: 50µm VANTAGGI: Riproducibile Buona risoluzione spaziale SVANTAGGI: Costo elevato

SUBLIMAZIONE

1_Informazione clinica

2_Dati sperimentali

3_Analisi biocomputazionale

IMS e PROTEOMICA CLINICA

1

3

2

IMS si focalizza sul fenotipo della

patologia

Tecnica veloce ed efficace capace di

valutare una finestra di centinaia di

segnali proteici in un range di massa

molto ampio

Firme proteiche legate alla malattia

primaria

Ricerca di firme molecolari: il

vantaggio combinatoriale

Marcatori diagnostici e target terapeutici

Risposta al trattamento terapeutico

Studio del microambiente della lesione

Biologia dello sviluppo

Imaging Mass Spectrometry (IMS)

Distribuzione spaziale e caratterizzazione in situ di biomarcatori proteici

Distribuzione spaziale di piccole molecole (<1KDa) nel tessuto

Xenobiotici (composti farmaceutici e loro metaboliti, droghe, tossine,..)

Farmacocinetica

Farmacodinamica

IMS = alternativa all’autoradiografia!

No molecole radioattive

Metaboliti

Tissue protein profiling by MS

Tissues comparison:

normal vs disease

m/z 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

In

ten

sity (

arb

. u

.)

MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)

*

*

Spettro medio del normale

Spettro medio RCC

*

*

Normale RCC Spettri Normale : 23

Spettri RCC : 20

* Differenze statisticamente

significative

m/z

In

ten

sit

y (

arb

. u

.)

Normale RCC

9800 10000 10200 10400 10600 10800 11000 11200 11400

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

Normale RCC

P-Value = 0.00335

AR

EA

DE

L P

ICC

O

Spettro medio del normale

Spettro medio RCC

MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)_II

2900 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700 3800 3900

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

22.5

25.0

27.5

30.0

32.5

35.0

37.5

40.0

42.5

45.0

47.5

m/z

In

ten

sity (

arb

. u

.)

RCC

RCC

Normale RCC

P-Value = 6.24e-005

Normale RCC

P-Value = 6.24e-005

Normale

Normale

Spettro medio del normale

Spettro medio RCC A

RE

A D

EL

PIC

CO

AR

EA

DE

L P

ICC

O

MALDI-TOF Profiling –RCC (Renal Cell Carcinoma)_III

Applicazioni TUMORE: definizione margini istologici e margini molecolari

Molecular Tumor Margin!

TUMORE ALLO STOMACO

• Non esistono Biomarker diagnostici affidabili

• CEA e CA19-9 non sono sufficientemente sensibili né specifici

• Difficile interpretazione istologica delle lesioni precancerose da quelle di stadio più avanzato.

Histology driven approach !!!

Controls n=43 Patients n=63

CTRL vs DISEASE

PCA

Sensitivity 94% Specificity 96%

SUMMARY

• Histology driven approach allowed to apply profiling analysis in order to:

- detect diagnostic pattern characterizing gastric cancer

- define molecular patterns discriminating intestinal and diffuse histological lesions

- differentiate stage Ia lesions to more advanced lesions (support to prognosis/aid in resolving ambiguous ultrasonography/TAC

Tissue Imaging by MS

MALDI IMS: Applications

Terapia adiuvante preoperatoria condotta con Paclitaxel + radioterapia: - Pazienti con risposta completa (pCR) - Pazienti che non rispondono alla terapia (NR)

α-defensine: peptidi ad effetto citotossico coinvolti nel processo di difesa mediato dai neutrofili

POTENZIALI MARKER PROGNOSTICI – RISPOSTA AL TRATTAMENTO

OLANZAPINA: 2-metil-4-(4-metilpiperazin-1-il)-10H-tieno[2,3-b][1,5] benzodiazepina, utilizzata per il trattamento di schizofrenia e disturbi bipolari.

OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272

2h

OLANZAPINE m/z 256 N-desmethyl m/z 256 2-hydroximethyl m/z 272

6h

PDZ = primary decidual zone SDZ = secondary decidual zone

M= mesometrial pole AM= antimesometrial pole

Distribuzione di sfingomieline e fosfatidilcoline durante lo sviluppo embrionale

Distribuzione di lisofosfatidilinositolo, fosfatidilinositolo, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerolo e fosfatidilserina

durante lo sviluppo embrionale

SUMMARY OF APPLICATIONS

• Normale vs Tumorale

• Definizione dei margini tumorali

• Diagnosi e prognosi di lesioni tumorali: presenza/assenza della lesione, grado della lesione, caratterizzazione istotipo

• Risposta al trattamento

• Farmacocinetica e farmacodinamica

• Lipidomica e proteomica per la definizione di pathways cellulari rilevanti in specifici processi patologici

PROFILING

IMAGING

LIMITI e PROSPETTIVE

Sensibilità: aumentare il numero e la varietà dei composti osservabili

Identificazione: metodi più semplici, veloci ed efficaci ad elevata

risoluzione/ proteomica top down

Risoluzione spaziale: laser; ionizzazione (SIMS, DESI)

Validazione: nuovi software biostatistici

Quantificazione

Integrazione dati: correlazione con altre tecniche di imaging (es:PET,

MRI) e complementazione con metodologie tradizionali (es:shotgun, 2DE)

IMPROVING SENSITIVITY

MALDI IMS:

LIVER

No detergent

0.05% TRITON X-100 matrix

0.05% SDS matrix

BRAIN

No detergent

0.05% TRITON X-100 matrix

0.05% SDS matrix

HEART

No detergent

0.05% TRITON X-100 matrix

0.05% SDS matrix

m/z 4554

NO DETERGENT MATRIX

SDS MATRIX

m/z 4940

m/z 8956

INTENSITY SCALE

0% 100%

NO DETERGENT MATRIX

TRITON X-100 MATRIX

m/z 10165

m/z 11083

m/z 14004

INTENSITY SCALE

0% 100%

NEW TECHNOLOGIES

&

ADVANCED APPROACHES

Imaging Mass Spectrometry:

Anna C. Crecelius et Al. Three-Dimensional Visualization of Protein Expression in Mouse Brain Structures Using Imaging

Mass Spectrometry Journal of the American Society for Mass Spectrometry, Volume 16, Issue 7, 2005, 1093-1099

MBP 8 MBP 5

Unident.

Prot.

MALDI imaging_ visualizzazione 3D

Andersson M, Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM. Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume

reconstruction. Nat Methods. 2008 Jan;5(1):101-8.

Immagini 2D - Localizzazione di proteine in specifiche

regioni istologiche

TUMOR STRIATUM

NORMALE

HISTONE H4 TUMORE

GB protein γ7 STRIATUM

Cyt c OXase

polypeptide VIIc

NORMALE

es:

Immagini 3D

Piano colorato

Piano nero

MRI

IMS

proteine

- Ricostruzione 3D (IMS + imm. Ottiche)

- Correlazione immagini in 3D

(MRI + IMS + imm. Ottiche)

MALDI imaging:

visualizzazione 3D e RMI

Tatiana C. Rohner, Dieter Staab, Markus Stoeckli.

MALDI mass spectrometric imaging of biological

tissue sections. Mechanisms of Ageing and

Development 126 (2005) 177–185

1. Molecular Scanner Approach

2. Digestione proteolitica in situ

M. Reid Groseclose, Malin

Andersson, William M. Hardesty and

Richard M. Caprioli. Identification

of proteins directly from tissue: in

situ tryptic digestions coupled

with imaging mass spectrometry.

J. Mass Spectrom. 2007; 42: 254–

262

IDENTIFICAZIONE PROTEINE – sequenziamento su sezioni tissutali

* Peptidi di siero

amiloide A

Spettro MS/MS del

peptide a 1550 m/z

Spettro MS

IMS con digestione triptica in situ su sezione

conservata in formaldeide del 1899 di milza di paziente

malato di amiloidosi

IMS di materiale archiviato: tessuti FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded)

rimozione della paraffina e

digestione triptica in situ

Principale metodo di

conservazione e stoccaggio

MALDI-IMS

Vaste librerie correlate a dati

clinici accurati

diagnosi

prognosi

progressione della malattia

trattamento terapeutico

1550 m/z

LIPIDOMICA: FT-ICR e Ion Mobility

Specie molecolari isobare

Strumenti ad elevata risoluzione

(FT-ICR: R=1 x 106)

LIP

IDI

in R

EN

E m

uri

no

ΔMW=0.061Da

Specie difficilmente frazionabili

Separazione per

mobilità ionica

oltre che per

tempo di volo

IMAGING LIPIDI

PR

OF

ILIN

G L

IPID

I

Nello stesso

campione lipidi

distinti da altre

piccole molecole

con stessa massa

nominale

BIBLIOGRAFIA – REVIEWS & BOOKS -

• Mass Spectrometry Imaging Principles and Protocols Rubakhin SS, Sweedler JV .Methods in Molecular Biology 656 Humana Press

• Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chughtai K, Heeren RM. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):3237-77. Review.

• Imaging of intact tissue sections: moving beyond the microscope. Seeley EH, Schwamborn K, Caprioli RM. J Biol Chem. 2011 Jul 22;286(29):25459-66.

• MALDI imaging mass spectrometry of human tissue: method challenges and clinical perspectives. Seeley EH, Caprioli RM. Trends Biotechnol. 2011 Mar;29(3):136-43

• MALDI imaging mass spectrometry--painting molecular pictures. Schwamborn K, Caprioli RM. Mol Oncol. 2010 Dec;4(6):529-38.

• Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Schwamborn K, Caprioli RM. Nat Rev Cancer. 2010 Sep;10(9):639-46.

• Imaging mass spectrometry: viewing the future. Schwartz SA, Caprioli RM. Methods Mol Biol. 2010;656:3-19.

BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 1 - • Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal

carcinoma. Oppenheimer SR, Mi D, Sanders ME, Caprioli RM. J Proteome Res. 2010 May 7;9(5):2182-90.

• Gastric cancer-specific protein profile identified using endoscopic biopsy samples via MALDI mass spectrometry. Kim HK, Reyzer ML, Choi IJ, Kim CG, Kim HS, Oshima A, Chertov O, Colantonio S, Fisher RJ, Allen JL, Caprioli RM, Green JE. J Proteome Res. 2010 Aug 6;9(8):4123-30. Erratum in: J Proteome Res. 2011 Jan 7;10(1):361.

• Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neoadjuvant paclitaxel and radiation Bauer JA, Chakravarthy BA, Rosenbluth JM et al. Clin Canc Res 2010; 16:681-690

• Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry. Khatib-Shahidi S, Andersson M, Herman JL, Gillespie TA, Caprioli RM. Anal Chem. 2006 Sep 15;78(18):6448-56.

• Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass spectrometry during mouse embryo implantation. Burnum KE, Cornett DS, Puolitaival SM, Milne SB, Myers DS, Tranguch S, Brown HA, Dey SK, Caprioli RM. J Lipid Res. 2009 Nov;50(11):2290-8.

• 3D Imaging by Mass Spectrometry: a new frontier Seeley EH, Caprioli RM Anal Chem 2012 Mar 6;84(5):2105-10.

BIBLIOGRAFIA – APPLICATIONS 2 -

•Imaging mass spectrometry of proteins and peptides: 3D volume proteomics Andersson M. Groseclose MR, Deutch AY, Caprioli RM Nat Meth vol 5, n.1 Jan2008; 101-108 • MALDI Imaging and Profiling Mass Spectrometry in Neuroproteomics. Andersson M, Andren P, Caprioli RM. In: Alzate O, editor. europroteomics. Boca Raton (FL): CRC Press; 2010. Chapter 7. • Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Casadonte R, Caprioli RM. Nat Protoc. 2011 Oct 13;6(11):1695-709. •Enhancement of protein sensitivity for MALDI imaging mass spectrometry after chemical treatment of tissue sections Seeley EH, Oppenheimer SR, Deming M, Chaurand P, Caprioli RM J Am Soc Mass Spec 2008; 19(8): 1069-1077. • Detergent enhancement of on-tissue protein analysis by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry Mainini V, Angel PM, Magni F, Caprioli RM Rapid Comm Mass Spec 2011; 25: 199-204. • Detection of high molecular weight proteins by MALDI imaging mass spectrometry Mainini V, Bovo G, Chinello C, Gianazza E, Grasso M, Cattoretti G, Magni F. • Multiplex target protein imaging in tissue sections by mass spectrometry – TAMSIM Thiery G, Schepinov MS, Southern EM, et al RCM 2007; 21:823-829. • Tag-Mass: specific molecular imaging of transcriptome and proteome by mass spectrometry based on photocleavable tag. Lemaire R et al. J Prot Res 2007; 6(6):2057-2067. • Improvements of Targeted multiplex mass spectrometry Imaging. Thiery G, Anselmi E etal Proteomics 2008; 8:3725-3734