Identificación y caracterización de levaduras no-Saccharomyces de distintas regiones vitivinícolas españolas Subprograma Nacional de Conservación de Recursos Genéticos de Interés Agroalimentario- Recursos Microbianos RM2006-00012 Madrid/19-01-10 Jornada de presentación de resultados Proyecto RM2006-00012
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Identificación y caracterización de levaduras no-Saccharomycesde distintas regiones vitivinícolas
españolas
Subprograma Nacional de Conservación de Recursos Genéticos de Interés Agroalimentario-
Recursos Microbianos
RM2006-00012
Madrid/19-01-10 Jornada de presentación de resultados Proyecto RM2006-00012
ENTIDAD: IMIDRAPROYECTO Nº RM2006-00012-00-00TITULO DEL PROYECTO: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LEVADURAS NO-SACCHAROMYCES DE DISTINTAS REGIONES ESPAÑOLAS
Madrid/19-01-10 Jornada de presentación de resultados Proyecto RM2006-00012
OBJETIVO: Identificación, caracterización y ampliación de la colección de levaduras vínicas no-Saccharomyces del
IMIDRA
• Estudio de la viabilidad de la colección de cepas de levaduras autóctonas y de colección no-Saccharomyces presentes en el IMIDRA.
• Aislamiento de nuevas cepas de levaduras no-Saccharomycesprocedentes de viñedo y de bodega de elaboración.
• Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de especie de estas cepas de levaduras no-Saccharomyces.
• Utilización de técnicas moleculares para la identificación a nivel de cepa de levaduras no-Saccharomyces.
• Recopilación, análisis de datos y creación de una base de datos en el IMIDRA de cepas de levaduras no-Saccharomyces.
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Material de partida• Colección de levaduras del IMIDRA (CLI) ~ 1200
cepas (Saccharomyces RM2007-00008 y no-Saccharomyces) conservadas en YM a 4ºC.
• Recopilación de 118 cepas de levaduras no-Saccharomyces, conservadas en la colección delevaduras del IMIDRA
• 38 cepas proceden de aislados asociados a levadurasde flor de diferentes regiones españolas, recogidas amediados de los años 50
• 80 cepas autóctonas de Arganda, Nalvalcarnero y SanMartín de Valdeiglesias, año 1991. Primeros estudiosde la microbiota de mostos y vinos en la D.O. “Vinosde Madrid”.
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Tareas realizadas
• Test de viabilidad y pureza
• Ajuste de condiciones óptimas de liofilización, primera vez que se aplica este sistema de conservación al mantenimiento de la colección
• Conservación de las cepas en leche descremada (200 g/l)
Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC
Nueva catalogación (CLIXX) y mantenimiento bajo dos sistemas de conservación, LIOFILIZACIÓN y CONGELACIÓN -80ºC
CLI liofilizada y conservada a 4ºC y a temperatura ambiente
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Rhodotorula
mucilaginosa
Ampliación de la colección
• 834 aislados de cepas no-Saccharomyces procedentes delviñedo
• Estudios de biodiversidad de levaduras sobre diferentesvariedades de vid cultivadas en la D.O. “Vinos de Madrid”
• Viñedos bajo diferentes sistemas de mantenimiento delsuelo y de defensa biológica (ecológica y convencional)
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Las colonias fueron seleccionadas en función de su capacidad para crecer
en medio con lisina como única fuente de carbono
YNB Lys - YNB Lys +
Saccharomyces
Non Saccharomyces
Detección de las cepas de levaduras no-Saccharomyces
Identificación genética
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• RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic
DNA-Polymerase Chain Reaction) desarrollada
por Williams et al. (1990).
• Se utilizó el primer OPB-15 MWG Biotech AG
(Ebersberg, Alemania) secuencia:
• 5’-GGAGGGTGTT-3’
• Se tomó como referencia las cepas tipo de la
CECT.
• Identificación genética de las cepas de
levaduras no-Saccharomyces método
basado en PCR-RFLP de la región ITS
del ADN ribosómico desarrollado por
Granchi y col. (1999)
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Identificación molecular por
PCR/RFLP de la región ITS
ribosómica
Referencias para la identificación
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• Comparación de los productos amplificados y el tamaño de los fragmentos de restricción descritos previamente por Guillamón et al. (1998), Esteve-Zarzoso et al. (1999) y Fernández-Espinar et al.(2000). http://motor.edinfo.es/iata
• Base de datos yeast-id.com
• En cada reacción de amplificación y restricción, se utilizaron como referencia cepas tipo procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipos (CECT)
Cepas utilizadas como referencia
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Cepa Referencia
Candida glabrata CECT 1448
Candida stellata CECT 11918
Candida vini CECT 11905
Dekkera bruxellensis CECT 1010
Debaryomyces hansenii var. hansenii CECT 10353
Hanseniaspora uvarum CECT11105
Kluyveromyces thermotolerans CECT 1962
Metschnikowia pulcherrima CECT 10071
Pichia carsonii CECT10227
Pichia membranaefaciens CECT 10037
Rhodotorula mucilaginosa CECT 10359
Schyzosaccharomyces pombe CECT 10685
Torulaspora delbruekii CECT 1015
Zygosaccharomyces bailii CECT1898
Resultado de clasificación de cepas de diferentes regiones
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Cultivos de levaduras muy antiguos (1956).Mantenidos en mosto peptonado rejuvenecimiento cada 2 meses durante 25 años; y en medio sólido (YM) cada 6 meses.
Resultados ¿ ? no coinciden con base de datos CECTse hace necesario recurrir a:
Base de datos CBS (http://www.cbs.knaw.nl)
Secuenciación de regiones ribosomalesDominios D1/D2 del extremo 5’del gen 26S (Cadez et al.2003)
• Levaduras aisladas en viñedo presentan mayor actividad β-glucosidasa
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Información científica generadaCongresos:
• SEM. Sociedad española de microbiología. Sevilla 17-20 de Septiembre de 2007. Biodiversidad de lamicrobiota de levaduras asociada a la uva en viñedos con diferentes sistemas de defensa biológica. A. Serrano,T. Arroyo, R. González, E. Valero.
• XIII CONGRESO ANUAL EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS, CYTALIA 2008. Madrid, 9,10 y 11 de Abril de 2008. Biodiversidad de la microbiota de levaduras de la uva en viñedos con distintossistemas de manejo del suelo. Serrano, A., Arroyo, T., Cordero, G., González, R., Pedrosa, R., Lissarrague R.,Valero, E.
• XXXI Congreso Mundial de la Viña y el Vino, OIV. Verona, 15-20 de Junio de 2008. Influencia de losparámetros agronómicos del viñedo en la Biodiversidad de levaduras fermentativas asociadas a la uva. A.Serrano, T. Arroyo, G. Cordero,González, R. Pedrosa, R. Lissarrague, E. Valero.
• XII WEURMAN FLAVOUR RESEARCH SYMPOSIUM. Interlaken (Switzerland) 1-4 de Julio de 2008.Glycosidase production by non-Saccharomyces yeast isolated from vineyard. T. Arroyo, G. Cordero, A.Serrano, E. Valero.
• XVI CONGRESO NACIONAL DE MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. Córdoba (Spain) 14-17 deseptiembre de 2008. Evolución de las levaduras comerciales en el ambiente. Primer año de estudio. A.Serrano, T. Arroyo, G. Cordero, E. Valero. ISBN: 978-84-691-5094-8. Pg: 327
• XXIV Reunión anual del grupo de trabajo de Experimentación en Viticultura y Enología. Madrid, 5-6 de Mayode 2009 en el IMIDRA. Resultados preliminares agronómicos sobre la microbiota del viñedo en la CM. G.Cordero, E. Valero, A. Serrano y T. Arroyo.
• 27th ISSY Pasteur’s Legacy “ Yeasts for Health and Biotechnologies” Paris 25-29 de Agosto de 2009. Effectof agronomic parameters on the microbiote of the vineyeard. First year of study. T. Arroyo, G. Cordero-Bueso, A. Serrano y E. Valero.
Diploma de Estudios Avanzados (DEA). Gustavo Cordero Bueso, Universidad Autónoma de Madrid. Departamentode Química Física Aplicada. Área de Tecnología de los Alimentos. Septiembre 2009. Efecto de los factoresagronómicos sobre la microbiota del viñedo. Estudios preliminares.
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