Imaging (mapping) Technique Hoffman Modulation Contrast Oblique Illumination Rheinberg Illumination Dispersion Staining Imaging Technique Brightfield (contrasto.

Imaging (mapping) Technique

Hoffman Modulation Contrast

Oblique Illumination

Rheinberg Illumination

Dispersion Staining

ImagingTechnique

Brightfield(contrasto di ampiezza)

Darkfield(contrasto di diffrazione)

Contrasto di fase

Differential Interference Contrast (DIC)

Polarizzazione

Fluorescenza

Meccanismi di contrasto: Microscopia ottica

Tecniche speciali solo in trasmissione

Campo chiaro (Bright Field, BF)

È la tecnica “normale”: l’obbiettivo raccoglie tutta la luce che è trasmessa o riflessa dal campione.

È basata sull’assorbimento della luce (o di alcune lunghezze d’onda) maggiore o minore da parte di aree diverse del campione che quindi risultano più o meno chiare (o di colore diverso).

Quindi è una tecnica che si basa direttamente sul contrasto di intensità (o di colore). Per questo si chiama contrasto di ampiezza (l’intensità è il quadrato dell’ampiezza dell’onda).

Campo scuro (Dark Field, DF)

È la tecnica per oggetti che assorbono poco ma diffondono: l’obbiettivo raccoglie solo la luce che diffusa dal campione.

L’illuminazione è fatta in modo tale che la luce che illumina il campione non entra nell’obiettivo.

Risultano quindi chiari solo gli oggetti che diffondono, mentre il fondo risulta scuro.

Contrasto di polarizzazione

L’anisotropia che genera birifrangenza può essere intrinseca

al materiale o indotta da stress

È la tecnica per oggetti birifrangenti: il fascio ordinario e straordinario acquistano una differenza di fase diversa per tipi diversi di cristalli e dipendente dallo spessore. La loro interferenza produce colori che permettono di identificare i diversi cristalli.

Immagini ortoscopiche

Contrasto di fase È la tecnica per oggetti trasparenti e che non diffondono. Nell’attraversamento del campione la luce subisce però un cambiamento di fase che può venir sfruttato per creare interferenza con il fascio diretto.

Applicato p.es. per il conteggio delle fibre di amianto

Differential Intereference Contrast (DIC)

SpecimenType

ImagingTechnique

Transmitted Light

Transparent SpecimensPhase Objects

Bacteria, Spermatozoa,Cells in Glass Containers,

Protozoa, Mites, Fibers, etc.

Phase ContrastDifferential Interference Contrast

(DIC)Hoffman Modulation Contrast

Oblique Illumination

Light Scattering ObjectsDiatoms, Fibers, Hairs,

Fresh Water Microorganisms,Radiolarians, etc.

Rheinberg IlluminationDarkfield Illumination

Phase Contrast and DIC

Light Refracting SpecimensColloidal Suspensionspowders and minerals

Liquids

Phase ContrastDispersion Staining

DIC

Amplitude SpecimensStained Tissue

Naturally Colored SpecimensHair and Fibers

Insects and Marine Algae

Brightfield Illumination

Fluorescent SpecimensCells in Tissue Culture

Fluorochrome-Stained SectionsSmears and Spreads

Fluorescence Illumination

Birefringent SpecimensMineral Thin Sections

Liquid CrystalsMelted and Recrystallized Chemicals

Hairs and FibersBones and Feathers

Polarized Illumination

SpecimenType

ImagingTechnique

Reflected Light

Specular (Reflecting) SurfaceThin Films, Mirrors

Polished Metallurgical SamplesIntegrated Circuits

Brightfield IlluminationPhase Contrast, DIC

Darkfield Illumination

Diffuse (Non-Reflecting) SurfaceThin and Thick FilmsRocks and Minerals

Hairs, Fibers, and BoneInsects

Brightfield IlluminationPhase Contrast, DIC

Darkfield Illumination

Amplitude Surface FeaturesDyed Fibers

Diffuse Metallic SpecimensComposite Materials

Polymers

Brightfield IlluminationDarkfield Illumination

Birefringent SpecimensMineral Thin Sections

Hairs and FibersBones and Feathers

Single CrystalsOriented Films

Polarized Illumination

Fluorescent SpecimensMounted Cells

Fluorochrome-Stained SectionsSmears and Spreads

Fluorescence Illumination

Microscopia ottica: rapporto campione meccanismo

Trasmissione

Riflessione Scansione

Il numero di pixel nello schermo e la dimensione dell’area scansionata definiscono la dimensione dell’area del campione corrispondente ad un pixel, cioè la risoluzione.

L’ingrandimento è il rapporto tra la lunghezza della linea sullo schermo e quella sul campione.

Ingrandimento a vuoto (oltre la massima risoluzione)

fascio Area sul campione corrispondente a un pixel

Risoluzione max300m/600pixel 0.5 m/pixelNessuna informazione può essere ottenuta sulla

struttura interna del pixel sul campione

Ingrandimento300mm/300m 1000 X

300m

300mm

Esempio

600 pixel

La risoluzione ha un limite inferiore nella dimensione del fascio.

A cosa è dovuto l’ingrandimento nel SEM?

Specimen Image

Mag=1

Mag=3

Differenza importante tra TEM e SEM• Ricordando che: il coefficiente di aberrazione sferica aumenta con la

lunghezza focale delle lenti e questi due numeri hanno lo stesso ordine di grandezza (Cs ~ f/2)

• Il TEM analizza piccoli campioni posti tra i pezzi polari della lente

obiettivo, che quindi può essere operata a lunghezza focale molto piccola con (relativamente) piccoli valori del coefficiente di aberrazione

alta risoluzione possibile

(conseguenza secondaria: più alta è la risoluzione, minore spazio c’è per orientare il campione o per accessori vari).

• Nel SEM grandi campioni sono posti fuori dalla lente obiettivo che è operata a grandi lunghezze focali

limitata risoluzione(per raggiungere alte risoluzioni esistono SEM speciali, in cui piccoli campioni sono inseriti nelle lenti; sono necessari anche rivelatori speciali)