UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
CARRERA DE BIOQUMICA CLNICA
TEMA: IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO
FERMENTADORES
INTEGRANTESNOEM CHANCUSICRISTINA GANCHALAANDREA MEDINAPATRICIA
SILVA.
FECHA: 12-02-15
1. CARACTERSTICAS GENERALES Este gran grupo de bacilos Gram
Negativos No Fermentadores incluyen grmenes pertenecientes a
diferentes familias:Pseudomonas
Flavobacterium
Alcalgenes
Acinetobacter
Acidovorax
Agrobacterium
Bordetella
Burkholderia
Chryseomonas
Empedobacter
Flavimonas
Moraxella
Roseomonas
Shewanella
Stenotrophomonas
Pero los gneros ms importantes son: Pseudomonas
Acinetobacter
Stenotrophomonas
Burkholderia
Algunos de ellos desprovistos de grandes atributos de virulencia
demostrables, no producen enfermedad en el individuo sano pero
pueden comportarse como oportunistas en enfermos
inmunodeprimidos.Los bacilos Gram negativos Nofermentadores son un
grupo de microorganismos aerobios estrictos, con flagelos polares,
no son esporulados, no utilizan hidratos de carbono como fuente de
energa o los degradan a travs de vas metablicas diferentes dela
fermentacin, son generalmente oxidasa positiva. Se encuentran en el
agua, fango, suelo, plantas, alimentos y material patolgico.
2. CARACTERSTICAS PARA SU IDENTIFICACIN
Crecen en la mayora de agares En agar sangre y chocolate crecen
como colonias grandes y brillantes En agar MacConkey, SS crecen
como colonias grandes, transparentes, porque no fermentan los
carbohidratos presentes. Crecen en TSI y LIA, pero no producen
ningn cambio de color, no se desarrollan ni acidifican la
profundidad de estos medios
IDENTIFICACIN DE LAS ESPECIES MAS FRECUENTES 1. Pseudomonas2.
Acinetobacter3. Burkholderia4. Stenotrophomonas
CARACTERSTICAS ESPECFICAS
GNERO PSEUDOMONAS Bacilos Gram negativos. Ligeramente curvos.
Aerobios estrictos. Cepas mviles (flagelos polares) Citocromo
Oxidasa positivo. Utiliza la glucosa y otros hidratos de carbono.
Debido a que Pseudomonas tienen unos requerimientos nutricionales
sencillos pueden crecer fcilmente en los medios comunes de
aislamiento, como el agar sangre y el agar MacConkey.
a) PSEUDOMONA AERUGINOSA
Se desarrolla en todos los medios de cultivo. Colonias grandes,
olor a humedad y brillo metlico o azul-verdoso. Coloracin de Gram:
Bacilos Gram negativos, alargados Produccin de Oxidasa: (
positivo). Coloracin azul Siembra en agar hierro de Kligler: Imagen
alcalina de color rojo en todo el tubo SH2 (-), gas (-). Motilidad:
Crecimiento alrededor del sitio de inoculacin En agar MacConkey:
Colonias redondas, incoloras por no utilizacin de la lactosa.
Siembra en medios King A y King B para la produccin de pigmentos:
Produccin de pigmentos (piocianina y pioverdina). Siembra en agar
Cetrimide : Colonias redondas, lisas, de bordes regulares.
Produccin de pigmento verde (pioverdina) En Agar sangre las
colonias son de color gris y son beta hemolisis (Halo transparente
verdoso alrededor de las colonias). OF Glucosa: Oxidativa Produce
pigmentacin verde relacionada con la sntesis de piocianina azul y
fluorescena amarilla, y un olor dulce caracterstico semejante al de
las uvas.
GNERO ACINETOBACTER Son bacilos o cocobacilos Gram negativos.
Son aerobios estrictos inmviles . Crecen bien en todos los medios
de cultivo , siendo su temperatura ptima de crecimiento de 33 a 35
C. Citocromo oxidasa negativo. Catalasa positivo. Son no
fermentadores de glucosa Utilizan una amplia variedad de compuestos
orgnicos como fuente de carbono.
b) ACINETOBACTER BAUMANNII
Es el no fermentador encontrado en segundo orden de frecuencia
en los laboratorios clnicos. Es un patgeno oportunista. Muestran
una utilizacin rpida de la glucosa con produccin de cido. Son
multiresistentes a los antimicrobianos Cocos o cocobacilos Gram
negativo. En agar MacConkey las colonias pueden tener un tinte
ligeramente rosado. Producen hemlisis en Agar sangre No crecen en
TSI. Catalasa (positivo) No reducen los nitratos a nitritos No
descarboxilan la lisina Citocromo Oxidasa ( negativo).
GNERO STENOTROPHOMONAS Es un gnero que consta solo de una
especie S. Maltophilia anteriormente Xanthomona Maltophilia. Buen
desarrollo en Agar sangre y MacConkey. Citocromo Oxidasa Negativa.
microorganismo de baja patogenicidad. Su hbitat natural es el
ambiente acutico. Bacteria aerobia. Metabolismo oxidativo. Se
desarrolla en forma rpida en los medios de cultivo
c) STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA
El diagnstico de laboratorio se determina en base al Gram.
Bacilos Gram negativos. Otras pruebas adicionales incluyen la
oxidacin de la glucosa y maltosa en medio OF, decarboxilacin de la
lisina, licuefaccin de la gelatina y produccin de H2S, evidenciada
con papel de acetato de plomo. Lisina descarboxilasa positiva.
Algunas cepas producen pigmentos amarillos. Citocromo Oxidasa
negativa. ADNasa positiva (prueba clave debe incubarse 72 horas
para evitar falsos negativos) Colonia caf verdosa en Agar sangre,
generalmente no hemoltica. Colonia amarilla verdosa en MacConkey.
Agar sangre ADNasa
Tincin de Gram
ADNasa
GNERO BURKHOLDERIA Antes pertenecan al gnero Pseudomonas
cepacea. Pueden sobrevivir en ambientes hmedos. Patgeno aislado en
infecciones respiratorias en pacientes con enfermedad
fibroqustica.
d) BURKHOLDERIA CEPACIA
Bacilo Gram negativo no fermentador de crecimiento muy lento.
Oxidasa: positivo dbil (93% de las cepas, el otro 7% es oxidasa
negativo). Mvil. Pigmento: amarillo claro. Causa septicemias
nosocomiales y otras infecciones
3. IMPORTANCIA CLNICA Pseudomona aeruginosa , se trata de un
grupo de bacilos aerbicos Gram negativos , no fermentativos, cuyo
papel patgeno se encuentra bien establecido . Se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el agua, en el suelo
e inclusive en el jabn, adems de ser parte de la flora saprolitica
de piel e intestinos en seres humanos y animales de diversas
especies.Son mviles debido a la presencia de un flagelo polar.
Poseen cilios que probablemente jueguen un papel importante en la
resistencia a la fagocitosis y les permite adherirse a las
superficies celulares, han recibido el nombre de bacilos
piocianicos por su capacidad de producir pigmentos, no afecta a
individuos sanos se comportan como oportunistas en pacientes
inmunodeprimidos La importancia clnica Pseudomonas aeruginosa, es
bien conocida ya que es agente causal de otitis media. Oftalmitis,
infeccin de heridas, bacteriuria, neumona y bactermia . Causa una
alta mortalidad en los pacientes con compromiso inmunolgico,
quemado, oncolgico o aquellos que son cometidos a instrumentacin o
manipulaciones. En los hospitales, la transmisin de pacientes a
pacientes por las manos del personal es ms importante que la
diseminacin area.Pseudomona no aeruginosa consideradas como un solo
grupo ( especies=sp ), solo ocasionalmente causan infecciones
oportunistas aunque puedan observarse con heridas , ulceras delos
pies y bacteriuria . Estas especies aunque se aslan con frecuencia,
solo ocasionalmente estn implicadas en enfermedades, su
susceptibilidad los antibiticos es mayor que las cepas aeuriginosa
es superior a las de otras Pseudomonas sp es conveniente
considerar:a) Que existe una relacin directa entre la relacin de
piocianina y el potencial patgeno y el potencial patgeno ya , que
este pigmento afecta la utilizacin del oxgeno no por parte de las
clulas infectadas incluidos los leucocitos, los cuales como
consecuencia fagocitan inadecuadamente.b) Que Pseudomona
aeuriginosa son considerablemente ms resistentes a los antibiticos
y por lo tanto pueden comportarse como oportunistas con mayor
facilidad
4. MEDIOS DE CULTIVO PARA NO FERMENTADORES
AGAR CETRIMIDA USO: Es un medio utilizado para el aislamiento
selectivo de Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del
gnero.FUNDAMENTO:Su formulacin permite el crecimiento selectivo de
Pseudomonas aeruginosa y estimula la produccin de pigmentos. En
este medio muy semejante al King A, en el cual la peptona de
gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. El
cloruro de magnesio y el sulfato de potasio promueven la formacin
de piocianina, pioverdina, piomelina y fluorescena de P.
aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como
agente inhibidor, libera el nitrgeno y el fosforo de las clulas de
casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin algunas especie
Pseudomonas. El agar es el agente
gelificante.INSTRUCCIONESSuspender 45.3 g del polvo en 1 litro de
agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Dejar reposar 5
minutos. Calentar agitando frecuentemente hervir durante 1 minuto
para disolucin total.Distribuir en tubo u otros recipientes
apropiaos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.CARACTERSTICAS Medio de cultivo deshidratado: color beige
claro, homogneo, libre deslizamiento.Medio de cultivo preparado:
color mbar claro.PROCEDIMIENTO SiembraEn superficie, por inoculacin
directa de la muestra estriando a partir de un caldo de
enriquecimiento por ejemplo cerebro corazn Infusin o Triptena Soya
Caldo.Incubacin:En anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48
horas.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS Observa el crecimiento
microbiano, las caractersticas de las colonias y la produccin de
pigmentos.La presencia de un color verde azulado corresponde a
produccin de piocianina, mientras que un color verde corresponde a
la produccin de pioverdina y color rosa claro, rojizo marrn oscuro
corresponde a la produccin de piorrubina.Examinar las placas bajo
luz ultravioleta, ya que la produccin de fluorescena se observa de
color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir
del crecimiento microbiano.
PSEUDOMONA AGAR FUSO: Medio de cultivo utilizado para el
aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de
Pseudomonas en base a la produccin de fluorescena. Conocido tambin
como medio King B y Flo AgarFUNDAMENTO: En el medio de cultivo, la
triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin
de pigmentos, la concentracin de fosfato dipotsico estimula la
produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y
piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes necesarios
que incrementan la produccin de fluorescena y e agar es el agente
solidificante.
CARACTERSTICAS DEL MEDIO:Medio de cultivo color mbar claro.
PROCEDIMIENTO:Siembra:A partir de un cultivo puro de 18-24
horas, del cual se sospecha la presencia de Pseudomona spp, tomar
una colonia y estriar la superficie del medio.Incubacin: En
anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48horas.Si no se observa
crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22C y observar
diariamente hasta 7 das.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:Examinar
las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm.Se considera un
resultado positivo la observacin de fluorescena, que es un pigmento
de color amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que
se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenmenos de
difusin.
PSEUDOMONA AGAR P
USO: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin
y la diferenciacin de especies de Pseudomonas en base a la
produccin de piocianina. Conocido tambin como medio King A y Tech
Agar.FUNDAMENTO:En el medio de cultivo, la peptona de la gelatina
aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio
y potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e
inhiben la produccin de fluorescena. El agar es el agente
solidificante.
INSTRUCCIONES Suspender 46.4g del polvo en 1 litro de agua
purificada. Agregar 10ml de glicerina. Calentar con agitacin
constante para homogenizar el producto. Llevar a ebullicin para que
se disuelva por completo.Distribuir en tubos u otros recipientes
apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.Colocar los tubos en posicin inclinada para solidificar el
medio de cultivo (pico de flauta). Tambin puede distribuirse en
cajas Petri estriles.CARACTERTICAS DEL PRODUCTO:Medio de cultivo
deshidratado: color beige, homogneo, libre deslizamiento.Medio de
cultivo preparado: color mbar claro.PROCEDIMIENTO:Siembra: A partir
de un cultivo puro de 18-24horas, del cual se sospeche la presencia
de Pseudomonas spp, tomar una colonia y estriar la superficie del
medio.
5. PRUEBAS BIOQUMICAS
OXIDASALos citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y
actan como ltimo eslabn de la cadena de la respiracin aerobia,
transfiriendo electrones (H2) al oxgeno. El sistema Citocromo
oxidasa se encuentra en microorganismos aerobios o microorganismos
aerfilos y anaerobios facultativos. La prueba para detectar la
presencia de oxidasa puede realizar cubriendo las colonias
bacterianas en la superficie del agar con el reactivo clorhidrato
de tetrametil p- fenilendiamina al 1%. Una alternativa es frotar
una muestra de la colonia bacteriana sobre un papel filtro
impregnado con el reactivo. En estado reducido es incoloro pero
cuando se oxida vira a purpura.
OF Glucosa Para la mayora de las bacterias de importancia clnica
implica la utilizacin de sustratos como hidratos de carbono. Para
la identificacin de diversas bacterias es importante determinar si
la utilizacin del sustrato es oxidativo o fermentativo. El proceso
oxidativo requiere oxigeno el fermentador no.El proceso oxidativo
fermentativo se logra con el medio O-F que contiene concentraciones
bajas de peptona y un sustrato con un nico hidrato de carbono como
glucosa. El microorganismo que se desea identificar se siembra en
dos tubos O-F con glucosa uno de los cuales se cubre luego con
aceite mineral para impedir el ingreso de Oxigeno. El indicador de
pH para la prueba O-F y los cambios de color que sufren en
condiciones acidas son azul de bromo timol (que cambia de verde a
amarillo). Cuando se determina la produccin de cido en ambos tubos
el microorganismo se identifica como fermentadores de la glucosa
Porque la fermentacin puede producirse con oxgeno o sin l. Si el
cido solo se detecta en el tubo en aerobiosis (abierto) se
considera que el microorganismo oxida la glucosa.Algunos
microorganismos no utilizan la glucosa como sustrato y no se
observa la presencia de cido en ninguno de los tubos.
Reduccin de Nitratos a Nitritos
La capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a
nitritos es una caracterstica importante para identificar y
diferenciar especies de muchos microorganismos. Los microorganismos
que reducen los nitratos pueden extraer oxigeno de los nitratos
para formar nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de
nitritos en el medio de prueba se detecta por el agregado -
naftilamina y cido sulfanilico con formacin de un color rojo de
diazonio p- sulfobenzenoazo- - naftilamina.
Hidrolisis esculina
El medio de esculina sin bilis es til para diferenciar especies
de bacilos no fermentadores. La esculina es un glcido sustituido
que puede ser hidrolizado por ciertas bacterias para producir
glucosa y esculetina. La esculina es un compuesto fluorescente bajo
la luz UV a 360 nm. Cuando hidrolisa la esculina la fluorescencia
se pierde y el medio vira a negro debido a la reaccin de esculetina
con iones frricos presentes en el medio. Composicin: Esculina
1gCitrato frrico 0,5gAgar infusin corazn 4gAgua destilada 1L
PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINAPRINCIPIODeterminar la
capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo
proteoltico (gelatinasas) que licuan/ hidrolizan la gelatina o
muestran cambios caractersticos debido a los productos de
degradacin.BIOQUMICALa gelatina, una protena derivada del colgeno
animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para determinar
la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolticas
(proteinasas), detectadas por gestin o licuefaccin de la gelatina.
Las enzimas capaces de producir gelatinosis se denominan
gelatinasas.Estas enzimas proteolticas a menudo son importantes
factores de virulencia de algunos microorganismos.Las protenas
naturales son demasiado grandes para entrar en una clula
bacteriana; por ende; para que una clula pueda usar las protenas,
estas primero deben ser catabolizadas a componentes ms
pequeos.Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para
degradar las protenas y esta capacidad ayuda a la identificacin
bacteriana.Este catabolismo de las protenas por parte de las
gelatinasas es un proceso de dos pasos, el resultado final es una
mezcla de aminocidos aislados.Gelatinasas
Protena + H2OPolipptidosProteasas
Gelatinasas
Polipptidos + H2O Aminocidos individualesProteasas
Medio de Cultivo: Gelatina nutritiva.Composicin: a) Extracto de
carne.b) Peptona.c) Gelatina.d) Agua Destilada.Consistencia del
medio: Semislido.Inoculacin:Picadura en posicin vertical hasta una
profundidad de 2.5 cm, inculo densoCondiciones de incubacin:Tiempo:
18-24 horas.Temperatura: 35-37CAl trmino de la incubacin se coloca
el tubo en un refrigerador o bao de hielo durante dos horas para
determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina
(licuefaccin).
Resultados:
Interpretacin:Positivo: Medio licuado (estado lquido)Negativo:
Medio slido.El medio de gelatina nutritiva para puncin no es
conveniente para las pruebas de rutina de la actividad gelatinasa,
dado que muchas especies requieren de una incubacin prolongada
antes de que aparezcan muestras de licuefaccin.En los mtodos
diagnsticos de rutina para identificar bacterias, la duracin de la
incubacin deber alcanzar un perodo razonable.Reporte de resultados:
Positivo: (+)Negativo: (-)
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ESQUEMA DE IDENTIFICACIN