identifikasi peridinin klorofil protein (pcp) pada - Universitas ...

1

IDENTIFIKASI PERIDININ KLOROFIL PROTEIN (PCP) PADA

MAKROALGA LAUT Halimeda sp DENGAN METODE ELEKTROFORESIS

SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRILAMIDE GEL (SDS-PAGE) DAN

HEMAGLUTINASI (HA)

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Meraih Gelar Sarjana Perikanan di Fakultas

Perikanan dan Ilmu Kelautan

Universitas Brawijaya

Oleh :

ZULFIKRI

NIM. 0810810065

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013

2

SKRIPSI

IDENTIFIKASI PERIDININ KLOROFIL PROTEIN (PCP) PADA MAKROALGA

LAUT Halimeda sp DENGAN METODE ELEKTROFORESIS SODIUM DODECYL

SULFATE POLYACRILAMIDE GEL (SDS-PAGE) DAN HEMAGLUTINASI (HA)

Oleh:

ZULFIKRI

NIM. 0810810065

telah dipertahankan di depan penguji

pada tanggal : 4 september 2013

dan dinyatakan telah memenuhi syarat

SK Dekan No.:

Tanggal :

Menyetujui,

Dosen Penguji I Dosen Pembimbing I

Ir Supriatna M.Si Dr. Uun Yanuhar S.Pi., M.Si

NIP. 19640515 199003 1 NIP. 19730404 200212 2 001 Dosen Penguji II Dosen Pembimbing II Nanik Retno Buwono S.Pi., MP Ir. Putut Widjanarko MP

NIK. 840420 08 1 2 0095 NIP. 19540101 198303 1 006

Mengetahui,

Ketua Jurusan MSP

Dr. Ir. Happy Nursyam, MS

NIP. 19600322 198601 1 001

3

LEMBAR KHUSUS

PENELITIAN INI ADALAH SEBAGIAN DARI PROGRAM PENELITIAN UNGGULAN PAYUNG DIKTI DENGAN PROGRAM UNGGULAN HIBAH PASCA

SARJANA TAHUN 2012 DAN PROGRAM PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI UTAMA (U)-BOPTN 2013

DENGAN JUDUL :

IDENTIFIKASI PERIDININ KLOROFIL PROTEIN (PCP) PADA

MAKROALGA LAUT Halimeda sp DENGAN METODE ELEKTROFORESIS

SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRILAMIDE GEL (SDS-PAGE) DAN

HEMAGLUTINASI (HA)

YANG DIBIAYAI OLEH :

DIREKTORAT JENDRAL PENDIDIKAN TINGGI, KEMENTRIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN, MELALUI DIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA NOMOR : DIPA-023.04.2.414989/2013, TANGGAL 5 DESEMBER 2012, DAN BERDASARKAN SK REKTOR UNIVERSITAS

BRAWIJAYA NOMOR : 295/SK/2013 TANGGAL 12 JUNI 2013

YANG MELIBATKAN MAHASISWA S1, S2 DAN S3:

1. Ir. NICODEMUS DAHOKLORY, M.Si 2. ARIF HABIB FASYA, S.Pi 3. RIMA OKTAVIA KUSUMA, S.Pi 4. ARAFIK LAMADI, SST 5. RYAN CHRISTIAWAN 6. AFIK SUDARSONO 7. PARAMITA PUTRI LARASATI 8. ZULFIKRI 9. RAHMAT SANDI RAHARJA 10. CAHYO DWI NUGROHO 11. DWI LISTYORINI 12. CATUR WAHYUDI 13. ALFIA GITA KUNTARI 14. LENI SRI WAHYUNI 15. LUQMAN HARIONO

Mengetahui Ketua Peneliti

Dr. Uun Yanuhar, S.Pi, M.Si

4

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi yang saya tulis ini benar-

benar merupakan hasil karya Penelitian melalui Program Penelitian Payung Dikti

dengan Program Hibah Pasca Sarjana dan BOPTN Tahun 2012-2013, yang

dibiayai oleh Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan dan

Kebudayaan, Melalui DIPA Universitas Brawijaya NO : DIPA-

023.04.2.414989/2013, tanggal 5 Desember 2012, dan berdasarkan SK Rektor

Universitas Brawijaya Nomor : 295/SK/2013 tanggal 12 Juni 2012. Penelitian ini

diketuai oleh Dr. Uun Yanuhar, S.Pi, M.Si. Dalam naskah Skripsi ini tidak terdapat

karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain kecuali yang

tertulis dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila kemudian hari terbukti atau dapat dibuktikan skripsi ini hasil

penjiplakan (plagiasi), maka saya bersedia menerima sanksi atas perbuatan

tersebut, sesuai hukum yang berlaku di Indonesia.

Mengetahui, Malang, Agustus 2013

Ketua Peneliti Mahasiswa,

Dr Uun Yanuhar, S.Pi, M.Si ZULFIKRI

NIP. 19730404 200212 2 001 NIM.0810810065

5

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan laporan tugas akhir ini.

1. Kepada Allah SWT yang berkat rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat

menyelesaikan tugas akhir ini.

2. Kepada Ibunda Ermayeti dan Ayahanda Iyondri Elisman yang selalu

memberikan dukungan baik secara moril maupun secara materil.

3. Kepada Nenek penulis Mariani , kepada kakak-kakak penulis Ainil Khairati

dan Nofrida Yanti yang juga tidak henti-hentinya memberikan motifasi kepada

penulis untuk menyesaikan tugas akhir ini.

4. Kepada dosen pembimbing, Dr. Uun Yanuhar, S.Pi., M.Si dan Ir. Putut

Widjanarko MP yang telah memberikan ilmu yang bermanfaat, bimbingan,

dan pengarahan agar laporan tugas akhir ini dapat diselesaikan dengan baik.

5. Kepada Ir. Supriatna M.Si dan Nanik Retno Buwono S.Pi., M.Si selaku dosen

penguji yang telah banyak memberikan kritikan dan saran agar laporan tugas

akhir ini dapat tersusun dengan baik

6. Kepada Pihak Kementerian Pendidikan, Payung Dikti Riset Hibah Pasca

Sarjana tahun 2012 dan program penelitian unggulan Perguruan Tinggi

Utama (U)-BOPTN Tahun 2012/2013 dengan kontrak Nomor : DIPA-

023.04.2.414989/2013, tanggal 5 desember 2012 yang diketuai oleh Dr. Uun

Yanuhar, S.Pi, M.Si.

7. Kepada Bapak H Darnel Ibrahim yang juga sudah banyak membantu dalam

kelancaran study Penulis.

6

8. KepadaTim penelitian Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) Pak Nico, Mbak

Rima, Mas Arafik, Mas Fasya, Mas Ryan, Putri, Afik, Sandi Dwi, Cahyo, Gita,

Catur, Leni dan Lukman yang lebih akrab dengan panggilan Kerapunisti,

yang satu perjuangan dengan penulis.

9. Kepada civitas akademika Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas

Brawijaya yang telah banyak berjasa dalam kelancaran study penulis.

10. Laboran Laboratorium Ilmu-Ilmu Perairan atas kerjasamanya selama

kegiatan penelitian.

11. Laboran Laboratorium Biosains Universitas Brawijaya Malang dan

Laboratorium FAAL Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Malang.

12. Laboran Laboratorium Biomolekular Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya,

Malang.

13. Laboran Biomedik Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya, Malang.

14. Teman-teman MSP 2008 atas kebersamaannya.

15. Dunsanak-dunsanak Ikatan Pemuda Pelajar Mahasiswa (IPPM) Bundo

Kanduang yang senasib sepenanggungan yang juga telah banyak

memberikan Motivasi dan semangat dalam mengerjakan laporan tugas akhir

ini.

16. Semua orang yang telah berjasa dalam hidup penulis, sehingga penulis

dapat menyelesaikan laporan skripsi ini.

Malang, Juli 2013

Penulis

7

RINGKASAN

ZULFIKRI / 0810810065. Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Brawijaya. Identifikasi Peridinin Chlorofil Protein (PCP) Makroalga Laut Halimeda sp dengan Metode Elektroforesis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel (SDS-PAGE) dan Hemaglutinasi (HA) . Pembimbing : 1. Dr. Uun Yanuhar, S.Pi, M.Si dan 2. Ir. Putut Widjanarko MP.

Hasil laut umumnya adalah ikan, alternatif hasil laut lainnya yang bisa diolah

adalah rumput laut. Dalam dunia perdagangan, rumput laut merupakan salah satu

komoditi yang cukup terkenal, meskipun tidak semua jenis rumput laut memiliki nilai

ekonomis. Alga laut banyak mengandung senyawa kimia dan umumnya

menghasilkan senyawa hidrokoloid sebagai produk metabolisme primer. Alga laut

juga mengandung metabolisme sekunder yang mempunyai protein untuk

dimanfaatkan sebagai obat karena banyak mengandung senyawa bioaktif.

Makroalga laut Halimeda sp secara kimiawi mampu menghasilkan diterpenoid

metabolites halimedatrial dan halimeda tetra acetate pada konsentrasi yang

bermacam-macam. Metabolite ini telah diteliti untuk berperanan dalam bahan kimia

pertahanan melawan terhadap pemakan tumbuhan berdasar pada bahan kimia

struktur mereka dan aktivitas biologi.

Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan protein PCP (Peridinin-Chlorophyll Protein) makroalga laut Halimeda sp dengan menggunakan metode SDS-PAGE dan Hemaglutinasi (HA). Metode pada Penelitian ini adalah deskriptif ekploratif, dengan kegiatan penelitian isolasi makroalga laut Halimeda sp, Spektrofotometer crude protein PCP, elektroforesis SDS PAGE crude protein PCP untuk mengetahui berat molekul PCP dan uji Hemaglutinasi (HA), Berdasarkan hasil penelitian, molekul Peridinin Chlorofil Protein (PCP)

terekspresi dalam 2 bentuk yakni 16 kDa (homodimer) dan 33,5 kDa (monomer).

PCP homodimer merupakan PCP dengan rantai panjang yang mana peridinin

mengikat 4 molekul klorofil, sedangkan PCP monomer merupakan PCP dengan

rantai pendek, molekul PCP hanya mengikat satu molekul klorofil. Kosentrasi PCP

yang terdapat pada supernatant hasil isolasi adalah sebesar 27 mg/ml.

Analisa HA, Reaksi positif terjadi pada sumua pengenceran 1/2 , 1/4, 1/8,

1/16, 1/32 dan 1/64. Hal ini terjadi karena terjadinya aglutinasi pada sel darah ikan

kerapu tikus. Apabila aglutinasi terjadi sampai lubang ke 6 maka nilai titer HA sama

dengan 26 atau sama dengan 64 (uji HA tinggi). Aglutinasi terjadi kerena PCP akan

berikatan dengan eritrosit (sel darah merah), menyebabkan pembentukan suatu kisi

yang disebut hemaglutinasi yang merupakan dasar untuk menentukan konsentrasi

PCP sampel, bereaksi atau tidak bereaksi yang diperankan oleh protein Hemaglutin

(HA) sebagai molekul glikoprotein.

8

KATA PENGANTAR

Puji beserta syukur penulis ucapkan kepada Allah Subhanahu Wata’ala atas

segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga Laporan Skripsi yang berjudul “Identifikasi

Protein Peridinin Klorofil Protein ( PCP ) pada Makroalga Laut Halimeda sp dengan

Metode Elektroforesis Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel (SDS-PAGE) dan

Hemaglutinasi (HA)”, sebagai bagian dari payung riset DIKTI dengan Program

Penelitian Unggulan Hibah Pasca Sarjana thun 2012 dengan surat perjanjian No.

0636/023-04.2.16/15/2012 dan Program Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi

Utama (U)-BOPTN, melalui Dipa Universitas Brawijaya Nomor : Dipa-

023.04.2.414989/2013, Tanggal 5 Desember 2012, dapat terselesaikan dengan

baik. Sholawat beserta salam penulis doakan kepada kepada Allah, agar berkenan

menyampaikannya kepada Baginda Rasulullah Muhammad SAW yang telah

menjadi suri tauladan sampai akhir zaman.

Penulis menyadari bahwa laporan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan.

Oleh karena itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi

kesempurnaan laporan ini. Semoga laporan ini dapat memberikan informasi dan

bermanfaat bagi penulis dan semua pihak.

Malang, Agustus 2013

Penulis

9

DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. i

PERNYATAAN ORISINILITAS ......................................................................... ii

UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................................. iii

RINGKASAN ..................................................................................................... iv

KATA PENGANTAR ......................................................................................... vi

DAFTAR ISI ...................................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiii

BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................... 3

1.3 Tujuan ..................................................................................................... 3

1.4 Kegunaan ................................................................................................ 3

1.4.1 Kegunaan Teoritis ......................................................................... 3

1.4.1 Kegunaan Praktis .......................................................................... 4

1.5 Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................. 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 5

2.1 Makroalga ............................................................................................... 5

2.2 Halimeda sp ............................................................................................ 7

2.2.1 Klasifikasi dan Morfologi ................................................................ 7

2.2.2 Habitat Halimeda sp ...................................................................... 9

2.2.3 Zat Aktif Halimeda sp .................................................................... 9

2.3 Protein Halimeda sp ................................................................................ 11

2.4 Peridinin Chlorophyll Protein (PCP) ......................................................... 14

2.5 Faktor-Faktor Parameter Kualitas Air Makroalga Halimeda sp ................ 16

2.5.1 Suhu .............................................................................................. 16

2.5.2 Salinitas ......................................................................................... 17

2.5.3 Arus ............................................................................................... 17

10

2.5.4 Kekeruhan ..................................................................................... 18

2.5.5 Nitrat (NO3) ................................................................................... 18

2.5.6 Fosfat (PO4) .................................................................................. 19

2.6 Elektroforesis .......................................................................................... 19

2.7 Matriks Penyangga .................................................................................. 20

2.8 Metode SDS PAGE ................................................................................ 21

2.9 Molekul Adhesi ........................................................................................ 26

2.10 Hemaglutinasi (HA) .............................................................................. 27

BAB III. MATERI DAN METODE PENELITIAN................................................. 29

3.1 Materi ...................................................................................................... 29

3.2 Alat dan Bahan ........................................................................................ 29

3.2.1 Alat ................................................................................................ 29

3.2.2 Bahan ............................................................................................ 29

3.3 Metode Pengambilan Data ...................................................................... 30

3.4 Teknik Pengambilan Data ....................................................................... 30

3.5 Metode Penelitian.................................................................................... 31

3.6 Prosedur Penelitian ................................................................................. 33

3.6.1 Pembuatan Solid Amunium Sulfat ................................................. 33

3.6.2 Pembuatan Tris-HCL pH 8 ............................................................ 33

3.6.3 Pembuatan Glysin + KCL pH 7,5 ................................................... 33

3.6.4 Pembuatan Larutan NaCl 0,5 M .................................................... 33

3.6.5 Isolasi Protein Makroalga Laut Halimeda sp .................................. 34

3.6.6 Prosedur Dialisa ............................................................................ 35

3.6.7 Elektroforesis Protein dan Sodium Dodesil Poliakrilamida (SDS PAGE)

36

3.6.8 Uji Hemaglutinasi (HA) ................................................................. 40

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 42

4.1 Isolasi Halimeda sp ................................................................................. 42

4.2 Elektroforesis Sodium Dodesil Poliakrilamida Gel (SDS PAGE) .............. 44

4.3 Peridinin Chloropyll Protein (PCP) ........................................................... 45

4.4 Pengukuran Kosentrasi PCP (Peridinin Klorofil Protein) dengan

Spektrofotometri ..................................................................................... 51

11

4.5 Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Crude Peridinin Klorofil Protein (PCP) Halimeda

sp ........................................................................................................... 53

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 56

5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 56

5.2 Saran ...................................................................................................... 56

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 57

Lampiran 1. KOmposisi Pembuatan SDS-PAGE ........................................... 61

Lampiran 2. Komposisi Pembuatan Elektroforesis Gel 12 % ....................... 63

Lampiran 3. Perhitungan Konsentrasi PCP ................................................... 64

Lampiran 4. Prosedur Pembuatan Amunium Sulfat ...................................... 65

Lampiran 5. Prosedur Pembuatan Tris-HCL pH 8 ......................................... 66

Lampiran 6. Prosedur Pembuatan Glysin + KCL ........................................... 67

Lampiran 7. Prosedur Pembuatan NaCL 0,5 M .............................................. 68

Lampiran 8. Dokumentasi ............................................................................... 69

12

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Morfologi Halimeda sp .............................................................................. 8

2. Struktur PCP ............................................................................................. 15

3. Sampel Halimeda sp ................................................................................ 40

4. Supernatan dan Hasil Dialisa .................................................................... 41

5. Persamaan linear kurva standar marker ................................................... 45

6. Hasil Elektroforesis marker standar Low Range Marker PRO-STAINTM

(Fermentas) dan pita-pita hasil Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE).................................................................... 47

7. Kurva Standar Bovin Serum Albumin (BSA) ............................................. 50

8. Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Crude peridinin klorofil protein (PCP) Halimeda

sp terhadap Sel Darah Merah Ikan Kerapu Tikus ...................................... 52

9. Halimeda sp yang akan diisolasi ............................................................... 72

10. Penimbangan Halimeda sp ....................................................................... 72

11. Halimeda sp yang digunting ...................................................................... 72

12. Pemberian nitrogen cair ............................................................................ 72

13. Penggerusan Halimeda sp ........................................................................ 72

14. Hasil gerusan Halimeda sp ....................................................................... 72

15. Pemindahan hasil gerusan kedalam ependoft ........................................... 73

16. Sentrifus dingin 18.000 rpm, 40c, selama 60 menit ................................... 73

17. Supernatan hasil sentrifus ......................................................................... 73

18. Dialisa supernatant hasil isolasi ................................................................ 73

19. Gel hasil elektroforesis SDS PAGE ........................................................... 73

20. Pewarnaan dengan commasie blue .......................................................... 73

21. Timbangan Digital ..................................................................................... 74

22. Mortar ....................................................................................................... 74

23. Sentrifus dingin ......................................................................................... 74

24. Tubbing dan Kantong dialisa ..................................................................... 74

25. Spektrofotometer ...................................................................................... 74

26. Alat untuk SDS PAGE ............................................................................... 74

13

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Komposisi gel SDS-PAGE ........................................................................... 31

2. Komposisi pembuatan Stacking gel 3 % ..................................................... 37

3. Komposisi pembuatan larutan staining ........................................................ 38

4. Komposisi pembuatan larutan destaining 1 L .............................................. 39

5. Hasil analisis regresi linear marker .............................................................. 46

6. Jarak tracking dan BM protein yang muncul ................................................ 48

7. Kosentrasi PCP Halimeda sp dengan spektrofotometer .............................. 53

8. Hasil uji hemaglutinasi (HA) PCP Halimeda sp terhadap sel darah merah ikan

kerapu tikus ................................................................................................. 54

14

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Bahan Pembuatan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel

Elektrophoresis (SDS-PAGE) ...................................................................... 64

2. Pembuatan Elektroforesis Gel 12.5% .......................................................... 66

3. Perhitungan kosentrasi PCP yang terdapat di dalam supernatan ................ 67

4. Pembuatan solid amunium sulfat (Metode Yanuhar, 2013) ......................... 68

5. Pembuatan Tris-HCL pH (Metode Yanuhar, 2013) ...................................... 69

6. Pembuatan Glysin + KCL (Metode Yanuhar, 2013) ..................................... 70

7. Pembuatan larutan NaCL 0,5 M (Metode Yanuhar, 2013) .......................... 71

8. Dokumentasi Kegiatan Tim Peneliti Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-

BOPTN 2013 ............................................................................................... 72

15

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara maritim yang mempunyai prospek yang cukup

cerah untuk mengembangkan dan memberdayakan sumberdaya hayati kelautannya.

Salah satu sumberdaya hayati di Indonesia yang belum termanfaatkan secara

optimal adalah makroalga laut. Makroalga laut banyak mengandung senyawa

bioaktif yang dapat digunakan sebagai obat. Halimeda sp merupakan salah satu

sumber daya perairan yang masih belum termanfaatkan di Indonesia, sementara

keberadaannya di Indonesia sangat melimpah, khususnya di daerah timur

Indonesia.

Halimeda secara kimiawi mampu menghasilkan diterpenoid metabolites

halimedatrial dan halimeda tetra acetate pada konsentrasi yang bermacam-macam.

Metabolite ini telah diteliti untuk berperanan dalam bahan kimia pertahanan melawan

terhadap pemakan tumbuhan berdasar pada bahan kimia struktur mereka dan

aktivitas biologi. Halimedatrial lebih efektif dibandingkan halimedatetraasetat dalam

sistem pertahanan ganggang laut untuk mengusir musuh-musuh alaminya (Valerie

J. Paul and Kathryn L. Van Alstyne., 1999).

Halimeda sp juga diduga mengandung Peridinin Chlorofil Protein (PCP) yang

dapat dimanfaatkan sebagai upaya pengembangan dan pengendalian penyakit virus

pada ikan berbasis bahan hayati. PCP yang terdapat pada Halimeda sp selama ini

belum banyak terekplorasi, sehingga informasi terhadap kandungan PCP yang

terdapat didalam Halmeda sp yang tersedia hanya sedikit. PCP merupakan

16

komponen penangkap cahaya yang terdapat pada klorofil, sehingga untuk

mengekplorasi PCP tersebut dibutuhkan sebuah motode isolasi.

Protein-protein atau asam nukleat dapat dipisahkan satu dari yang lain atas

dasar perbedaan muatan listrik. Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat

molekul. Elektroforesis agarosa dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat

(atau fragmennya) yang bermuatan negative sesuai dengan arus listrik. Pada

system elektroforesis tersebut, agranosa merupakan bahan media yang berfungsi

sebagai alas / medium pemisah yang diletakkan antara anoda dan catoda alat

elektroforesis. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel

Elektrophoresis) adalah teknik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis

protein di laboratorium. Sampel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur

dengan SDS (yang merupakan deterjen yang anionik) dengan akibat kompleks

protein-deterjen itu bermuatan negatif dan protein yang lebih besar mempunyai

muatan negatif yang lebih besar. Kompleks protein-deterjen itu akan dibawa oleh

medan listrik kearah kutub positif (anoda) (Biokimia FKUI, 2000).

Protein memiliki gugus-gugus yang dapat terionisasi sehingga membentuk

gugus bermuatan pada pH tertentu baik sebagai anion maupun kation sehingga

dapat dipisahkan dengan teknik elektoforesis. Protein akan bermuatan tergantung

pada pH larutan dan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik, protein tidak akan

bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Jika pH larutan di bawah pI, protein

bergerak sebagai kation dan kecepatannya naik dengan turunnya pH lalu kation ini

akan bergerak ke elektroda negatif. Jika pH larutan di atas pI, protein bergerak

sebagai anion dan kecepatannya naik dengan meningkatnya pH lalu anion ini akan

bergerak ke elektroda positif (Edelstein dan Bollag, 1991).

17

Uji Hemaglutinasi (HA) merupakan salah satu uji yang dapat digunakan

untuk mengetahui tingkat aglutinasi / pengumpalan yang terjadi antara molekul

adhesi sampel uji dengan sel eritrosit. Hal ini terjadi karena imunodeterminan

antigen yang terdapat di permukaan sel eritrosit. Uji HA merupakan dasar dari uji HI

(Hemaglutinasi Inhibisi). Menurut WHO (2009), uji HA merupakan uji diagnostik yang

paling banyak dilakukan di dunia. Klasse dan Sattentau, (2002) mengatakan bahwa,

reaksi aglutinasi ini dapat dihalangi atau dihambat dengan antibody spesifik

terhadap antigen, sehingga reaksi ini digunakan sebagai dasar pada isolasi virus

serta diferensiasi pada strain yang sering muncul. Farlisa (2010), mengatakan

bahwa, pada uji HA terdapat uji secara kualitatif dan kuantitatif. Pada uji HA kualitatif

digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya virus,eritrosit yang digunakan 5%. Pada

uji HA kuantitatif salah satu uji yang digunakan untuk mengukur titer antigen yang

selanjutnnya digunakan untuk uji HI, dengan menggunakan mikroplate 96 lubang.

1.2 Rumusan Masalah Bagaimana cara menentukan protein PCP (Peridinin-Chlorophyll a Protein)

makroalga Halimeda sp dengan menggunakan metode SDS-PAGE dan

Hemaglutinasi (HA).

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah Menentukan Protein Makroalga laut

Halimeda sp, dengan menggunakan metode Elektroforesis SDS-PAGE dan Uji

hemaglutinasi (HA).

1.4. Kegunaan 1.4.1. Kegunaan Teoritis

Diharapkan penelitian ini dapat memberikan informasi mengenai PCP

(Peridinin-Chlorophyll a Protein) dalam Halimeda sp

18

1.4.2. Kegunaan Praktis

Diharapkan penelitian ini dapat menambah wawasan mengenai Halimeda sp

dapat sebagai produsen primer perairan, sebagai pakan alami, sebagai sumber

suplemen, dan meningkatkan sistem imun pada ikan.

1.3 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2012 sampai dengan bulan

Juni 2013 yang bertempat di laboratorium Ilmu-Ilmu Perairan Fakultas Perikanan

dan Ilmu kelautan, Laboratorium Fisiologi Molekular FK, Laboratorium Biomedik FK,

Laboratorium Biosains LSIH, Universitas Brawijaya, Malang, dan BBAP Situbondo.

19

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Makroalga Makroalga digolongkan kedalam tumbuhan tingkat rendah, secara taksonomi

termasuk divisi Thallophyta yang meruoakan peralihan dari tumbuhan tingkat rendah

ke tumbuhan tingkat tinggi. Makro alga bersifat multiseluler yang dapat dilihat pada

tallus yang secara morfologi menyerupai tumbuhan tingkat tinggi seperti daun,

batang dan akar. Makroalga umumnya hidup di air baik itu air tawar maupu air laut.

Berdasarrkan bentuk pertumbuhannya makroalga digolongkan kedalam lima bentuk

yaitu fleshy algae, calcareous algae, truf algae dan crustose coralline algae

(McCook, 2001).

Menurut Atmadja & Sulistijo (1988), makroalga dapat diklasifikasikan menjadi

3 divisi berdasarkan pigmen fotosintetik dan pigmen asesoris, yaitu: chlorophyta,

phaeophyta, dan Rhodophyta.

1. Divisi chlorophyta

Makro alga divisi chlorophyta memiliki thalli berbentuk filamen, membran dan

tabung. Makroalga tersebut umumnya menempel pada substrat di dasar perairan

laut seperti karang mati, fragmen karang dan pasir. Clorophyta dapat bersifat

uniseluler atau multiseluler ( Gupta 1981).

2. Divisi phaeophyta

Makroalga divisi phaeophyta memiliki bentuk thalli lembaran, bulat atau

menyerupai batang. Thalli tersebut berwarna coklat, berbentuk filamen bercabang

dan bentuk seperti lembaran daun (Dawes, 1981).

3. Divisi Rhodophyta

20

Makroalga divisi rhodophyta memiliki thalli berbentuk silindris, pipih, dan

lembaran. Makroalga tersebut umumnya memiliki thalli berwarna merah, ungu,

pirang, cokat dan hijau (Bold & Wynne 1978: Atmadja 1996). Reproduksi seksual

Rhodophyta dilakukan dengan penyebaran spora dan gamet. Reproduksi aseksual

dilakukan dengan pembelahan sel dan fragmentasi thalli (Atmadja, 1996).

Keragaman jenis di alam dapat diketahui melalui inventarisasi dan

identifikasi. Inventarisasi meliputi pengumpulan informasi melalui suatu organisme

hidup pada habitat tertentu. Identifikasi adalah proses penamaan suatu organisme (

Jeffries, 1997). Alga laut banyak mengandung senyawa kimia dan umumnya

menghasilkan senyawa Hidrokoloid sebagai produk metabolisme primer. Disamping

itu alga laut juga mengandung metabolism sekunder yang mempunyai protein untuk

dimanfaatkan sebagai obat karena banyak senyawa bioaktifnya (Amalia, 2000).

Makroalga tercatat sebagai salah satu biota laut yang memiliki tingkat

keanekaragaman yang cukup tinggi dibandingkan dengan biota laut lainnya.

Berbagai penelitian telah dilakukan untuk menghasilkan produk-produk yang dapat

digunakan untuk meningkatkan kesejahteraan hidup manusia. Salah satu

diantaranya adalah dengan cara melakukan isolasi protein makroalga. Alga laut

dapat diolah menjadi beberapa produk komersil. Ekstrak alga laut sangat luas

penggunaannya terutama sebagai bahan mentah industri dalam negeri serta ekspor

non migas. Fulcelaran, laminaran, karagenan dan agar merupakan beberapa produk

alga yang mempunyai nilai ekonomis penting baik di pasar lokal maupun

internasional (Chapman dan chapman, 1980).

21

2.2 Halimeda sp 2.2.1 Kasifikasi dan Morfologi Klasifikasi Halimeda sp menurut Bold dan Wynne (1985) sebagai berikut: Kingdom : Plantae

Divisio : Chlorophyta

Class : Chlorophyceae

Ordo : Caulerpales

Family : Udoteaceae

Genus : Halimeda

Jenis : Halimeda sp

Sisa kapur yang terakumulasi dari Halimeda sp menetap secara khusus

untuk membantu pertumbuhan bertahap pada terumbu karang. Bukti dari pendapat

ini datang dari studi penggalian dari karang atoll Funafuti, yang memperlihatkan

bahwa 20 m pertama dari sedimen terdiri dari 80-95% segmen-segmen Halimeda sp

yang dikenali (Bold dan Wynne, 1985). Halimeda menghasilkan kerak kapur

(CaCO), karenanya dapat memberi sumbangan yang sangat berarti di daerah tropic.

Sendi-sendi dari jenis Halimeda ini tidak berkapur, karena lentur dan alga ini dapat

bergerak-gerak dalam air jika air bergerak (Romimohtarto, 2001).

Halimeda adalah rumput laut yang termasuk kedalam ordo Bryopsidales, klas

Chlorophyta. Halimeda merupakan genus calcified coenocytic green algae.

Kelompok algae jenis ini dikenal mempunyai nilai penting secara ekologis di daerah

perairan tropis. (Bandeira-Pedrosa et al., 2004), dan mempunyai aktivitas anti

bakteri (Mtolera & Semesi, 1996), anti jamur (Dzeha et al., 2003), dan juga kaya

akan antioksidan (Yoshie et al., 2002).

22

H. macroloba yang ditemukan memiliki basal segment dengan panjang 15

mm dan lebar 18 mm. Holdfast H. Macroloba menyerupai bentuk ubi. Hal tersebut

sesuai dengan pernyataan Kadi (1996:31), bahwa H. Macroloba memilki segment

utama berbentuk subcuneate hingga reniforn. Thalli memiliki basal segment dengan

lebar 20 mm dan panjang 15 m. Holdfast berbentuk seperti ubi dengan diameter 10

mm dan panjang 20 mm. H. Opuntia memiliki bentuk segment seperti trisula dan

tidak memiliki basal segment. Holdfast terdiri dari kumpulan massa akar serabut

yang berfungsi untuk menempel pada substrat. H. Incrassata memiliki segment

dengan panjang 6 mm dan lebar 2 mm. Thalli terdiri dari segment berbentuk selinder

atau prisma dangan percabanganutama dikotom. Basal segment berukuran panjang

10 mm dan lebar 18 mm. Morfologi Halimeda seperti gambar 1.

Gambar 1. Morfologi Halimeda sp (sumber: Kirby Adams.) H. opuntia yang ditemukan memiliki thalli dengan segment berukuran lebih

kecil dari pada H. Macroloba. Menurut Kadi (1996:37), H. Opuntia memiliki bentuk

segment seperti trisula dan tidak memiliki basal segment. Holdfast terdiri dari

kumpulan massa akar serabut yang berfungsi untuk menempel pada substrat. H.

incrassata memiliki segment dengan panjang 6 mm dan lebar 2 mm. Thalli terdiri

23

dari segment berbentuk silinder atau prisma dengan percabangan utama dikotom.

Basal segment berukuran panjang 10 mm dan lebar 18 mm (Morton, 1990 dalam

Kadi, 1996)

2.2.2 Habitat Halimeda sp Genus Halimeda dicirikan dengan karekteristik talus coenocytic, genus ini

berkembang biak di terumbu karang bersubstrat keras. Talus Halimeda banyak

mengandung kapur dan membentuk koloni-koloni atau berkelompok dan mempunyai

alat perekat berupa rhizoid dan bersegmen (Barton, 1901). Menurut Tampubolon

dkk, (2013), pada umumnya Halimeda mempunyai bentuk percabangan yang hampir

sama yaitu dichotomous dan Trichotomous, bentuksegmen yang silindris dan garis

permukaan utrikel yang hampir sama yaitu heksagonal dan polygonal.

Halimeda terdiri dari tersegmentasi, kalsifikasi thalli dan melimpah di sekitar

terumbu karang dan laguna seluruh daerah tropis dan subtropis sampai kedalaman

lebih dari 150 m (Hillis & Colinvaux, 1980). Dalam beberapa tahun terakhir,

khususnya makroalga memilki komponen yang dominan di banyak terumbu karang

di wilayah tropis lautan Indo-Pasifik termasuk perairan thailand, melalui peningkatan

tutupan, biomassa dan kelimpahannya. Peningkatan tutupan halimeda itu telah

didokumentasikan dari banyak terumbu karang seperti yang di Jamaika (Lapointe

dan Thacker, 2002).

Menurut Atmadja (1986) dan Morton (1990), Halimeda memiliki penyebaran

yang luas di seluruh daerah tropis dan umumnya mendominasi daerah bersubtrat

pasir yang mengalami sedimentasi. Halimeda yang di temukan terdiri dari 3 jenis,

yaitu H. Macroba, H. Opuntia, dan H. Incrassata.

24

2.3.3 Zat Aktif Halimeda sp

Halimeda adalah tumbuhan laut yang memiliki hijau daun dan merupakan

salah satu jenis dari golongan alga hijau. Halimeda memiliki kemampuan untuk

menghasilkan zat bioktif untuk antifouling. Zat aktif yang dihasilkan untuk biofouling

tersebut dikenal sebagai halimedatrial dan halimeda tetra asetat. Halimedatrial

adalah diterpenoid yang belum pernah terjadi trialdehyde, dikenal sebagai

metabolite sekunder yang utama dalam enam jenis ganggang yang mengandung zat

kapur. Di laboratorium bioassays, halimedatrial mememiliki sifat toksik dan beracun

ke arah batu karang, ikan, dan mempunyai cytotoxic dan antimicrobial. Halimedatrial

yang disekresikan keluar dapat menghadirkan suatu proses metabolisme tertentu

yang menjadi sistem pertahanan pada berbagai jenis ganggang laut terhadap musuh

alaminya (Valerie J Paul dan William Fenical, 1983).

Kemampuan Halimeda sp. Memodulasi sistem pertahanan non spesifik pada

ikan dan udang diantaranya dimungkinkan selain oleh adanya senyawa spesifik

imunostimulant, juga oleh kandungan senyawa poliphenol yang mempunyai aktivitas

antioksidan tinggi. Hal ini dibuktikan secara in vitro dan in vivo oleh penelitian Rivero

et al., (2003). Hasil penelitian Yoshie et al., (2002) menunjukan bahwa Halimeda

mengandung epigallocatechin (sejenis antioksidan) dalam jumlah yang sangat tinggi

yaitu 28 μg/g berat kering. Selain itu Halimeda juga kaya akan mineral seperti Fe,

Mn, Zn dan Cu. Menurut Bendich (1993) mineral merupakan komponen penting dari

enzim-enzim antioksidant. Mineral Zn, Cu dan Mn merupakan mineral esensial untuk

aktivitas superoksida dismutase.

Halimeda secara kimiawi mampu menghasilkan diterpenoid metabolites

halimedatrial dan halimeda tetra acetate pada konsentrasi yang bermacam-macam.

25

Metabolite ini telah diteliti untuk berperanan dalam bahan kimia pertahanan melawan

terhadap pemakan tumbuhan berdasar pada bahan kimia struktur mereka dan

aktivitas biologi. Halimedatrial lebih efektif dibandingkan halimedatetraasetat dalam

sistem pertahanan ganggang laut untuk mengusir musuh-musuh alaminya

(Valerie J. Paul and Kathryn L. Van Alstyne., 1999). Romimohtarto, (2001) juga

mengatakan bahwa manfaat dari Halimeda macroloba adalah memiliki kemampuan

untuk menghasilkan zat bioaktif untuk antifouling. Zat aktif yang dihasilkan untuk

biofouling tersebut dikenal dengan halimedatrial atau halimeda tetra asetat.

Halimeda trial adalah diterpenoid yang belum pernah terjadi tryale dehide, dikenal

sebagai metabolit sekunder yang utama dalam enam jenis ganggang yang

mengandung zat kapur halimeda. Di laboratorium bioassays, halimedatrial memiliki

sifat toksik dan beracun ke arah batu karang , ikan, dan mempunyai cytotoxix dan

antimicrobial. Halimedatrial yang disekresikan keluar dapat menghadirkan suatu

proses metabolisme tertentu yang menjadi sistem pertahanan pada berbagai jenis

ganggang blaut terhadap musuh alaminya.

2.3 Protein Halimeda sp

Protein adalah senyawa organik yang kompleks dan berbobot molekul tinggi

yang sangat penting dalam sel makhluk hidup. Kata protein berasal dari bahasa

Yunani protos yang artinya “yang paling utama”. Protein pertama kali ditemukan

pada 1838 oleh Jons Jakob Berzelius. Protein dalam sel makhluk hidup membawa

cetak biru makhluk tersebut yang diberi nama RNA dan DNA. Protein sangat penting

bagi pertumbuhan sel-sel manusia, seperti yang kita ketahui, sel-sel dalam tubuh

kita memiliki masa hidup yang tidak sama satu sama lain. Setiap interval waktu

tertentu, ada pergantian sel, dimana yang lama akan dibuang dan diganti dengan

26

yang baru. Protein berperan dalam hal ini. Selain regenerasi, protein juga berperan

dalam recovery atau perbaikan sel (WW.RidwanAZ.com.2012).

Protein di dalam tubuh dapat berupa cadangan makanan, zat

pembangun dan zat pengatur (enzim, antibodi, dan lain-lain). Protein

merupakan polimer biologis yang mengekspresikan fungsi dari suatu sel. Protein

tersusun dari suatu monomer yang disebut dengan asam amino. Asam amino ini

akan saling berikatan membentuk suatu rantai polipeptida, di mana rantai polipeptida

ini nantinya akan menyusun protein sehingga protein terlihat seperti memiliki bentuk

3 dimensi. Struktur molekul protein sangat beragam, tetapi pada dasarnya protein

merupakan polimer dari 20 asam amino.Polimer asam amino disebut

polipeptida.Suatu protein terdiri dari satu atau lebih polipeptida yang terlipat dan

terbelit membentuk suatu kesesuaian yang spesifik dengan fungsinya.Bentuk tiga

dimensi atau konformasi protein ditentukan oleh urutan asam amino pada suatu

polipeptida penyusun protein tersebut (Clark dan Russel 2005 dalam Rizki 2008).

Martini (2006), asam amino mempunyai dua komponen utama, yaitu asam organic(-

COOH) dan gugus amino (-NH2).

Yuwono (2005) menjelaskan, fungsi dari protein adalah sebagai berikut:

1) Sebagai katalisator reaksi-reaksi biokimia dalam sel.

Peranan ini dimainkan oleh oleh molekul protein khusus yaitu enzim. Reaksi-

reaksi sederhana, misalnya hidrasi karbon dioksida, sampai reaksi kompleks,

misalnya replikasi kromosom.

2) Sebagai pengangkut molekul-molekul kecil dan ion.

Telah diketahui bahwa molekul-molekul berukuran kecil, misalnya oksigen,

diangkut di dalam jaringan tubuh jasad multiseluler oleh protein hemoglobin

atau oleh myoglobin.

27

3) Berperan di dalam sistem pergerakan yang terkoordinasi

Misalnya dalam kontraksi otot, pergerakan kromosom menuju kutub-kutub

sel selama proses mitosis, maupun pergerakan flagela bakteri.

4) Sebagai komponen sistem kekebalan tubuh.

Sistem kekebalan tubuh ditentukan oleh adanya antibodi yang merupakan

protein dengan fungsi sangat spesifik. Antibodi akan disintesis jika ada

senyawa atau benda-benda asing masuk kedalam tubuh. Antibodi berfungsi

untuk mengenali benda-benda asing (antigen), misalnya sel bakteri, virus

atau sel-sel jasad hidup lain.

5) Sebagai feromon

Jasad eukaryot tingkat rendah, misalnya khamir Saccharomyces cerevisiae,

menghasilkan molekul berukuran kecil yang disekresikan ke luar sel. Khamir

haploid S. Cerevisiae terdiri atas dua macam tipe mating yaitu tipe a dan tipe

α. Kedua macam tipe sel khamir tersebut menghasilkan feromon berbeda

yang digunakan untuk “menarik “ sel tipe mating yang berbeda sehingga

akan terjadi konjugasi. Feromon yang berfungsi di dalam proses

“perkawinan” antara dua sel khamir yang berbeda tipenya tersebut tidak lain

juga berupa molekul protein.

6) Sebagai pengatur ekspresi genetik

proses replikasi DNA, transkripsi, dan translasi yang berlangsung di dalam

sel merupakan proses seluler yang sangat kompleks dan diatur oleh

bermacam-macam protein, baik yang berupa protein sebagai katalisator

reaksi (enzim) maupun protein regulator. Ekspresi genetik, pada dasarnya

menentukan semua aktivitas biologis jasad hidup. Pada jasad renik,

misalnya, hal ini akan menentukan apakah suatu substrat dapat

28

dimetabolisme. Pada jasad tingkat tinggi, ekspresi genetik juga akan

menentukan proses diferensiasi. Oleh karena itu peranan protein dalam

metabolisme jasad hidup sangat besar dan vital.

7) Sebagai penerus impuls syaraf

Protein reseptor, misalnya rhodopsin, merupakan contoh protein yang

berperan meneruskan stimulus terutama ke sel saraf.

8) Sebagai komponen pendukung kekuatan-regang (tensile strength) pada kulit

dan tulang, misalnya kolagen.

Beberapa teknik analisis protein membutuhkan prosedur isolasi, yaitu

memisahkan protein dari makromolekul yang lain atau memsahkan protein dengan

sifat tertentu dari protein lain yang tidak diinginkan dalam analis. Suatu teknik isolasi

dan identifikasi protein harus mempertimbangkan sifat-sifat fisik, kimiawi dan

kelistrikan suatu protein sedemikian rupa sehingga konformasi dan aktifitasnya tidak

berubah. Pada awal isolasi, biasanya digunakan metode yang memiliki daya

pemisah terendah, seperti pengendapan dengan amunium sulfat. Pengendapan ini

dipengaruhi oleg berbagai faktor, antara lain jumlah dan posisi gugus polar, berat

molekul, pH, dan suhu larutan (Fatchiyah dkk, 2011)

2.4 Peridinin Chlorophyll-Protein (PCP)

Peridinin adalah suatu pigmen yang terkait dengan klorofil dan ditemukan dalam

peridinin-klorofil-protein (PCP) yang kompleks cahaya-panen di dinoflagellata. PCP

kompleks adalah unik dalam rasio yang tinggi dari peridinin ke klorofil, sebagian

cahaya-panen kompleks mengandung klorofil lebih dari karotenoid, tetapi PCP berisi

delapan peridinin dan dua molekul klorofil, diatur untuk mempromosikan peridinin-

klorofil transfer energi.. Kompleks PCP adalah protein trimer dengan solenoida

alphakali lipat protein(Hofmann, 1996).

29

PCP homodimer atau terdiri dari satu chloroplas dan empat karetenoid

berukuran 16 Kda, sedangkan PCP compleks memiliki ukuran 36 Kda (Hoftman,

1999). Dengan menggunakan X-ray Crytallography (2 A) diketahui bahwa selain

terdiri Dari pigmen yaitu chlorofil dan karetenoid (peridinin), terdapat ikatan dengan

air , lemak dalam bentuk digalactocyl diasil glyserol (DGDG), DGDG berikatan

sangat kuat dengan chlorofil sebelum bentuk PCP komplek terbentuk, DGDG ini

sering sekali ditemukan dimembran tilakoid. Protein juga ikut dalam ikatan komplek

ini, beberapa jenis asam amino terikat dalam PCP complek. PCP merupakan media

kompleks penangkap cahaya yang berperan sebagai antena dalam proses

fotosintesis, fungsinya adalah menangkap dan mengumpulkan cahaya matahari

selama proses penyinaran. Peridinin mampu menangkap pigmen warna biru dan

hijau dari energi cahaya matahari pada panjang gelombang antara 470-550 nm

(Hofmann et al., 1996). Struktur PCP seperti Gambar 2.

A B

Gambar 2. Struktur PCP Keterangan : A. PCP komplek terdapat ikatan klorofil (chl), karetenoid/peridinin (per),

protein (leusin dan histidin), lipid dan air (wat). B. PCP sederhana satu klorofil diikat empat karetenoid (peridinin).

(sumber: Hofmann, 1996).

30

Peranan terpenting peridinin dalam proses fisiologis adalah sebagai zat

antioksidan, yakni merupakan senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya

radikal bebas. Dalam tumbuhan dan alga, peridinin memegang peranan penting di

pusat reaksi photosynthesis dan juga terlibat dalam proses transfer energy. Peridinin

efisien menangkal radikal bebas dan juga meningkatkan kekebalan tubuh vertebrata.

Konsumsi komponen peridinin yang sudah berasosiasi mampu mengurangi resiko

kanker (Hirschberg et al, 1997).

Peridinin-klorofil-protein kompleks disediakan untuk digunakan sebagai label

neon dan sangat berguna dalam tes diagnostik sebagai reagen yang

mempekerjakan senyawa neon konjugasi anggota dari sepasang ikatan spesifik,

dimana pasangan terdiri dari ligan biokimia dan reseptor dan uji diagnostik terdiri

dari langkah yang konjugat mengikat anggotanya pelengkap mengikat-pasangan.

Penemuan ini berhubungan dengan fluorophores digunakan sebagai label pada

molekul lain, biasanya untuk tujuan mendeteksi adanya interaksi antara molekul

yang fluorophore yang terkonjugasi dan molekul lain, permukaan sel, atau

sejenisnya dalam sampel (Recktenwald, 1989).

Dinoflagellata laut, Glenodinium sp. dan Gonyaulax polyedra mengandung

sebuah Peridinin-Chlorophyll Protein kompleks, pigmen yang bertindak sebagai

pemanen cahaya yang digunakan untuk photosynthesis. Kompleks pigmen tersebut

untuk Glenodinium sp. dan Gonyaulax polyedra masing-masing memiliki berat

molekul 35,5 kDa dan 34,5 kDa. Sedangkan Amphidinium carterae mempunyai

Peridinin-Chlorophyll Protein dengan berat molekul 39,2 kDa , tetapi apoproteinnya

31,8 kDa dengan mengikat sembilan peridinin dan dua klorofil dalam satu molekul

(Song et.al., 1976).

31

Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP), sebuah kompleks pemanen cahaya

yang larut dalam air yang memiliki karotenoid hijau-biru sebagai pigmen utama. Dari

pengamatan X-ray beresolusi tinggi, memperlihatkan struktur trimer non-kristalografi

dimana masing-masing polipeptida mengandung domain α-helix amino terminal (N-

terminal) dan karboksil terminal (C-terminal). Varian dari PCP dengan apoprotein

adalah sekitar 16 kDa sebagai homodimer. Padahal bentuk apoprotein sekitar 32

kDa. Hal ini dapat terjadi duplikasi fusi dari gen kuno PCP (Hofmann et.al., 2004).

2.5 Faktor-Faktor Parameter Kualitas Air Makroalga Halimeda sp 2.5.1 Suhu

Pengaruh suhu terhadap sifat fisiologi organisme perairan merupakan salah

satu faktor yang mempengaruhi fotosintesis disamping cahaya dan konsentrasi

fosfat (Odum,1993). Perbedaan suhu terjadi karena adanya perbedaan energi

matahari yang diterima oleh perairan. Suhu akan naik dengan meningkatkan

kecepatan fotosintesis sampai pada radiasi tertentu. Kecepatan fotosintesis akan

konstan pada produksi maksimal, tidak tergantung pada energi matahari lagi

sampai pada reaksi mengenzim (Nontji, 2002). Rumput laut hidup dan tumbuh pada

perairan dengan kisaran suhu air antara 20–280C, namun masih ditemukan tumbuh

pada suhu 310C (Direktorat Jenderal perikanan, 1990).

2.5.2 Salinitas

Salinitas merupakan parameter penunjuk jumlah padatan total yang terlarut

dalam air, setelah semua karbonat dikonversi menjadi oksida, semua bromida dan

iodida digantikan olek klorida dan semua bahan organik telah dioksidasi. Salinitas

dinyatakan dalam satuan g/kg atau promil (0/00 ) (Effendi, 2003).

32

Makroalgae umumnya hidup di laut dengan salinitas antara 30‰–32‰.

Namun banyak jenis makroalgae mampu hidup pada kisaran salinitas yang

besar. Fucus misalnya, mampu hidup pada kisaran salinitas antara 28‰-34‰.

Salinitas berperan penting dalam kehidupan makroalgae. Salinitas yang terlalu

tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan gangguan pada proses fisiologis

(Luning, 1990).

2.5.3. Arus

Rumput laut merupakan organisme yang memperoleh makanan melalui

aliran air yang melewatinya. Gerakan air yang cukup akan menghindari

terkumpulnya kotoran pada thallus, membatu pengundaraan, dan mencengah

adanya fluktuasi yang besar terhadap salinitas maupun suhu air (Ditjenkanbud,

2004). Arus dapat terjadi karena pasang dan angin. Arus pasang lebih mudah

diramal dibanding dengan arus karena angin. Arus tidak terlalu banyak

menyebabkan kerusakan pada tanaman dibandingkan dengan ombak, kisaran

kecepatan arus yang cukup untuk pertumbuhan rumput laut antara 20–40 cm/detik

(Direktorat Jenderal perikanan, 1990). Ada tidaknya suatu jenis makroalgae di

daerah tertentu bergantung pada kemampuannya untuk beradaptasi dengan

substrat yang ada. Jadi, penyebaran lokal makroalgae di suatu daerah juga

dipengaruhi oleh kondisi substrat dan pergerakan air (arus/gelombang).

2.5.4. Kekeruhan

Kekeruhan adalah suatu ukuran biasan cahaya di dalam air yang

disebabkan oleh adanya partikel koloid dan suspensi dari suatu polutan yang

terkandung dalam air. (Lantang, 1999). Kekeruhan dalam perairan untuk budidaya

rumput laut adalah 0 gram/liter, hal ini sangat baik untuk tanaman melakukan

33

fotosintesis karena dapat mempengaruhi pertumbuhan dan mutu tanaman

(Afrianto dan lifiawati, 1995). Tetapi menurut Boyd dan Lichtkoppler (1982)

bahwa kondisi kekeruhan yang optimal bagi tanaman rumput laut adalah kurang dari

40 NTU.

2.5.5 Nitrat (NO3)

Nitrat merupakan salah satu senyawa nitrogen yang ada di perairan. Nitrat

(NO3) adalah bentuk senyawa nitrogen yang merupakan sebuah senyawa yang

stabil. Nitrat nerupakan salah satu unsure yang penting untuk sintesa protein

tumbuh-tumbuhan dan hewan. Riani (1994) menjelaskan bahwa kandungan nitrat

dalam kadar yang berbeda dibutuhkan oleh setiap jenis alga untuk keperluan

pertumbuhannya sedangkan kadar nitrat untuk mikroalga dapat tumbuh dan

optimal diperlukan kandungan nitrat 0,9-3,5 mg/l. apabila kadar nitrat dibawah 0,1

atau diatas 4,5 mg/l, merupakan faktor pembatas. Kandungan nitrat yang

menggambarkan kondisi perairan yang baik untuk pertumbuhan makroalga yaitu

0,09 sampai 3,5 ppm (Moss, 1986 dalam Putinella, 2001). Menurut Keputusan

Mentri Negara Lingkungan Hidup No.51 Tahun 2004 Menyebutkan bahwa

kandungan nitrat untuk biota laut adalah 0,008mg/l (Kementrian Lingkungan Hidup,

2004).

Kisaran nitrat terendah untuk pertumbuahan alga adalah 0,3-0,9 mg/l

sedangkan untuk pertumbuhan optimal adalah 0,9-3,5 mg/l (Sulistijo,1996).

Menurut Boyd dan Lichtkoppler (1982) batas toleransi nitrat terendah untuk

pertumbuhan alga adalah 0,1 ppm sedangkan batas tertingginya adalah 3

ppm. Apabila kadar nitrat dibawah 0,1 atau di atas 3 ppm maka nitrat

merupakan faktor pembatas.

34

2.5.6 Fosfat (PO4) Fosfat (PO4) merupakan salah satu unsur yang diperlukan dan mempunyai

pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangan hidup organisme di laut

(Nybakken, 1992). Sumber alami fosfor di perairan adalah pelapukan batuau

mineral. Selain itu, fosfor juga berasal dari dekomposisi bahan organik. Sumber

antropogenik fosfor adalah limbah industry dan domestik, yakni fosfor yang berasal

dari deterjen. Keberadaan fosfor secara berlebihan yang disertai dengan

keberadaan nitrogen dapat menstimulir pertumbuhan alga di perairan (Belliveau dan

Paul, 2002).

Fosfat (PO4) dapat menjadi faktor pembatas baik secara temporal

maupun spasial karena sumber Fosfat yang lebih sedikit di perairan. Kisaran

fosfat yang optimal untuk pertumbuhan rumput laut adalah 0,051-1,00 ppm

(Indriani dan Sumiarsih, 1999).

2.6 Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan fraksi-fraksi zat berdasarkan migrasi

partikel bermuatan di bawah pengaruh medan listrik karena adanya perbedaan

ukuran, bentuk, muatan, atau sifat kimia molekul. Elektroforesis dapat digunakan

untuk menentukan berat molekul protein, mendeteksi kemurnian dan kerusakan

protein, menetapkan titik isoelektrik protein, dan memisahkan spesies-spesies

molekuler yang berbeda secara kuantitatif dan kualitatif (Boyer, 1986).

Protein memiliki gugus-gugus yang dapat terionisasi sehingga membentuk

gugus bermuatan pada pH tertentu baik sebagai anion maupun kation sehingga

dapat dipisahkan dengan teknik elektoforesis. Protein akan bermuatan tergantung

pada pH larutan dan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik, protein tidak akan

35

bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Jika pH larutan di bawah pI, protein

bergerak sebagai kation dan kecepatannya naik dengan turunnya pH lalu kation ini

akan bergerak ke elektroda negatif. Jika pH larutan di atas pI, protein bergerak

sebagai anion dan kecepatannya naik dengan meningkatnya pH lalu anion ini akan

bergerak ke elektroda positif (Edelstein dan Bollag, 1991).

Menurut Widyarti (2009), elektroforesis merupakan proses bergeraknya

molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak

pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian

elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan

asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan

pewarnaan atau autoradiografi, atau dilakukan kuantifikasi dengan debsitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel

poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk

separasi protein dan asam nukleat.

2.7 Matriks Penyangga

Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat

bermigrasinya molekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung

pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai

dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulosa asetat dan gel. Gel yang

dipakai dapat berupa pati, agarose ataupun poliakrilamid. Pada elektroforesis dalam

matriks gel poliakrilamid, protein terseparasi ketika protein bergerak melalui matriks

tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan

protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH bufer agar muatan protein tidak

berubah (Fatchiyah et al., 2011).

36

Poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan kisaran berat molekul 500

250.000 atau polinukleotida dengan kisaran 5 2000 pasang basa. Pori matriks ini

terbentuk dari ikatan silang antara akrilamid dengan cara meningkatkan persentase

total akrilamid (atau %C) dengan bisakrilamid. Gel 20% T 5%Cbis berarti bahwa

kandungan total akrilamid dan bisakrilamid sebesar 20% (w/v) dimana kandungan

bisakrilamid 5% dari total akrilamid dan bisakrilamid. Pada %T yang sama, 5%C

menghasilkan ukuran pori terkecil. Diatas dan dibawah 5%C besar pori bertambah.

Untuk mendapatkan hasil separasi protein yang diinginkan, diperlukan %T tertentu

yang sesuai. %T yang terlalu tinggi akan menghalangi bergeraknya protein,

sedangkan %T yang terlalu rendah akan menyebabakan protein kurang atau tidak

terseparasi karena protein bergerak sangat cepat pada gel (Fatchiyah et al., 2011).

2.8 Metode SDS-PAGE

Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran

protein secara kualitatif adalah SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide

Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah migrasi komponen akril

amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut berfungsi sebagai saringan

molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid dengan bisakrilamid dapat diatur

untuk mengoptimalkan kondisi migrasi komponen protein. Metode ini sering

digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk memonitor

pemurnian protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul

suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker,

2000).

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel Elektroforesis)

merupakan salah satu cara elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamida

37

yang dikombinasikan dengan SDS. Penggunaan poliakrilamida mempunyai

keunggulan dibandingkan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel

dan tidak membentuk matriks dengan sampel, sehingga tidak menghambat

pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna. Gel

poliakrilamida ini mempunyai daya pemisah yang cukup tinggi. Penggunaan SDS

berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjan yang

mengakibatkan ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi

dalam gel begitu juga mercaptoetanol (Anam, 2009).

Penggunaan SDS‐PAGE bertujuan untuk memberikan muatan negatif pada

protein yang akan dianalisa. Protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat

SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut (Dunn,1989).

Denaturasi protein dilakukan dengan merebus sampel dalam buffer yang

mengandung β‐merkaptoetanol (berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfide), gliserol

dan SDS (Wilson dan Walker,2000).

Muatan asli protein akan digantikan oleh muatan negatif dari anion yang

teikat sehingga kompleks protein‐SDS memiliki rasio muatan per berat molekul yang

konstan. (Hames, 1987). Sampel‐sampel enzim yang diinjeksikan ke dalam sumur

gel diberi warna dengan bromphenol biru yang dapat terionisasi. Fungsi pewarna

adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Berat molekul protein

dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan protein standar yang

berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).

Protein memiliki gugus-gugus yang dapat terionisasi sehingga membentuk

gugus bermuatan pada pH tertentu baik sebagai anion maupun kation sehingga

dapat dipisahkan dengan teknik elektroforesis. Protein akan bermuatan

tergantungpada pH larutan dan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik, protein tidak

38

akan bergerak di bawah pengaruh medan listrik. Jika pH larutan di bawah pI, protein

bergerak sebagai kation dan kecepatannya naik dengan meningkatnya pH lalu anion

ini akan bergerak ke elektroda positif (Edelstein dan Bollag, 1991).

Media yang digunakan untuk elektroforesis harus dapat mengurangi atau

mencegah terjadinya konveksi dan tidak bereaksi dengan sampel atau menghambat

pergerakan partikel sebagai akibat adanya ikatan antara sampel dengan matriks.

Keberhasilan pemisahan protein dengan elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa

factor antara lain buffer, suhu, waktu, dan arus listrik yang digunakan. Buffer

berfungsi untuk mempertahankan pH baik dalam chamber maupun gel serta

pembawa muatan listrik (Nur dan Adijuwana. 1988). Pada umumnya, buffer yang

digunakan bersifat sedikit alkalis dengan pH sekitar 8-9. Pada pH tersebut, sebagian

besar protein bermuatan negative dan bergerak ke kutub anoda yang biasanya

terletak pada bagian dasar gel. Hal ini mencegah kemungkinan protein untuk

bergerak ke atas dari system elektroforesis (Scopes, 1987). Elektroforesis dilakukan

pada suhu dingin (0-40C) untuk mengurangi kehilangan aktifitas protein akibat

denaturasi dan kerusakan akibat proteolysis (Edelstein dan Bollag, 1991). Kenaikan

suhu yang tinggi selama elektroforesis dapat menyebabkan pemisahan yang kurang

baik. Waktu yang diperlukan untuk elektroforesis berkaitan erat dengan dengan arus

listrik yang digunakan. Semakin tinggi arus listrik yang digunakan, maka semakin

pendek waktu yang dibutuhkan, tetapi suhu akan meningkat (Nur dan Adijuwana,

1988).

Menurut Harris dan Angal (1989), elektroforesis gel polikrilamida (PAGE)

adalah metode yang paling banyak digunakan karena memiliki kapasitas pemisahan

yang tinggi. Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan adalah SDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis). Nur dan Adijuwana

39

(1988) mengatakan, radikal-radikal bebas yang terbentuk dari amunium persulfat

(APS) akan bereaksi dengan akrilamida dimana terjadi penyimpanan radikal bebas

di dalam molekul akrilamida sehingga terbentuk akrilamida aktif. Akrilamida aktif ini

akan bereaksi dengan cara yang sama dengan akrilamida yang lain sehingga

dihasilkan suatu rantai polimer yang panjang. Gel poliakrilamida terbentuk oleh

adanya polimerasi dari monomer akrilamida dan pembentukan ikatan silang kovalen

antar rantai panjang akrilamida. Cross linking agent yang digunakan adalah N, N’ –

metilenbis-akrilamida. Kompleks APS-TEMED mengkatalisa pembentukan radikal

bebas dari persulfat yang selanjutnya berfungsi sebagai inisiator polimerasi.

Lembaran elektroforesis gel poliakrilamida terdiri atas 2 bagian, yaitu gel penahan

(stacking gel) dan gel pemisah (separating gel). Stacking gel terletak pada bagian

atas dari separating gel. Stacking gel berfungsi sebagai tempat dicetaknya sumur

untuk memasukkan sampel. Selain itu stacking gel berfungsi untuk

mengkosentrasikan sampel membentuk pita yang tajam sebelum memasuki

separating gel. Separating gel berfungsi sebagai tempat terjadinya pemisahan

protein.

Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamida adalah akrilamida, bis

akrilamida, ammonium persulfate dan TEMED (N, N, N’, N’ tetrametilendiamin).

Akrilamida sebagai senyawa utama yang menyusun gel merupakan senyawa

karsinogenik. Ammonium persulfate berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan

akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk rantai

polimer yang panjang. TEMED berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerasi

akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan

protein. Bis-akrilamida berfungsi sebagai cross-linking agent yang membentuk kisi-

kisi bersama polimer akrilamida. kisi-kisi tersebut berfungsi sebagai saringan

40

molekul protein. Perbandingan antara akrilamida dengan bis-akrilamida dapat diatur

sesuai dengan berat molekul protein yang dipisahkan. Semakin rendah berat

molekul protein yang dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang

digunakan agar kisi-kisi yang terbentuk semakin rapat.

Pergerakan kompleks SDS-protein yang berukuran besar akan mempunyai

mobilitas yang lebih kecil. Adanya gliserol dalam buffer sampel berfungsi untuk

mengikat berat jenis larutan sampel sehingga dapat masuk dengan mudah ketika

diinjeksi ke dalam sumur gel. Buffer sampel juga mengandung pewarna bromphenol

blue yang berfungsi untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis. Jika

pewarna telah mencapai bagian bawah gel, maka elektroforesis dihentikan (Wilson

dan Walker, 2000).

Sebelum dilakukan prosedur pewarnaan, terlebih dahulu dilakukan proses

fiksasi terhadap gel hasil elektroforesis. Proses fiksasi bertujuan untuk

mengendapkan dan mengimobilisasi pita-pita protein pada gel dan menghilangkan

komponen-komponen non protein yang dapat mengganggu pewarnaan seperti SDS.

Proses fiksasi dilakukan dengan menggunakan campuran methanol-asam asetat-air,

formaldehid, TCA, atau asam perklorat 5-10% (Scopes, 1987).

Pita-pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis diperjelas dengan

teknik pewarnaan. Syarat dari pewarna yang digunakan untuk staining adalah dapat

berikatan kuat dengan protein, tetapi tidak bereaksi dengan gel. Ikatan antara

pewarna dan gel adalah ikatan non kovalen sehingga mudah dilepaskan dengan

pencucian secara intensif (Scopes,1987). Proses penghilangan warna (destaining)

dilakukan dengan merndam gel dalam larutan peluntur sampai deperoleh latar

belakang yang relative jernih sehingga pita-pita protein yang dihasilkan dapat

diamati dengan jelas (Nur dan Adijuwana. 1989). Berat molekul protein dapat

41

diketahui dengan membandingkan mobilitas relative (Rf) protein dengan protein

standar yang berat molekulnya sudah diketahui. Rf protein merupakan perbandingan

jarak antara titik awal ke pita protein dengan titik awal ke titik akhir elektroforesis

(Wilson dan Walker, 2000).

2.9 Molekul Adhesi Molekul adhesi seperti Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) dan

interceluler adhesion molecule-1 (ICAM-1), adlah protein yang diekpresikan ke

permukaan sel endotel apabila fungsi endotel terganggu. Molekul adhesi merupakan

tanda-tanda awal terjadinya aterosklerosis yang disebabkan oleh meningkatnya

konsentrasi kolesterol yang beredar di pembuluh darah. Interaksi antara sel-sel dan

matrik ektraseluler sel memegang peranan penting dalam bermigrasi sel dan

teraktivasiny sel darah putih selama peradangan. Ekpresi molekul adhesi pada sel

endotel dan jaringan ekstra vascular merupakan tanda awal terjanya pathogenesis

aterosklerosis. Dalam proses radang, sel akan mengeluarkan sitokina kepermukaan

vascular sehingga akan menstimuli pembentukan molekul adhesi, protease dan

mediator lainnya yang terlarut dan dapat masuk ke sirkulasi darah (Packard & Libby,

2008:Hansson 2009). Inoue et al 2006, menyatakan bahwa molekul TNF-α secara

biologis mengaktivasi gen dari sel-sel endotel dalam mengatur berinteraksinya sel

endotel dengan leukosit, seperti VCAM-1, ICAM-1. P-selektin, factor jaringan,

sitokina radang dan kemokina.

Secara normal, sel endotel resisten terhadap adhesi leukosit. Rangsangan

awal pada peradangan, seperti diet tinggi asam lemak jenuh, hiperkolsterolemia,

abesitas, resisten insulin, hipertensi dan menstimuli molekul adhesi seperti P-

selektin, VCAM-1 dan ICAM-1 sehingga monosit dan limfosit yang ada pada

peredaran darah dapat menempel pada permukaan endotel (Packard & Libby,

42

2008). Molekul VCAM-1 dan ICAM-1 merupakan suatu bentuk protein yang muncul

pada permukaan endotel apabila terjadi rangsangan. Monosit yang melekat pada

permukaan sel endotel, berpenetrasi ke itima menjadi makrofag lalu

mengekspresikan macrophage colony stimulating factor (M-CSP). Molekul M-CSP

berfungsi merangsang terjadinya radang. Mengekspresikan reseptor scavenger

yang dapat mengenali LDL termodifikasi sihingga membentuk sel busa. Dalam

waktu bersamaan, poliferasi makrofag memperkuat respos radang dengan

mensekresikan sejumlah factor pertumbuhan dan sitokina, termasuk tumor nekrosis-

α (TNF-α) dan IL-1β (Hansson 2009;Linton & Fazio, 2003).

2.10 Hemaglutinasi Test (HA)

Uji HA digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan virus dalam

menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer virus dapat

diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end point) yang

menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-

agregat di dasar sumuran (Purchase, 1980). Uji penghambatan hemaglutinasi

ternyata sensitif kecuali untukTogavirus, sangat spesifik, karena uji itu mengukur

antibodi yang berikatan pada protein permukaan yang paling gampang mengalami

perubahan antigenik. Terlebih lagi, uji ini sederhana, murah, dan cepat. Oleh karena

itu, sering digunakan sebagai pilihan prosedur serologis dalam mengidentifikasi

isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi (Fennner, 1993).

Farlisa (2010), mengatakan bahwa, pada uji HA terdapat uji secara kualitatif

dan kuantitatif. Pada uji HA kualitatif digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya

virus,eritrosit yang digunakan 5%. Pada uji HA kuantitatif salah satu uji yang

digunakan untuk mengukur titer antigen yang selanjutnnya digunakan untuk uji HI,

dengan menggunakan mikroplate 96.

43

Uji HA merupakan suatu uji untuk mengetahui keberadaan antigen virus yang

dapat mengaglutinasi sel darah merah (WHO, 2002). Reaksi aglutinasi ini dapat

dihalangi atau dihambat dengan antibody spesifik terhadap antigen, sehingga reaksi

ini digunakan sebagai dasar pada isolasi virus serta diferensiasi pada strain yang

sering muncul (Klasse dan Sattentau, 2002). Menurut Muflihanah (2009), aglutinasi

eritrosit adalah dasar pengujian hemaglutinati (HA) dan hambatan aglutinasi dengan

menggunakan subtipe HA yang spesifik adalah merupakan dasar pengujian HI.

Prinsip pengujian hemaglutinasi inbihisi (HI) adalah antibody terhadap virus akan

mencegah pengikatan virus dengan sel darah merah. Oleh karena itu, hemaglutinasi

dihambat ketika terdapat antibody di dalam serum. Pengenceran tertinggi dari serum

yang mencegah terjadinya hemaglutinasi disebut titer HI serum.

44

BAB III MATERI DAN METODE PENELITIAN

3.1 Meteri

Materi pada penelitian skripsi ini adalah Halimeda sp. Halimeda sp diambil

crude proteinnya, kemudian dipisahkan menggunakan metode Elektroforesis SDS-

PAGE.

3.2 Alat dan bahan 3.2.1 Alat

Autoklaf, inkubator, timbangan analitik, magnetik stirrer, pipet tetes, beaker

glass, erlenmeyer, refraktometer, pH meter, DO meter, microsentrifuse 40C,

eppendorf 1,5 ml, falcon 15 ml dan 50 ml, mikropipet 2 μl, 20 μl, 200 μl dan 1000 μl,

chamber dot blot, seperangkat western blot, thermocycler, blue tip, yellow tip, white

tip, seperangkat elektroforesis vertikal (SDS-PAGE), deckglass, coverglass,

nanodrop spektrofotometer, shaker inkubator, freezer -20 dan -80 0C, tabung

nitrogen cair, refrigerator 40C, mikro plate V-bottom, spuit 1 cc ½”X26G, sarung

tangan karet (gloves), masker, aluminium foil, hot stirer plate, aquarium, heater,

seperangkat aerasi, baki/nampan.

3.2.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian skripsi ini adalah makroalga

Halimeda sp, amunium suffat 100 g, Tris HCL 3,13 g, NaOH, poliakrilamide,

Phosphate Buffer Saline (PBS), separating gel 12,5 % dan stacking gel 4 %, running

buffer, staining (commassie briliant blue) dan destaining (methanol: asam asetat

glasial: aquades 1:2:7), Ethylenediamine tetra-acetate (EDTA), nitrocelulosa

(membran selovan) dan larutan PBS, alkohol 70%, aquabidest, es batu, NaCl 0,5 M,

45

buffer ekstrak, PBS Tween, PBS skim, Sodium Chloride 29,20 gr, KCL 0,149 gr,

Glysin 0,375 gr.

3.3 Metode Pengambilan Data

Penelitian skripsi ini menggunakan metode deskriptif eksploratif. Menurut

Kotler (2006), penelitian deskriptif adalah penelitian yang tujuannya memaparkan

(mendeskripsikan) sesuatu, misalnya mengenai potensi pasar (peluang besarnya

potensi sumberdaya alam yang tersedia). Sedangkan penelitian eksploratif adalah

penelitian yang bertujuan menghimpun informasi awal yang akan membantu upaya

menetapkan masalah dan merumuskan hipotesis. Menurut Suryabrata (2009),

penelitian deskriptif itu adalah penelitian yang bermaksud untuk membuat

pencandraan (deskripsi) mengenai situasi-situasi atau kejadian-kejadian. Dalam arti

ini penelitian deskriptif itu adalah akumulasi data dasar dalam cara deskriptif

semata-mata tidak perlu mencari atau menerangkan saling hubungan, mentest

hipotesis, membuat ramalan, atau mendapatkan makna dan implikasi, walaupun

penelitian yang bertujuan untuk menemukan hal-hal tersebut dapat mencakup juga

metode-metode deskriptif

3.4 Teknik Pengambilan Data

Data primer

Data Primer adalah data yang langsung dikumpulkan oleh peneliti (atau

petugas-petugasnya dari sumber pertamannya. Prosedur yang dituntut oleh setiap

metode pengambilan data yang digunakan harus dipenuhi secara tertib. Pada

umumnya, setiap alat atau metode pengambilan data yang digunakan harus

dipenuhi secara tertib. Pada umumnya setiap alat atau metode pengambilan data

mempunyai panduan pelaksaaan. panduan ini harus sejak awal dipahami oleh

46

peneliti, dan dalam hal peneliti harus mempunyai cara untuk memperoleh keyakinan

bahwa pengambilan data itu telah dilaksananmwnurut prosedur yang seharusnya.

Data sekunder

Data sekunder adalah data yang terlebih dahulu dikumpulkan dan dilaporkan

oleh orang di luar dari penelitian itu sendiri. Data ini dapat diambil dari biro statistic,

majalah, keterangan atau publikasi yang lain (Surachmad, 1985).

Data sekunder adalah data yang diperoleh atau dikumpulkan oleh orang

yang melakukan penelitian dari sumber-sumber yang telah ada. Data ini biasanya

diperoleh dari perpustakaan atau dari laporan-laporan peneliti terdahulu. Data

sekunder disebut juga data tersedia (Hasan, 2002).

3.5 Metode Penelitian

Persiapan awal yang perlu dilakukan dalam elektroforesis adalah pembuatan

gel. Metode yang digunakan dalam pembuatan gel adalah metode Edelstein dan

Bollag (1991). Komposisi gel SDS-PAGE dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi gel SDS-PAGE

Bahan Separating gel (8%) Stacking gel (4%)

Larutan A

Larutan B

Larutan C

Akuabides

APS 10%

TEMED

2.7 ml

2.5 ml

-

4.8 ml

50 µl

5.0 µl

0.67 ml

-

1.25 ml

3.0 ml

50% µl

5.0 µl

47

Bahan untuk separating gel dicampur satu persatu dengan memasukkan

TEMED pada akhir campuran. Larutan tersebut diaduk dan dipipet perlahan ke

dalam plate kaca sampai 1.5 cm dari permukaan kaca lalu didiamkan sekitar 15-20

menit, dan dalam proses ini diusahakan agar tidak terbentuk gelembung udara.

Setelah gel memadat, campuran stacking gel dipipet perlahan ke dalam plate kaca

lalu dengan segera dimasukkan sisir (10 sumur) sebagai tempat memasukkan

sampel. Sampel yang telah dipanaskan pada 1000C selama 3 menit dicampurkan

dengan buffer sampel lalu dilakukan loading sampel ke dalam sumur sebanyak 12

μl. Berbeda halnya dengan sampel, Marker yang di-loading ke dalam sumur

sebanyak 10 μl. Sebelum running dilakukan, buffer elektroforesis dimasukkan ke

dalam chamber. Running elektroforesis dilakukan pada 100 Volt, 50 mA dalam

kondisi dingin. Waktu yang diperlukan untuk running elektroforesis sekitar 1.5 jam.

Setelah pemisahan, gel dilepas dari plate kaca lalu direndam dalam larutan fiksasi

(25% metanol + 12% asam asetat) selama 1 jam. Selanjutnya, gel tersebut

direndam dalam larutan etanol 50% selama 20 menit dan larutan etanol 30% selama

2 x 20 menit. Setelah itu, gel tersebut direndam dalam larutan enhancer (larutan

Na2S2O3.5H2O) selama 1 menit. Gel kemudian dicuci dengan akuabides selama 3 x

20 menit. Setelah dicuci dengan akuabides, gel direndam dalam larutan staining

silver nitrat (larutan AgNO3 + formaldehida 37%) selama 30 menit lalu dibilas cepat

dengan akuabides selama 2 x 20 detik. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan

destaining (larutan Na2CO3 + formaldehida 37%) sampai diperoleh pita-pita protein

yang jelas teramati dengan latar belakang relatif jernih. Reaksi dihentikan dengan

menggunakan larutan fiksasi. Berat molekul akan dapat terlihat pada cetakan gel

SDS-PAGE (Rantam, 2003).

48

3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pembuatan Solid Amunium Sulfat

Amunium sulfat1 ditimbang seberat 100 gr, kemudian dilarutkan dengan

akuades sebanyak 70 ml dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer selama 2 x 24

jam, setelah itu hasilnya disimpan di dalam refrigerator.

3.6.2 Pembuatan Tris-HCL pH 8 Tris HCL2 ditimbang sebanyak 3,13 gr dan dimasukkan dalam botol kaca

steril, kemudian ditambahkan akuades hingga mencapai 700 ml, selanjutnya adjust

pH larutan hingga 8,0. Setelah mencapai pH yang diinginkan volume larutan

ditingkatkan hingga mencapai 1000 ml dengan pembahan akuades.

3.6.3 Pembuatan Glysin + KCL pH 7,5 Glysin3 ditimbang sebanyak 0,375 gram, KCL ditimbang sebanyak 0,149.

Keduanya dimasukkan dalam botol steril dan ditambhkan dH2O hingga volume

mencapai 40/50 ml, homogenasi dilakukan dengan menggunakan stirer. pH di

Adjust hingga mencapai 7,5 melalui penambahan NaOH atau HCl. Setelah larutn

Glysin KCl mencapai pH 7,5 volume ditingkatkan hingga 100 ml dan Adjust pH 7,5.

3.6.4 Pembuatan Larutan NaCL 0,5 M NaCl4 ditimbang 58,44 gr ditambahkan 500 ml aquades, homogenasi dengan

stirer, setelah larut ditambahkan aquades 500ml sehingga volume mencapai

1000ml.

1 Lampiran 4

2 Lampiran 5

3 Lampiran 6

4 Lampiran 7

49

3.6.5 Isolasi Protein Makroalga Laut Halimeda sp Dalam metode isolasi langkah pertama yang dilakukan adalah mengeluarkan

sampel dari freezer, lalu diangin-anginkan sampai sampel mencair. Kemudian

sampel ditimbang sebanyak 40 gram. Sampel yang sudah ditimbang tersebut

dihaluskan atau dipotong menjadi bagian kecil-kecil dengan menggunakan gunting.

Kemudian sampel tersebut disiram dengan nitrogen cair, setelah sampel membeku,

langsung digerus dengan menggunakan mortal yang steril. Nitrogen cair disini

berfungsi untuk memecah dinding dinding sel, agar protein target kita bisa keluar.

PCP terdapat di dalam dinding sel, sehingga untuk mendapatkannya harus terlebih

dahulu memecahkan dinding sel tersebut dengan menggunakan nitrogen cair dan

dengan cara digerus. Proses penggerusan dilakukan selama 1 jam, kemudian

ditambahkan glysin + KCL pH 7,5 sebanyak 17 ml. Glysin + KCL juga berfungsi

untuk memecah dinding sel. Setelah penambahan glysin + KCL dilakukan lagi

penggerusan selama 1 jam lagi.

Hasil dari gerusan tersebut dimasukkan kedalam ependof dan ditimbang

seberat 2 gram, kemudian disentrifus dengan menggunakan mikrosentrifus selama

1 jam dengan kecepatan 17.000 rpm pada suhu 40 C untuk memisahkan pelet

dengan supernatannya. Supernatannya dimasukkan lagi kedalam ependof yang

steril, masing – masing 1 ml, kemudian ditambahkan SAS (sodium amunium sulfat)

yang bertujuan untuk mengikat protein. Penambahan amunium sulfat dilakukan

dengan menggunakan rumus modifikasi Yanuhar (2013):

50

SAS = 30 % x (70 % x V)

2

Ket: SAS = volume total SAS (sodium amunium sulfat) yang akan

ditambahkan

V = volume total hasil supernatan

Setelah penambahan SAS (sodium amunium sulfat), kemudian di sentrifus

lagi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 30 menit pada suhu 40 C, kemudian

dipisahkan lagi pelet dengan supernatannya.

3.6.6 Prosedur Dialisa Prosedur dialisa menurut metode modifikasi dialisa oleh Yanuhar (2013).

Kantong selofan diambil secukupnya, kemudian direbus dengan PBS + EDTA.

EDTA yang ditambahkan cukup sedikit saja (seujung pinset). Perebusan dlakukan

dalam air yang sudah mendidih selama ± 10 menit, kemudian dibilas lagi dengan

menggunakan PBS. Ujung selofan tersebut di jepit dengan menggunakan tubing dan

diikat dengan menggunakan tali kasur agar pada saat dialisa tidak lepas dan dicek

kebocorannya dengan mamasukkan sedikit PBS dan ujung selofan tersebut di

tempelkan pada tissue. Selanjutnya supernatan hasil isolasi dari protein makroalga

Halimeda Sp, dimasukkan ke dalam kantong selofan tersebut, kemudian ujungnya di

jepit lagi dengan menggunakan tubing dan diikat lagi dengan menggunakan tali

kasur. Selofan yang sudah berisi supernatan tersebut kemudian dimasukkan dalam

larutan larutan Tris HCL pH 8, dan di stirer sampai larutan berwarna keruh (2-3 hari).

Tris HCl berfungsi untuk mengikat lemak. Lemak yang berada dalam supernatan

akan tertarik keluar dari dalam kantong selofan, sedangkan proteinnya akan tetap

51

berada dalam kantong selofan. kantong selofan bersifat semipermiabel, yaitu hanya

bisa dilewati oleh zat-zat tertentu. Setelah larutan berwarna keruh, hasil dialisa

tersebut diangkat dan disaring dengan menggunakan minisart yang pori-porinya

berukuran 0,20 µm. hasil saringan tersebut didialisa lagi sampai larutan Tris HCl nya

berwarna keruh lagi. Hasil dialisa yang kedua ini kemudian dispektrofotometer

dengan panjang gelombang 550 nm untuk mengetahui kosentrasi PCP nya.

Konsentrasi PCP dihitung dengan menggunakan kurva baku.

3.6.7 Elektroforesis Protein dengan SDS-Page Menurut Fatchiyah dkk (2011), prosedur Elektroforesis5 protein dengan SDS

PAGE6 adalah sebagai berikut:

Menyiapkan sampel

1. Menambahkan sampel bufer ke dalam sampel protein (perbandingan 1 : 1) dalam

tabung Eppendorf.

2. Memanaskan sampel pada suhu 1000C selama 5 menit.

3. Setelah dingin, simpan pada suhu 200C bila sampel tidak langsung dipakai.

Menyiapkan separating gel dan stacking gel

1. Menyusun plate pembentuk gel.

2. Membuat separating gel 12,5% dengan cara sebagai berikut:

menyiapkan tabung polipropilen 50ml.

Memasukkan 3,125 ml stok akrilamida dalam tabung.

Memasukkan 2,75 ml 1M Tris pH 8,8. Tabung di tutup, lalu tabung digoyang

secara perlahan.

5Lampiran 2

6 Lampiran 3

52

Memasukkan aquabides 1,505 ml. Tabung ditutup, lalu tabung digoyang

secara perlahan.

Memasukkan 75 µl SDS 10%. Tabung ditutup, lalu digoyang cecara

perlahan.

Memasukkan 75 µl APS 10%. Tabung ditutup, lalu digotang secara perlahan.

Memasukkan 6,25 µl TEMED. Tabung ditutup, lalu digoyang secara

perlahan.

Segera tuang larutan kedalam plate pembentuk gel menggunakan mikropipet

1 ml (jaga jangan sampai terbentuk gelembung udara) sampai batas yang

terdapat pada plate.

Secara perlahan, tambahkan aquades di atas larutan gel dalam plate agar

permukaan gel tidak bergelombang.

3. Biarkan gel memadat selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan

terbentuknya garis transparan diantara batas air dan gel yang terbentuk).

Setelah itu buang air yang menutup separating gel.

4. Sesudah separating gel memadat, siapkan stacking gel 3% dengan cara yang

sama seperti prosedur no 2 di atas, volume larutan pada Tabel 2 berikut.

Tabel 2. Komposisi pembuatan Stacking gel 3 %

No Bahan Volume

1 Bis-akrilamida 30 % 0,45 ml

2 1 M Tris pH 6,8 0,38 ml

3 Aquabides 2,11 ml

4 SDS 10 % 30 µl

5 TEMED 5 µl

53

6 APS 10 % 30 µl

Memasukkan sampel pada sumur gel

1. Memasukkan plate yang sudah berisi gel ke dalam chamber

elektroforesis.

2. Menuangkan running buffer sampai bagian atas dan bawah gel

terendam.

3. Bila terbentuk gelembung udara pada dasar gel atau diantara sumur

sampel, maka gelembung tersebut harus dihilangkan.

4. Memasukkan sampel sebanyak 10-20 µl (yang kandungan proteinnya

minimal 0,1 g dan maksimal 20-40 g) secara hati-hati ke dalam dasar

sumur gel menggunakan syringe Hamilton.

5. Bilas syringe sampai 3x dengan air atau dengan running buffer sebelum

dipakai untuk mamasukkan sampel yang berbeda pada sumur gel

berikutnya.

Running sampel

1. Untuk memulai running, hubungkan perangkat elektroforesis dengan

sumber listrik.

2. Melakukan running pada arus konstan 20 mA selama kurang lebih 40-50

menit atau sampai tracking dye mencapai jarak 0,5 cm dari dasar gel.

3. Setelah selesai, tuang running buffer dan ambil gel dari plate.

Pewarnaan gel dengan Coomassie Brilliant Blue (CBB)

1. Untuk tahap ini diperlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada

gel dan larutan destaining untuk menghilangkan warana pada gel dan

54

memperjelas pita protein yang terbentuk. Komposisi pembuatan larutan

staining dapat dilihat pada Tabel 3 berikut.

Tabel 3. Komposisi pembuatan larutan staining

No Bahan Volume

1 Coomassie Blue R-250 1,0 g

2 Metanol 450 ml

3 Aquades 450 ml

4 Asam asetat Glasial 100 ml

Komposisi untuk pembuatan larutan destaining 1 liter dapat dilihat pada

Tabel 4.

Tabel 4. Komposisi pembuatan larutan destaining 1 L

No Bahan Volume

1 Metanol 100 ml

2 Asam asetat glasial 100 ml

2. Merendam gel dalam 20 ml staining solusion sambil digoyang selama

kurang lebih 15 menit. Setelah itu, tuang kembali larutan staining pada

wadahnya.

3. Mencuci dengan air beberapa kali. Setelah itu, rendam gel dalam larutan

50 ml destaining solusion sambil digoyang selama kurang lebih 30 menit

atau sampai pita protein terlihat jelas.

Pewarnaa perak 1. Merendam gel dalam larutan fiksasi selam 30 menit.

2. Menuang larutan fiksasi, kemudian merendam gel dalam larutan

sensitizing selama 30 menit.

55

3. Selanjutnya gel di cuci dengan cara direndam dalam aquades selama 5

menit dan dilakukan sebanyak tiga kali.

4. Merendam gel dalam pereaksi perak.

5. Mencuci gel dengan cara direndam dalam aquades selama 2 menit dan

dilakukan sebanyak satu kali.

6. Selanjutnya gel direndam dalam larutan developing selama 30 detik

sampai 5 menit. Perendaman harus segera dihentikan bila gel sudah

mulai menjadi berwarna gelap.

7. Reaksi yang berlangsung pada tahap 7 dihentikan dengan cara

merendam gel dalam larutan stopping selama 10 menit.

8. Mencuci gel dengan cara direndam dalam aquades selama 5 menit dan

dilakukan sebanyak tiga kali.

9. Merendam gel dalam larutan pengawet selama 30 menit dan dilakukan

sebanyak 2 kali.

10. Gel siap diamati

Pengukuran berat molekul protein sampel

1. Untuk setiap sampel protein, amati terlebih dahulu berapa jumlah pita

protein yang terlihat, kemudian tentukan nilai Rf masing-masing pita

protein dari setiap sampel

2. Dari setiap nilai Rf yang diperoleh, hitung berat molekulnya dengan

bantuan persamaan garis linear dari kurva standar berat molekul.

3. Catat hasil yang di peroleh dalam tabel.

3.6.8 Uji Hemaglutinasi (HA)

56

Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif kecuali untuk togavirus,

sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada protein

permukaan yang paling gampang mengalami perubahan antigenik. Di samping itu,

uji ini sederhana mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan hemaglutinasi

(Fennner, 1993). Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif kecuali untuk

togavirus, sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada

protein permukaan yang paling gampang mengalami perubahan antigenik. Di

samping itu, uji ini sederhana mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan

hemaglutinasi(Fennner, 1993).

Analisis hemaglutinasi yang dilakukan beradasarkan Hanne dan Finkelstein

(1982). Darah diisolasi dari ikan kerapu normal menggunakan spuit 1 ml 26 GX½”

(Therumo) yang sebelumnya dibasahi dengan larutan EDTA 10%. Darah ikan

selanjutnya dicuci dua kali menggunakan PBS, dihomogenkan kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Eritrosit selanjutnya

diencerkan dengan menggunakan PBS (1:200) untuk digunakan dalam uji HA.

Uji HA dilakukan dengan menggunakan mikroplate V-bottom 96 well.

Sebanyak 50 µl PCP dari supernatant hasil dialisa, dimasukkan dalam sumuran dan

dibuat pengenceran berseri menggunakan larutan PBS hingga pada pengenceran

(1/64). Untuk pembanding digunakan sumuran sebagai kontrol negatif yang hanya

berisi PBS. Selanjutnya semua ditambahkan eritrosit yang telah diencerkan dengan

PBS pada semua sumuran, mikroplate digoyang-goyang dan reaksi hemaglutinasi

diamati selama 24 jam.

57

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Halimeda sp Isolasi Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP) Halimeda sp mengacu pada

Yanuhar (2013). Hasil penelitian isolasi makroalga Halimeda sp ini, didapatkan

berupa supernatan Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP) yang berwarna bening.

Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP) dari makroalga Halimeda sp didapatkan dari

beberapa tahap: isolasi, dan dialisa. Langkah awal yang dilakukan pada proses

isolasi adalah menimbang halimeda seberat 25 gr, kemudian diberi nitrogen cair

yang berfungsi untuk memberi kejutan pada sel agar mulut sel membuka sehingga

pada saat penggerusan dinding sel bisa pecah. Setelah itu digerus dengan

58

menggunakan mortar sampai benar-benar halus. Setelah halus kemudian

ditambakan Glisin sebanyak 20 ml. Pemberian glisin ini bertujuan sebagai pelarut

setelah itu di gerus lagi sampai satu jam.

A B Gambar 3. Sample Halimeda sp Keterangan: a. Halimeda sp sebelum digerus

b. Halimeda sp hasil gerusan yang yang siap untuk disentrifus. (sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013)

Hasil gerusan tersebut di masukkan ke dalam opendoft dan di sentrifus

menggunakan sentrifus dingin dengan kecepatan 18000 rpm pada suhu 4 oc

selama satu jam. Supernatan kemudian dipisahkan dengan pellet menggunakan

mikropipet. Supernatant yang sudah dipisahkan dari peletnya tersebut ditambahkan

dengan Solid Amunium Sulfat (SAS) yang bertujuan untuk mengikat protein target.

Selanjutnya di sentrisfus dingin lagi dengan kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4oc

selama 30 menit. Kemudian hasil sentrifus yang kedua ini dimasukkan kedalam

kantong selofan yang bersifat selaput semipermeable atau selaput yang hanya bisa

dilewati oleh zat-zat tertentu saja. Selanjutnya didialisa selama satu minggu, sampai

larutan tris HCL yang digunakan untuk merendam kantong selofan tersebut menjadi

59

keruh. Selanjutnya hasil dialisa tersebut di filter dengan filter ukuran 0,20 µm.

kemudian di masukkan kantong selofan lagi dan didaialisa lagi sampai hasil isolasi

berwarna bening. Selanjutnya dilakukan pengukuran kadar protein yang terdapat

dalam sampel dengan menggunakan spektofotometer.

A B

Gambar 4. Supernatan dan Hasil Dialisa Keterangan: a. supernatant hasil sentrifus yang siap didialisa pertama.

b. PCP hasil dialisa yang sudah dipisahkan dari protein lain. (sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013) Isolasi protein dilakukan dengan beberapa tahapan, yakni pemecahan sel

dan pemisahan komponen protein dari komponen lain selain protein. Proses

pemecahan sel sebagai langkah awal prosedur isolasi untuk mengeluarkan isi dari

sel yang salah satu komponennya terdapat protein. Protein merupakan salah satu

komponen penyusun sel yang paling besar, sehingga harus dilakukan pemecahan

sel ketika akan mempelajari protein (Bintang, 2010). Sedangkan Fatchiyah et.,al

(2011) menyatakan bahwa untuk menganalisis protein yang ada di dalam sel,

diperlukan prosedur fraksinasi sel, yaitu (1) memisahkan sel dari jaringannya, (2)

menghancurkan membran sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan

organelnya, serta (3) memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya.

60

Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenisasi. Homogenisasi dapat dilakukan

dengan menggunakan alat yang paling sederhana seperti homogenizer atau mortar,

sampai dengan menggunakan alat yang paling mutakhir seperti vibrasi dan sonikasi.

Prosedur (3) dilakukan menggunakan sentrifugasi dengan kecepatan dan lama

sentrifugasi tertentu.

4.2 Elektroforesis Sodium Dodesil Poliakrilamida Gel (SDS PAGE)

Metode sodium dodesyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

(elektroforesis SDS-PAGE ) digunakan untuk membuktikan bahwa hasil isolasi yang

didapatkan adalah Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP), Polyacrylamide gel berfungsi

sebagai medium penyangga sedangkan sodium dodecyl sulfate berfungsi untuk

mendenaturasi protein. Sedangkan elektroforesis itu sendiri adalah suatu proses

migrasi molekul bermuatan di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana

kecepatan migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap molekul

yang ada. Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui media

(biasanya berupa gel), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat daripada yang

besar, sehingga akan terjadi pemisahan. Agar pita-pita protein yang terbentuk dapat

terlihat maka dibutuhkan sebuah pewarnaan pada gel yang telah terbentuk.

Terdapat dua macam cairan pewarna / staining untuk elektroforesis SDS PAGE

yaitu Comassie Brilliant Blue dan Silver Stain atau pewarnaan perak nitrat..

a). Pewarnaan Comassie Briliant Blue

Setelah kurang lebih 90 menit proses elektroforesis atau running, kemudian

gel dikeluarkan dari dalam chamber elektroforesis secara perlahan-lahan. Setelah itu

direndam dalam cairan pewarna Comassie Briliant Blue sambil digoyang perlahan-

lahan pada alat penggoyang (shakker) selama kurang lebih 45 menit. Setelah 45

menit, gel diambil dari dalam cairan pewarna / staining kemudian diganti atau

61

dibersihkan dengan cairan pencuci / destaining. Cairan destaining dapat diganti tiap

1.5 jam sekali hingga diperoleh hasil gel yang jernih.

b). Pewarnaan Perak Nitrat (Silver Stain)

Untuk proses pewarnaan perak nitrat terdapat beberapa tahapan dan

disetiap tahapan tersebut terdapat larutan yang berbeda. Urutan untuk proses

pewarnaan perak nitrat adalah dimulai dari fiksasi, sensitizing, washing, silver

reaction, washing, developing dan yang terakhir adalah stopping. Pada tahap

developing inilah akan terlihat pita-pita protein yang terbentuk pada gel hasil

elektroforesis.

4.3 Peridinin Chloropyll Protein (PCP) Kurva standar marker / kurva kalibrasi digunakan untuk menentukan berat

molekul protein target dari pita-pita yang dihasilkan dari elektroforesis SDS-PAGE.

Kurva standar marker tersebut didapatkan dari berat molekul marker, yang sudah

diketahui berat molekulnya (BM). Setelah didapatkan persamaan linear dari kurva

standar marker, maka kita bisa menghitung berat molekul dari setiap pergerakan

protein sampel dengan mengeplotkan langsung pada kurva standar marker atau

dapat dihitung dengan menggunakan persamaan garis linear dari kurva standar

marker tersebut.

Persamaan linear dibuat berdasarkan pada kurva standar marker, kita

terlebih dahulu harus mengukur jarak tracking dari setiap pita marker yang

terbentuk. Jarak tracking dari pita pertama adalah jarak sumuran dengan pita

pertama. Sedangkan jarak tracking pita kedua adalah jarak antara sumuran dengan

pita kedua, begitu seterusnya hingga pita terakhir. Kita harus megukur jarak tracking

dari tiap-tiap pita yang tampil pada gel. Kemudian kita menghitung Mobilitas Rate

62

y = -1.8849x + 2.252 R² = 0.9401

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 0.2 0.4 0.6 0.8

y

y

Linear (y)

X

(Mr atau Rf) dengan membandingkan jarak tracking dari setiap pita (a) dengan jarak

terakhir pergerakan warna dari tempat awal. Setelah itu dianalisis regresi linear

dengan menggunakan Microsoft Excel. Analisis regresi linear marker dapat dilihat

pada Tabel 5 berikut ini:

Tabel 5. Hasil Analisis Regresi Linear Marker

No.Pita BM (KDa) Jarak Tracking Log BM Rf

1 200 0.5 2.301029996 0.068493151

2 116 0.8 2.064457989 0.109589041

3 89 1.3 1.949390007 0.178082192

4 51 1.6 1.707570176 0.219178082

5 47 1.9 1.672097858 0.260273973

7 37 2.5 1.568201724 0.342465753

7 28 3.1 1.447158031 0.424657534

8 21 3.3 1.322219295 0.452054795

9 9.3 5.4 0.968482949 0.739726027

(sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013)

Log BM harus kita ketahui terlebih dahulu untuk mendapatkan persamaan

garis linear. Log BM akan berfungsi sebagai sumbu y sedangkan Rf akan berfungsi

sebagai sumbu x. sehingga kita akan mendapatkan persamaan garis linear y = a +

bx. Kurva persamaan garis linear dari marker dapat kita lihat pada Gambar 5 berikut:

63

Gambar 5. persamaan linear kurva standar marker Keterangan: Persamaan garis linear yang pada dari kurva diaatas adalah

Y = -1.8849x + 2.252 dengan R2 = 0.9401. Y = log BM X = Mobilitas Rate (Mr/Rf)

(sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013) Persamaan garis linear dari kurva standar marker tersebut diperlukan untuk

mengetahui berat molekul protein yang muncul pada pita-pita hasil dari elektroforsis

dan SDS-PAGE. Setelah kita mengetahui jarak tracking dan Mobilitas Rate (Mr

atau Rf) dari pita-pita yang muncul, kemudian kita bisa mendapatkan log BM dengan

memasukkan Mobilitas Rate (Mr atau Rf) sebagai sumbu x kedalam persamaan

garis linear kurva standar marker. Berat molekul (BM) dapat diketahui dengan

antilog dari log BM yang sudah didapatkan. Mobilitas Rate (Mr) sample bisa kita

dapatkan sama dengan cara yang sama untuk mendapatkan Mobilitas Rate (Mr)

pada marker yaitu dengan cara membandingkan jarak tracking (a) dengan jarak

terakhir pergerakan warna dari tempat awal.

PCP (Peridinin- Chlorophyll α –Protein) adalah hasil dari pigmen protein yang

unik dan sangat berlimpah pada proses fotosintesis (Weis et al., 2002). Peridinin-

klorofil-protein (PCP) merupakan protein cahaya pemanen yang unik yang

menggunakan karotenoid sebagai peredam cahaya utama (Damjanović, 2000) .

64

Jarak tracking pita-pita yang terbentuk dari hasil elektroforesis dan SDS PAGE dapat

kita lihat pada Table 6 berikut:

Tabel 6. Jarak Tracking dan BM Protein yang muncul

NO A b MR/Rf Log BM BM

1 2.7 7 0.385714 1.524967 33.5

2 3.9 7 0.557143 1.201841 16

3 5.4 7 0.771429 0.797934 6.3

(sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013)

Berat molekul dari PCP didapatkan dengan cara mengganti nilai X pada

persamaan garis linear kurva standar marker dengan RF yang didapatkan dari

perbandingan antara jarak Tracking dengan pergerakan warna yang terakhir. Hasil

yang kita akan dapatkan berupa log BM pita-pita yang muncul dari hasil

elektroforesis dan SDS PAGE, sehingga untuk mendapatkan berat molekul dari pita-

pita tersebut kita harus mengantilogkan log BM tersebut.

Hasil dari Elektroforesis SDS-PAGE berupa tampilan pita-pita protein, yang

pergerakannya menggambarkan besarnya BM dari molekul tersebut. Pada

penelitian ini didapatkan tiga pita protein yang mungcul dari hasil SDS-PAGE.

65

A B

Gambar 6. Hasil Elektroforesis marker standar Low Range Marker PRO-STAINTM (Fermentas) dan pita-pita hasil Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Keterangan: a. pita marker SDS PAGE b. berat molekul PCP yang muncul dengan nilai 33,5 kDa yang

merupakan hasil dari isolasi makroalga laut Halimeda sp (sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013)

Berdasarkan pita hasil elektrofosis dan SDS-PAGE dapat kita lihat bahwa

protein yang muncul adalah PCP, hal ini dapat kita lihat dari berat molekul (BM)

protein yang muncul yaitu 16 Kda dan 33,5 Kda. Peridinin klorofil protein (PCP) yang

muncul dengan berat molekul 16 Kda merupakan peridin klorofil protein (PCP)

dalam bentuk rantai pendek (homodimer) sedangkan peridinin klorofil protein (PCP)

dengan berat molekul 33,5 Kda merupakan PCP dalam bentuk merupakan PCP

dalam bentuk rantai panjang (monomer). Menurut Hoftman (1999) PCP homodimer

berukuran 16 Kda sedangkan PCP komplek memiliki berat molekul 36 Kda.

Pernyataan Hoftman tersebut diperkuat oleh pernyataan Weis et.al.(2002), PCP

terjadi dalam dua bentuk, satu sebagai homodimer (bentuk pendek) dengan massa

molekul (berat molekul) antara 14-16 kDa dan satu lagi sebagai monomer (bentuk

panjang) dengan berat molekul antara 30-35 kDa. Lebih lanjut ditegaskan oleh

pernyataan Ogata et.al.(1994), diketahui bahwa PCP memiliki berbagai isoelektrik

yang berbeda. Beberapa fraksi PCP telah diisolasi dengan menggunakan pertukaran

ion kromatografi kolom dan semua ini telah menunjukkan spectrum absorpsi serupa

dengan massa molecular monomer mulai 32 – 39 kDa tergantung pada spesiesnya.

66

Peridinin adalah suatu pigmen yang terkait dengan klorofil dan ditemukan

dalam peridinin-klorofil-protein (PCP) kompleks cahaya-panen pada dinoflagellata.

Kompleks PCP adalah unik dalam rasio yang tinggi dari peridinin ke klorofil,

sebagian cahaya-panen kompleks mengandung klorofil lebih dari karotenoid, tetapi

PCP berisi delapan peridinin dan molekul klorofil dua diatur untuk mempromosikan

peridinin-klorofil transfer energi.. Kompleks PCP adalah protein trimer dengan

solenoida alphakali lipat protein(Hofmann, 1996).

Peridinin Chlorophyll Protein (PCP) selain berguna bagi tumbuhan pada saat

fotosintesis, peridinin chlorophyll protein (pcp), bisa beguna untuk meningkatkan

system kekebalan tubuh (system imun) dan sebegai antiviral untuk pengembangan

pengendalian penyakit virus pada ikan berbasis bahan hayati. Pada penelitian ini

dibuktikan dengan memberikan ikan kerapu yang sudah terinfeksi Viral Nerveus

Necrotic (VNN) crude Peridinin chloropyll protein dari hasil isolasi makrolalga

Halimeda sp. Pada penelitian pendahuluan telah dibuktikan bahwa ikan yang positif

terinfeksi Viral Nerveus Necrotic (VNN), hanya akan mampu bertahan sekitar satu

minggu. Setelah terinfeksi ikan akan mengalami wearling, yaitu gerakan berenang

berputar-putar pada ikan dan ikan berenang tidak beratuaran. Dari hasil percobaan

pada ikan kerapu tikus (Cromileptes altivelis) yang dilakukan di Balai Besar Air

Payau (BBAP) Situbondo, Jawa Timur, didapatkan hasil bahwa ikan kerapu tikus

(Cromileptes altivelis) yang telah diinfeksi VNN masih bertahan setelah diberikan

crude Peridinin chlorophyll protein (pcp).

Hal ini terjadi karena PCP dapat membentuk inducer di dalam ikan kerapu

tikus (Cromileptes altivelis) yang berfungsi untuk mengeliminasi virus RNA VNN.

Fungsinya inducer adalah untuk meregulatori viabilitas system imun pada ikan

67

kerapu sehingga dapat meningkatkan system viabilitas atau ketahanan dan

kelulusan hidup ikan kerapu budidaya sebagai salah satu komoditi unggulan disektor

perikanan dan kelautan (Yanuhar,2012).

4.4 Pengukuran Konsentrasi PCP (Peridinin Klorofil Protein) dengan Spektrofotometri

Pengukuran kosentrasi PCP yang terkandung di dalam supernatant

dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer yang dilakukan di Laboratorium

Fisiologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Pengukuran

konsentrasi PCP yang terdapat didalam supernatant dilakukan dengan

menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. Spektrofotometri merupakan salah satu

metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu

sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara

materi dengan cahaya. Sedangkan peralatan yang digunakan dalam

spektrofotometri disebut spektrofotometer. Spektrofotometer merupakan alat yang

digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan

panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau kuarsa yang disebut kuvet.

Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai dari

cahya yang dilewatkan akan sebanding dengan konsentrasi larutan di dalam kuvet.

Pengukuran kosentrasi protein PCP diperlukan sebuah kurva kalibrasi atau

kurva standar konsentrasi protein. Kurva sstandar protein di dapatkan dari mengukur

kalibrasi dari beberapa kosentrasi larutan standar protein. Larutan standar yang

biasanya digunakan adalah larutan Bovine Serum Albumin (BSA). Disebut larutan

standar protein karena larutan BSA dapat digunakan untuk mengukur segala jenis

protein.

68

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

50 250 500 750 1000

y=0.0003x+0.0019

X

Y

Pada penelitian ini kurva kalibrasi yang digunakan adalah kurva kalibrasi

yang sudah terlebih dahulu dibuat oleh analisi laboran Laboratorium Fisiologi

Molekular, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Persamaan garis linear pada

kurva standar yang akan digunakan untuk menentukan kosentrasi protein,

diadapatkan dari mengeplotkan nilai absorbansi pada sumbu y dan kadar protein

pada sumbu x dengan nilai R2 mendekati 1.

Gambar 7. Kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA) Ketengan: X = Konsentrasi molekul

Y = Besarnya Absorbansi yang terbaca pada monitor spektrofotometer

(Sumber: Laboratorium Faal UB, 2012)

Berdasarkan grafik yang didapatkan dari laboratorium Fisiologi Molekular,

Fakultas Kedokteran Unversitas Brawijaya, Malang, diatas dapat kita lihat bahwa

persamaan linear untuk menentukan kosentrasi Protein yang terkandung dalam

larutan adalah y = 0.0003x + 0.0019.

Besarnya absorbansi dari hasil isolasi Peridinin-chlorophyll Protein (PCP)

yang terbaca pada monitor alat spektrofotometer adalah 0,01. Panjang gelombang

yang digunakan untuk pengukuran absorbansi PCP yang terdapat dari supernatant

hasil isolasi, adalah 550 nm, sedangkan metode yang digunakan adalah metode

69

Bradford. Menurut Anam (2010), Uji Bradford adalah suatu uji untuk mengukur

kosentrasi protein total secara kalorimetri dalam suatu larutan. Dalam uji Bradford

melibatkan pewarna Coomassie Briliant Blue (CBB) yang berikatan dengan protein

dalam suatu larutan yang bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan),

karena mengahasilkan warna sehingga secara kolorimetri dapat diukur

absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometri (Lambert-Beer) pada panjang

gelombang 465-595 nm (cahaya tampak).

Besarnya kandungan kosentrasi PCP yang terkandung dalam supernatant

yang diperoleh dari hasil isolasi Halimeda sp dapat kita lihat pada Table 7 berikut:

Tabel 7. Konsentrasi PCP Halimeda sp dengan Spektrofotometer

Protein Absorbansi

(Abs)

Panjang gelombang

(λ)

Konsentrasi protein

(µg / µl)

Halimeda sp 0,01 550 nm 27

(sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013) Berdasarkan tabel diatas7 dapat kita lihat bahwa kosentrasi PCP yang

terdapat pada Halimeda sp sebesar 27 µg/µl dalam supernatant hasil isolasi.

Besarnya kosentrasi yang terkandung didalam supernatant hasil isolasi tersebut

didapatkan dengan memasukkan nilai absorbansi yang didapatkan dari hasil

spektrofotometer kedalam kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA) yang pada

penelitian ini diperoleh dari laboratorium FAAL Universitas Brawijaya.

4.5 Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Crude Peridinin klorofil Protein (PCP) Halimeda sp.

7 Lampiran 3

70

Uji hemaglutinasi (HA) merupakan uji serologik yang relatif mudah, murah

dan cepat dibandingkan dengan uji yang lain. Pengujian tidak harus dilakukan pada

kondisi steril sehingga dapat dikerjakan di laboratorium dengan dengan fasilitas

yang terbatas/sederhana. Namun demikian, sebaiknya pengambilan serum

dilakukan dengan alat-alat yang steril. Pemakaian peralatan yang tidak steril dapat

berpengaruh kepada hasil dari hemaglutinasi dari sampel. Hasil dari hemaglutinasi

(HA) dapat di lihat pada gambar di berikut ini:

Gambar 6. Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Crude peridinin klorofil protein (PCP) Halimeda sp terhadap Sel Darah Merah Ikan Kerapu Tikus

Keterangan: Hasil yang didapatkan dari uji Hemaglutinasi (HA) pada crude peridinin klorofil protein (PCP) terhadap sel darah merah ikan kerapu tikus bersifat positif.

(sumber: Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013)

Tabel 8. Hasil Uji Hemaglutinasi (HA) Crude peridinin klorofil protein (PCP) Halimeda sp terhadap Sel Darah Merah Ikan Kerapu Tikus

No sampel Proses Pengenceran

K (+) ½ ¼ 1/8 1/16 1/32 1/64 K (-)

PCP Halimeda sp

+ + + + + + + -

Gambar

Pembacaan dilakukan setelah 2 jam. Pada lubang yang menunjukkan

terjadinya endapan sel darah merah ikan kerapu tikus seperti yang terdapat pada

lubang kontrol negatif diberikan nilai positif, sedangkan pada lubang yang tidak

menunjukkan adanya endapan tetapi terjadi aglutinasi (penggumpalan) sel darah

71

ikan kerapu tikus dinilai negative. Untuk memudahkan pembacaan, pelat mikrotiter

tersebut dimiringkan sekitar 45 derajat.

Reaksi positif terjadi pada sumua pengenceran 1/2 , 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 dan

1/64. Hal ini terjadi karena terjadinya aglutinasi pada sel darah ikan kerapu tikus.

Apabila aglutinasi terjadi sampai lubang ke 6 maka nilai titer HA sama dengan 26

atau sama dengan 64 (uji HA tinggi). Hal ini sesuai dengan pernyataan Kurniadhi

(2002), penghitungan HA unit dilakukan dengan cara menghitung lubang yang positif

dimulai dari enceran yang paling pekat (lubang pertama). Apabila aglutinasi terjadi

sampai pada lubang ke-6, maka titer HA dinyatakan dengan nilai 26 yaitu sama

dengan 64 HA.

Aglutinasi terjadi karena molekul PCP mampu dikenali oleh antibodi lewat

perantara eritrosit. PCP diduga sangat berperan diawal infeksi yang sangat

menenentukan kemampuan attachmement virus ke permukaan sel. PCP bersifat

imunogenik karena mampu menginduksi antibody protektif dan penghambat

attachment virus ke permukaan sel inang sehingga mampu mencegah infeksi. PCP

ini juga akan berikatan dengan eritrosit (sel darah merah), menyebabkan

pembentukan suatu kisi yang disebut hemaglutinasi dan merupakan dasar untuk

menentukan tingkat PCP sampel. Aktifitas ini diperankan oleh protein Hemaglutinasi

(HA) yang merupakan glikoprotein permukaan. Menurut Muflihanah (2009),

aglutinasi eritrosit adalah dasar pengujian hemaglutination (HA) dan hambatan

aglutinasi dengan menggunakan subtipe HA yang spesifik adalah merupakan dasar

pengujian HI. Prinsip pengujian hemaglutinasi inbihisi (HI) adalah antibody terhadap

virus akan mencegah pengikatan virus dengan sel darah merah. Oleh karena itu,

72

hemaglutinasi dihambat ketika terdapat antibody di dalam serum. Pengenceran

tertinggi dari serum yang mencegah terjadinya hemaglutinasi disebut titer HI serum.

73

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Kesimpulan penelitian dalam tugas akhir ini bahwa Halimeda sp mempunyai

kandungan protein peridinin klorofil protein (PCP) yang terdiri dari homodimer dan

monomer, dibuktikan dengan munculnya pita-pita protein hasil SDS PAGE dengan

berat molekul 16 kDa dan 33,5 kDa. PCP Homodimer adalah (PCP) dalam bentuk

rantai pendek dengan berat molekul 16 Kda. PCP dalam bentuk homodimer terdiri

dari satu kloroplas dan empat karetenoid (peridinin), sedangkan PCP monomer

merupakan PCP dalam bentuk rantai panjang dengan berat molekul 33,5 Kda. PCP

dalam bentuk monomer berisi satu molekul klorofil berikatan dengan peridinin,

lemak, protein, dan air. Kandungan PCP yang terdapat pada Halimeda sp dengan

konsentrasi hasil 27 µg/µl. Uji hemaglutinasi test (HA) pada crude peridinin klorofil

protein (PCP), bereaksi positif terhadap sel darah merah ikan kerapu tikus, yang

membuktikan bahwa Peridinin Klorofil Protein (PCP) tersebut adalah molekul

adhesion sebagai penanda reaksi imunologi pada ikan kerapu tikus.

5.2 Saran

Penelitian lebih lanjut disarankan menguji fungsi PCP secara in vivo pada

selain ikan kerapu tikus untuk anti viral.

74

DAFTAR PUSTAKA

Amalia, Nur, Y. 2000. Ekstraksi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Anestetik Alga Laut Jenis Caulerpa sertularioides. Program Studi Teknologi Hasil Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Amiruddin, H., R.K. Dongoran, R. Nurhadi, dan L. Darto. 2012. Manajemen Induk Ikan Kerapu Tikus (Cromileptes altivelis) sebagai Upaya Optimalisasi Produksi Telur Berkualitas. Balai Budidaya Laut Ambon.

Anam, Khairul. 2010. Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Bradford. Laporan Praktikum Mikrob dan Potensinya. Jurusan Bioteknologi Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Bogor

Anggadiredja, J. 1994. Produk Algae (Makro) Laut dalam Bidang Kesehatan. Dalam

Seminar Nasional Akupuntur Indonesia 7 April 1994. Surabaya. Atmadja, W.S. 1996. Kolonisasi dan suksesi pada algae laut bentik. Oseana.

& Sulistijo. 1988. Beberapa aspek vegetasi dan habitat tumbuhan laut bentik di pulau-pulau seribu. Dalam : Moosa, M.K., D.P. Praseno & Sukarno (eds.). 1988. Teluk Jakarta: Biologi, budidaya, oceanografi, geologi, dan kondisi perairan. P3O-LIPI, Jakarta.

Bagian Biokimia FKUI, 2000. Pemisahan protein dengan elektroforesis gel

poliakrilamid-SDS. Biokimia Eksperimen Laboratorium Jakarta: Widya Medika, pp36-44

Barton, E.S., 1901. The genus Halimeda. Monographs of the Siboga

Expedition, 60. Leiden.

Barus, T.A. 2002. Pengantar Limnologi. Jurusan Biologi FMIPA USU. Medan.

75

Bell, P.R.& A.R. Hamsley. 2004. Green Plants: Their origin and diversity.2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge.

Bendich A (1993) Biological functions of dietary carotenoids. Ann NY Acad Sci USA 691.

Bintang, Maria. 2010. BIOKIMIA Teknik Penelitian. Penerbit Erlangga. Jakarta

Bold, H.C. & M.J. Wynne. 1978. Introduction to the algae: Structure and Reproduction. 2nd ed. Prentice hall, Inc, Englewood Cliffs.

.1985. Introduction to the algae. Second edition. Prentice-Hall, inc, Engelwoods Cliffs, New Jersy. 720 pp.

Boyd, C.E. and F. Lichtkoppler. 1982. Water Quality Management in Pond Fish Culture. Auburn University. Auburn, Alabama. 30 p.

Boyer RF. 1986. Modern Experimental Biochemistry. The Benjamin/Cummings

Pub. Co. Inc., Canada.

Chapman, V.J. & Chapman, D.J. (1980). Seaweeds and their uses. pp. [i-iv], v-ix, [x], 1-334. London & New York: Chapman & Hall.

Damjanovic, Ana. Thorsten Ritz, Klaus Schulten. 2000. Excitation Transfer In The Peridinin-Chlorophyll Protein Of Amphidinium carterae. Biophysical Journal Volume 79 : 1695 - 1705.

Dawes, C.J. 1981. Marine Botany. John Wiley & Sons, Inc. New York.

Ditjen Perikanan. 1990. Pedoman Pengenalan Sumber Perikanan Laut. Jakarta:

Direktorat Jenderal perikanan.

76

Ditjenkanbud. 2004. Profil Rumput Laut Indonesia, Jakarta.

Edelstein SJ, Bollag DM. 1991. Protein Methods. Wiley-Liss, USA.

Effendi, H. 2003. Telaah Kualitas Air: Bagi Pengelolaan Sumber Daya dan Lingkungan Perairan. Kanisius. Yogyakarta.

Farlisa, Triliani. 2010. Titer Antibodi Ayanm Pedaging terhadap Virus Newcastle disease (ND) dengan Uji Hemaglutinasi (HA) dan Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI). Jurusan Biologi, Fakultas MIPA. Universitas Jember.

Fatchiyah et.al. 2011. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta

Fenner. F. 1993. Virology Veteriner Edisi kedua. New York: Academic Press Inc.

Giri. N. A. and A. Kazawa. 1993. Pengaruh Vitamin C Glucosit terhadap Pertumbuhan Juvenil Udang Kuruma, Penaeus japonicus. J. Panel. Budidaya Pantai 9(2): 107-114.

Gupta, J.S. 1981. Textbook of Algae. Oxford & IBH Publishing Co, New Delhi.

Hansson GK. 2009. Atherosclerosis-an Immune Disease. The Atnitschove Lecture 2007. Atheroscler, 202(1):2:10.

Hasan, I. M. 2002. Pokok-Pokok Materi Metodologi Penelitian dan Aplikasinya. Ghalia Indonesia. Jakarta.

Hillis-Colinvaux, L. (1980) Ecology and taxonomy of Halimeda: primary producer of coral reefs. Advances in Marine Biology.

77

Hofmann Eckhard, Pamela M. Wrench. Frank p. Sharples. Roger G. Hiller. Wolfram Welte. 1996. Structural basis of light harvesting by carotenoids : peridinin- Chlorophyll- Protein From Amphidinium Carterae. Science, Vol. 272. No 5269, 1788-1791.

http://ridwanaz.com/kesehatan/pengertian-fungsi-dan-akibat-dari-kekuarangan-protein/

Indriani, H. dan Sumarsih, E. 1999. Budidaya, Pengolahan, dan Pemasaran Rumput Laut (cetakan 7). Penebar Swadaya. Jakarta.

Jeffries, M.J. 1997. Biodiversity and convervation. Routledge, London.

Kadi, A. 1996. Pengenalan Jenis Algae Hijau (Chlorophyta). Dalam: Pengenalan Jenis-jenis Rumput Laut Indonesia. Puslitbang Oceanologi LIPI, Jakarta.

Kementerian Lingkungan Hidup. 2004. Status Lingkungan Hidup Indonesia 2004. Kementerian Lingkungan Hidup Indonesia. Jakarta.

Klasse PJ and Sattentau QJ. 2002. Occupancy and mechanism in antibody mediated neutralization of animal Viruses. Journal of General Virology. 83: 2091-2108.

Kordi K, M. Ghufron dan Andi B.T. 2007. Pengelolaan Kualitas Air. Rineka Cipta. Jakarta.

Kotler, Philip and Gary Armstrong. 2006. Marketing : An Introduction. Prentice Hall PTR.

Kurniadhi, Pudji. 2002. Metode Uji Hambat Hemaglutinasi (HI Test) sebagai Teknik Pemeriksaaan Diagnosa Serologik Terhadap Penyakit Aujeszky. Buletin Teknik Pertanian Vol. 7. Nomor 2, 2002.

Kurniawaan, dkk.2006. Diktat Kuliah Pengantar Oceanografi. Fakultas Perikanan Universitas Brawijaya. Malang.

78

Lapointe, B.E. and Thacker, K. 2002. Community-based water quality and coral reef monitoring in the Negril Marine Park, Jamaica: land-based nutrient inputs and their ecological consequences. In The Everglades, Florida Bay, and Coral Reefs of the Florida Keys: An Ecosystem Sourcebook, J.W. Porter and K.G. Porter, editors. CRC Press, Boca Raton, FL, U.S.A.,

Lerman, M. 1986. Marine Biology. The Benjamin/Cumming Publishing Company inc, Menlo Park.

Levinton, J.S. 2001. Marine Biology: Function, Biodeversity, Ecology.2nded. Oxford University Press, New York.

Linton NF & Fazio. 2003. Macrophage, Inflammation, and Atherosclerosis. Int.J. Obesity. 27, 335-540.

Lüning K (1990) Seaweeds. Their environment, biogeography and ecophysiology. Wiley, New York.

McConnaughey, B.H. & Zottoli, R. 1983. Pengantar Biologi Laut. Terj. Dari Introduction to Marine Biology, oleh H.Z.B. Talal drh. IKIP Semarang Press, Semarang.

McCook, L. (2001) Competition between corals and algal turfs along a gradient of terrestrial influence in the nearshore central Great Barrier Reef. Coral Reefs. 19:419-425

Morton, J. 1990. The shore ecology of the tropical pacific. Unesco Regional Office for Science and Technology for South East Asia, Jakarta.

Muflihanah. 2009. Serological Diagnostic of Avian Influenza Infections. The Indonesian Journal of Science. Volume 1 No. 5. July 2009 p. 298-308.

Natzir. 1983. Metode Penelitian. Ghalia Indonesia. Jakarta

79

Nontji, 2002. Laut Nusantara. PT. Pradnya Paramita. Jakarta.

Nybakken, J.W. 1992. Biologi Laut. Edisi II. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.

Odum, Eugene P. 1993. Dasar-dasar Ekologi. Gadjah Mada University. Press: Yogyakarta

Ogata et., al. 1994. A novel peridinin-chlorophyll a protein (PCP) from the marine

dinoflagellate Alexandrium cohorticula: a high pigment content and plural spectral forms of peridinin and chlorophyll a. Federation of European Biochemical Societies FEBS Letters 356 (1994) 367-371

Purchase. H. G., 1989. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Phatogens, Third Edition. Amerika: Kendal/hint Publishing Company.

Putra, Sinly Evan. 2008. Alga Laut sebagai Biotarget Industri. www.chem-is-try.org.

Putinella, J.D., 2001. Evaluasi Lingkungan Budidaya Rumput Laut Di Teluk Bagula Maluku. http://www.coremap.or.id/download/0121.pdf

Rantam, F.A. 2003. Metode Imunologi. Cetakan 1. Airlangga Univercity

Press. Surabaya.

Romimohtarto Kasijan-Sri Juwana. 2001. Biologi Laut-Ilmu Pengetahuan Tentang Biota Laut. Jakarta. Pusat Penelitian dan Pengembangan Oseanologi-LIPI

Song, Pill-soon, et all. 1976. Molekul Topology of the Photosynthetic Light-harvesting Pigment Complex, Peridinin-Chlorophyll a-Protein, from Marine Dinoflagellates. Biochemistry, 1976, 15 (20), pp 4422–4427.

Sumich, J.L. 1979. An introduction to the biology of marine life. C. Brown Co. Publishing, Iowa City.

80

Sulistijo 1996. Perkembangan budidaya rumput laut di Indonesia. Dalam Pengenalan Jenis-jenis Rumput Laut Indonesia. Editor: W.S. Atmadja, A. Kadi, Sulistijo dan R Satari. Puslitbang Oseanologi LIPI, Jakarta: 120-151.

Surachmad, W. 1985. Dasar dan Teknik Research: Pengantar Metodologi Ilmiah. Tarsito. Bandung.

Tampubolon, Agrialin, Grevo S. Gerung dan Wagey Billy. 2013. Biodiversitas Alga Makro di Lagun Pulau Pasige, Kecematan Tagulandang, Kabupaten Sitaro. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis Volume 2 No 1.

Valerie J. Paul and Kathryn L. Van Alstyne. 1999 Activation Of Chemical Defenses In The Tropical Green Algae Halimeda Spp. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, Volume 160, Issue 2, 5 October 1999, Pages 191-203

and William Fenical, 1983). Isolation of Halimedatrial: Chemical Defense Adaptation in the Calcareous Reef-Building Alga HalimedaInstitute of Marine Resources, Scripps Institution of Oceanography, La Jolla, California 92093. University of Guam Marine Laboratory, UOG Station, 96923 Mangilao Guam, USA. Departemen of Zoology NJ-15, University of Washington, 98195 Seattle Washington, USA.

Weis, Virginia M., E.Alan Verde, Wendy S.Reynold. 2002. Characterization of A

Short Form Peridinin-Chlorophyll Protein (PCP) cDNA and Protein From The Symbiotic Dinoflagellate Symbiodinium muscatinei (Dinophyceae) From The Sea Anemone Anthopleura elegantissima (Cnidaria). J.Phycol 38, 157-163 (2002).

[WHO] World Health Organization. 2002. Manual on Animal Influenza. Diagnosis

Threat. http://Www.Who.Int/Csr/Disease/Influenza/H5N1-9reduit.Pdf. [20-2-2008].

2009. Newcastle Disease: Aetiology, Diagnosis, Prevention, and Control References, OIE Technical Disease Cards. OIE Scientific and Technical Department, Thailand.

Wilson K, Walker J. 2000. Principles and Techniques of Practical Biochemistry

5th Edition. Cambridge University Press, Cambridge.

Yanuhar,U. 2012. Eksplorasi Karekter Molekul Peridinin Chlorofil Cell Pigmen (Pcp) Alga Nanochloropsis oculata dan Halimeda sp: Upaya Pengembangan

81

Pengendalian Penyakit Virus Pada Ikan Berbasis Bahan Hayati. Universitas Brawijaya. Malang.

2013. Laporan Kemajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi Utama (U)-BOPTN 2013, Belum Dipublikasikan.

Yoshie, Y., W. Wang, Y. P. Hsieh, & T. Suzuki, 2002. Compositional Difference of Phenolic Compounds between Two Seaweeds, Halimeda spp. J. of Tokyo Univ. of Fisheries 88: 21-24

Yuwono. Triwibowo. 2005. Biologi Molekular. Kanisius. Yogyakarta

82

Lampiran 1. KOmposisi Pembuatan SDS-PAGE

Bahan Pembuatan Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gel

Elektrophoresis (SDS-PAGE)

(1). Acrilamide 30%

- Acrylamide : 14.5 g

- Bis-acrylamide : 0.25 g

- dH2O : 30 ml

(2). Tris HCL (BM : 157.64) 1.5 M pH 8.8

- Tris HCL : 11.82 g

- dH2O : 50 ml

- Adjust pH harus tepat

(3). Tris HCL 1 M pH 6.8

- Tris HCL : 3.152 g

- dH2O : 20 ml

(4). SDS 10%

- SDS : 1 g

- dH2O : 10 ml

(5). APS 10%

- APS : 0.1 g

- dH2O : 1 ml

(6). Running Buffer pH 8.8

- Tris base : 3.03 g

- Gliserine : 14.2 g

- SDS : 1 g

- dH2O : 100 ml

- Pemakaian RB m aksinal 4X

(7). Staining Solution

- Comasive Brilliant Blue : 3.03 g

- Methanol : 40 g

- Asam asetat glasial : 10 %

- dH2O add 100 ml add

- 500 ml

83

(8). Destaining Solution

- Methanol 20% : 100 g

- As.asetat glasial 10% : 50 %

- dH2O add : 500 ml

(9). RSB

- Tris HCL pH 6.8 : 1 g

- Gliserol 100% : 0.8 ml

- SDS 10% : 1.6 ml

- β mercapto etanol : 0.4 ml

- Bromophenol Blue 1 % : 0.2 ml

- Aquadest : 4 ml

Total : 8 ml

10). PBS

Dengan NaCl

- NaCl : 8.473 g

- Na2HPO2 : 1.779 g

- NaH2PO4 : 1.379 g

- Aquades : 1000 ml

- pH 7.4

(11). TAE Buffer pH 8

- Tris Base 40 Mm : 2.42 g

- As.asetat glasial 20 mM : 570 µl

- EDTA 1MM : 1 ml

- H2O : 500 ml

- Adjust pH : 8

84

Lampiran 2. Komposisi Pembuatan Elektroforesis Gel 12 %

Pembuatan Elektroforesis Gel 12.5%

(1). Lower

- Acryl 30% : 2.063 ml

- Tris HCL 1.5 M, pH 8.8 : 1.25 ml

- dH2O : 1.637 ml

- SDS 10% : 50 µl

- APS 10% : 50 µl

- Temed : 10 µl

(2). Upper

- Acryl 30% : 2.063 ml

- Tris HCL 1.5 M, pH 6.8 : 0.312 ml

- dH2O : 0.662 ml

- SDS 10% : 12.5 µl

- APS 10% : 3.75 µl

- Temed : 2.5 µl

Running : 120 V, kuat arus 20 mAh selama 90 menit

85

Lampiran 3. Perhitungan Konsentrasi PCP

Perhitungan kosentrasi PCP yang terdapat di dalam supernatan.

Persamaan linaer dari kurva Standar BSA adalah y = 0,0003x + 0,0019,

dimana

Besarnya kanndungan kosentrasi PCP yang terkandung dalam supernatant

yang diperoleh dari hasil isolasi Halimeda sp dapat kita hitung dengan memasukkan

nilai absorbansi yang kita dapatkan dari hasil spektrofotometer.

Diketahui : Persamaan garis linear kurva standar, Y = 0,0003x + 0,0019

Nilai absorbansi hasil spektrofotometer ( y ) = 0,01

Konsentrasi PCP = x

Sehingga dapat kita ketahui konsentrasi PCP (Y) yang terdapat di dalam

supernatant hasil isolasi Halimeda sp:

0,01 = 0,0003x + 0,0019

0,01 – 0,0019 = 0,0003x

X = 0,0081 / 0,0003

X = 27 µg/µl

x adalah nilai yang dicari yaitu nilai konsentrasi Peridinin-Chlorophyll

Protein (PCP) Halimeda sp

y adalah nilai absorbansi yang terbaca pada alat spektrofotometer

86

Lampiran 4. Prosedur Pembuatan Amunium Sulfat

Pembuatan Solid Amunium Sulfat (Metode Yanuhar, 2013)

Ditimbang amunium sulfat 100 gr

Hasil

Disimpan di dalam refrigrator

Dihomogenkan dengan magnetik

stirer selama 2 x 24 jam

Dicampur akuades 70 ml

87

Lampiran 5. Prosedur Pembuatan Tris-HCL pH 8

Pembuatan Tris-HCL pH 8 (Metode Yanuhar, 2013)

Ditimbang Tris-HCL 3,13 gr

Dicharge pH dengan penambahan

NaOH/HCL sampai pH 8

Ditambahkan aquades sampai

volume 1000 ml

Ditambahkan aquades sampai

volume 700 ml

Dimasukkan kedalam becker glass

sterir

Hasil disimpan dalam suhu

ruangan

88

Lampiran 6. Prosedur Pembuatan Glysin + KCL

Pembuatan Glysin + KCL (Metode Yanuhar, 2013)

Timbang Glysin sebanyak 0,375 gr

Ditambahkan dH2O sampai volume

40/50 ml

Dicharge pH dengan penambahan

NaOH/HCL sampai pH 7,5

Dimasukkan kedalam botol steril

Ditimbang KCL sebanyak 0,149 gr

Ditambahkan lagi dH2O sampai

volume 100 ml

Hasil disimpan di dalam kulkas

- 40C

89

Lampiran 7. Prosedur Pembuatan NaCL 0,5 M

Pembuatan Larutan NaCL 0,5 M (Metode Yanuhar, 2013)

Ditimbang Sodium Chloride

29,20gr

Hasil

Disimpan di dalam kulkas - 40C

Ditambahkan aquades sampai

volume 1000 ml

Dimasukkan ke dalam becker glass

steril

90

Dokumentasi Penelitian

Gambar 10. Penimbangan Halimeda

sp

Gambar 11. Halimeda sp yang digunting

halus

Gambar 12. Pemberian nitrogen cair

Gambar 9. Halimeda sp yang akan diisolasi

Gambar 13. Penggerusan Halimeda sp Gambar 14. Hasil gerusan Halimeda sp

Lampiran 8. Dokumentasi Kegiatan Tim Peneliti Unggulan Perguruan Tinggi Utama

(U)-BOPTN 2013

1

Gambar 15. Pemindahan Hasil

gerusan ke dalam ependoft

Gambar 16. Sentrifus dingin 18.000

rpm, 40c, selama 60 menit

Gambar 17. Supernatan hasil sentrifus

Gambar 18. Dialisa supernatant hasil

isolasi

Gambar 19. Gel hasil elektroforesis

SDS PAGE

Gambar 20. Pewarnaan dengan

commasie blue

2

Alat-alat yang digunakan

Gambar 21. Timbangan Digital

Gambar 22. Mortar

Gambar 23. Sentrifus dingin

Gambar 24. Tubbing dan Kantong

dialisa

Gambar 25. Spektrofotometer

Gambar 26. Alat untuk SDS PAGE