Illustrations chez la levure Candida albicans

Facteurs de virulence chez les champignonsd’incidence médicale

Illustrations chez la levure Candida albicans

Th. Noël

Fiche d’identité (1)

➣ Levure commensale de l’homme

➣ Cavité orale, tractus digestif, muqueuse vaginale

➣ Pathogène opportuniste

. Mycoses superficielles (cutanéo-muqueuse, OPC, vaginites, …)

. Mycoses profondes (organes vitaux), disséminées (candidémies)

➣ 4ème agent nosocomial

➣ 40 % de mortalité associés aux candidémies


- 35 % mortalité- 50 % réa

CHU Bordeaux 2005 (Accoceberry, Gabriel)


➣ Levure diploïde

➣ Pas de reproduction sexuée connue (multiplication mitose et bourgeonnement)

➣ 8 chromosomes, 16 MB / génome haploïde

➣ Génome complètement séquencé et annoté

(Candida genome database)

➣ Normalement saprophyte

(matière organique morte)

Problématique

Facteurs de virulence ?

Saprophyte Pathogène

➣ Problèmes particuliers posés par

le commensalisme et l’opportunisme

➣ Approche par génomique fonctionnelle

Méthodologie (1)

- ARN interférence : inutilisable en théorie (pas de protéine argonaute chez les champignons)

- Stratégie antisens : + (applications chez filamenteux)

- Insertion d'un fragment d'ADN par recombinaison homologue : +++ chez les levures, +/- chez filamenteux

(possible améliorer le % recombinaison : inactivation des gènes codant

KU70 et KU80, 2 protéines nécessaires au Non Homologous End Joining)

Invalider l'expression d'un gène chez champignons ?

Méthodologie (2)

1. Création de mutants nuls

2. Caractérisation phénotypique

3. Virulence sur modèle animal

Chez les levures

Système de transformation génétique« URA3 blaster »

URA3hisG hisG

Δura3/ Δura3

Electroporation

URA3 = orotidine 5’phosphate decarboxylasehisG = partie de gène de S. typhimurium

Sélection URA+ sur YNB(milieu minimum)

1

Génotype

URA3hisG hisG5’X 3’X

Gène X Allèle 1X X

Gène X Allèle 2

Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans

Δura3/Δura3, X / X

Transformation souche homozygote Δura3par cassette URA3 blaster bordée des régions 5’ et 3’ du gène X

Intégration par double CO du gène URA3 au locus XRemplacement du 1er allèle

Création d’une souche mutante hétérozygote (URA Blaster)

1


Gène X Allèle 2

Génotype


Δura3/Δura3, Δx::URA3 / X

Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot ou PCR

Confirmation de l’intégration par double CO du gène URA3 au locus X


1

hisG

hisG

5’X

3’X

Gène X Allèle 2

XGénotype


Δura3/Δura3, Δx::URA3 / X

Contre-sélection sur 5FO de souches ura3Analyse par Southern blot ou PCR

Vérification excision de la cassette HisG-URA3-HisG par recombinaison en HisG

[5FO = Acide 5-fluoro-orotique]


1

hisG5’X 3’X

Gène X Allèle 2

Génotype


Δura3/Δura3, Δx::hisG / X


1

hisG5’X 3’X

Gène X Allèle 2

URA3hisG hisG5’X 3’XX X

Génotype


Transformation souche homozygote Δura3par cassette URA3 blaster bordée des régions 5’ et 3’ du gène X

Intégration par double CO du gène URA3 au locus XRemplacement du 2ème allèle


Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)

1

hisG5’X 3’X


Génotype


Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::URA3

Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot

Confirmation de l’intégration par double CO du gène URA3 au locus Xau niveau du 2ème allèle


1

hisG5’X 3’X

hisG

hisG

5’X

3’XX Génotype




Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::URA3


1

hisG5’X 3’X

hisG5’X 3’XGénotype


Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::hisG


1

hisG5’X 3’X

hisG5’X 3’XGénotype


URA3/Δura3, Δx::hisG / Δx::hisG


1

URA35’ 3’

5’ 3’

hisG5’X 3’X

hisG5’X 3’X

Gène X URA3hisG hisG


Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot

Confirmation de l’intégration par double CO des gènes X et URA3 au locus X

Création d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)

1

hisG5’X 3’X

Gène X URA3hisG hisG

Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicansCréation d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)

Génotype

Δura3/Δura3, Δx::hisG / X, URA3



1

hisG5’X 3’X

Gène X hisG

hisGX


GénotypeΔura3/Δura3, Δx::hisG / X, URA3



1

hisG5’X 3’X

Gène X hisG


Génotype


1

hisG5’X 3’X

Gène X hisG

URA35’ 3’

5’ 3’


Génotype

URA3/Δura3, Δx::hisG / X

1

ARG45’X-Target 3’X-Target

Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans1

5'∆URA33'∆URA3

Disruption en une seule étape ?Stratégie Cassette UAU

Transformation souche homozygote Δura3, Δarg4par cassette UAU bordée des régions 5’ et 3’ du gène X à déléter (Target)

Sélection Arg+ sur milieu YNB minimum + uridineIntégration par double CO de la cassette UAU au locus X

Remplacement du 1er allèle

1

Sélection Arg+, Ura+ sur milieu YNB minimum Conversion génique + recombinaison intragénique URA3

Remplacement du 2ème allèle

2

Génotype

Gène X Allèle 1X X

Gène X Allèle 2


Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, X / X

Sélection Arg+ sur YNB minimum + uridine

Création d’une souche mutante (Cassette UAU)

1

ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3

Génotype

Gène X Allèle 2


Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ X

Conversion génique (non sélectionnée)


1


Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ Δx::ARG4



Génotype

Génotype


Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ Δx::URA3

Recombinaison intragénique URA3Sélectionnée sur milieu YNB minimum


1


5’X-Target 3’X-TargetURA3

Possibilité de créer la souche révertante hétérozygote X/Δx - Contre-sélection ura3 sur 5FO - Complémentation : apport de l'allèle X avec marqueur URA3

Souche homozygote Δx

in vitro : - croissance C et N - température - pH - adhérence - morphologie cellulaire

2. Caractérisation phénotypique

3. Virulence sur modèle animal

Injection : 105 cfu / animal veine caudale

Survie21 j

Analyse microbiologique

(quantitatif)

Analysehistologique

(qualitatif)

Tests de survie chez les sourisOF1 et BalB/c

Représentation de Kaplan-Meier, Analyse de log-rank à p ≤ 0.05

Mutant sur OF1 et BalB/c

Sauvage sur OF1

Sauvage sur BalB/c

3

Analyse microbiologique

Prélèvement organe cible[ Rein, Foie, Poumon, cerveau ]

Homogénat

Etalement sur milieu completDénombrement CFU

Mutant Sauvage

< ?> ?= ?

3

Etude histologique

Souche virulente Souche avirulente

3

Coupe histologique de reins infectéslevures colorées au PAS

Facteurs de virulence

Températurecroissance

Sécrétion

Affichage Dimorphisme

MétabolismeBiofilm

Adhérence

Température de croissance

≥ 37°C

Ex. chez levures : - Candida albicans > 37°C

- Saccharomyces cerevisiae = 30°C

(quelques espèces de filamenteux aptes à se développer à 50°C, voire 60°C)

Adhérence

- Tout premier facteur de virulence dans tout système hôte-pathogène

- Chez C. albicans, protéines groupées sous le terme « adhésines »

Adhésines

Matrice extracellulaire Mammifère

- Fibronectine

- Fibrinogène

- Laminine

- Collagènes I / IV

Adhérence

1 - Agglutinin-like sequences (Als), spécifiques C. albicans

- Als S. cerevisiae : cell/cell interaction mating- Chez C. albicans : 10 gènes- principales protéines : Als1p et Als5p

S-S-S-S-SNH2 COOH

n repeats conserved Δ(108 pb)

1299-1308 pb GPIGlycosylphosphatidylinositol

➣ rendent S. cerevisiae adhérentes➣ délétion = hypovirulence

G G G

Ser/Thr-richAffinité fibronectine

Adhérence

2 - Hyphal Wall Protein (Hwp1)

- Mannoprotéine liée de façon covalente aux ß1-6glucanes de la paroi- Spécifique du stade hyphe chez C. albicans- Facilite adhérence aux cellules epithéliales- Ligand de transglutaminases des mammifères(modifications post-traductionnelles par transamidation desglutamines ➜ cross-link lysine glutamine ➜ meilleurerésistance protéolyse)- Fixation "covalente" de C. albicans aux cellules épithéliales

Adhérence

3 - Integrin-like protein (Int1)

- Intégrines mammifères = glycoprotéines impliquéesdans interactions cellullaires, adhésion (fibronectine,laminine)- Integrin-like synthétisée par C. albicans- Epitopes communs avec intégrines des mammifères- Mimétisme pour échapper au système immunitaire- Disruption = adhérence et virulence fortement diminuées

Sécrétion

1 - Secreted Aspartyl protéinases (Saps)

- Famillle d’enzymes (protéases acides) codée par 10 gèneschez C. albicans- Aptes à dégrader in vitro plusieurs protéines mammifères :mucines (protection des muqueuses), IgA, kératine, collagène- Souches virulentes = plus de Saps que les avirulentes- Sap2 : augmentation perméabilité vasculaire ➜ disséminationhématogène- Résistance à phagocytose macrophagique (4,5,6)

Sécrétion

2 - Autres enzymes

- Phospholipases (A à D) : hydrolyse des phospholipidesParticiperaient au franchissement de la membrane plasmique descellules de mammifères par C. albicans.

- Lysophospholipases : hydrolyse phosphatidylinositol,phosphatidylsérine (même rôle que phospholipases).

- Lipases : rôle dans l’utilisation des lipides de l’hôte pour unswitch métabolique (métabolisme glucosé ➜ lipidique).

Dimorphisme

. Transition morphogénétique levure - filament= hyphe vraie avec cloisons internes. C. albicans, C. dubliniensis

➢

. Transition morphogénétique levure - pseudofilaments= cellules allongées restant attachées après mitose. Candida non-albicans et albicans

➢

2 types

C. albicans SC5314 - Macrophages murins lignée J774.1

t = 0 h t = 3 h

Echapper à la Phagocytose macrophagique

Faciliter la colonisation des tissus

Rein filamentsRein pseudofilamentsvaisseau sanguinfilaments et pseudos

Facteurs déclenchant la transition morphogénétique

- Carence nutritionnelle- pH (induction pH > 7)- Température (37°C)- Sérum

Test de blastèse : filamentation de C. albicans en 3 h dans du sérum à 37°C

Perception du signal

(➚ et ➘ )(➘)

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Mep2Ammonium perméase

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH + sérum

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Gpr1 Glucose senseur ?

Protéine G

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Transduction du signalRôle des protéines G


Gpr1 Glucose senseur ?

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH

Gpa1

Gpa2Ras

Voie AMPc(adénylate cyclase)

Voie MAP kinases(MEK, Kss1)

??

Rim101

Hwp1

Glucose

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈


≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH

Gpa1

Gpa2Ras

Voie AMPc

Voie MAP kinases

?

Rim101

Cph1 (Ste12-like)(Candida PseudoHyphal regulator)

Efg1(Enhanced Filamentous growth)

Effecteurs

Facteurs de transcription

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Gpr1 Glucose senseur

?

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Gpr1 Glucose senseur

≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈

Effecteurs


≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH

Cph1Efg1

Gènes filamentation+

Tup1Nrg1Rfg1

_- Cytosquelette Actine- Glucanes paroi- Lipides membranaires- Hwp1

Formation de biofilms chez Candida

- 4 étapes . qq heures . tissus, cathéter . 200 µm

- Film stratifié . Levures/ filaments . Résistance Mécanique (flux) Syst immunitaire Antifongiques

Formation de biofilms chez Candida

- 4 étapes . qq heures . tissus, cathéter . 200 µm

- Film stratifié . Levures/ filaments . Résistance Mécanique (flux) (matrice extracell) Syst immunitaire Antifongiques

- Régulation . Tyrosol + . Farnesol -

glucose, galactose, sucres aminés

Tyrosol, farnésol

AdhérenceAgglutinin-like séquenceHyphal Wall ProteinIntegrin-like proteinsMannosyl transferase

SécrétionAspartyl protéinases

Phospholipases (A-D)Lysophospholipases

Lipases

AffichagePhospholipomannane Apoptose macrophage

DimorphismeHyphes

Pseudohyphes

Résistance aux antifongiques

Métabolisme énergétiqueß-oxydation + glyoxylate

Biofilm

Facteurs de virulence Conclusion - Résumé

Métabolisme fer

Température ≥ 37°C

Illustrations chez la levure Candida albicans

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