UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA “IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS” Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de Médico Veterinario Zootecnista AUTOR: Jenny Soraya Carrillo Toro TUTOR: Dr. Richar Iván Rodríguez Hidalgo Ph.D. Quito, Mayo, 2015
92
Embed
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE … · Identificación y cultivo de larvas ..... 24 Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp ... Gusano Barrenador
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp.
DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE
ZOONOSIS”
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario Zootecnista
AUTOR:
Jenny Soraya Carrillo Toro
TUTOR:
Dr. Richar Iván Rodríguez Hidalgo Ph.D.
Quito, Mayo, 2015
ii
DEDICATORIA
A mis padres y abuelos por su esfuerzo, sacrificio e incondicional apoyo, han
sido un ejemplo de superación y lucha en mi vida; además con su templanza
han sabido mostrarme el camino para alcanzar una meta; también a mi
hermano Fernando y a mi compañero Roberto quienes a pesar de las
circunstancias adversas han estado ahí durante mi carrera profesional.
Jenny
iii
AGRADECIMIENTOS
Quiero expresar mi más sincero agradecimiento Al Dr. Richar Rodríguez por
brindarme la oportunidad de formar parte de su Proyecto y, a la vez, ser tutor
de esta investigación.
A todos mis profesores que, de una u otra forma, me brindaron sus
conocimientos y experiencias para mi formación a lo largo de esta carrera.
Agradezco al personal científico del Centro Internacional de Zoonosis,
especialmente al Ing. Gustavo Echeverría, Dr. Juan Carlos Navarro y a la
MSc. Sandra Enríquez, cuyos conocimientos me han enriquecido y han
permitido concluir este proyecto.
A mis padres, hermano y a mi compañero Diego Cushicóndor, quienes
contribuyeron, directa e indirectamente, para la materialización y finalización
de este proyecto de tesis.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
v
INFORME DEL TUTOR
vi
APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp.
DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE
ZOONOSIS”
vii
ÍNDICE GENERAL
pp.
DEDICATORIA .......................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ............................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL .................................................. iv
INFORME DEL TUTOR ............................................................................................ v
APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL .............................................................. vi
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp. DE LA
COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS” ........ vi
ÍNDICE GENERAL .................................................................................................. vii
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. ix
LISTA DE TABLAS ................................................................................................... x
RESUMEN ................................................................................................................ xi
ABSTRACT ............................................................................................................. xii
CAPÍTULO I .............................................................................................................. 1
Tabla 4. Secuencia de cebadores para el COI y 12S ............................................. 27
Tabla 5. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la
amplificación del gen COI ....................................................................................... 28
Tabla 6. Reactivos utilizados para la preparación del master mix para la
amplificación del gen 12S ARNr ............................................................................. 28
Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares .............................. 31
xi
“IDENTIFICACIÓN MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DE Cochliomyia spp.
DE LA COLECCIÓN CIENTÍFICA DEL CENTRO INTERNACIONAL DE
ZOONOSIS”
Autor: Jenny Soraya Carrillo Toro
Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D
Fecha: mayo, 2015
RESUMEN:
Cochliomyia hominivorax es una mosca (Diptera: Calliphoridae) que, en su fase larvaria, es un parásito obligado que se lo conoce comúnmente como Gusano Barrenador del Ganado (GBG). La miasis causada por la mosca se encuentra en la lista de enfermedades de declaración obligatoria y ha sido considerada como un problema en la industria pecuaria y de salud pública. En el Ecuador, no existen estudios que permitan determinar la importancia de la mosca del gusano barrenador del ganado (GBG) ni su relación con otras especies; es por esto que, la finalidad de este estudio fue identificar morfológicamente y molecularmente a las poblaciones de Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar las relaciones evolutivas entre las especies de moscas Cochliomyia hominivorax y Cochliomyia macellaria utilizando la extracción, amplificación y secuenciación del ADN de los genes mitocondriales (COI y 12S -ADNmt). Para este estudio se utilizaron 48 ejemplares de la Colección Entomológica del Centro Internacional de Zoonosis. Los resultados permitieron identificar morfológicamente dos especies de Cochliomyia: C. macellaria con el 66,67% (32/48) y el 33.33% (16/48) de C. hominivorax. De la secuenciación se obtuvo 33 y 30 secuencias útiles para el COI y 12S, respectivamente. Los árboles filogenéticos, resultantes del análisis de COI, 12S y COI-12S (secuencias unidas), mediante el método de parsimonia máxima, mostraron la misma topología, identificando tres clados definidos, uno correspondiente a C. macellaria, el otro a C. hominivorax y el tercer clado correspondió a las muestras de grupos externos obtenidos del Genbank. En conclusión, el estudio permitió diferenciar morfológicamente dos especies de Cochliomyia las cuales fueron corroboradas con el estudio filogenético. Finalmente, se evidenció que existe una fuerte relación del lugar de origen de las larvas o moscas y su comportamiento, con la especie a la que pertenecen.
“MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR IDENTIFICATION OF Cochliomyia
spp. OF THE SCIENTIFIC COLLECTION OF THE ZOONOSIS INTERNATIONAL CENTER”
Author: Jenny Soraya Carrillo Toro Tutor: Richar Rodríguez H. Ph.D
Date: May, 2015
ABSTRACT
Cochliomyia hominivorax is a fly (Diptera: Calliphoridae) that in its larvae phase, is an obliged parasite commonly known as Screwworm. Miasis by such fly is in the list of mandatory report diseases and has been considered as a problem in the livestock industry and public health. In Ecuador, no studies have been made to determine the relevance of the Screwworm, or its relation with other species. The purpose of the current study was morphologically and molecularly identified Cochliomyia spp. populations, by using dichotomy keys and analyzing evolutionary relations between Cochliomyia hominivorax and Cochliomyia macellaria species of flies, by using extraction, magnification and DNA sequence of mitochondrial gens (COI and 12S - DNAmt). For the study, 48 samples of the Entomologic Collection of the Zoonosis International Center were used. Results allowed morphologically identifying two species of Cochliomyia: C. macellaria with 66.67% (32/48) and 33.33% (16/48) of C. hominivorax. From the sequence, 33 and 30 useful sequences were obtained for COI and 12S, respectively. Phylogenetic trees, resulting from analysis of COI, 12S and COI-12S (united sequences), by using maximum parsimony method, showed the same topology, identifying three strains clearly defined, C. macellaria, C. hominivorax and the third correspondent to samples of external groups obtained from Genbank. It has been concluded that the study allowed a morphologic differentiation of two species of Cochliomyia, which were confirmed with the phylogenetic study. Finally, a strong relation was found between the origin place of larvae or flies and behavior, with species to which they belong.
KEYWORDS: MIASIS / Cochliomyia / PHYLOGENETIC
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
La mosca del gusano barrenador del ganado (GBG), conocida como
Cochliomyia hominivorax (Coquerel, 1858), en su fase larvaria, es un
parásito obligado, debido a que se alimenta únicamente de tejido vivo
(biontófaga). Este parásito causa graves daños en animales homeotermos,
incluido el hombre, desarrollando una enfermedad parasitaria y zoonósica,
conocida como miasis traumática (Moya, 2003; Forero et al., 2008). La
Cochliomiasis está incluida en la lista de enfermedades, infecciones e
infestaciones comunes a varias especies, y su presencia es de declaración
obligatoria (OIE, 2014); además, es considerada como parte de las
Enfermedades Transfronterizas en las Américas (ENTRAS) prioritarias para
el Continente Americano (GF-TADs, 2007).
Las pérdidas anuales por infestación de C. hominivorax, fueron
considerables en Estados Unidos, México y Centro América; mientras que,
en algunas Islas del Caribe y Sudamérica continúan siendo un problema
latente; por esta razón, se ha considerado más un problema para la industria
pecuaria que de salud pública; no obstante, los daños que causa a los seres
humanos son importantes en regiones donde prevalece este parásito
(Rodríguez et al., 2011).
Existen programas para la erradicación del GBG, dentro de los que la
Técnica del insecto estéril (TIE) ha alcanzado mejores resultados logrando la
eliminación de este parásito de los Estados Unidos, México, Puerto Rico, las
Islas Vírgenes, Curaçao y otros países de Centro América (CFSPH, 2007).
2
Sin embargo, una de las actividades importantes para llevar a cabo un
programa de erradicación del GBG es establecer una correcta identificación,
ya que en estudios previos se han encontrado diferencias morfológicas entre
individuos de distintas poblaciones del gusano barrenador, además del alto
parecido morfológico entre los adultos y larvas de C. hominivorax y
Cochliomyia macellaria (Figarola, 2001; Skoda et al., 2002; Toledo, 2007).
Debido a los impedimentos taxonómicos que existen para una correcta
identificación de especies, el desarrollo de métodos moleculares ha permitido
abordar estos problemas empleando marcadores génicos como el uso de
regiones codificantes, no codificantes, conservadas y de alta variabilidad del
ADN mitocondrial. Las principales regiones de ADN mitocondrial que más
han sido utilizadas en estudios evolutivos corresponden los genes de ARNs,
12S, 28S, 16S, y las subunidades I y II del citocromo oxidasa c y b (Fresia et
al., 2007; Fresia et al., 2013 (Lyra et al., 2005; Lyra et al., 2009; Litjens et al.,
2001; McDonagh et al., 2009; Taylor et al., 1996); así como, la región control
y las subunidades del complejo NADH (Lessinger et al., 2000; Palumbi, 1996
citado por Lessinger, 1998; Toledo, 2007).
El ADN mitocondrial ha demostrado ser útil en los análisis evolutivos a partir
de genes (filogenética) debido a su herencia materna, rápida tasa de
divergencia y falta de recombinación (Simon et al., 1994; Kress & Erickson,
2012).
La falta de información del Gusano Barrenador del Ganado o la confusión
generada con otros agentes causantes de miasis de aparente importancia en
las zonas cálidas de Ecuador, establece que es necesario investigar la
situación real del parasito en el país; es por eso, que esta investigación se
realizó como parte del proyecto “Epidemiología molecular de parásitos y
microorganismos de interés zoonósico y de Salud Pública: Gusano
Barrenador del Ganado, Garrapatas y Fiebre Aftosa, financiado por la
Universidad Central del Ecuador - Núcleo de Investigadores, en colaboración
con el Centro Internacional de Zoonosis. Por lo anterior, el presente estudio
3
tuvo como objetivo identificar morfológicamente a las poblaciones de
Cochliomyia spp., mediante el uso de claves dicotómicas y analizar los genes
mitocondriales mediante herramientas bioinformáticas.
4
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA
Antecedentes
En el Ecuador, la larva de la mosca C. hominivorax fue descrita por primera
vez en un estudio realizado por Arteaga et al. (2012), aunque la mosca ha
sido conocida desde mucho tiempo antes, como causante de miasis
traumática, sin haber sido identificada. Miño et al. (2005), realizaron un
sondeo utilizando una encuesta epidemiológica para orientar la presencia del
parásito en el Ecuador sin demostrar físicamente su presencia. Del mismo
modo, varios estudios realizados por Lyra (2008) y McDonagh et al. (2009)
reportaron larvas de moscas colectadas en el Ecuador, las cuales fueron
identificadas como C. hominivorax mediante análisis de variabilidad genética
y filogenia. La importancia dada a C. hominivorax en la producción animal y
en la Salud Pública, además de la dificultad en la identificación de algunos
ejemplares, ha permitido el desarrollo de estudios basados en el análisis de
genes (Fresia et al., 2007; Griffiths et al., 2009; Infante, 1994; Infante, 1999;
Lyra et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Narang & Degrugillier, 1995; Taylor
& Peterson, 1994; Torres & Azeredo, 2009); mientras que los trabajos de
Alamalakala et al. (2009), Taylor et al., 1996, Toledo, (2007), Skoda et al.
(2002) y Skoda et al. (2012) se han enfocado en la diferenciación de C.
hominivorax de C. macellaria. La falta de estudios en el Ecuador sobre C.
hominivorax y su diferenciación con C. macellaria hace importante la
presente investigación y, además, permite evaluar la importancia de
Cochliomyia spp., tanto a nivel productivo como en Salud Pública.
5
Generalidades
El género Cochliomyia (Diptera: Calliphoridae) posee 4 especies: C.
hominivorax (Coquerel 1858), C. macellaria (Fabrícius 1775), C. aldrichi (Del
Ponte 1938) y C. minima (Shannon 1926) (Dear, 1985). Las dos primeras
especies son las que están comúnmente relacionadas con casos de miasis, y
la semejanza morfológica entre estas dos especies ha ocasionado
identificaciones erróneas; mientras que, las otras dos especies casi no se
reportan como causantes de miasis (FAO, 1993b). La larva de la mosca C.
hominivorax es considerada como la plaga de mayor importancia económica
por su impacto sanitario en animales de sangre caliente y los seres humanos
(Forero et al., 2008).
Clasificación Taxonómica de Cochliomyia spp. ( Según Wall et al., 2001;
americana y su nombre oficial actual es Cochliomyia hominivorax (del latin,
Cochlio= en forma de espiral o tornillo y Myia= mosca), muy conocida
comúnmente como gusano barrenador primario, gusano barrenador del
Nuevo Mundo, gusano tornillo, Screwworm en inglés y Bicheira en portugués
(FAO, 1993a; Bajatta, 2007; Forero et al., 2008).
Dada la gran similitud morfológica de C. hominivorax con C. macellaria, se
suponía que eran la misma especie y que las pocas diferencias que
presentaban se debían al medio alimenticio y ecología. Durante mucho
tiempo C. hominivorax fue considerada sinónimo de C. macellaria (Rocha,
1956 citado por Lyra; Alavez, 1975). Posteriormente, el Dr. Emory Cushing y
el Dr. Walter Patton, en 1933, establecieron la diferencia entre estas dos
moscas (Bajatta, 2007).
7
Ciclo de vida de C. hominivorax- GBG
El ciclo de vida del gusano barrenador del ganado es holometábolo, es decir
su etapa de metamorfosis es completa, pasando por fases de huevo, larva,
pupa y adulto (Rodríguez et al., 2011). La hembra es monógama; mientras
que, la mosca macho es polígamo (Alavez, 1975; COMEXA, 2008); una vez
que es fecundada, la hembra deposita sus huevos en los bordes de heridas,
en mucosas lesionadas principalmente de aberturas naturales del cuerpo e
incluso en
aquellas lesiones causadas por garrapatas (Rodríguez, 2011). Las moscas
depositan una masa de huevos superpuestos como tejas, todos orientados
en una misma dirección; cada hembra puede ovipositar, durante su vida,
entre 200 a 500 huevecillos, en aproximadamente 4 posturas en varios días;
la temperatura óptima para ovipositar es de 21 a 29°C (Bárcenas, 2010;
Quiroz, 2003).
Luego de 12 a 24 horas los huevecillos eclosionan y las larvas se introducen
en el tejido del hospedador. La forma de la herida se asemeja a un túnel o
bolsillo; esto debido a que las larvas laceran el tejido para alimentarse con
los fluidos corporales (Quiroz, 2003). A medida que las larvas se alimentan
van aumentando de tamaño, pasando por tres estadíos larvales. Después de
4 a 8 días las larvas abandonan la herida para caer al suelo y se entierran
para transformarse en pupas. Finalmente, luego de 7 a 54 días, dependiendo
de la temperatura ambiental, emerge la mosca adulta. El periodo de vida, en
condiciones normales, desde huevo hasta adulto es de 3 a 4 semanas y en
condiciones adversas su periodo puede prolongarse por 2 a 3 meses
(Guimarães et al., 1983; Bajatta, 2007).
La hembra alcanza su madurez sexual, después de 2 a 4 días de haber
emergido de la pupa y a partir del quinto día está lista para ovipositar; se
alimenta de proteínas de las heridas animales antes o después de su
oviposición y de hidratos de carbono (néctar de las flores) y agua. Estas
moscas pueden llegar a vivir hasta 30 días. Por el contrario, el macho
alcanza su madurez sexual a las 24 horas de nacido, se alimenta
8
principalmente de néctar de flores y puede llegar a vivir hasta 14 días (FAO,
1993a; CFSPH, 2007). En caso de no encontrar una herida, una mosca
puede viajar de 10 a 20 Km en climas tropicales ó 290 km en menos de dos
semanas en ambientes áridos (OIE, 2013; Spradbery, 1994).
Figura 1. Ciclo de vida de C. hominivorax
Fuente: CIZ (2015)
Distribución Geográfica
El GBG del nuevo mundo es originario de las regiones tropicales y
subtropicales del continente Americano; históricamente estuvo distribuido
desde el Centro y Sureste de los Estados Unidos, México, Centro América,
Panamá, Islas del Caribe y toda Sudamérica. En la actualidad, el GBG se
encuentra presente de forma endémica en América del Sur, a excepción de
Chile, y en algunos países del Caribe (Cuba, República Dominicana, Haití,
Trinidad-Tobago y Jamaica que se encuentra en proceso de erradicación)
(Bajjata, 2007; Robinson et al., 2009; Rodríguez, 2011). No es común
encontrarlo sobre los 2100 msnm (CFSPH, 2007). El gusano barrenador del
nuevo mundo fue detectado en Libia en 1988; sin embargo, por la oportuna
intervención epidemiológica fue erradicado en 1991(Ortiz, 2005).
9
Cochliomyia macellaria
La mosca C. macellaria, conocida como gusano barrenador secundario, fue
descubierta por Fabricius en 1775 quien la denominó Musca macellaria;
posteriormente, su nomenclatura ha ido cambiando a Callitroga macellaria y
actualmente se la conoce como Cochliomyia macellaria (Dear, 1985; Maes et
al., 1994; Whitworth, 2010)
Ciclo Biológico de Cochliomyia macellaria
El ciclo de vida incluye 4 etapas: huevo, larva, pupa y adulto. Las larvas de
C. macellaria se alimentan solo de tejido necrótico (necrófaga) de cadáveres
(Quiroz, 2003), aunque, se ha observado en tejido necrótico de heridas en
animales vivos, por lo que se les considera invasoras secundarias. Las
hembras pueden depositar hasta 1000 huevecillos en lotes de 40 a 250
huevos y, es frecuente que varias hembras se reúnan para la postura (do
Valle, 1997). En condiciones favorables, la eclosión se presenta dos horas
después de la oviposición y las larvas alcanzan su estadío 3 en un periodo
de 6 a 20 días. Posteriormente, abandonan el tejido para empezar a pupar
en un transcurso de 3 a 27 días. El periodo de vida desde huevo hasta adulto
puede durar entre 9 a 39 días (FAO, 1993b).
Los especímenes adultos de C. macellaria pueden vivir de 2 a 6 semanas,
alimentándose de los líquidos presentes en la materia orgánica en
descomposición, que también lo utilizan para su oviposición (Guimarães et
al., 1983).
Distribución Geográfica
Se encuentra ampliamente distribuidos en América desde el Sur de Canadá
hasta la Patagonia, incluido las Islas Galápagos y el Oeste de la India (Dear,
1985; Koller et al., 2011).
10
Morfología diferencial entre C. hominivorax y C. macellaria
Las principales características morfológicas que se utilizan en la
diferenciación de estas dos especies se las observan en larva estadío 3
según las claves de la FAO (1993a); COMEXA (2008) y Florez & Wolff (2009)
y, en adultos según Cushing & Hall (1937, citado por Barcellos, 1980); James
(1970 citado por Guimarães et al., 1983); Dear (1985); Spradbery (2002) y
Whitworth (2010), quienes describen las principales características
morfológicas empleadas para su diferenciación, las cuales se detallan en la
Tabla 1 y 2.
Tabla 1. Características morfológicas diferenciales entre las larvas en estadío 3 de
C. hominivorax y C. macellaria
Adaptado de: FAO,1993a; COMEXA, 2008 Florez & Wolff, 2009
Descripción C. hominivorax C. macellaria
Banda de espinas Espinas de 1 a 3 puntas, siendo más a
menudo 1 ó 2 puntas. Fig.2ª
Espinas pequeñas con 1 a 3 puntas,
siendo más a menudo 2 puntas. Fig. 3A
Espiráculos anteriores
Espiráculos anteriores, los cuales
presentan una prolongación (forma de
mano) cada uno de 6 a 11 lóbulos o
papilas. Usualmente de 7 a 9 lóbulos.
Fig.2ª
Espiráculos anteriores cortos con lóbulos
ó papilas cortas, que varían de 8 a 12.
Usualmente 9 a 11 lóbulos. Fig.3A
Troncos Traqueales
Los dos troncos traqueales presentan
una pigmentación oscura que va
desde el espiráculo posterior que se
encuentra en el doceavo segmento
hasta el décimo o incluso el noveno
segmento. Fig. 2ª
Los dos troncos traqueales pigmentados
de color oscuro solo hasta un tercio del
último segmento (doceavo). Fig.3C
Localización en el hospedador Barrenan o profundizan dentro del
tejido (lesión en forma de bolsillo) Se encuentran superficialmente.
11
Figura 2. Características del estadío larvario 3 de C. hominivorax: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: Laake et al., 1936 citado por OIE, 2013; COMEXA, 2008.
Figura 3. Características del estadío larvario 3 de C. macellaria: (A) aspecto lateral de la larva completa; (B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espiráculo anterior; sp = espinas; p = peritrema; ar = aberturas respiratorias; tr = troncos traqueales) Adaptado de: COMEXA, 2008; Florez & Wolff, 2009; Mendes, 2009
12
Tabla 2. Características morfológicas diferenciales entre los adultos de C.
Figura 4. Características morfológicas diferenciales entre adultos de C. hominivorax y C. macellaria; p = placa fronto - orbital, vista desde arriba y lateralmente en la cabeza; b = basicosta; tx = Tórax con las bandas longitudinales; ab= abdomen dividido en tergos) Adaptado de: OIE, 2013; Spradbery, 2002.
Morfología C. hominivorax C. macellaria
CABEZA – Región Frontal
Placas fronto - orbitales con setas
de color negro u oscuro, fuera de las
setas frontales. Fig.3p
Tercio inferior a la mitad de las
Placas fronto – orbitales solo con
setas de color pálido o amarillo
fuera de las setas frontales, (pero
en algunos casos sus inserciones
aparecen con puntos negros).
Fig.3p
ALA
En las hembras la basicosta es de
color marrón oscuro a casi negro.
Fig.3b
En las hembras la basicosta es de
color amarillo. Fig.3b
TÓRAX
La banda central en el tórax apenas
se extiende hacia delante de la
sutura mesonotal, es decir la banda
central es más corta que las 2
bandas laterales. Fig.3tx
La banda central en el tórax se
extiende mucho más adelante de la
sutura mesonotal, es decir las tres
bandas son del mismo tamaño.
Fig.3tx
ABDOMEN
Quinto tergito (cuarto visible)
lateralmente sin microtomentum
plateado. Fig.3ab
Quinto tergito (cuarto visible)
lateralmente con microtomentum
plateado pronunciado que parecen
manchas muy visibles. Fig.3ab
13
En la fase adulta, las moscas del género Cochliomyia se las puede distinguir
de otros géneros, que se encuentran relacionados en miasis de heridas, por
la coloración del cuerpo que varía entre verde y azul metálico o púrpura
azulado y la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax
(FAO, 1993a; OIE, 2013). Su cabeza presenta pelos de color amarillo o
dorado y sus ojos son ocre rojizos; los machos se distinguen de las hembras
porque tienen sus ojos casi juntos, es decir son holópticos, mientras que, en
las hembras los ojos son más separados o dicópticos (Quiroz, 2003; Mendes,
2009). El color y la longitud del cuerpo no son características útiles para
establecer una distinción clara entre especies; C. hominivorax puede llegar a
medir de 8 a 10mm y C. macellaria de 6 a 9mm (FAO, 1993a). Según los
reportes, una especie de mosca denominada Compsomyiops callipes es
muy similar en apariencia a la mosca del género Cochliomyia, la cual se la
puede diferenciar por sus palpos clavados y calípter oscuro (café) (Byrd &
Castner, 2010; Withworth, 2006).
14
Epidemiología
Situación en América
El GBG del nuevo mundo es endémico en climas tropicales y subtropicales
del Continente Americano; su distribución está determinada por las
condiciones climáticas, debido a la incapacidad para sobrevivir a bajas
temperaturas (FAO 1993ª, Bajatta, 2007). En la actualidad, existen países
declarados libres de C. hominivorax entre los cuales se encuentran Estados
Unidos, México, Libia, Puerto Rico, las Islas Vírgenes, Curaçao y Centro
América (CFSPH, 2007; Rodríguez et al., 2011). Por el contrario, la mosca
del GBG sigue siendo prevalente en la República Dominicana, Haíti, Trinidad
y Tobago, Cuba, Jamaica y en todos los países de Sudamérica a excepción
de Chile. En Sudamérica, se estima una población ganadera de 463,392
millones entre bovinos, ovinos, equinos y caprinos y una población humana
de 330,750 millones, en riesgo de ser afectado por el GBG (Bajatta, 2007;
Rodríguez et al., 2011).
Figura 5. Mapa de distribución de los países libres del GBG
Fuente: Bajatta, 2007
15
Situación en el Ecuador
Para el periodo de Enero a Junio del 2014, La Organización Mundial de la
Sanidad Animal determinó la distribución de miasis causada por C.
hominivorax en animales, donde en algunos países de Centroamérica y
Sudamérica esta miasis representa una enfermedad clínica; no obstante,
para el Ecuador ha sido reportada como no observada en este periodo (OIE,
2015).
Figura 6. Mapa de distribución de miasis por C. hominivorax
Fuente: OIE (2015)
En este contexto, en los años 80, el Dr. Gonzalo Moya Borja, mientras
realizaba un estudio de Dermatobia hominis en Santo Domingo de los
Tsáchilas, identificó la presencia de larvas de C. hominivorax en animales
(Miño et al., 2005). Del mismo modo, en enero del 2005 el Servicio
Ecuatoriano de Sanidad Agropecuaria (SESA), actual AGROCALIDAD, con
la participación de la Comisión México – Americana para la erradicación del
GBG plantean la necesidad de conocer la situación de esta parasitosis en las
ganaderías ecuatorianas; por lo cual, se realizó una encuesta epidemiológica
con el fin de determinar la presencia de la larva del GBG obteniendo como
resultado, que de un total de 1255 predios encuestados, 522 fincas
reportaron su presencia, alcanzando un total de 4132 animales infestados
(Miño et al., 2005).
16
Para el año 2012, durante un estudio del comportamiento de C. hominivorax
en una región de Manabí, se registró un porcentaje de animales infestados
por esta larva de: bovinos (73.4%), porcinos (13.7%), ovinos (8.8%), equinos
(5.3%), caprinos (1.8%) y caninos (0.4%); además, se observó a C.
macellaria en casos de miasis en tres especies de animales (bovinos,
porcinos y ovinos) (Arteaga et al., 2012). Por otro lado, en una investigación
realizada en el 2014 sobre la Dinámica Poblacional del GBG en el Cantón
San Miguel de los Bancos Provincia de Pichincha, se encontró 52 moscas de
C. hominivorax y 23 moscas de C. macellaria, que fueron identificadas
morfológicamente usando claves dicotómicas, las cuales fueron colectadas
por medio de trampas aéreas a base de hígado en putrefacción (Jervis,
2014).
Según la OIE para el año 2005 en el Ecuador se reporta la presencia de
miasis por C. hominivorax en humanos, pero no hay información sobre el
número de casos (OIE, 2015).
El GBG es un importante agente de zoonosis, en especial en zonas
marginadas con condiciones sanitarias deficientes; el principal grupo de
riesgo son ancianos, niños y discapacitados (Bajatta, 2007; Forero et al.,
2007); es así que, se ha reportado 3 casos de miasis por C. hominivorax: un
caso de infestación en una paciente de 7 años proveniente de Esmeraldas
en 1994, quien presentó lesiones a nivel del pabellón auricular (Chico et al.,
1994); en el año 2014, se reporta un caso de Infestación maxilar por larvas
de C. hominivorax en una mujer de 24 años originaria del Cantón Santa
Isabel – Provincia del Azuay, a la cual le extrajeron 100 larvas que formaban
túneles larvarios en paladar duro, labio superior y mucosa del vestíbulo
superior de la cavidad bucal (Alemán & Reinoso, 2014) y, de igual manera,
para el año 2014, se presenta un caso de miasis orbital severa, causada por
C. hominivorax en una anciana Kichwa de 91 años de edad proveniente de la
Comunidad Tunipamba – Imbabura; la paciente tenía una lesión tumoral
17
ulcerada en el ojo derecho y de la cual se extrajo más de 100 larvas
(Dominguez et al., en prensa)
Impacto Económico
En 1933, los investigadores del Departamento de Agricultura de los Estados
Unidos de América revelaron que, el origen de las pérdidas económicas
causadas por miasis en las ganaderías no se debían al díptero C.
macellaria, sino a una especie diferente denominada C. hominivorax que
afectaba tanto a la industria ganadera y a los animales silvestres, así como
también causaba lesiones en los seres humanos (Rodríguez et al., 2011;
Forero et al., 2007)
La larva del GBG – C. hominivorax, ha afectado enormemente la ganadería
en el Continente Americano; no obstante, los factores de riesgo en los
animales están relacionados, principalmente, con las prácticas de manejo
(Forero et al., 2007). Rodríguez et al. (2011) mencionan que, en gran parte
de América, la larva de C. hominivorax es considerada como la principal
plaga de insectos del ganado debido a las infestaciones múltiples que
pueden llegar a ocasionar, mutilaciones y la muerte de los animales,
especialmente de terneros; los animales que no reciben tratamiento pueden
morir entre 7 y 14 días por las toxinas segregadas por las larvas y por la
presencia de infecciones secundarias, principalmente por bacterias
oportunistas como Escherichia coli y Proteus spp. (Anziani, 2011; CFSPH,
2007).
Las pérdidas anuales por costos de mano de obra para prevención y control,
tratamiento del ganado y costos de productos utilizados pueden llegar a ser
altos, sin considerar la muerte de los animales (Rodríguez et al., 2011). Las
pérdidas anuales reportadas para los Estados Unidos fueron de $870
millones de dólares, para México $319 millones, para Centro América $85.1
millones, el Caribe (Jamaica, República Dominicana, Haití, Trinidad y
Tobago, Cuba) $128.67 millones, y para los países de Sudamérica $3591.17
millones (Rodríguez et al., 2011). En este sentido, se calcula que el promedio
18
anual de gastos en varios países, por inspección y tratamiento, es de 7.76$
por animal, por lo que sus pérdidas económicas en conjunto resultarían ser
cuantiosas (Bajatta, 2007).
Erradicación del GBG – Cochliomyia hominivorax
En 1936, el Dr. Raymond Bushland desarrolló una técnica para criar
considerables cantidades de insectos en forma artificial, usando una dieta a
base de carne molida, sangre de bovino, agua y formol como conservante;
sin embargo, en el año de 1937, el Dr. Edward Knipling fue el primero en
establecer la teoría del control biológico de la mosca mediante la Técnica del
Insecto estéril, la cual establece la introducción de grandes cantidades de
machos sexualmente estériles en las poblaciones de insectos silvestres, con
el propósito de que los huevos ovipositados por las hembras fértiles
apareadas con dichos machos fueran infértiles y, por lo tanto, no exista
descendencia. Por el contrario, Bushland y Hopkins, en 1951, realizaron la
primera esterilización de moscas del GBG y demostraron que ambos sexos
La técnica del insecto estéril implica la producción masiva de moscas del
GBG y su esterilización en la fase de pupa por medio de radiación de rayos
Gamma (Cesium 137); después, los insectos estériles son dispersados en
una proporción de 10 moscas machos estériles por cada mosca hembra
silvestre (Rodríguez et al., 2011).
En Estados Unidos, se crearon plantas productoras de moscas estériles del
GBG que permitieron la erradicación en dicho país; sin embargo, debido a la
migración de moscas de México a Estados Unidos, en 1972, se formó la
Comisión México Americana para la Erradicación del Gusano Barrenador del
Ganado (CMAEGBG), cuyo objetivo fue erradicar el gusano en el territorio
mexicano, desde la frontera con Estados Unidos hasta la región del Istmo de
Tehuantepec- México; por esta razón, la comisión desarrolló una planta
productora de moscas estériles en Chiapa de Corzo, cuya capacidad de
19
producción era de 500 millones de moscas por semana; no obstante, esta
planta en México desapareció una vez que se logró la erradicación de esta
plaga en dicho país (Quiroz, 2003; Bajatta, 2007).
En la actualidad, la Comisión Panamá - Estados Unidos para la Erradicación
y Prevención del Gusano Barrenador del Ganado (COPEG) posee la Planta
productora de moscas estériles, cuya finalidad es la de proveer insectos
estériles para el mantenimiento de la última Barrera biológica, cuyo objetivo
es evitar el ingreso de esta plaga a la región Norte y Centro de América,
siendo su capacidad de producción de 100 millones de moscas semanales
(COPEG, 2014).
Biología Molecular en la Identificación de Insectos
La biología molecular juega un rol muy importante en la identificación de
insectos mediante la utilización del ADN; los insectos contienen material
genético (ADN nuclear y mitocondrial) que ha sido utilizado con el fin de
identificar las distintas etapas de vida de los insectos (Gennard, 2007).
20
ADN Mitocondrial
El uso de ADN mitocondrial (ADNmt) ha demostrado ser eficiente para
muchos grupos de animales como un marcador genético para estudios
evolutivos y poblacionales, debido al predominio de la línea materna, la falta
de recombinación y la rápida sustitución de nucleótidos (Fresia et al., 2007;
Simon et al., 1994; Sperling et al., 1994).
Lessinger et al., (2000), determinaron la secuencia del genoma mitocondrial
de C. hominivorax la cual es una molécula circular de 16022 pares de bases
(pb); en su genoma se encontró un gen que contiene 13 proteínas
codificables, 22 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 2 genes de ARN
ribosomal (ARNr).
Figura 7. Insect mitochondrial genome
Fuente: Gennard, 2012
21
Estudios Moleculares realizados en Cochliomyia
Los análisis moleculares con califóridos se ha concentrado en tres temas:
genética de poblaciones, identificación de especies y filogenia o análisis
evolutivos (Azeredo-Espin & Lessinger, 2006)
Dentro de las diferentes técnicas empleadas para el análisis del ADNmt
destacan el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP por
sus siglas en inglés), utilizando ADNmt para el análisis de poblaciones de
C.hominivorax (Infante & Azeredo-Espin, 1995; Roehrdanz, 1989; Lyra et al.,
2005) además de permitir la identificación y caracterización de especies del
GBG (Taylor et al., 1996; Litjens et al., 2011). Con la técnica de amplificación
aleatoria de ADN polifórmico (RAPD por sus siglas en ingles), Skoda et al.
(2002), realizaron estudios comparativos con C. hominivorax y C. macellaria;
no obstante, Alamalakala et al., (2009) utilizaron la técnica de Polimorfismo
en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP por sus siglas en inglés)
para la diferenciación de C. hominivorax de C. macellaria.
Las técnicas de fingerprinting (AFLP, RAPD) se han utilizado ampliamente en
todo el mundo, permitiendo obtener resultados adecuados en la
diferenciación de especies, pero ha presentado varios problemas en la
interpretación de las bandas obtenidas después del corte por enzimas; es así
que en la búsqueda de un mejor análisis de las secuencias se ha optado por
la secuenciación y el análisis bioinformático de las mismas.
Filogenia
La filogenia determina la historia evolutiva de un grupo de organismos,
utilizando matrices de información de moléculas de ADN y de morfología; con
esta información se establecen árboles filogenéticos que representan la
historia evolutiva de las especies, poblaciones y genes (Sadava et al., 2009).
La misión de la filogenética molecular es la construcción de árboles
22
filogenéticos a partir de la inferencia de las relaciones evolutivas existentes
entre las secuencias a estudiar (Page & Holmes, 2009).
La máxima parsimonia es uno de los métodos más utilizados en la
reconstrucción de árboles filogenéticos basado en caracteres, que tiene
como principal fundamento escoger el árbol filogenético que explica la
filogenia de un grupo con el menor número de pasos o eventos evolutivos
(Vaca & Larralde, 2009).
Debido a su condición de parásitos del ganado y su papel como especie
indicadora primaria en entomología forense, la familia Calliphoridae se
encuentra entre lo filogenéticamente más estudiado de las moscas
causantes de miasis (Steven, 2003; Wallman, J.F. et al., 2005); es así que
los estudios filogenéticos, de varios autores como McDonagh et al., (2009) y
Fresia, (2013), se han realizado en el sur, centro y norte de América.
Teniendo como punto de inicio los aspectos evolutivos, las miasis se pueden
agrupar en dos raíces filogenéticas distintas, considerando el
comportamiento y hábitos de vida de los organismos que lo causan. En la
raíz saprófaga, estos organismos estaban adaptados a la alimentación de
materia orgánica en descomposición, luego pasaron a alimentarse de
carcasas de animales y posteriormente de tejidos necrosados de vertebrados
en descomposición; mientras que, en la raíz sanguinívora, las larvas son
capaces de perforar el tegumento de otras larvas y alimentarse de su
contenido corpóreo. Posteriormente, estas larvas pasaron a perforar la piel
de hospedadores vertebrados y alimentarse de su sangre, haciéndose de
esa forma parásitos obligados (Guimarães & Papavero, 1999; Zumpt, 1965
citado por Grella, 2011).
23
CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación fue de tipo descriptiva, por medio de la que se detallaron los
procesos utilizados y por ende sus resultados.
El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en dos etapas en los
laboratorios del Centro Internacional de Zoonosis-Universidad Central del
Ecuador (CIZ-UCE); una en la Unidad de Entomología Aplicada (UEA),
donde se realizó los estudios de identificación morfológica y, la otra, en el
área de Biología Molecular, en donde se procedió a la extracción,
amplificación del ADN, visualización de las bandas; posteriormente, se envió
a secuenciar. Los especímenes adultos utilizados en este estudio pertenecen
a la colección del CIZ-UCE, los que han sido colectados durante el año 2013
y 2014.
El origen de las muestras colectadas proviene de San Miguel de los Bancos,
Saloya, Tumbaco y Quito (Valles), pertenecientes a la Provincia de
Pichincha. Para el estudio se utilizaron ejemplares en estadíos juveniles
(larvas) colectadas en miasis de bovinos y caninos y, moscas adultas
obtenidas de trampas y cadáveres de bovinos y armadillo. Cabe señalar que
los estadíos juveniles (larvas) fueron cultivadas en el laboratorio hasta la
obtención de adultos mismos que fueron utilizados en los estudios
moleculares.
El esquema para la selección de los individuos analizados se realizó en base
a los registros del CIZ, considerando el origen, la procedencia y el estado de
desarrollo de los ejemplares (Ver tabla 3).
24
Tabla 3. Esquema de selección de individuos para la Identificación morfológica y molecular
Origen Estadío # de ejemplares Procedencia (#)***
Animal vivo
Adultos* 3
Los Bancos (2)
Durán (1)
Larvas** 16
Los Bancos (3)
Saloya (7)
Tumbaco (3)
Quito (Valles) (3)
Trampa Adultos 8
Los Bancos (7)
Saloya (1)
Cadáver
Adultos***** 14
Los Bancos (8)
Saloya (6)
Huevos**** 7 Los Bancos (7)
Total = 48 ejemplatres
*Ejemplares adultos colectados directamente del animal vivo; **Larvas criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, ***Cantidad de ejemplares por localidad, **** Huevos criados hasta obtener moscas adultos, ***** Ejemplares adultos colectados directamente del cadáver.
Fase de Laboratorio: Unidad de Entomología Aplicada
Identificación y cultivo de larvas:
Las larvas obtenidas de las heridas de animales fueron identificadas
morfológicamente utilizando un estereomicroscopio y las claves para larvas
del género Cochliomyia, publicadas por el COMEXA (2008), FAO
(1993a,1993b), Florez & Wolff (2009) y Spradbery (2002); posteriormente,
fueron criadas en el laboratorio hasta obtener adultos, según el Manual de
FAO (1993a), las cuales se utilizaron para la investigación; este
procedimiento fue desarrollado por el personal del CIZ y no forma parte de
este trabajo.
25
Identificación Morfológica de Adultos de Cochliomyia spp:
Todos los adultos (capturados o procedentes de miasis) fueron identificados
utilizando un estereomicroscopio y claves dicotómicas de la FAO
Para la identificación morfológica se utilizaron 48 ejemplares adultos; mismos
que se detallan en la Tabla 7.
Tabla 7. Procedencia y fecha de obtención de los ejemplares
N° Código Procedencia Dato de Captura Estadío
de vida
Fecha de
Captura
1 1C San Miguel de los
Bancos Animal Vivo-oreja A 7-nov-2013
2 2C San Miguel de los
Bancos Animal Vivo A 20-ene-2014
3 3C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
4 4C Quito(Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
5 5C Quito(Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
6 6C San Miguel de los
Bancos Trampa A 7-nov-2013
7 7C San Miguel de los
Bancos Trampa A 7-nov-2013
8 8C San Miguel de los
Bancos Trampa A 7-nov-2013
9 9C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
10 10C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
11 31C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
12 32C Quito (Tumbaco) Animal Vivo A 30-sep-2013
13 33C San Miguel de los
Bancos Trampa A 7-nov-2013
14 34C San Miguel de los
Bancos Trampa A 27-sep-2013
32
15 35C San Miguel de los
Bancos Trampa A 27-sep-2013
16 36C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
17 37C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
18 38C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
19 39C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
20 40C San Miguel de los
Bancos Cadáver lab. A 19-nov-2013
21 41C San Miguel de los
Bancos Cadáver armadillo A 24-ene-2014
22 42C San Miguel de los
Bancos Cadáver.armadillo A 24-ene-2014
23 45C San Miguel de los
Bancos Trampa A 27-sep-2013
24 46C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013
25 47C Saloya Animal Vivo A 7-dic-2013
26 48C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014
27 49C Saloya Animal Vivo A 26-mar-2014
28 50C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
29 51C Saloya Trampa A 25-oct-2013
30 52C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
31 54C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
32 55C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
33 56C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
34 57C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
35 58C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
36 59C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
37 60C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
38 61C San Miguel de los
Bancos Animal Vivo- oreja A 7-nov-2013
33
A, ejemplar adulto
Fuente: CIZ (2015)
Las moscas del género Cochliomyia fueron diferenciadas de otros géneros
causantes de miasis en heridas, principalmente por la coloración del cuerpo y
la presencia de tres bandas longitudinales oscuras sobre el tórax. Estas
condiciones, en términos generales, no son compartidas por otras especies
que hayan sido implicadas en las miasis de las heridas, como parásito
obligatorio. Las principales características observadas en las moscas de este
estudio, para discriminar entre C. hominivorax de C. macellaria, se detallan
en la Figura 8.
39 62C San Miguel de los
Bancos Animal Vivo A 20-ene-2014
40 63C San Miguel de los
Bancos Animal Vivo A 20-ene-2014
41 64C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
42 65C Saloya Animal Vivo A 21-ene-2014
43 66C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
44 67C Quito (Valles) Animal Vivo A 30-nov-2013
45 68C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
46 69C Saloya Cadáver A 27-nov-2013
47 70C San Miguel de los
Bancos Cadáver A 7-nov-2013
48 100C Guayaquil/Guayas Animal Vivo A 5-jun-2013
34
Figura 8. Adultos de C. hominivorax (izq) y C. macellaria (dcha). (a y b) Cabeza - Vista Frontal. (c y d) Tórax -Vista dorsal. (e y f) Ala – Vista lateral. (g y h) Abdomen – Vista lateral. Fuente: CIZ (2015)
a. C. hominivorax - Placas fronto - orbitales con setas de color negro
b. C. macellaria - Placas fronto - orbitales con setas de color amarillo y las inserciones de las setas aparecen como puntos negros
c. C. hominivorax - Tres bandas longitudinales, la del centro es más corta.
d. C. macellaria - Tiene tres bandas longitudinales negras de igual longitud.
e. C. hominivorax - En hembras las basicosta es de color marrón oscuro o negro.
f. C. macellaria - En hembras las basicosta es de color amarillo.
g. C. hominivorax - Quinto tergito (cuarto visible) lateralmente sin microtomentum plateado.
h. C. macellaria - Quinto tergito (cuarto visible) lateralmente con microtomentum plateado.
35
La identificación por claves morfológicas, en los ejemplares adultos, hasta la
fecha ha presentado falencias, entre autores, que han dificultado la
diferenciación certera de algunos individuos que comparten características
similares. No obstante, las claves dicotómicas, reportadas en la literatura,
presentan pocos caracteres únicos que permiten diferenciar entre especies;
los que, en la literatura científica no muestran un consenso (Figarola, 2001;
Skoda et al., 2002; Toledo, 2007). Es por esto que, las características
morfológicas que se detallan en la Fig. 8, por si solas no aportaron
información clara para diferenciar a estas dos especies. Dos ejemplos claros
son la descripción de colores y las bandas del tórax las que, en este estudio,
resultaron ser muy subjetivas y sin valor diagnóstico, ya que no concuerdan
con la descripción de los ejemplares reportados en las claves dicotómicas.
Del mismo modo, la coloración de la basicosta es característica para
diferenciar entre hembras de estas dos especies lo que coincide con la
literatura reportada (Spradbery, 2002); sin embargo, la principal limitante de
esta característica es que no diferencia a los machos entre especies;
consecuentemente, se necesitan otras estructuras (genitalia del macho) para
su diferenciación. La observación de los genitales requiere de una
especialización y de protocolos complejos que no fueron utilizados en este
estudio.
Los registros del CIZ-UCE, respecto al origen de los especímenes, incluidos
en este estudio, fueron importantes ya que permitieron, en base de la
procedencia, establecer la especie de mosca adulta; es decir, los casos de
miasis recuperados en animales vivos correspondieron a C. hominivorax y
los que fueron colectados en cadáveres pertenecieron a C. macellaria, ya
que la identificación de ejemplares en estadío larval 3 es más fácil de
diferenciar que los ejemplares adultos (FAO, 1993a; Rodríguez, et al., 2011;
OIE, 2013); además, el comportamiento de las larvas es muy marcado y ha
permitido diferenciarlas por sus hábitos alimenticios.
36
Por todo lo anteriormente expuesto, de acuerdo con la identificación de las
claves morfológicas del COMEXA (2008); FAO (1993a,1993b); Florez & Wolff
(2009); Spradbery (2002) y Withworth (2010) para larvas, moscas del género
Cochliomyia, y los datos obtenidos del origen de colecta, del total de
ejemplares analizados, se identificaron dos especies; el 66,67% (32/48)
correspondió a ejemplares de Cochliomyia macellaria y, el 33,33% (16/48) a
Cochliomyia hominivorax.
Según los registros del CIZ-UCE (datos no publicados), se obtuvieron 19
ejemplares, 3 moscas adultas y 16 larvas, capturados o colectados en
animales vivos. De este grupo, los 3 ejemplares adultos, capturados en la
cercanías de una herida en los animales vivos, correspondieron a la especie
C. macellaria; 2 de estas moscas fueron colectadas en San Miguel de los
Bancos - Pichincha y una en Durán - Guayas. Es importante señalar que se
evidenció la presencia de cadáveres cerca de los animales vivos que
presentaban la herida; consecuentemente, es muy probable que las moscas
colectadas, y que corresponden a C. macellaria, estaban buscando el
ambiente adecuado para copular ya que, todos los ejemplares fueron
machos en busca de hembras; según Benedito, (1992), los tejidos
necrosados de la heridas simulan la presencia de un cadáver y las
condiciones ideales para la reproducción.
Las restantes 16 moscas adultas (originalmente colectadas como larvas)
provenían de casos de miasis en bovinos originarios de Saloya y de San
Miguel de los Bancos, y en caninos en la Ciudad de Quito, del sector los
valles y Tumbaco (Ver tabla 7), las que fueron identificadas como C.
hominivorax.
Del mismo modo, los 21 ejemplares, 14 moscas adultas capturadas en
cadáveres y 7 moscas adultas cultivadas en el CIZ-UCE a partir de huevos
ovipositados (Ver tabla 3), correspondieron a la especie C. macellaria. De los
21 ejemplares, 14 adultos fueron colectados de San Miguel de los Bancos y
37
Saloya, y 7 adultos cultivados (a partir de huevos ovipositados) de San
Miguel de los Bancos.
Finalmente, 8 ejemplares adultos colectados en trampas (7 moscas
provenientes de San Miguel de los Bancos y una colectada en Saloya),
confirmaron ser de la especie C. macellaria.
El origen de las muestras juega un papel muy importante para la
discriminación de las dos especies; es así que, se identificó la presencia de
C. hominivorax solo en los 16 casos de miasis de bovinos y de caninos;
mientras que, todas las muestras colectadas fuera de una miasis resultaron
ser C. macellaria; es decir, aquellas colectadas en trampas, cadáveres o
simplemente capturadas en los alrededores de las heridas de los bovinos.
Andrade et al., (2005) y Toledo, (2007) identificaron a C. macellaria en
cadáveres y trampas, respectivamente lo que está en concordancia con este
estudio. Por otra parte, Arteaga et al., (2007) y Valviesse et al., (2014), en
sus investigaciones, identificaron a las dos especies asociadas en casos de
miasis; la razón de este hallazgo fue que C. macellaria interviene como un
invasor secundario de la herida; esto puede ser debido a la preferencia
alimenticia de cada una de estas especies, lo cual concuerda con lo afirmado
por Cushing & Patton, (1933), citado por Azeredo, (1982), quienes fueron los
primeros en establecer la distinción entre las dos especies por sus hábitos
alimenticios. Del mismo modo, Byrd & Castner, (2010), COMEXA, (2008),
FAO, (1993b), Hall, (1991) y Quiroz, (2003), mencionan que el
comportamiento principal de la larva de C. hominivorax es alimentarse de
tejido vivo (parásito obligado en los casos de miasis); mientras que, la larva
de C. macellaria se desarrolla en cadáveres o restos de carcasas. C.
macellaria solo participa como un eventual invasor secundario de miasis,
alimentándose de los bordes del tejido necrosado de las heridas; por esta
razón, esta especie, ha ganado reconocimiento en la entomología forense
como una especie principal para basar estimaciones de intervalos post
mortem del fallecimiento de la víctima. En este estudio, el comportamiento de
38
estas dos especies también fue considerada como un aspecto importante
para su diferenciación, gracias a los registros de colecta del CIZ-UCE (datos
no publicados).
Según la afirmación de Fresia et al., (2007) quienes indican que C.
hominivorax es la especie más frecuente en procesos miásicos en Uruguay,
este estudio desacuerda con los autores debido a que, la miasis más
frecuente del área de estudio es Dermatobia hominis (observaciones
personales). En Uruguay, la presencia de Dermatobia hominis es igual de
importante que en el Ecuador (Conti, 2001). Del mismo modo, es importante
recalcar que en el Ecuador, las especies reportadas como obligatorias,
causantes de miasis, en el ganado bovino son C. hominivorax y Dermatobia
hominis; hasta la fecha, no se ha reportado una especie diferente a las
mencionadas.
Según los registros del CIZ, las larvas colectadas de las miasis de los
animales corresponden al tercer estadio de desarrollo de Cochliomyia (datos
no publicados); mismas que presentan un cuerpo liso dividido en 12
segmentos, cada uno cubierto por bandas de espinas de 1 a 3 puntas. En el
borde posterior del segundo segmento, a ambos lados se encuentran los
espiráculos anteriores, los cuales presentan lóbulos o papilas; mientras que,
los espiráculos posteriores no se encuentran en cavidad sino expuestos en el
último segmento (12 segmento), y el peritrema del espiráculo posterior es
incompleto por lo que no rodea completamente a las aberturas respiratorias;
sin embargo, la principal característica que se observó para diferenciar a las
dos especies fueron los troncos traqueales. En este sentido, los resultados
de identificación morfológica del CIZ-UCE (datos no publicados)
determinaron que las larvas, colectadas en miasis de los animales,
corresponden a C. hominivorax; mientras que, las larvas provenientes de
huevos, ovipositados en los tubos de ensayo, pertenecen a C. macellaria.
Este resultado, previamente expresado por el CIZ-UCE, confirma la
39
identificación morfológica de las moscas adultas en este estudio, como se
expresa en la Fig. 9
Figura 9. Larvas y Adultos de C. hominivorax y C. macellaria
(A) Larva de C. hominivorax (B) Larva de C. macellaria (C) Mosca de C. hominivorax (D) Mosca de C. macellaria. Fuente: CIZ (2015)
Algunos autores como Toledo, (2007) y Fonseca, (1999), se basaron en los
caracteres detallados anteriormente en la Figura. 8 para diferenciar a las dos
especies. Sin embargo, Toledo, (2007) señala que se han encontrado
diferencias morfológicas entre ejemplares adultos de distintas poblaciones
del GBG como la variación del color del cuerpo y los ojos, así como
anormalidades en la venación de las alas, lo que es corroborado por el
Servicio de Investigación agrícola del Ministerio de Agricultura de los Estados
Unidos, quienes poseen 6 poblaciones del GBG (moscas adultas)
provenientes de México, Costa Rica y Panamá, las mismas que presentan
diferencias morfológicas.
40
Otro factor importante es que durante mucho tiempo las miasis han sido
tratadas con insecticidas y esto, probablemente, ha llevado a una resistencia
producto de mutaciones, como lo afirma Lachance & Hopkins, (1962)
quienes encontraron 9 mutaciones en la mosca C. hominivorax que
afectaban a la coloración del cuerpo, venación de las alas y otras estaban
ligadas al sexo.
Por los antecedentes mencionados, estas variaciones morfológicas pueden
influir en una correcta identificación; razón por la cual, estudios basados en
análisis de regiones del ADNmt se han venido desarrollando, con el fin de
facilitar un acercamiento para la identificación taxonómica y de relaciones
entre poblaciones estudiadas de C. macellaria y C. hominivorax (Taylor et al,
1996; Litjens et al., 2001; Skoda et al., 2002; Skoda et al., 2012;
Alamalakala et al., 2009; McDonagh et al., 2009; Toledo, 2007).
Identificación Molecular
La extracción de ADN y la amplificación según los protocolos publicados por
Echeverría et al. (2015), permitieron obtener un ADN en buen estado. La
secuenciación de los productos amplificados de las regiones COI y 12S de
48 ejemplares adultos (96 reacciones) se realizó en Eurofins Genomics.
De las 48 muestras analizadas morfológicamente, realizadas la extracción,
cuantificación (Ver anexo B), amplificación de ADN y enviadas a
secuenciación, solo 33 y 30 muestras presentaron cromatogramas
adecuados para el análisis filogenético para el gen COI y 12S ARNr
respectivamente. Las muestras que presentaron problemas son 15 las cuales
pertenecen a: 6 ejemplares de casos de miasis en caninos, 4 ejemplares de
miasis en bovinos y 2 ejemplares adultos capturados en heridas; del mismo
modo, una muestra colectada en trampa y dos muestras obtenidas en
cadáveres, por lo tanto no fueron incluidas en este análisis. Probablemente,
esto se debe a que presentaban exceso de ruido, es decir problemas en la
41
diferenciación de las bases nitrogenadas posiblemente por errores en el
almacenamiento, extracción, secuenciación y manipulación durante el
procesamiento de la muestra en los laboratorios (Ver anexo C).
Para la identificación molecular de las secuencias, se editaron las
secuencias con ayuda de los cromatogramas en el programa Sequencher 4.2
y fueron introducidos en la herramienta BLAST de Pubmed; los resultados de
este análisis son presentados en el Anexo D.
Análisis Filogenéticos
Las secuencias consenso de los genes citocromo oxidasa subunidad I (COI)
y 12S de las muestras de estudio, como resultado dieron secuencias de una
longitud de 467 pb (COI), 322 pb (12S) y al unir la información de los dos
genes una longitud de 944 pb. Posteriormente, estas secuencias fueron
analizadas mediante el software de alineamiento MacVector en donde se
incluyó secuencias externas desde la base de datos Pubmed (Ver anexo E)
y se realizó un alineamiento mediante ClustalW. Por último, mediante PAUP
se realizó análisis de máxima parsimonia para obtener las relaciones
filogenéticas.
Citocromo Oxidasa subunidad I (COI)
Los análisis de parsimonia máxima de los 56 taxa arrojaron como resultado 9
árboles óptimos, con un valor de longitud (L) de 387.17, Índice de
consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.89.
En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 10, se pueden
observar 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del
genbank, pertenecientes a los grupos externos o de referencia; un segundo
grupo en la parte interna conformado por secuencias de C. macellaria del
genbank asociadas con las secuencias provenientes de muestras de trampas
42
y cadáveres. Este grupo presentó una politomía (nodos no resueltos), con un
valor de apoyo del 100%; sin embargo, las muestras 10C, 36C y 37C se
encuentran muy emparentadas ya que provienen de ejemplares
(originalmente colectados como huevos) en cadáveres; así mismo, las
secuencias 33C, 50C, y 68C se encuentran emparentadas proviniendo de
trampa y cadáveres respectivamente.
Adicionalmente, la secuencia de Compsomyiops fulvicrura obtenida del
genbank, muestra una relación basal y hermana con el grupo de C.
macellaria. Un tercer grupo, conformado por secuencias de C. hominivorax
del genbank con secuencias provenientes de muestras de miasis, presentó
un valor de apoyo del 100%.
43
Figura 10. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI.
-
C. macellaria
Grupo externo
Grupo externo
C. h
om
iniv
ora
x
44
ARN ribosomal (12S)
Los análisis de máxima parsimonia de los 33 taxa utilizadas arrojaron como
resultado 9 árboles igualmente óptimos, con un valor de longitud (L) de 55.1,
Índice de consistencia (IC) de 0.87 e Índice de retención (IR) de 0.80.
En el árbol consenso de mayoría que se muestra en la Fig. 11 se observan 3
grupos definidos, un primer grupo conformado por secuencias del genbank,
pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo grupo, en la
parte interna conformado por secuencias de C. macellaria provenientes de
muestras de trampas y cadáveres; este grupo presentó una politomía, la
misma que coincide con la observada en el árbol del gen citocromo oxidasa I
y presenta un valor de apoyo del 100%. Y un tercer grupo conformado por
secuencias provenientes de muestras de miasis con un valor de apoyo del
100%. Por otra parte, la secuencia de Calliphora vomitora, obtenida del
genbank, manifiesta alguna relación con dos de los grupos definidos.
Para este análisis, no se incluyó secuencias del genbank de C. macellaria
porque no hay datos para este gen publicadas y, en el caso C. hominivorax
hay secuencias (FM867729, FM867727, FM867728) que presentan
problemas y se sospecha de una mala identificación ya que en los
alineamientos se muestran muy distintas a las secuencias del estudio.
45
Figura 11. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen 12S.
C. macellaria
C. hominivorax
Grupo externo
46
Genes combinados COI y 12S
Los análisis de máxima parsimonia de los 35 taxa utilizados arrojaron como
resultado 110 árboles igualmente óptimos con un valor de longitud de 577.4,
Índice de consistencia (IC) de 0.91 e Índice de retención (IR) de 0.92.
En el árbol de consenso de mayoría que se muestra en la Fig.12 se
observan 3 grupos definidos: un primer grupo conformado por secuencias del
genbank, pertenecientes al grupo externo o de referencia. Un segundo
grupo, en la parte interna, conformado por C. hominivorax de secuencias
provenientes de muestras de miasis que manifiestan alguna relación con
Phormia regina del genbank; este grupo tiene un valor de apoyo del 100%. Y
un tercer grupo, conformado por C. macellaria de secuencias provenientes
de muestras de cadáveres y trampas, presentó un valor de apoyo del 100%.
De forma similar a lo obtenido en el árbol del gen COI. La secuencia de
Compsomyiops fulvicrura sigue manifestando relación cercana y basal con el
grupo de C. macellaria
47
Figura 12. Árbol de consenso de mayoría producido por análisis de parsimonia del gen COI y 12S.
C. m
ac
ella
ria
C. h
om
iniv
ora
x
Grupo
externo
48
La topología de los árboles filogenéticos obtenidos para los genes COI y 12S
y la combinación de los 2 genes, no revelan mayores cambios en la
agrupación interna. Se puede observar la formación de tres grupos,
correspondientes a las secuencias de C. macellaria, C. hominivorax y
secuencias externas o de referencia; cada grupo tenía un valor de apoyo del
100%, lo que indica que el gen COI y 12S permitieron diferenciar a estas dos
especies, contrario de lo reportado por McDonagh et al., (2009), quien
establece que el gen COI revela un mayor grado de diferenciación que el gen
12S, el que presentó una falta de resolución en los árboles, lo que sugiere
que algunas regiones del ADNmt están experimentando tasas más rápidas
de evolución que otras regiones.
En la distribución interna del grupo de C. macellaria se observa politomías
en los tres árboles, lo que sugiere que las muestras están muy cercanamente
emparentadas; sin embargo, estas relaciones filogenéticas poco resueltas,
indican la necesidad de estudiar más genes del ADNmt que aporten con
más información con fines de estructura poblacional.
En el grupo de C. hominivorax, de alguna manera las muestras de miasis en
el árbol del gen COI se presentan en un solo clado, cercano a las muestras
de C. hominivorax del genbank, pero en una porción génica más conservada
como 12s lo está asociando con grupos más lejanos, lo que nos indica que
las muestras de miasis presentan alguna diferencia con las Cochliomyias
hominivorax del genbank provenientes de varios lugares. Cabe mencionar
que las muestras de miasis en la amplificación presentaron doble banda, por
esta razón se asume la diferencia entre las C. hominivorax de miasis con las
del genbank; sin embargo, no se descarta que el ambiente en el que se
desenvuelven cada uno de estos grupos son diferentes y esto ha ocasionado
diferencias genéticas que han dado a lugar a la divergencia evolutiva, como
lo menciona Fresia et al., (2011), quienes señalan que existe variabilidad
genética en las poblaciones de C. hominivorax, de la región del caribe y en
Sudamérica (Norte y sur de la Amazonia), por lo que las considera
49
poblaciones independientes; por consiguiente, algunos autores como
Roerhdanz (1989) y Taylor et al. (1996) señalan que las poblaciones de C.
hominivorax del Norte y Centro América, en relación con las poblaciones de
América del Sur, presentan un cierto grado de diferenciación.
Por lo anteriormente expuesto, Lyra et al., (2009) establecen que en la
especie C. hominivorax el aislamiento geográfico puede ser la principal
causa de la gran diferenciación poblacional. Por esta razón, es importante
conocer las diferencias poblacionales de la especie C. hominivorax; mismas
que representan un aspecto importante para el diseño de futuros programas
basados en la TIE en las diferentes regiones. Del mismo modo, el requisito
indispensable para la eficiencia del programa de erradicación del GBG es la
correcta identificación de las especies en los sitios muestreados. La falta de
este requisito podría ocasionar un serio error en la liberación de moscas
estériles innecesarias, lo cual representaría un alto costo para el programa
de control y erradicación de una región. Por otro lado, para declarar una zona
libre, una zona infestada o una zona re infestada de GBG, dependerá de la
correcta identificación de C. hominivorax.
Finalmente, la identificación morfológica de los ejemplares concuerda con los
resultados obtenidos en los árboles filogenéticos; las muestras procedentes
de miasis fueron identificadas morfológicamente como C. hominivorax y las
muestras provenientes de cadáveres, trampas y de moscas posándose en
heridas fueron identificadas como C. macellaria; esto concuerda con los
datos obtenidos en los tres árboles, en los que se observan dos grupos
claramente definidos, uno correspondiente a C. macellaria donde están las
muestras de trampas, cadáveres y moscas capturadas en animales vivos y,
el otro grupo corresponde a C. hominivorax donde están las muestras de
miasis.
50
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones
En base a las características morfológicas de las claves dicotómicas, y
los datos de origen de colecta de los ejemplares, se identificaron dos
especies de Cochliomyia; C. hominivorax presente en el 33.33%
(16/48) de muestras colectadas de casos de miasis, y C. macellaria
presente en el 66,67% (32/48) de muestras colectadas de trampas,
cadáveres y adultos capturados en animales vivos.
La información aportada por el gen mitocondrial Citocromo oxidasa
subunidad I (COI) y el gen ribosomal (12S) del ADN mitocondrial
permitió diferenciar a dos grupos de especies del género Cochliomyia,
provenientes de distintos orígenes de muestreo y localidades, debido
a su alta conservación y variabilidad.
51
Recomendaciones
Utilizar marcadores con evidencia de mayor variabilidad como el COI
subunidad II, el 28S, que permita resolver las politomías de los
árboles.
Realizar la identificación morfológica de la genitalia de los machos
como una característica adicional para diferenciar las especies de
Cochliomyia.
Reestructurar las claves morfológicas para larvas y moscas del
Género Cochliomyia.
Subir la información de las secuencias obtenidas del gen COI y 12S al
genbank con la finalidad de aportar información para otros estudios y
contribuir a incrementar la información del genoma de cada una de las
especies de Cochliomyia.
Plantear un estudio similar, pero con un número muestral mayor, de
diferentes localidades, para verificar la variabilidad genética de C.
hominivorax a nivel nacional, con la finalidad de implementar un
programa de control basado en la mosca estéril.
52
BIBLIOGRAFÍA
Alamalakala, L., Skoda, S., & Foster, E. (2009). Amplified fragment length
polymorphism used for inter-and intraspecific differentiation of
screwworms (Diptera: Calliphoridae). Bulletin of entomological
research, 99(02), 139-149.
Alavez, J. (1975). Tesis Monográfica sobre el Gusano Barrenador del
Ganado Cochliomyia hominivorax (Coquerel). Tesis de Pregrado.
Universidad de Guadalajara, México.
Alemán, J., & Reinoso, S. (2014). Infestación maxilar por larvas Cochliomyia
hominivorax. Primer reporte Ecuatoriano de debridación en miasis
gingivo – maxilar. Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias
Biológicas, 35(N°1 ,2), pp. 21-29.
Andrade, H., Varela, A., Batista, M., & Medeiros, J. (2005). Calliphoridae
(Diptera) Coletados em Cadáveres Humanos no Rio Grande do Norte.
Neotropical Entomology, 34 (5), 855-856.
Anziani, O., (2011). Mosca de las bicheras (Cochliomyia hominivorax)
Biología, importancia económica, aspectos epidemiológicos y
tendencias estacionales en el área central de la Argentina, control.
Recuperado el 21 de Noviembre del 2013, de: www.inta.gob.ar