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Universidad de Antofagasta
Facultad de Recursos del Mar
Programa de Doctorado en Ciencias Aplicadas
Mención Sistemas Marinos Costeros
Identificación de productos extracelulares de dos bacterias marinas
inhibidoras de Vibrio parahaemolyticus y evaluación del potencial
uso de estos productos como control de este patógeno
Por
YANETT LEYTON LOBOS
Tesis presentada a la Facultad de Recursos del Mar de la
Universidad de Antofagasta, como uno de los requisitos para optar
al grado de Doctor en Ciencias Aplicadas. Mención Sistemas
Marinos Costeros
Profesor Guía : Dr. Carlos Riquelme Salamanca
Profesor Co-Guía : Dr. Jorge Bórquez Ramirez
Consejo de Tesis : Dr. Rubén Araya Valencia
Dra. Marcela Wilkens Anwandter
Dr. Carlos Riquelme Salamanca
Antofagasta, Chile Septiembre 2012
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A mi esposo Rodolfo por su amor, comprensión y apoyo incondicional. A mi hija
Sofía a quien le quite un poquito de su tiempo para dedicarlo al término de esta tesis.
Ustedes son mis grandes amores y el pilar de mis actividades.
A mi madre por venir de tan lejos a ayudarme a cuidar de mi hija, gracias a usted he
podido dedicarle a esta tesis el tiempo que merecía.
A mis hermanos, a pesar de la distancia con su apoyo me han ayudado mucho.
A los que me quieren y acompañaron en este camino.
No quería terminar esta dedicatoria sin recordar a una persona que seguro se hubiera
sentido orgullosa de leer su nombre aquí, pero desafortunadamente no podrá verlo.
Estoy hablando de mi padre Lesme Leyton, que ya no está en este mundo pero
siempre esta en mis recuerdos.
Dedicatoria
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3
Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos a todas aquellas personas que de buena
fe, tuvieron un buen consejo para mi y ayudaron durante la realización de esta Tesis, en
especial:
Al Dr. Carlos Riquelme tutor de esta Tesis, por la oportunidad de integrarme en su
grupo de investigación en mis años de pre-grado, a usted le debo descubrir el lindo
mundo de la microbiología marina, agradezco su consejo de realizar este doctorado
para seguir mejorando mi formación profesional. Gracias por su dedicación y
asesoramiento en la revisión de mis manuscritos, por brindarme su apoyo en
momentos difíciles de mi vida profesional y personal. Usted es un verdadero ejemplo
de entrega y dedicación a la investigación.
Deseo expresar mi gratitud al Dr. Jorge Bórquez co-tutor de esta Tesis, gracias por
las facilidades dadas para trabajar en el Laboratorio de Química Orgánica de la
Universidad de Antofagasta, por ayudarme y estar dispuesto siempre a resolver mis
dudas y en todo lo necesario para completar los capítulos de aislamiento,
purificación y caracterización de las moléculas de este trabajo, por su interés en el
desarrollo de la misma. También agradezco su consejo y ayuda en conseguir mi
pasantía en la maravillosa Islas Canarias (Tenerife), España.
Al Dr. José Darias por aceptar hacer mi pasantía en el Instituto de Productos
Naturales y Agrobiología (IPNA), CSIC, Tenerife, España. Por las facilidades
proporcionadas durante mi estadía. A la Dra. Mercedes Cueto y Dra. Ana Díaz por
su colaboración en la identificación de las estructuras de los compuestos
relacionados a esta Tesis y en la enseñanza de uso de equipos. A los amigos que
conocí en Tenerife que hicieron que mi estadía fuera muy agradable y a quienes
tendré presente por siempre.
Al Dr. Romilio Espejo por proveer la bacteria Vibrio parahaemolyticus (cepa
PM48.5) usada en esta investigación.
Agradecimientos
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4
A mis profesores del programa de Doctorado en Ciencias Aplicadas por el apoyo y
conocimientos entregados.
A mis compañeros de generación Carolina, Manuel y Marcos por los conocimientos
compartidos sobre todo en aquellos momentos de largo estudio para Diseño
Experimental.
A mis compañeros de laboratorio, con quienes he compartido incontables horas de
trabajo. A Fernando Valenzuela, Mauricio Cáceres por el buceo y obtención de los
ostiones para los ensayos biológicos y Rodrigo Varas por su apoyo en la ejecución
del último experimento de esta tesis, cuyo análisis dio validez y sentido de aplicación
a este trabajo. A Claudia Bahamondes por su ayuda en los análisis de secuencias. A
la Dra. Mariella Rivas por su ayuda en la corrección de esta tesis.
A mis queridas ex alumnas tesistas (ahora tituladas) quienes desinteresadamente me
ayudaron en algunas actividades prácticas de esta Tesis, lo que las hace parte de ésta.
A los aportes financieros recibidos durante el desarrollo de esta Tesis: Beca de
Doctorado Proyecto MECESUP (ANT0711); Beca de Postgrado. Dirección de
Investigación y Postgrado. Universidad de Antofagasta; Beca de Postgrado
CONICYT (21070555); Beca de apoyo para la realización de Tesis Doctoral.
CONICYT (24090153) y proyecto FONDEF (MRO7I1006).
Finalmente a los doctores Rubén Araya académico de la Universidad de Antofagasta
y Rubén Avendaño-Herrera académico de la Universidad Andrés Bello y Marcela
Wilkens académico de la Universidad de Santiago de Chile, quienes me ayudaron en
la revisión de esta tesis y que con su contribución permitieron el formato final.
Agradecimientos
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5
Dedicatoria 2
Agradecimientos 3
Tabla de contenidos 5
Resumen 10
Abstract 11
1. INTRODUCCIÓN 12
1.1. Vibrios en los sistemas marinos costeros 13
1.1.1. Distribución y diversidad 13
1.1.2. Vibrios patógenos 14
1.1.3. Vibrio parahaemolyticus 16
1.1.3.1. Tipificación 16
1.1.3.2. Aspectos clínicos y factores de virulencia 17
1.1.3.3. Situación en Chile 18
1.2. Potenciales alternativas de control de bacterias patógenas marinas 20
1.2.1. Sustancias bioactivas de bacterias marinas 20
1.2.2. Probióticos 21
1.2.1.1. Vibrios probióticos 23
1.2.1.2. Bacillus probióticos 25
1.2.3. Bacteriófagos 25
1.3. Importancia de las sustancias bioactivas en la industria acuícola 26
1.4. Hipótesis 28
1.4.1. Hipótesis general 28
1.4.2. Hipótesis específica 28
Tabla de contenidos
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6
1.5. Objetivos 28
1.5.1. Objetivo general 28
1.5.2. Objetivos específicos 28
2. METODOLOGÍA 29
2.1. Sitio de estudios 30
2.2. Pruebas de inhibición bacteriana 30
2.3. Identificación bacteriana de las bacterias antagonistas 30
2.3.1. Gen 16S ARNr 30
2.3.2. Tinción Gram 31
2.3.3. Kit API 20E / 50CHB 32
2.3.4. Prueba Kanagawa 32
2.3.5. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 32
2.3.6. Prueba de susceptibilidad al compuesto vibriostático 0/129 32
2.3.7. Crecimiento en agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS) 33
2.4. Crecimiento de la cepa antagonista y extracción de sus productos antibacterianos 33
2.5. Evaluación del tamaño del producto antibacteriano 34
2.6. Sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano 35
2.7. Purificación y caracterización del producto antibacteriano 35
2.7.1. Fraccionamiento del producto antibacteriano 35
2.7.2. Evaluación de pureza del producto antibacteriano 37
Tabla de contenidos
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7
2.8. Inhibición de V. parahaemolyticus por los productos antibacterianos 37
2.9. Efecto antibacteriano del producto extraído desde las bacterias en ostiones
Argopecten purpuratus infectados 38
2.10. Efecto antibacteriano del producto comercial en ostiones infectados 39
2.11. Análisis estadístico 40
3. RESULTADOS 41
3.1. Identificación de las cepas antibacterianas 42
3.2. Crecimiento de la cepa antibacteriana y extracción de sus productos 45
3.3. Separación por tamaño y sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano 46
3.4. Purificación y caracterización del producto antibacteriano 48
3.5. Inhibición de V. parahaemolyticus por productos antibacterianos 52
3.6. Actividad del ácido oleico (AO) y dicetopiperazinas (DKP) en ostiones
infectados con V. parahaemolyticus 55
3.7. Publicaciones 57
3.7.1. Publicación 1: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Vibrios en los
sistemas marinos costeros. Revista de Biología Marina y Oceanografía
43(3): 441-456. 58
Tabla de contenidos
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8
3.7.2. Publicación 2: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2010. Marine
Bacillus spp. associated with the egg capsule of Concholepas concholepas
(Commom name “Loco”) have an inhibitory activity toward the pathogen
Vibrio parahaemolyticus. Microbial Ecology: 60(3): 599. 59
3.7.3. Publicación 3: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas y Carlos Riquelme.
2011. Probiotic activity of bacteria associated with egg capsules of
Concholepas concholepas (Common name “Loco”). Aquaculture
Research 1-7. 60
3.7.4. Publicación 4: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes
Cueto, Ana Díaz y Carlos Riquelme. 2011. Oleic acid produced by a
marine Vibrio spp. acts as an anti-Vibrio parahaemolyticus agent.
Marine Drugs. 9:2155-2163. 61
3.7.5. Publicación 5: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes
Cueto, Ana Díaz y Carlos Riquelme. 2012. Diketopiperazines produced by
a Bacillus sp. inhibit Vibrio parahaemolyticus. En prensa en Aquaculture
Research and Development. 62
3.7.6. Publicación 6: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2012. Oleic
acid and diketopiperacines produced by marine bacteria reduce the load of
Vibrio parahaemolyticus in the scallop Argopecten purpuratus. Enviada a
Aquacultre Research. 63
4. DISCUSIÓN 64
4.1. Actividad probiótica de bacterias marinas 65
4.2. Antecedentes bioactivos de dicetopiperazinas (DKP) 68
4.3. Antecedentes de la bioactividad de los ácidos oleicos (AO) 69
4.4. Actividad de AO y DKP en bivalvos A. purpuratus 70
Tabla de contenidos
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9
5. CONCLUSIÓN 74
6. PERSPECTIVAS FUTURAS DE INVESTIGACIÓN, INNOVACIÓN Y APLICACIÓN 76
7. ANEXOS 79
7.1. Anexo 1: Publicación: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Use of specific
Bacterial-Microbial biofilms for improving the larval settlement of Argopecten
purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.
Aquaculture 276 78–82. 81
7.2. Anexo 2: XVIII Congreso Latino-Americano de Microbiología. Pucón 2006 82
7.3. Anexo 3: XII Congreso Latino-Americano de Ciencias del mar.
COLACMAR. Florianópolis. Brasil 2007 83
7.4. Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y IV Congreso Chileno de
Microbiología e Higiene de los Alimentos. Viña del Mar, Chile 2001 84
7.5. Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Microbiología de Chile.
Santa Cruz, Chile 2009 85
7.6. Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle,
USA 2010. 86
7.7. Anexo 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología.
Antofagasta, Chile 2010 87
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 88
Tabla de contenidos
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10
La bacteria patógena Vibrio parahaemolyticus es responsable de enfermedades
gastroentéricas causadas por la ingesta de organismos marinos, principalmente moluscos
contaminados. Debido a esto, en las industrias acuícolas existe un gran interés por aplicar
productos bioactivos medioambientalmente inocuos que eliminen bacterias patógenas desde
sus cultivos y así, reemplazar a los antibióticos usados por años, los que han generado
grandes problemas de contaminación en los ecosistemas marinos. El objetivo de este trabajo
fue identificar productos extracelulares de dos cepas bacterianas marinas, las cuales
evidenciaron actividad inhibidora del crecimiento de V. parahaemolyticus y evaluar su
potencial uso para controlar la proliferación de este patógeno en bivalvos como Argopecten
purpuratus. Cada cepa bacteriana fue identificada molecularmente mediante secuenciación
del gen 16S ARNr y pruebas bioquímicas. Los productos orgánicos activos de cada cepa se
extrajeron usando el solvente orgánico acetato de etilo (EtOAc), luego se purificaron las
moléculas activas fraccionando por cromatografía de fase reversa, permeación por Sephadex
LH20, fase normal y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, siglas en inglés).
Finalmente, la estructura de las moléculas se elucidó mediante el estudio de sus espectros de
Resonancia Magnética Nuclear (NMR, siglas en inglés) de protón (1H) y carbono 13 (
13C).
La actividad de los productos orgánicos se comprobó mediante el método de difusión de
disco y se determinó su concentración inhibitoria en el crecimiento de V. parahaemolyticus
en medio de cultivo líquido. Los resultados indicaron que las cepas bacterianas
corresponden a un Vibrio sp. y Bacillus pumilus, cuyos productos activos mayoritarios
corresponden a las moléculas: ácido oleico (Vibrio sp.) y dicetopiperazinas (B. pumilus). En
los organismos de A. purpuratus tratados con los productos ácido oleico y dicetopiperazinas
aislados desde las bacterias, se observó preliminarmente que se produce una reducción en la
carga bacteriana del patógeno V. parahaemolyticus. Este mismo comportamiento fue
observado al tratar los ostiones con, ácido oleico y dicetopiperazinas comerciales. En base a
la actividad inhibidora observada de los productos comerciales se planteó la posibilidad de
experimentar estos productos contra V. parahaemolyticus en diferentes organismos de
importancia comercial, principalmente en sistemas de depuración, que requieren de breve
tiempo (12 a 24 horas) para reducir la concentración de patógenos humanos como el V.
parahaemolyticus.
Resumen
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11
The pathogenic bacterium Vibrio parahaemolyticus is responsible for gastroenteric diseases
caused by the ingestion of contaminated marine organisms, mainly mollusks. The
aquaculture industry has interest in the applification of bioactive products environmental
inocuous that eliminate pathogenic bacteria from the cultures and replace the antibiotics that
have been used for many years, which have given rise to great contamination problems in
marine ecosystems. The objective of this work was to identify extracellular products from
two marine bacterial strains that have shown growth inhibiting activity of V.
parahaemolyticus and evaluate their potential use to control the proliferation of this
pathogen in Argopecten purpuratus bivalves. Each strain was identified molecularly by
sequencing the rRNA16S fragment and by biochemical tests. The active organic products
from each strain were extracted with ethyl acetate (EtOAc), the active molecules were
purified fractionating them by reverse phase chromatography, permeation on Sephadex LH-
20, normal phase, and HPLC, and finally the structure of the molecules was elucidated by 1H
NMR and 13
C NMR. The activity of the organic products was verified by the diffusion disk
method and their growth inhibiting concentration against V. parahaemolyticus was
determined in liquid culture medium. The results showed that the bacterial strains
corresponded to Vibrio sp. and Bacillus pumilus, whose major active products are oleic acid
(Vibrio sp.) and diketopiperazines (B. pumilus). The A. purpuratus bivalves treated with the
oleic acid and diketopiperazines isolated from these bacteria showed preliminarily that they
cause a bacterial load reduction of the bacterial load of the pathogen V. parahaemolyticus.
The same trend was found when the scallops were treated with commercial oleic acid and
diketopiperazines. Based on the inhibitory activity seen with the commercial products we
suggest the possibility of testing these products against V. parahaemolyticus or other
pathogens in different commercially important organisms, mainly in depuration systems that
require a short time (12 to 24 h) to reduce the concentration of human pathogens like V.
parahaemolyticus.
Abstract
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12
1. Introducción
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13
1.1.- Vibrios en los sistemas marinos costeros
1.1.1.- Distribución y diversidad
Los Vibrios fueron uno de los primeros grupos bacterianos en ser reconocidos y descritos
taxonómicamente en la naturaleza (Pacini 1854). Se clasifican en la familia Vibrionaceae
abarcando diversos grupos de bacterias marinas heterótrofas, son gamma proteobacterias,
Gram negativas, oxidasa positivos, mesófilos y generalmente móviles por medio de al
menos un flagelo polar (Thompson et al. 2006). Toleran un amplio rango de salinidades, el
óptimo requerimiento de NaCl es de 2,0 a 2,5% (peso/volumen), algunas especies halófilas
requieren al menos una concentración del 0,5% de NaCl en el medio para crecer. La
presencia de altas concentraciones de nutrientes orgánicos o cationes divalentes pueden
compensar la falta de catión sodio (Urakawa y Rivera 2006). Naturalmente habitan
ambientes marinos y de agua dulce en formas de vida planctónica (Worden et al. 2006),
bentónica (desarrollando biopelículas en sedimentos), zooplanctónica (Heidelberg et al.
2002) o en el tracto gastrointestinal de organismos marinos (Watnick et al. 2001). La
distribución y dinámica de estas poblaciones está influenciada por gradientes
medioambientales de temperatura, salinidad, disponibilidad de nutrientes y factores
biológicos como depredación y abundancia de dinoflagelados y hospedadores (Thompson et
al. 2006), encontrándose distribuídas en el ecosistema marino costero (Leyton y Riquelme
2008b) (Figura 1). Aunque la costa difiere significativamente del océano abierto con
respecto a los rangos de producción primaria e influencia terrestre, la secuencia del 16S
ARNr de Vibrios aislados desde el océano abierto son filogenéticamente similares a las de
Vibrios aislados desde medio ambientes costeros (Radjasa et al. 2001). Los Vibrios son el
grupo mayormente cultivable de bacterias heterótrofas, especialmente de aguas costeras y la
proporción de recuento total en placas varía de acuerdo a los métodos de muestreo, área
geográfica, estacionalidad y medios de cultivos diferenciales (Austin et al. 1979).
Además de esto se han desarrollado métodos específicos para identificar la patogenicidad,
ecología y distribución de Vibrios (Eiler et al. 2007).
Introducción
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14
Figura 1: Representación gráfica de las interacciones de Vibrios en diferentes
compartimentos del ecosistema costero, los números de la figura se detallan en Leyton y
Riquelme (2008b) (en resultados, publicación1).
En el ecosistema marino, los Vibrios cumplen funciones importantes como biodegradación
de la materia orgánica y regeneración de nutrientes (Cavallo y Stabili 2004). Thompson et
al. (2009) describen que dentro del género Vibrio, el número de especies válidamente
descritas aumentó a más de 100. Algunas de ellas son patógenas para el hombre y animales,
tanto vertebrados como invertebrados (Heitmann et al. 2005). Su taxonomía está en
constante revisión gracias a la incorporación de técnicas de biología molecular. Por ejemplo,
Romalde (2010) ha descrito cinco nuevas especies dentro del género Vibrio: V. breoganii, V.
gallaecicus, V. artabrorum, V. atlanticus y V. celticus, esta última con potencial patogénico
para almeja. Haley et al (2010) describieron dos nuevas especies V. metecus y V. parilis,
previamente caracterizados como no toxigénicas.
1.1.2.- Vibrios patógenos
El desarrollo de enfermedades es el resultado de la interacción entre patógeno, hospedador y
medio ambiente. Existen especies del género Vibrio que varían en su patogenicidad, hoy en
día no se definen las causas de su aparición y epidemiología, aún cuando éstos ocasionan
numerosos episodios patológicos, casos de mortalidad, pérdidas económicas en la industria
acuícola y alteraciones sociales en la población dedicada a la industria extractiva y
Introducción
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15
procesadoras de productos marinos. Los Vibrios en la naturaleza pueden estar en un estado
inactivo o no ser capaces de crecer en los medios selectivos empleados (Colwell y Grimes
2000), no obstante, se ha evidenciado que las bacterias en estado de viables no
cultivables (VNC) pueden también causar enfermedades (Colwell 2000). Se han descrito
varios casos de vibriosis que afectan a organismos de importancia comercial como por
ejemplo, Gómez-León et al. (2005) reportaron que en el cultivo de larvas de almejas
Ruditapes decussatus, cultivadas en España durante los años 2001 y 2002, ocurrieron dos
episodios de mortalidades, el primero con un 62% y el segundo con un 73%,
respectivamente, asociados con infecciones bacterianas de V. alginolyticus en los dos
episodios, causando lesiones histológicas que afectaron principalmente el manto, el velo, y
el tejido conectivo de los organismos infectados. Otro ejemplo, es la especie V.
parahaemolyticus que actúa como patógeno en post larvas de abalón Haliotis diversicolor
supertexta (Cai et al. 2007). En el caso de la enfermedad del blanqueamiento de corales, que
se debe a la interrupción de la simbiosis entre el coral y el dinoflagelado Zooxanthellae, se
atribuye a los patógenos V. shilonii (también conocido como V. mediterranei), V.
coralliilyticus (Ben-Haim y Rosenberg 2002) y V. shiloi (Kushmaro et al. 2001). En peces,
los patógenos causantes de importantes pérdidas económicas en los cultivos de todo el
mundo son V. splendidus (Austin y Austin 1999), V. ordalii (Thompson et al. 2006), V.
vulnificus biotipo 2 (Toranzo et al. 2005), V. viscosus (Lunder et al. 2000) y Vibrio harveyi
(Austin y Zhang 2006).
Algunas especies de copépodos, rotíferos y artemias son usadas como importantes
fuentes nutricionales para el cultivo de muchos organismos acuáticos y existe evidencia de la
asociación que ocurre entre estos organismos con especies del género Vibrio. Por ejemplo,
los Vibrios tienen una relación de simbiosis con organismos quitinosos, como los copépodos
y la concentración de copépodos se correlaciona con el número de V. parahaemolyticus y V.
cholerae presentes en el agua de mar (Lipp et al. 2003). Tamplin et al. (1990) postulan que
los Vibrios utilizan la quitina como sustrato y el saco ovígero de los copépodos como un
vehículo para la diseminación cuando el copépodo libera los huevos fertilizados al ambiente.
También existen antecedentes de la asociación de Vibrios con diferentes especies de
de rotíferos, tal es el caso de V. rotiferianus aislado desde cultivos de Brachionus plicatilis
(Gómez-Gil et al. 2003). Por otro lado, se han aislado desde Artemia sp. V. hispanicus
Introducción
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16
(Gómez-Gil et al. 2004) y V. alginolyticus (Snoussi et al. 2006). La asociación de Vibrios
patógenos con estos organismos tendría como consecuencia la transmisión de estas bacterias
a larvas que son alimentadas con estos organismos. Otras interacciones patogénicas de
Vibrios se han descrito en Leyton y Riquelme (2008b) (en resultados, publicación 1, tabla
2B).
1.1.3.- Vibrio parahaemolyticus
1.1.3.1.- Tipificación
La bacteria pandémica V. parahaemolyticus es un bacilo Gram negativo, levemente curvo,
aerobio facultativo, halofílico, oxidasa positivo, fermentador de glucosa, pero no de sacarosa
(Farmer et al. 2003). Existen diferentes clones patógenos de este agente, algunos de los
cuales tienen distribución mundial y otros son propios de algunas regiones específicas (Silva
et al. 2008). El esquema antigénico de tipificación fue diseñado inicialmente en Japón por
Sakazaki en 1963 (Elliot et al. 1998). En la tipificación se destaca la serotipificación de
lipopolisacáridos somáticos (O), polisacáridos capsulares (K) y flagelares (H) (Figura 2). El
antígeno H es común a todos los tipos, por lo que la serotipificación se realiza en base a los
antígenos O y K (Paris 2005). El sistema de serotipificación de V. parahaemolyticus incluye
13 diferentes antígenos O y 71 diferentes tipos K, y la determinación de serotipos por
combinación O:K ha resultado ser útil para el estudio epidemiológico de la enfermedad. De
los 71 tipos O:K reconocidos en V. parahaemolyticus, todos pueden causar gastroenteritis
(Nair y Hormazabal 2005). La distribución de los serotipos es mundial y la transición entre
un serotipo y otro se ha observado tanto en pacientes como en el ambiente (Paris 2005).
Figura 2: Esquema antigénico de tipificación considerada para bacterias del género Vibrio.
Introducción
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17
1.1.3.2.- Aspectos clínicos y factores de virulencia:
Vibrio parahaemolyticus fue identificado por primera vez como agente de gastroenteritis por
Fujino (1951) y es responsable del 40 al 70% de las enfermedades gastrointestinales
causadas por el consumo de moluscos, crustáceos y peces crudos (Balcázar et al. 2007). El
primer reporte del clon patógeno O3:K6 fue detectado en India en febrero de 1996 (Okuda et
al. 1997) y hay registros de su diseminación en los diferentes continentes, por ejemplo, en
India, Bangladesh, Chile, Francia, Japón, Korea, Mozambique, Perú, Rusia, España, Taiwán,
Tailandia, Corea y Estados Unidos (Nair et al. 2007). Este clon pandémico posee el gen tdh
codificante de la hemolisina termoestable directa (TDH), principal factor de virulencia en
esta especie (Gil et al. 2007). Este serotipo, a diferencia de los otros, es capaz de incrementar
rápidamente no sólo la incidencia, sino la gravedad de los casos de diarrea aguda en zonas
donde se presenten condiciones favorables para su desarrollo. En el año 2005, el clon
pandémico fue asociado con casos clínicos de diarrea en Mozambique, África
(Ansaruzzaman et al. 2005). Igualmente, en México se reportó por primera vez
gastroenteritis causado por V. parahaemolyticus O3:K6 durante 2003 y 2004 (Cabanillas-
Beltran et al. 2006). Otros serotipos como O4:K68, O1: KNT, O1:K25, O1:K41, O4:K12
(Islam et al. 2004) y O3:KUT (Nair 2007) están presentes en diversas regiones del mundo,
determinándose por variados estudios moleculares su asociación genética con el clon
pandémico O3:K6. Estos nuevos serotipos parecieran haber divergido del clon pandémico
O3:K6 por alteración de los antígenos O:K (Tantillo et al. 2004).
La bacteria patógena V. parahaemolyticus produce una hemolisina directa
termoestable (TDH), codificada por genes tdh. La TDH es una proteína con actividad
hemolítica, esta toxina posee varias propiedades entre las que destacan: citotoxicidad y
aumento de la permeabilidad vascular. El 90% de los patógenos clínicos de esta especie
producen TDH. Además, esta bacteria puede presentar el gen trh (de la hemolisina
relacionada al tdh), así como el gen de la hemolisina termolábil (tlh) (De Paola et al. 2003).
Además requiere de otros factores para causar la enfermedad, como una variedad específica
de pili, factores de colonización y capacidad de invasión celular (Peterson y Zuppardo
2002). La alteración del flujo iónico de las células intestinales, es el que desencadena un
Introducción
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18
cuadro intestinal (enteritis) caracterizado por diarrea acuosa y cólicos abdominales (Peterson
y Zuppardo 2002), que puede acompañarse de náuseas, vómitos, fiebre y cefalea.
Generalmente es autolimitado y dura alrededor de 3 días (rango 1 a 7), el período de
incubación entre 12 a 24 hrs. La muerte por esta causa es muy rara, no supera el 0,5%, la
cual se ha observado en casos aislados y suele ocurrir en pacientes con daño hepático,
alcoholismo, diabetes mellitus, embarazo y pacientes con edades extremas (Hlady y Klontz
1996, Heitmann et al. 2005).
El nivel de producción de TDH del clon patogénico y su susceptibilidad
antimicrobiana no es distinto a la de otras cepas patógenas de V. parahaemolyticus. Se
especula que su capacidad de persistir en el medioambiente o su habilidad en producir
infección son la base de su éxito como patógeno (Yi-Shin et al. 2003), por lo que no es
sorprendente que estas bacterias posean un gran repertorio de proteínas con enorme
especificidad de sustratos, los cuales le permiten realizar diferentes funciones catabólicas
para responder eficientemente a los constantes cambios en los ecosistemas (Connell et al.
1998). Desde el descubrimiento del clon pandémico de V. parahaemolyticus se han centrado
los esfuerzos en identificar el o los factores determinantes de este potencial pandémico. Sin
embargo, no se han observado diferencias en la producción de TDH, ni diferencias
significativas entre el porcentaje de sobrevida en similares condiciones de estrés medio
ambientales (temperaturas extremas, pH bajo, y alta salinidad), entre las cepas pandémicas y
no pandémicas de V. parahaemolyticus (Matsumoto et al. 2000, Wong et al. 2000).
1.1.3.3. Situación en Chile
Entre noviembre de 1997 y abril de 1998 en la ciudad de Antofagasta (23° 39'S 70° 24'W),
se detectaron por primera vez en Chile casos de gastroenteritis asociados a un cuadro de
intoxicación por V. parahaemolyticus, afectando a 340 personas (Córdova et al. 2002),
detectándose las cepas O1:K56 y O3:K6 en almejas, cholgas y ostiones (Heitmann et al.
2005). En los años posteriores se puede observar en los registros del Ministerio de Salud
(MINSAL, 2012) la ocurrencia de nuevos casos clínicos, registrándose el año 2005 un
aumento significativo de casos. El año recién pasado se registraron 71 casos, dos de ellos
ocurridos en Antofagasta (Figura 3).
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19
Figura 3: Casos clínicos ocurridos en Chile desde el año 1998-2011. Elaborado en base a
datos obtenidos del Ministerio de Salud (MINSAL).
En la zona norte de Chile se presentan las condiciones ambientales apropiadas como
temperatura superficial del mar y nutrientes para la proliferación del patógeno V.
parahaemolyticus. Esta ocurrencia de casos esporádicos de brotes de V. parahaemolyticus
en la Región de Antofagasta se podría explicar por factores biológicos, como la antibiosis
microbiana, entre otros. Fuenzalida et al. (2007) analizaron la presencia del patógeno V.
parahemolyticus en casos clínicos y muestras de mariscos en Puerto Montt y Antofagasta
durante los brotes de diarrea en 2006. En las muestras de Antofagasta no se detectó la
presencia de V. parahaemolyticus en moluscos ni en casos clínicos. Sin embargo, su
presencia se detectó en el 80% de las muestras de Puerto Montt. Las cepas de V.
parahaemolyticus aisladas evidenciaron que todos los patógenos (TDH+) provenientes
desde moluscos obtenidos de Puerto Montt correspondieron al clon pandémico O3:K6. Estos
autores discuten que los brotes son atípicos, debido a que la temperatura del agua de mar
en Puerto Montt, que tiene un rango entre 11 a 16ºC es 5°C más baja que en Antofagasta, y
la presencia de V. parahaemolyticus en pescados y mariscos se ha asociado con una mayor
temperatura del agua. Finalmente, Fuenzalida et al. (2007) concluyen que las posibles
causas de la desaparición de la cepa pandémica del norte y su persistencia en el sur son
desconocidas.
Introducción
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20
1.2. Potenciales alternativas de control de bacterias patógenas marinas
1.2.1. Sustancias bioactivas de bacterias marinas
El ecosistema marino comprende alrededor del 70% de la superficie del planeta y por su
biodiversidad de microorganismos se sugiere que este medio es una fuente importante de
Productos Naturales Bioactivos Marinos (PNBM). Desde los años 60 ha habido un aumento
en la investigación de productos naturales marinos (Al-Zereini 2006), potenciado por la
industria farmacéutica, quien está en la búsqueda de nuevas drogas antitumorales,
antivirales, antifúngicas, antihelmínticas, anti-inflamatorias, analgésicas e
inmunoreguladoras y suplementos alimenticios, entre otros (Grabley y Thiericke 1999, Hale
et al. 2002, Kelecom 2002, Mydlarz et al. 2003, Piel 2004, Newman y Cragg 2004, Butler
2005). Al respecto, una revisión realizada por Faulkner (1984-1999) indica que durante los
años 1978-1987 se publicó un total de 3.076 metabolitos marinos, de los cuales 22
provenían de bacterias y hongos. Sin embargo, entre los años 1988-1997 se observó un
aumento a 7.099 metabolitos de origen marino, siendo 246 aislados desde microorganismos,
dejando en manifiesto el interés por investigar en esta área. Paralelamente se han realizado
estudios en bacterias, hongos, sedimentos, algas, peces, moluscos, tunicados y crustáceos
(Kelekom 2002). Estudios químicos y de actividad biológica de organismos como esponjas,
celenterados y equinodermos, han demostrado que contienen una gran cantidad y variedad
de metabolitos secundarios, con estructuras químicas diferentes a las encontradas en
organismos terrestres (Marquez et al. 2004). Sin embargo, algunos estudios evidencian que
productos naturales bioactivos, inicialmente aislados de esponjas marinas, son producidos
por microorganismos que están asociados como comensales o en simbiosis con
invertebrados marinos (Proksch et al. 2002), por lo que un buen aislamiento y selección con
medios de cultivo adecuados podrían aclarar el verdadero origen de las sustancias
bioactivas. Desde 1990, los metabolitos bioactivos descubiertos en bacterias marinas han
aumentado de manera exponencial (Hill 2003, Blunt et al. 2006). La mayoría de los
productos bioactivos se han obtenido desde géneros como Streptomyces,
Alteromonas/Pseudoalteromonas, Bacillus, Vibrio, Pseudomonas y Cytophaga, quienes
producen moléculas tales como quinonas, polienos, macrólidos, alcaloides, péptidos y
terpenoides (Al-Zereini 2006).
Introducción
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La actividad metabólica bacteriana se divide en metabolismo primario, asociado a los
procesos normales de crecimiento y proliferación celular de un cultivo determinado, y
metabolismo secundario que tiene lugar en la fase estacionaria una vez que ha cesado el
crecimiento de la biomasa y en cuyo período se producen diferentes tipos de compuestos
denominados metabolitos secundarios (MS), presentando una enorme variedad de
estructuras químicas, consecuencia de la diversificación y ramificación de sus vías
biosintéticas (Parés y Juarez 1997), lo cuál es común en microorganismos marinos
(Kelekom 2002). En la década de los años cuarenta, las investigaciones sobre MS se
centraron particularmente en la producción de sustancias tóxicas para microorganismos
patógenos (antibióticos) (Parés y Juáres 1997). En general, los MS están representados por
moléculas con un peso molecular relativamente bajo que no sobrepasan los 1.500 a 2.000 Da
(Parés y Juárez 1997), constituidos total o parcialmente por péptidos (dipéptidos cíclicos).
No se conocen bien los factores que disparan la producción de MS, pero normalmente se
producen cuando algún nutriente del medio es limitante, como el nitrógeno, carbono o
fósforo alterando la producción de metabolitos primarios y originando inductores de
enzimas que darán lugar a MS. Parés y Juárez (1997) proponen que la actividad
antibiótica de los MS generados por las bacterias se fundamenta en su capacidad de inhibir
procesos metabólicos primarios esenciales de otras bacterias y así lograr la dominancia en su
nicho biológico.
1.2.2. Probióticos
El término “probiótico” se define como “microorganismos vivos que administrados en
cantidades adecuadas como alimento o suplemento alimenticio tienen efectos beneficiosos
sobre el equilibrio microbiológico intestinal del hospedador” (Sihag y Sharma 2012). Estos
están surgiendo como importantes complementos alimenticios en el campo de la profilaxis
(Geovanny et al. 2007). Algunos metabolitos obtenidos desde bacterias marinas tienen
efectos antagonistas contra otras bacterias marinas (Armstrong et al. 2000, Long et al. 2005,
Zapata et al. 2007, Castillo et al. 2008, Zhang et al. 2009) como inhibir su crecimiento. El
concepto “antagonismo” fue introducido en microbiología por el médico W. Roberts en
1874, quien describió las propiedades antibióticas de ciertos cultivos de hongo (Penicillium
glaucum) contra bacterias. Estas sustancias son productos extracelulares que recubren la
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22
célula, varían en complejidad estructural, desde una simple capa de mucus compuesta de
un polímero extracelular hasta una cápsula altamente estructurada o glicocalix (Fabregas et
al. 1991). Estas estructuras ayudan a la adherencia superficial para la formación de
biopelículas, lo que puede constituir también una estrategia para sobrevivir en períodos de
escasez de nutrientes (Lipp et al. 2002), protegerse contra cambios ambientales (Eboigbodin
et al. 2007), atrapar y absorber nutrientes, resistir antibióticos y establecer interacciones
favorables (Thompson et al. 2004) o patogénicas. Al respecto, Leyton y Riquelme (2008a)
(en anexo 1) observaron que biopelículas bacteria-microalgas específicas estimulan el
asentamiento de larvas de Argopecten purpuratus y sugieren estudiar las sustancias
producidas por estas biopelículas como posibles responsables de la estimulación del
asentamiento larval. Las interacciones antagónicas de tipo bacteria-bacteria que involucran
la inhibición del crecimiento de otra bacteria, corresponden a un mecanismo que puede
ayudar a mantener especies bacterianas (Long y Azam 2001), ya sea, mediante la
competencia por nutrientes, espacio, luz y/o a través de la producción de diversos
metabolitos secundarios, entre ellos sustancias antibacterianas (Verschuere et al. 2000).
Los mecanismos de acción de estas bacterias incluyen también, bacteriocinas, sideróforos,
lisozimas, proteasas y alteración del pH por producción de ácidos orgánicos (Sugita et al.
1998). Los primeros estudios de bacterias marinas productoras de sustancias
antimicrobianas fueron realizados por Rosenfeld y Zobell (1947). Desde entonces, la
búsqueda, aislamiento y caracterización de bacterias nativas con actividad antagónica sobre
microorganismos patógenos marinos y terrestres, se ha realizado en diversos hábitats como
agua de mar, sedimentos, fitoplancton, vertebrados e invertebrados (Gauthier 1976, Toranzo
et al. 1982, Lodeiros et al. 1988, Austin et al. 1995, Riquelme et al. 1997). La mayoría de las
investigaciones evalúan el efecto de bacterias antagonistas contra colecciones de bacterias
patógenas de peces y moluscos, así como también frente a cepas no marinas patógenas de
humanos (Fabregas et al. 1991, León y García-Tello 1998). Una alternativa para
biocontrolar la densidad bacteriana mediante el principio de exclusión competitiva es el uso
de cepas nativas de biopelículas productoras de sustancias inhibitorias contra otros géneros
del mismo hábitat (McCarthy et al. 1994) y/o producción de sustancias antibióticas
(Jorquera et al. 1999). Estas biopelículas microbianas muestran diferentes grados de
colonización en la interfase agua-sustrato (Wiencek y Fletcher 1995). Sin embargo, la
relación antagónica entre las bacterias adheridas que conforman una biopelícula y ocupan
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23
un mismo microcosmos, así como la interacción de estas bacterias contra otras cepas de
la micro-comunidad, han sido escasamente estudiados. Al respecto, Armstrong et al. (2000)
reportaron la existencia de microorganismos productores de metabolitos bacterianos,
utilizados para contrarrestar la colonización de organismos no deseados en superficies
sumergidas en ambientes marinos. Isnansetyo et al. (2009) proponen el uso de la cepa
bacteriana S2V2 como una alternativa de control biológico, la cual presentó actividad
inhibidora contra el 68% de un total de 28 patógenos analizados del género Vibrio, sin
embargo, plantean el interés de purificar y elucidar la estructura química de sus metabolitos
inhibidores.
Años atrás el uso de antibióticos en la industria acuícola fue una práctica común para
el tratamiento de enfermedades, pero su uso excesivo ha provocado una evolución
en las bacterias volviéndolas resistentes, al generar modificaciones en su metabolismo
(Cabello 2006), tener efectos tóxicos en la salud humana y generar un impacto negativo en
el medio ambiente provocando una alerta ambiental. Un método alternativo para el
tratamiento con antibióticos sería la utilización de probióticos, o bacterias benéficas, que
tienen el potencial para anular los agentes patógenos mediante la producción de
sustancias inhibidoras, o mediante la prevención de la colonización patógena en el
hospedador (Riquelme et al. 2000). Los antibióticos bacterianos son metabolitos de bajo
peso molecular, no son vitales para el crecimiento del propio microorganismo, pero sí se ha
descubierto su importancia para la salud humana (Sánchez et al. 2010). Estos metabolitos
derivan de diferentes vías biosintéticas que surgen de intermediarios intracelulares que se
condensan en estructuras más complejas (Sánchez et al. 2010). Los miembros de los géneros
Vibrio, Pseudomonas y Bacillus han sido utilizados como potenciales bacterias probióticas
en cultivos de peces, moluscos y crustáceos.
1.2.2.1. Vibrios probióticos
En la actualidad se investiga cada vez más, las interacciones benéficas o antagónicas de
algunas especies bacterianas con los demás componentes del ecosistema marino. Los
Vibrios se han identificado como mediadores significativos de interacciones antagonistas
entre bacterias marinas (Long y Azam 2001) y otros organismos marinos (Urakawa y
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24
Rivera 2006), algunas de las cuales se han usado en organismos acuáticos para
prevenir altas mortalidades larvales (Gómez-Gil et al. 2000). Una de las relaciones
simbióticas más estudiadas es la utilización de la quitina del calamar Eupyrmma
scolopes, nutriente importante para Aliivibrio fischeri, quien la utiliza como fuente de
carbono (Meibom et al. 2004) y a su vez el calamar aprovecha la bioluminiscencia de las
bacterias, en la comunicación, atracción de presas y defensa ante depredadores
(Fidopiastis et al. 1998). Vibrio harveyi secreta más de 10 enzimas que degradan la
quitina (Sugita et al. 2004), polímero natural (N-acetil-D-glucosamina) y una de las fuentes
más abundantes de amino azucares en el océano (Riemann y Azam 2002). Algunas
investigaciones en camarones silvestres sanos (Penaeus mergulensis) han reportado una alta
abundancia de bacterias del género Vibrio, sugiriendo que el camarón influencia y/o
selecciona su microflora bacteriana (Oxley et al. 2002). Además existen antecedentes que
evidencian que la asociación de Vibrios y plancton aumenta la supervivencia de
Litopenaeus vannamei indicando que Vibrios y Aeromonas componen hasta el 85% de la
flora bacteriana en el intestino del camarón. Algunas mezclas de bacterias probióticas de
V. alginolyticus y Vibrio sp. fueron sometidas a pruebas de inhibición in vitro con Vibrios
patógenos de camarones (V. harveyi, V. vulnificus y V. parahaemolyticus) para demostrar su
efecto antagónico, obteniendo porcentajes de inhibición mayores al 50% (Sotomayor y
Balcázar 2003). Igualmente los Vibrios se han utilizado con eficacia en el control biológico
de agentes patógenos en cultivo de peces (Austin et al. 1995, Gatesoupe 1997, Gram et al.
1999). Avendaño-Herrera et al. (2001) encontraron que Vibrio sp. fue un componente
predominante en la microflora de poblaciones de post-larvas de Argopecten purpuratus
alcanzando valores porcentuales de 53,4%. Posteriormente, Avendaño-Herrera et al. (2002)
observaron un número significativo de semillas Argopecten purpuratus en colectores
biologizados con 3 bacterias del género Vibrio después de 30 días de cultivo en el mar, lo
que evidencia un efecto benéfico de las bacterias. Otras interacciones benéficas de Vibrios
se detallan en Leyton y Riquelme (2008b) (en resultados publicación 1, tabla 2). Con esta
información se infiere que algunas bacterias del género Vibrio son beneficiosas para usarlas
como potenciales probióticos en organismos de importancia comercial, por lo que,
estudiar sus potencialidades benéficas y mecanismos de acción es una alternativa que
debiera considerarse en futuras investigaciones.
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25
1.2.2.2. Bacillus probióticos
Las bacterias del género Bacillus se encuentran distribuidas ampliamente através del hábitat
terrestre y acuático (Siefert et al. 2000), incluyendo sedimento marino (Miranda 2008). Se
han estudiado bastante en los últimos años, porque se ha evidenciado actividad
antimicrobiana (Oguntoyinbo 2007), bioinsecticida (Ben Khedher et al. 2011), antifúngica
(Liu et al. 2011) y probiótica (Cutting 2011). Las más estudiadas son Bacillus subtilis, B.
clausii, B. cereus, B. coagulans y B. licheniformis. La ventaja de este género es que se
reproducen en forma sencilla al crecer de manera eficiente con muy bajo costo de fuentes de
carbono y nitrógeno (Siefert et al. 2000). Además, pueden crecer en el tracto intestinal, al ser
capaces de sobrevivir a bajo pH (Barbosa et al. 2005, Spinosa et al. 2000). Hace más de 50
años que se utilizan las esporas de Bacillus como probióticos por sus ventajas de
manipulación, se pueden almacenar a temperatura ambiente en una forma de desecado sin
ningún efecto perjudicial sobre la viabilidad y son fáciles de incorporar a cultivos o sistemas
de alimentos (Gatesoupe 1999). Las esporas probióticas se utilizan como suplemento
dietético en humanos y en acuicultura como promotores de crecimiento y para aumentar la
resistencia a enfermedades de los individuos en cultivo como en el camarón Penaeus
monodon (Cutting 2011). Por otro lado, enzimas provenientes de bacterias del género
Bacillus son muy eficaces en romper una gran variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas
en unidades más pequeñas (Ochoa-Solano y Olmos-Soto 2006).
Algunos productos extracelulares de bacterias del género Bacillus se han añadido a
cultivos de peces y camarones peneidos, inhibiendo el crecimiento de patógenos y
aumentando la sobrevivencia de los organismos cultivados (Sugita et al. 1998, Moriarty
1998, Rengpipat et al. 1998). Opalinski (2007) concluye que B. subtilis puede ser utilizado
como probióticos ya que promueve el crecimiento de pollos a través de la dieta de engorda.
Esta especie posee una marcada acción bactericida y fungicida, por lo que, se ha aprobado
su uso como biopesticida en plantas y es un ingrediente común en las mezclas de probióticos
recomendadas para el uso en animales acuáticos.
1.2.3. Bacteriófagos
En el medio marino existe una alta concentración de bacteriófagos los cuales afectan a
poblaciones de bacterias marinas (Curtis 2005). Por ejemplo, hay evidencia de cianófagos
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que infectan cianobacterias (fundamentales en la fotosíntesis marina) que codifican el
fotosistema I y II, así como proteínas de transferencia de electrones apuntando a una
perturbación en el flujo de electrones de las cianobacterias (Alperovitch-Lavy et al. 2011).
Clokie et al. (2010) afirmaron que los fagos son considerablemente importantes en el medio
ambiente por su impacto en la producción primaria oceánica.
Se ha planteado la terapia con fagos para controlar las bacterias patógenas en los
sistemas acuícolas. Según Crothers-Stomps et al. (2010) este desarrollo requiere de un
aislamiento inicial de bacteriófagos y la determinación posterior de huéspedes. Por ejemplo,
Crothers-Stomps et al. (2010) aislaron bacteriófagos líticos desde V. harveyi para aplicarlos
contra bacterias patógenas de larvas de langosta Panolirus ornatos observando que el fago
Myoviridae induce la producción de bacteriocinas en cepas huéspedes bacterianas.
Igualmente, Hyung et al. (2010) aislaron 5 bacteriófagos (dentro de los miembros
Myoviridae, podoviridae y Siphoviridae) que infectaron a bacterias Flavobacterium
psychrophilum, con el fin de estudiar métodos para controlar la enfermedad de bacterias
patógenas de peces Plecoglossus altiveiis. Los resultados evidenciaron que ninguno de estos
fagos se vio afectado a la prueba de diferentes condiciones de pH y temperatura resultando
ser eficaz en la reducción bacteriana. Bastías et al. (2010) estudiaron los fagos que infectan
la cepa pandémica de V. parahaemolyticus en las aguas costeras, de 143 muestras analizadas
se encontraron fagos sólo en 13, los que fueron capaces de multiplicarse en la cepa
pandémica, pero su concentración inicial fue insignificante respecto a su posterior
crecimiento, la bacteria infectada continuó produciendo el fago pero no se lisogenizó, lo que
sugiere que este tipo de fago (Podofagos) ejerce poco control sobre la propagación de la
cepa pandémica en el medio ambiente. En base a los antecedentes disponibles actualmente,
no queda claro que los bacteriófagos puedan ser controladores definitivos de las poblaciones
de V. parahaemolyticus.
1.3. Importancia de las sustancias bioactivas en la industria acuícola
La contaminación por patógenos en organismos de importancia comercial trae consigo
problemáticas como: ocurrencia de episodios pandémicos, mortalidad de recursos marinos y
humanos en los casos extremos, pérdidas económicas, alteraciones sociales en el sector
industrial de extracción/procesamiento de recursos marinos y pérdida en las capturas que son
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irrecuperables al no existir un plan de mitigación. Por lo tanto, se hace necesario conocer la
dinámica existente entre las bacterias antagonistas y patógenas en el ecosistema marino para
evaluar la función que pueden cumplir moléculas específicas presentes en bacterias nativas
antagonistas y que podrían generar antibiosis contra patógenos como V. parahaemolyticus.
En los ecosistemas acuáticos las interacciones bacteria-bacteria pueden ser específicas
entre especies que coexisten en un microcosmos, provocando un efecto positivo
(simbiosis) o negativo (antagonismo), dependiendo de las condiciones del ecosistema
(Riquelme y Avendaño-Herrera 2003), estas interacciones podrían ser reguladoras de la
proliferación de algunas especies bacterianas en el ecosistema marino.
El aumento de la resistencia bacteriana a antibióticos ha obligado a buscar
alternativas a su uso como control biológico, un camino viable para contrarrestar esta
problemática es la búsqueda de nuevos mecanismos más amigables con el medio ambiente.
Con estas alternativas se podría controlar la “vibriosis”, enfermedad común en los cultivos
marinos alrededor del mundo causada por bacterias, y que afecta a cultivos de moluscos,
crustáceos y peces (Isnansetyo et al. 2009). Algunas bacterias patógenas del género Vibrio
son resistentes a antibióticos tales como oxitetraciclina, norfloxacina y ciprofloxacina,
debido al uso frecuente de éstos en los sistemas de cultivo (Molina-Aja et al. 2002). Por otro
lado, hay algunos Vibrios presentes en el medio marino que además causan enfermedades en
humanos, tal es el caso de V. parahaemolyticus, cuya aparición produce una disminución en
el consumo de organismos marinos. Debido a lo anterior, tener estrategias de control o
conocer sustancias inocuas que puedan inhibir la proliferación de V. parahaemolyticus
podrían ser útiles para su uso en futuras plantas de depuración.
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1.4- Hipótesis
Considerando los antecedentes antes señalados, en esta investigación la hipótesis de trabajo
se planteó en base a la predicción que, en la región de Antofagasta se presentan las
condiciones ambientales apropiadas de temperatura superficial y nutrientes para la
proliferación de V. parahaemolyticus. Sin embargo, una de las causas que impiden la
proliferación de éste podrían ser factores biológicos como antibiosis microbiana.
1.4.1. Hipótesis general: Cepas bacterianas marinas nativas, secretan productos
extracelulares inhibidores del crecimiento de V. parahaemolyticus.
1.4.2. Hipótesis específica: La presencia de ciertos compuestos específicos de los productos
extracelulares (como péptidos u otros) de bacterias marinas nativas producirán inhibición en
el crecimiento de V. parahaemolyticus.
1.5. Objetivos
Para poner a prueba estas hipótesis se establecieron los siguientes objetivos:
1.5.1. Objetivo general: Identificar, caracterizar y evaluar productos extracelulares de 2
bacterias marinas nativas inhibidoras de V. parahaemolyticus para su potencial uso como
controlador de la proliferación de este patógeno.
1.5.2. Objetivos específicos
Identificar las especies antagonistas mediante técnicas bioquímicas y moleculares.
Aislar y caracterizar los productos extracelulares bacterianos que inhiben el
crecimiento de V. parahaemolyticus.
Determinar la capacidad inhibitoria de los productos antibacterianos en el
crecimiento de V. parahaemolyticus en ostiones (A. purpuratus) infectados.
Introducción
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29
2. Metodología
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30
2.1. Sitio de estudio
Las actividades de esta investigación se realizaron en el Laboratorio de Ecología
Microbiana del Centro de Bioinnovación de la Facultad de Recursos del Mar de la
Universidad de Antofagasta. Las bacterias fueron obtenidas desde el cepario de colección
del laboratorio. Se trabajó con la bacteria patógena V. parahaemolyticus (cepa PM48.5)
donada por el Doctor Romilio Espejo del Instituto de Nutrición y Tecnología de los
Alimentos (INTA), las bacterias antagonistas C33 fue aislada desde sistemas de cultivo de
A. purpuratus (Jorquera et al. 1999) y C32 aislada desde cápsulas de huevo de Concholepas
concholepas (Leyton y Riquelme 2010) (en resultados, publicación 2). Las bacterias se
mantuvieron en ceparios con medio de cultivo de agar tripticasa de soya (TSA Oxoid Ltd.,
Basingstoke, Hampshire, England) suplementado con 2% de NaCl, en condiciones axénicas
a 20 ± 1°C y congelados a -80ºC en criobank (PVequip).
2.2. Pruebas de inhibición bacteriana
Los ensayos de inhibición se realizaron mediante el método de “doble capa” (Dopazo et al.
1988), inoculando 10 µL (7,1x104 células/ml) de la cepa antagonista desde un cultivo de 18
horas, en el centro de una placa Petri con medio Mueller-Hinton (Difco) suplementado con
2% de NaCl, y se incubó a 20°C por 48 horas. Después de este tiempo, la macro colonia
formada se sometió a vapores de cloroformo por 45 minutos. Posteriormente, se agregó una
segunda capa de agar semisólido previamente inoculado con la bacteria patógena V.
parahaemolyticus (2,3x104 células/ml) y se incubó a 20°C por 48 horas. La presencia de un
halo de inhibición definido alrededor de la macro colonia fue considerada como actividad
antibacteriana. El estudio se realizó en triplicado y el grado de inhibición se determinó
midiendo el diámetro del halo, considerándose valores mayores a 5 mm como fuerte
inhibición según Avendaño-Herrera et al. (2005). Como control negativo se evaluó el efecto
del cloroformo inoculando la bacteria patógena sin el inóculo de la bacteria antagonista.
2.3. Identificación bacteriana de las bacterias antagonistas
2.3.1. Gen 16S ARNr: Desde un cultivo estéril se suspendió en buffer de lisis una colonia
de las bacterias (0,15M NaCl+0,1M Na2EDTA+0,1% Lisozima), se centifugó a 5000 rpm
por 20 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió en buffer de lisis más 10 µl de
Metodología
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31
proteinasa K. Se incubó a 65ºC por 4 horas. El ADN genómico fue extraído mediante el
método descrito por Sambrook et al. (1989). Luego se amplificó el gen 16S ARNr mediante
reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés) (Buffer 5x, MgCl2 25 mM,
dNTPs 10 mM, BSA 1X, 1 μM de cada oligonucleótido, y 0,04 U/μl Taq ADN polimerasa
(Fermentas)), usando partidores universales, una primera amplificación se realizó
con los partidores 27F (5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`) y 1542R (5`-
AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`) previamente descritos por Brosius et al. (1981), luego
se realizaron 3 procesos más para obtener la secuenciación completa del 16S ARNr usando
los partidores 358F (5`-CCTACGGGAGGCAGCAG-3`), 907R (5`-CCGTCAATTCCTTTR
AGTTT-3`) y 1492R (5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`). La amplificación de los
productos se realizó en un termociclador Px2 (Thermo Corporation), las condiciones de PCR
fueron 5 minutos a 94ºC y luego 30 ciclos de 45 s a 94ºC, 45 s a 55ºC, 90 s a 72ºC y 5
minutos a 72ºC, los productos amplificados fueron visualizados en gel de agarosa 1%. El
producto de PCR fue purificado con el kit de purificación (UltraCleanTM
15 DNA, MoBio
Laboratories, CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación de los
fragmentos se realizó en Macrogen Inc. (Korea). Las secuencias fueron analizadas usando el
programa Bio Edit y Blast en GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Los
alineamientos fueron realizados con Clustal W (Thompson et al. 1994) y la secuencia fue
comparada con aquellas que se encontraron disponibles en la base de datos GenBank.
2.3.2. Tinción Gram: este procedimiento permite clasificar a las bacterias en dos grupos:
Gram positivas y Gram negativas (Doetsch 1981). Para ello, se tomaron 10 µl de un cultivo
de 18 horas de las cepas antagonistas en caldo de tripticasa de soya (TSB, siglas en inglés) y
se inoculó en un portaobjeto, para fijar la muestra, la gota se flameó sobre un mechero de
manera ondulante hasta que se secó, luego se cubrió la muestra con cristal violeta por un
minuto y se eliminó el exceso con abundante agua, posteriormente se cubrió la muestra por
un minuto con lugol (aumenta la afinidad entre la célula y la tinción) y se eliminó el exceso
con agua, posterior a esto se procedió a cubrir la muestra con alcohol-acetona por 10
segundos para luego lavar con abundante agua. Por último, el portaobjeto con la muestra se
cubrió con safranina por un minuto y se lavó el exceso con abundante agua. La muestra
teñida se secó finalmente y se observó en un microscopio de campo claro a 100X
(Olympus BN-2). El diagnóstico se realizó en base a la coloración de la bacteria,
Metodología
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32
color violeta para las bacterias que poseen una gran proporción de péptidoglucano que
conforma la pared celular (Gram positiva) o una tonalidad rosada/roja las que poseen una
proporción reducida (Gram negativa).
2.3.3. Kit API 20E / 50CHB: Para pruebas bioquímicas de identificación se utilizó el kit
para cepas Gram negativas API 20E (BioMerieux) de acuerdo a lo descrito por Swanson y
Collins (1980) y el kit API 50CH (BioMerieux) para cepas Gram positivas siguiendo las
indicaciones del fabricante. Los resultados de las reacciones fueron enviados a la empresa
BioMerieux quienes reportaron la identificación.
2.3.4. Prueba Kanagawa: Se inoculó una gota de 1 µl del cultivo bacteriano de cada cepa
(C32 y C33) provenientes de cultivos de caldo de Tripticasa de soya suplementado al 2%
con NaCl (TSB siglas en inglés, Oxoid, Hampshire, England), en placas por triplicado de
agar Wagatsuma (sangre 5%, Blood Agar base, Oxoid, Hampshire, England). Se incubó por
37ºC y los datos se interpretaron 18 horas después de la incubación. Una reacción positiva
se indicó por la presencia de un halo de 3 mm o más, alrededor de la colonia observándose
una zona transparente de hemólisis por la ausencia de glóbulos rojos. Esta prueba se realizó
en base al protocolo descrito por Miyamoto et al. (1969).
2.3.5. Prueba de susceptibilidad a antibióticos: Se utilizó el test de susceptibilidad
antimicrobiana (Discos, Oxoid). Los discos fueron dispuestos sobre placas de agar Mueller-
Hinton (Oxoid, Ltd., Basingstoke, Hampshire, England) suplementada con 2% de NaCl,
previamente se sembró en extendido la cepa de interés a una concentración de 1x105
células/ml. Los antibióticos evaluados fueron: novobiocina (NV, 30 µg); tetraciclina (TE, 30
µg); amikacina (AK, 30 µg); cloranfenicol (C, 30 µg) y estreptomicina (S, 25 µg). Los
resultados fueron interpretados de acuerdo al método de (Bauer et al. 1966).
2.3.6. Prueba de susceptibilidad al compuesto vibriostático O/129: Se usó el compuesto
vibriostático O/129 (2,4diamino-6,7-diisopropilpteridina sal fosfato; SIGMA), mediante el
método de disco de difusión usado para identificar Vibrios halofílicos (Ericsson y Sherns
1971). La susceptibilidad al agente vibriostático fue determinada utilizando discos con una
concentración de 150 µg/disco, los que fueron colocados en una placa de agar Mueller-
Metodología
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33
Hinton, suplementada con 2% NaCl, sembrada previamente en extendido con la bacteria de
interés. Las placas se incubaron 24 horas a 20ºC, un halo alrededor del disco, independiente
del diámetro, indicó susceptibilidad al vibriostático.
2.3.7. Crecimiento en agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS): Se inoculó 10 µl de
las cepas con actividad antagonista en placas de agar tiosulfato citrato con sales biliares al
2% NaCl (TCBS Cholera Medium, Oxoid, Hampshire, England), provenientes de un cultivo
de 18 horas en caldo de tripticasa de soya (TSB, siglas en inglés). La incubación se realizó a
20ºC por 24 horas para observar las unidades formadoras de colonia UFC.
2.4. Crecimiento de la cepa antagonista y extracción de sus productos antibacterianos
La cepa C33 fue cultivada en medio mínimo M9 (casaminoácidos 1 g/l; Na2HPO4 6 g/l;
KH2PO4 3 g/l; NH4Cl 1 g/l ; NaCl 20 g/l; 960 ml de agua destilada (DW), 10 ml MgSO4; 10
ml de CaCl2; vitamina B1 1 ml; glucosa 100 ml, pH 7) (Gerhardt et al. 1994) y la cepa C32
en medio mínimo M9 con algunas modificaciones (casaminoácido 1 g/l; Na2HPO4 1 g/l;
KH2PO4 2 g/l; NH4Cl 1 g/l ; NaCl 4 g/l; DW 960 ml, 10 ml MgSO4; 10 ml de CaCl2;
vitamina B1 1 ml; glucosa 100 ml, pH 4), con una concentración inicial de 1x107
células/ml a 20ºC. El crecimiento celular se registró mediante recuento total de células/ml a
las 6, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60, 72, 78, 90, 96, 102, 108 y 120 horas, tiñendo el núcleo de
las bacterias con el fluorocromo 4´ 6- diamino-2 phenylindol (DAPI ) (Porter y Feig 1980) y
fueron observadas en un microscopio de epifluorescencia a 100X (Olympus BN-2),
equipado con un espejo dicroico DM400 y filtros de excitación UG1 y absorción L420.
Paralelamente, se hizo extracción de los productos orgánicos a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas
de cultivo, agregando 150 ml del solvente acetato de etilo por litro de cultivo
(bacteria+sobrenadante). Se recuperó la fase orgánica y se dejó por 20 minutos en sulfato de
sodio (Merck, Germany), luego se filtró con papel filtro de celulosa y se concentró hasta
sequedad en rotavapor a 45ºC. Finalmente, se dejó 24 horas en liofilizador para eliminar la
humedad. Para determinar la actividad del producto orgánico aislado a cada hora de
muestreo se realizó bioensayos con el método de disco de difusión agregando 2 mg/filtro del
producto diluido en el solvente diclorometano, cada filtro (4 mm diámetro) se colocó
sobre placas de Mueller-Hinton las que tenían sembrado en extendido la bacteria V.
parahaemolyticus a una concentración de (1x105 células/ml). Para el control se usó extracto
Metodología
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de medio de cultivo sin la bacteria y el solvente orgánico usado para disolver los productos.
Las placas se incubaron por 48 horas a 20ºC.
2.5. Determinación del tamaño del producto antibacteriano
Sobre placas Petri con medio Mueller-Hinton se colocaron membranas de diálisis (1 y 10
kDa) conteniendo 3 ml de medio de cultivo líquido M9 más el inóculo (1x105 células/ml) de
las bacterias antagonistas C32 y C33 (cada bacteria se trabajó en forma independiente), se
inyectó con una jeringa sobre la parte superior de la membrana el cultivo bacteriano, se
mantuvieron por 48 horas a 20ºC, luego de este tiempo se retiraron las membranas y sobre
este agar se inoculó la bacteria patógena V. parahaemolyticus (a una concentración de 1x105
células/ml) proveniente desde un cultivo de 18 horas en medio TSB, las placas fueron
incubadas por 48 horas a 20ºC. La experiencia se realizó en triplicado y la inhibición se
determinó al no observar crecimiento del V. parahaemolyticus sobre el área donde estuvo la
bolsa de diálisis. Como control se usó el mismo procedimiento sin el inóculo de la bacteria
antagonista.
2.6. Sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano
Sobre placas P etri con medio Mueller-Hinton se colocaron membranas de diálisis (1 y 10
kDa) unidas en sus extremos con selladores plásticos y se inoculó las bacterias
antagonistas C32 y C33 (a una concentración inicial de 1x105 células/ml, independientes
una de la otra) en 10 ml de medio de cultivo M9 específico para cada bacteria. Se
mantuvieron por 48 horas a 20ºC, luego de este tiempo se eliminaron las bolsas y el agar se
dispuso en botellas Schott en baño maría a 100ºC por una hora. El medio fundido se volvió
a plaquear, y una vez frío se sembraron gotas de un cultivo de 18 horas de la bacteria
patógena V. parahaemolyticus a una concentración (1x105 células/ml), las placas se
incubaron por 48 horas a 20ºC. La experiencia se realizó en triplicado y la inhibición se
determinó al no observar crecimiento de V. parahaemolyticus en las placas inoculadas.
Como control se usó el mismo procedimiento sin el inóculo de la bacteria antagonista.
Metodología
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2.7. Purificación y caracterización del producto antibacteriano
2.7.1. Fraccionamiento del producto antibacteriano: Se cultivaron 80 litros de cada
bacteria en medio de cultivo M9 específico para cada bacteria según paso 2.4, durante 96
horas a una concentración inicial de 1×107 células/ml a 20°C. La extracción del producto
orgánico de cada bacteria se realizó según el paso 2.4. El extracto de acetato de etilo se
separó de acuerdo a su polaridad por cromatografía en fase reversa en una columna
de cromatografía compactada con gel de sílice (100-C18 fase reversa) a una altura de 10
cm. El extracto se añadió a la columna adsorbido en el mismo gel de sílice que se utilizó
en la columna. La fase móvil fue agua destilada (100 ml) como fracción inicial, seguido por
las mezclas (100 ml) de agua destilada y metanol en 3:1, 3:2, 2:3 y proporciones 1:4, y
finalmente 100 ml de los disolventes metanol, diclorometano y metanol. A partir de este
procedimiento se obtuvieron 8 fracciones para la cepa C32 y C33. De estas fracciones se
trabajó con aquella que presentó mayor biomasa considerándolo como producto mayoritario.
A las fracciones se les confirmó actividad contra el V. parahaemolyticus mediante el método
de disco de difusión, como se describió en el paso 2.4. Igualmente se comprobó actividad
Kanagawa a los productos extraídos desde las bacterias C32 y C33, para ello se agregó 2
mg/filtro de producto y se dispusieron sobre agar sangre. Se incubó por 37ºC y los datos se
interpretaron 18 horas después de la incubación con el mismo criterio usado en el ítem 2.3.4.
Luego de la fase reversa, las fracciones obtenidas de las bacterias C32 y C33 se
refraccionaron mediante fase normal para C32 y Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine
Chemicals. 17-090-01) para C33, durante este procedimiento se seleccionaron fracciones
basadas en el criterio de pureza y producto mayoritario. Finalmente, la identificación de las
fracciones se realizó en la cepa C32 mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC,
siglas en inglés) y resonancia magnética nuclear 1H (NMR, siglas en inglés) (Figura 4). Para
la cepa C33, se realizó la identificación mediante la comparación de sus espectros de masas
1H y
13C NMR (Figura 5). Durante todo el procedimiento, cada fracción se secó en un
rotavapor a 45°C y liofilizó durante 24 horas.
Metodología
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Figura 4: Secuencia del fraccionamiento usada para el análisis de caracterización de los
productos de la bacteria C32.
Figura 5: Secuencia del fraccionamiento usada para el análisis de caracterización de los
productos de la bacteria C33.
Metodología
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2.7.2. Evaluación de pureza del producto antibacteriano:
La separación y pureza de los productos de cada cepa se determinó por cromatografía en
capa fina (CCF) empleando cromatofolios (20 x 20 cm) de gel de sílice 60 F254 con base de
aluminio (Merck art. 105554) y pulverizado con oleum (H2SO4: H2O:AcOH (1:4:20)). Este
seguimiento proporcionó un criterio para reunir las fracciones obtenidas. Adicionalmente, a
la fracción que presentó un grado de pureza con la formación de cristales se le realizó
NMR de +H,
13C y Espectrometría de Masas (EM). Los espectros de NMR se realizaron en
el espectrómetro Bruker AMX 500 operando a 500 MHz para la obtención de los espectros
de 1H y a 125 MHz para
13C. Los experimentos de correlación homo y heteronuclear COSY,
HSQC, HMBC y NOESY se obtuvieron en el mismo equipo. Para la adquisición de datos se
empleó cloroformo deuterado como disolvente y cloroformo como patrón de referencia
interna (δH 7,25 ppm; δC 77,0 ppm). Los valores de desplazamiento químico (δ) se expresan
en partes por millón (ppm), en relación al disolvente empleado como referencia interna, y las
constantes de acoplamiento (J) en Hertzios (Hz). Finalmente los espectros de masas de baja
(EM) y alta (EMAR) resolución se adquirieron en un espectrómetro Micromass Autospec
operando con una energía de ionización de 70 eV y una temperatura de fuente de 220ºC.
2.8. Inhibición de V. parahaemolyticus de los productos antibacterianos
Se evaluó la inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus en presencia de
los productos antibacterianos obtenidos desde la bacterias y con productos de similares
carcaterísticas obtenidos comercialmente, esto último considerando que los productos
identificados son conocidos y además, la baja producción de moléculas activas obtenidas
desde las bacterias dificulta realizar ensayos en volúmenes mayores. El ácido oleico (AO) es
un producto fácil de obtener (Biosonda $62.000 / litro, aproximadamente), sin embargo las
dicetopiperazinas (DKP) no fue posible encontrar las mismas estructuras aisladas en este
trabajo, por lo que se trabajó con la DKP más similar en su estructura cuyo valor comercial
fue mucho mayor respecto a AO (Biosonda $45.000 / 5 gramos, aproximadamente). Los
productos fueron diluidos en diclorometano y distribuidos en placas multipozos de 96
pocillos, las concentraciones usadas fueron: 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,5 y 2 mg/ml.
Luego de la evaporación del diclorometano, se agregó 200 µl de agua de mar filtrada 0,2
µm y un inóculo inicial de 1x103 células/ml del patógeno. La inhibición del patógeno se
midió por absorbancia a 620 nm en un lector de placas (Tecan Sunrise, MAGELLAN
Metodología
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interface), las lecturas se realizaron a las 24 y 48 horas de cultivo. Como control se usó agua
de mar, cada tratamiento se hizo por triplicado y las placas se mantuvieron a 20ºC.
2.9. Efecto antibacteriano del producto extraído de bacterias en ostiones infectados
El experimento se realizó en recipientes plásticos con 1 litro de agua de mar (previamente
filtrada y tratada con radiación ultra violeta (UV)), cada recipiente estuvo cubierto para
descartar factores de estrés de los ostiones, tenían en su interior producto bacteriano a una
concentración de 1 mg/ml y 3 ostiones A. purpuratus (previamente aclimatados e infectados
por 18 horas en recipientes independientes a una concentración de 1x105 células/ml del
patógeno V. parahaemolyticus). Los tratamientos usados fueron los siguientes: P-C32
(ostión + V. parahaemolyticus + producto de C32); P-C33 (ostión + V. parahaaemolyticus +
producto C33); y como control se usó CT (ostión + V. parahaemolyticus). Luego de 24
horas de tratados los ostiones infectados con los productos antibacterianos, se tomó cada
réplica y se dispuso el organismo completo en recipientes por separado con 100 ml de
solución salina marina (SSM) y se molió el tejido del organismo con minipimer. La
confirmación de V. parahaemolyticus en el tejido del molusco se determinó a través de la
técnica de número más probable (NMP) como se describe en el manual de análisis
bacteriológicos de EE.UU, Food and Drug Administration (Kaysner y DePaola 2004). Para
ello, cada muestra se diluyó en 3 series por triplicado en medio de cultivo enriquecido de
agua peptonada alcalina (APW siglas en inglés, peptona 10 g, NaCl 5 g y agua destilada
1000 ml, pH 8,4). Las muestras se incubaron en baño termorregulado a 37ºC durante 18
horas, luego se tomó 1 ml de cada muestra y se hirvió a 100ºC por 15 minutos,
posteriormente la muestra se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Para
identificar la presencia de los genes indicadores de patogenicidad se usó los marcadores: tdh
(fwd 5’-GTA AAG GTC TCT GAC TTT TGG AC-3’, rev 5’-TGG AAT AGA ACC TTC
ATC TTC ACC-3’) y tlh (fwd 5’-AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG-3’, rev 5’-
GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC-3’). Finalmente, mediante el análisis de PCR
(Buffer 10x, MgCl2 50 mM, dNTPs 2,5 mM, tlh-F 20 mM, tlh-R 20 mM, tdh-F 20 mM, tdh-
R 20 mM y 0,04 U/μl Taq ADN polimerasa (Fermentas)), usando un termociclador Px2
(Thermo Corporation), cuyas condiciones de PCR fueron 3 minutos a 94ºC y luego 35 ciclos
de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, 1 minuto a 72ºC y 7 minutos a 72ºC, se identificó
Metodología
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por el tamaño de la banda la presencia de genes patogénicos en geles de agarosa al 1%,
previamente teñido con 5 µl de bromuro de etidio.
2.10. Efecto antibacteriano del producto comercial en ostiones infectados
El experimento se realizó en recipientes plásticos con 50 litros de agua de mar (previamente
filtrada y tratada con UV), cada recipiente contenía 22 ostiones previamente infectados en
las mismas condiciones mencionadas en el paso anterior. Al momento de inocular el
producto comercial se bajó el nivel de agua hasta 30 litros (con el objetivo de ahorrar
producto) y se agregó 1 mg/ml del producto, se dejó actuar por 40 minutos con agitación
manual cada 10 minutos, luego se subió el nivel de agua hasta 50 litros, no se realizó
recambio de agua durante el experimento, los tratamientos fueron; CT (ostión sin infectar);
Ost+Vp (ostión + V. parahaemolyticus); Ost+Vp+C (ostión + V. parahaemolyticus +
cloranfenicol (1mg/ml)); Ost+Vp+DKP (ostión + V. parahaemolyticus + DKP comercial);
Ost+Vp+AO (ostión + V. parahaemolyticus + AO comercial). Luego de 24 horas de
tratados los ostiones infectados con los productos antibacterianos comerciales se tomó
muestras por triplicado de cada tratamiento y se procesaron para el análisis de NMP
usando la misma metodología mencionada en el paso anterior.
Finalmente en la figura 6, se grafica la secuencia de la metodología usada desde la
identificación del producto activo hasta los bioensayos de actividad en A. purpuratus.
Figura 6: Síntesis de la metodología usada para aislar, purificar y probar actividad
antibacteriana desde bacterias marinas.
Metodología
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2.11. Análisis estadístico
Se evaluó el cumplimiento de las presunciones de homogeneidad de varianza (prueba
Bartlett´s), distribución normal de los datos (prueba Kolmogorov-Smirnov), normalidad de
los residuales (prueba Anderson-Darling), independencia y linealidad del modelo usando
el software estadístico MINITAB 14. A los datos se les realizó análisis de varianza
(ANDEVA) de una vía (Zar 1994) y comparación de los tratamientos mediante el test
Kruskal Wallis (Kruskal y Wallis 1952).
Metodología
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3.1. Identificación de las cepas antibacterianas
La bacterias utilizadas en este trabajo C32 aislada desde cápsulas de huevo de Concholepas
concholepas (en resultados, publicación 2) y cepa C33 aislada desde sistemas de cultivo de
A. purpuratus obtenidas desde el cepario de colección del laboratorio, fueron seleccionadas
por su fuerte y estable actividad inhibidora contra la cepa patógena V. parahaemolyticus,
evidenciada por el método de doble capa (Dopazo) (Figura 7), observándose un halo de
inhibición de 27 mm en la bacteria C32 y 35 mm en la bacteria C33.
Figura 7: Identificación de actividad inhibidora de la cepa antagonista C32 y C33 contra el
clon pandémico V. parahaemolyticus mediante el método de Dopazo.
Sobre la base del análisis del 16S ARNr, se confirmó que la secuencia del gen de la cepa
C32 pertenece al género Bacillus y compartió el 99% de similitud con Bacillus pumilus
(número de acceso GU191914.1). La cepa C33 corresponde al género Vibrio y compartió el
100% de similitud con Vibrio sp. 52B8 (número de acceso JF346764). Las pruebas
complementarias de identificación de tinción Gram comprueban que la bacteria C32
pertenece al grupo bacteriano de las Gram positivas y la bacteria C33 al de las Gram
negativas (Figura 8).
Figura 8: Tinción Gram de las bacterias, observadas en microscopio de campo claro a
100X de magnificación. (A) bacteria C32 y (B) bacteria C33.
Resultados
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Los resultados obtenidos con los kit de identificación API coinciden con los resultados
obtenidos en la identificación molecular 16S ARNr, donde el kit API 20E (BioMérieux)
reveló que la bacteria C33 tiene un 98% de identidad con Vibrio sp., y el kit API 50
CHB (BioMérieux) indicó que la bacteria C32 tiene un 96,1% de identidad con Bacillus
pumilus.
La prueba de Kanagawa realizada a las 2 cepas indicaron que ambas bacterias
presentan efectos hemolíticos en los eritrocitos de la sangre usada en el medio de cultivo.
Sin embargo, las pruebas de Kanagawa realizada a los productos orgánicos extraídos desde
las bacterias no revelaron actividad hemolítica (Figura 9).
Figura 9: Actividad hemolítica del cultivo bacteria versus producto orgánico activo aislados
desde las bacterias. C32A y C33A: inóculo de cultivo bacteriano C32 y C33; C32B y C33B:
filtros con el producto activo de las bacterias.
En las pruebas de antibiograma, se observó en ambas bacterias susceptibilidad a todos los
antibióticos usados: Novobiocina (NV, 30 µg); Tetraciclina (TE, 3 0 µg); Amikacina (AK,
30 µg); Cloranfenicol (C, 30 µg) y Estreptomicina (S, 25 µg). Los antibióticos que
presentaron la mayor susceptibilidad en la Cepa C32 fueron Tetraciclina/Novobiocina y
Cloranfenicol/Tetraciclina/Novobiocina para la cepa C33 (Figura 10).
Resultados
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Figura 10: Antibiograma realizado a las bacterias antagonistas. Novobiocina (NV, 30 µg);
Tetraciclina (TE, 3 0 µg); Amikacina (AK, 30 µg); Cloranfenicol (C, 30 µg) y
Estreptomicina (S, 25 µg).
Las pruebas de susceptibilidad al compuesto vibriostático O/129 fue positivo para la cepa
C33 presentando un halo de inhibición de +/- 23 mm (valor promedio de 3 réplicas) y
negativo para la cepa C32. Los análisis de actividad mediante técnicas de Dopazo,
Kanagawa, antibiograma y susceptibilidad a vibrióstatico fueron reproducibles.
El crecimiento de las cepas en el medio de cultivo TCBS reveló crecimiento de unidades
formadoras de colonia (CFU) de color amarillo en ambas bacterias (Figura 18).
Figura 11: Crecimiento de las bacterias C32 (foto izquierda) y C33 (foto derecha) en medio
de cultivo TCBS.
Resultados
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3.2. Crecimiento de la cepa antibacteriana y extracción de sus productos
La extracción óptima del producto orgánico activo bacteriano en relación al tiempo de
cultivo reveló que la actividad inhibidora aumentó significativamente en la bacteria C32 a
las 96 horas de cultivo, período en el que el crecimiento bacteriano se encuentra en la fase
estacionaria del cultivo (Figura 12). Respecto a la bacteria C33, la mayor actividad del
compuesto activo se observó entre las 96 y 120 horas de cultivo, cuando el cultivo
bacteriano se encontraba en la fase de decadencia del cultivo (Figura 13). El rendimiento
total del producto orgánico obtenido a partir del cultivo de la bacteria C32 fue de 260 mg/80
L de cultivo y para la bacteria C33 alrededor de 264 mg/80 L.
Figura 12: Evaluación del crecimiento y producción de sustancias antibacterianas de la
bacteria antagonista C32. Las barras indican zona de inhibición y la curva células / ml.
Barra vertical=error estándar.
Resultados
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Figura 13: Evaluación del crecimiento y producción de sustancias antibacterianas de la
bacteria antagonista C33. Las barras indican zona de inhibición y la curva células / ml.
Barra vertical=error estándar.
3.3. Separación por tamaño y sensibilidad a temperatura del producto antibacteriano
El producto orgánico activo de las bacterias C32 (Figura 14) y C33 (Figura 15) demostró ser
menor que 1 kDa al observarse inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus
sobre el área del agar que estuvo en contacto con el producto que traspasó las bolsas de
diálisis de 1 y 10 kDa.
Figura 14: Separación por tamaño de los extractos antibacterianos de la cepa C32. Control
(CT): Crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el
medio de cultivo sin la bacteria; Membranas de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del
crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el medio
de cultivo y la bacteria. El patógeno fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido.
Resultados
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Figura 15: Separación por tamaño de los extractos antibacterianos de la cepa C33. Control
(CT): Crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el
medio de cultivo sin la bacteria; Membranas de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del
crecimiento de V. parahaemolyticus en el área expuesta a la bolsa de diálisis con el medio
de cultivo y la bacteria. El patógeno fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido.
La exposición a 100ºC de los productos orgánicos de las bacterias C32 (Figura 16) y
C33 (Figura 17) no afectó su actividad, observándose inhibición del crecimiento de V.
parahaemolyticus sobre el agar que tiene inmerso el producto bacteriano, demostrando ser
un producto termoestable. Las réplicas realizadas en los ensayos de separación por tamaño y
sensibilidad a temperatura fueron reproducibles.
Figura 16: Estabilidad térmica del extracto antibacteriano de la cepa C32. Control (CT):
Crecimiento de V. parahaemolyticus en agar con el medio de cultivo dialisado sin la
bacteria; Membrana de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del crecimiento de V.
parahaemolyticus en agar con extracto antibacteriano obtenido de la diálisis del medio de
cultivo más la bacteria. Todos los tratamientos fueron expuestos 1 hr a 100 ºC. El patógeno
fue inoculado en una segunda capa de agar semi-sólido sobre el agar.
Resultados Resultados
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Figura 17: Estabilidad térmica del extracto antibacteriano de la cepa C32. Control (CT):
Crecimiento de V. parahaemolyticus en agar con el medio de cultivo dialisado sin la
bacteria; Membrana de diálisis (1 kDa) y (10 kDa): Inhibición del crecimiento de V.
parahaemolyticus en agar con extracto antibacteriano obtenido de la diálisis del medio de
cultivo más la bacteria. Todos los tratamientos fueron expuestos 1 hr a 100 ºC. El patógeno
fue inoculado en una segunda capa de agar semi-solido sobre el agar.
3.4. Purificación y caracterización de los productos antibacterianos
El extracto total (260 mg) obtenido desde 80 litros de cultivo bacteriano se fraccionó en una
primera etapa en una columna de Fase Reversa (FR). A partir de este procedimiento se
obtuvo 8 fracciones para la cepa C32 y 8 fracciones para la cepa C33. De estas fracciones,
se trabajó con la que presentó mayor biomasa considerándolo como producto mayoritario.
Luego de la FR en la cepa C32 se continuó trabajando con la fracción 4 y 5, las que fueron
nuevamente separadas por cromatografía de Fase Normal (FN), consiguiendo 10 fracciones
de la número 4, y 11 de la número 5. Las fracciones activas 9/10 (de la fracción 4) y
11 (de la fracción 5) se separaron por HPLC (Figura 18). Luego, mediante los análisis
espectroscópicos (1H RMN) se identificaron 5 dicetopiperazinas conocidas (Figura 19), las
que fueron: cis-ciclo (L-Phe-L-Val) (Stark y Hofmann 2005, Cabrera et al. 2006), cis-ciclo
(L-Phe-L-Leu) (Cabrera et al. 2006, Tullberg et al. 2006, Takaya et al. 2007), cis-ciclo (L-
Phe-L-Pro) (Stark y Hofmann 2005, Takaya et al. 2007), cis-ciclo (L-Leu-L-Leu) (Huang et
al. 2007) y cis-ciclo (L-Leu-L-Val) (Stark y Hofmann 2005, Erikson et al. 1999).
Resultados
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Figura 18: Cantidad de producto obtenido por fracción en la metodología usada para la
purificación y caracterización de los productos antibacterianos de la cepa C32. HPLC (High-
performance liquid chromatography) cromatografía líquida de alta resolución.
Resultados
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Figura 19: Dicetopiperazinas (DKP) previamente publicadas, similares a las aisladas desde
la bacteria Bacillus pumilus: (A) composición estructural C11H20N2O2, (B) composición
estructural C12H22N2O2; (C) composición estructural C14H16N2O2; (D) composición
estructural C15H20N2O2; (E) composición estructural C14H18N2O2.
En la cepa C33, después de la fase reversa se continuó trabajando con la fracción 6, la cual
se refraccionó en una columna Sephadex LH-20, obteniéndose ocho fracciones. La fracción
activa 3 (76,9 mg) se comparó sus espectros de masas 1H and
13C NMR y se identificó un
ácido graso monoinsaturado de cadena larga llamado ácido oleico (OA) como producto
activo. Los datos espectroscópicos del producto fueron los siguientes: IR (KBr, cm-1
): 3000,
2965, 2928, 1710, 1413, 938, 600. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 5,33 (m, 2H); 2,35 (m,
2H); 2,01 (m, 4H); 1,62 (m, 2H); 1,28 (m, 20H); 0,76 (m, 3H). 13
C NMR (CDCl3, 500
MHz): 179,6 (s, -COOH); 130,0 (d, C-9); 129,7 (d, C-10); 34,0 (t, C-2); 31,9 (t, C-16); 29,7
(t, C-7, 12, 14); 29,4 (t, C-13, 15); 29,1 (t, C-4, 5, 6); 27,2 (t, C-8, 11); 24,7 (t, C-3); 22,6 (t,
C-17); 14,1 (q, C-18). EIMS m/z 282 ([M]+; 6,6); 265 (18); 264 (21); 257 (11); 111 (21); 97
(51); 83 (96); 82 (39); 81 (52); 70 (47); 69 (99); 67 (49); 60 (47); 57 (50); 56 (41); 55 (100).
HREIMS m/z [M]+ 282,2552 (calcd.C18H34O2, 282,2559) (en resultados, publicación 4). La
metodología seguida para el aislamiento e identificación del producto activo proveniente de
la cepa C33 se esquematiza en la figura 20.
Resultados
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51
Figura 20: Cantidad de producto obtenido por fracción en la metodología usada para la
purificación y caracterización de los productos antibacterianos de la cepa C33. RMN
(resonancia magnética nuclear de protón y carbono 13); EM (espectroscopía de masas).
A los productos aislados desde la bacteria C32 y C33 se les evaluó la inhibición del
crecimiento de V. parahaemolyticus mediante el método de disco de difusión (Figura 21).
Resultados
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52
Figura 21: Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus, mediante el método de disco
de difusión. Producto de la bacteria C33 (Foto izquierda) y producto de la bacteria C32
(Foto derecha).
3.5. Inhibición de V. parahaemolyticus por productos antibacterianos
Se evaluó la inhibición del crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus en diferentes
concentraciones de mg/ml (0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,5 y 2) del producto
antibacteriano. La actividad inhibidora del producto de ambas bacterias mostró inhibición
del patógeno en todas las concentraciones evaluadas con diferencias significativas respecto
al control (cultivo de V. parahaemolyticus sin la adición de productos y solvente),
observándose mejor inhibición entre 0,4-1 mg/ml, durante las primeras 48 horas de cultivo
(Figura 22). La actividad inhibidora del producto antibacteriano comercial mostró inhibición
del V. parahaemolyticus en todas las concentraciones tratadas con diferencias significativas
respecto al control. Las réplicas de cada tratamiento fueron reproducibles, no observándose
diferencias significativas. La mejor inhibición se observó a una concentración de 1 mg/ml en
AO y 1,5 mg/ml en DKP. El ácido oleico presentó mejor inhibición en todas las
concentraciones analizadas durante las 48 horas (Figura 23). Igualmente se comprobó la
actividad inhibidora del crecimiento de V. parahaemolyticus del AO (Sigma-Aldrich) y DKP
(Sigma-Aldrich) comercial por el método de disco de difusión antes mencionado (Figura
24). En la Figura 25 se puede observar la inhibición en medio líquido del patógeno en
presencia del producto antibacteriano extraído desde las bacterias.
Resultados
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53
Figura 22: Crecimiento del V. parahaemolyticus a diferentes concentraciones del producto
activo obtenidos desde la cepa C32 y C33, después de 48 horas de cultivo.
Figura 23: Crecimiento del V. parahaemolyticus en SW a diferentes concentraciones de
AO y DKP comerciales, después de 48 horas de cultivo.
Resultados
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54
Figura 24: Inhibición del crecimiento de V. parahaemolyticus expuesto a dicetopiperazina
(foto izquierda) y ácido oleico (foto derecha) comerciales (ambos). El patógeno fue
sembrado en extendido sobre el agar.
Figura 25: Crecimiento de V. parahaemlyticus en presencia de producto antibacteriano a
las 48 horas de tratamiento. Vp (V. parahaemolyticus concentración inicial 1x103
células/ml); M (Control Metanol medio de cultivo con Vp más el mismo volumen de
metanol usado para diluir el producto antibacteriano); PA (Producto antibacteriano) y C
(Cloranfenicol).
Resultados
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55
3.6. Actividad del ácido oleico y dicetopiperazina en A. purpuratus infectados con V.
parahaemolyticus
El objetivo de esta experiencia fue probar la reducción de la carga bacteriana del patógeno
V. parahaemolyticus en ostiones A. purpuratus usando AO y DKP como antibacterianos.
En una primera etapa se trabajó en volúmenes pequeños con los productos extraídos desde
las bacterias Vibrio sp. y B. pumilus debido a la baja concentración del producto
bacteriano. La identificación de la reducción de la carga del patógeno en el ostión se evaluó
mediante el análisis de NMP, cuyos resultados mostraron una disminución de la carga de
patógenos en los tejidos del ostión A. purpuratus a las 24 horas de tratamiento respecto al
tratamiento control de 5.6 x 103 (NMP/100 gr de ostión) en los productos de la bacteria B.
pumilus y 2.6 x 103 (NMP/100 gr de ostión) de la bacteria Vibrio sp., respecto al control
1 x 104 (NMP/100 gr de ostión) (Figura 26).
Figura 26: Evaluación de la actividad inhibidora de los productos aislados desde las
bacterias antagonistas contra el patógeno V. parahaemolyticus (Vp) evidenciada con la
reducción del gen tdh indicadores de la presencia del patógeno en el tejido del ostión. NMP
(número más probable de bacterias patógenas por 100 gr de ostión); CT (medio de cultivo
con Vp sin producto antibacteriano); P-C32 (medio de cultivo con Vp+producto de C32) y
P-C33 (medio de cultivo con Vp+producto de C33).
Resultados
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56
Como segunda etapa se trabajó con compuestos AO y DKP que se encontraron
disponibles comercialmente. Los resultados del NMP demostraron que los productos
comerciales redujeron la carga del patógeno V. parahaemolyticus en el tejido del ostión A.
purpuratus después 48 horas de tratamiento. Se observó 100% de sobrevivencia de los
ostiones durante las 48 horas en todos los tratamientos, con excepción del tratamiento
control con cloranfenicol en el que se observó 27% de mortalidad de ostiones a las 24 horas
y 100% de mortalidad a las 48 horas, demostrándose la toxicidad del cloranfenicol, distinto a
lo observado en los tratamientos con los productos comerciales AO y DKP. En el
tratamiento CT (ostiones sin infectar y sin tratar con AO y DKP) se observó la presencia del
gen tdh a las 48 horas de cultivo indicando que los ostiones eran portadores del patógeno V.
parahaemolyticus. El tratamiento Vp (ostiones infectados por 18 horas con el patógeno)
comprueba que los ostiones fueron infectados y que la concentración del patógeno aumento
a las 48 horas de cultivo. El tratamiento CL (ostiones tratados con cloranfenicol) demostró
su efecto antibiótico al no observarse presencia del gen tdh durante el experimento. El
tratamiento de los ostiones infectados con DKP comercial fue el que presentó mejor efecto
antibiótico contra el patógeno al observarse una disminución de 4,7x104
a 0 (NMP/100 gr de
ostión) a las 48 horas de cultivo. En el tratamiento AO igualmente se observó una
disminución de 4,7x104 a 91 (NMP/100 gr de ostión) a las 48 horas de cultivo (Figura 27).
Resultados
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57
Figura 27: Evaluación de la actividad inhibidora de los productos comerciales contra el
patógeno V. parahaemolyticus (Vp) evidenciada con la reducción del gen tdh indicadores de
la presencia del patógeno en el tejido del ostión. NMP (número más probable de bacterias
patógenas por 100 gr de ostión); CT (ostión sin infectar y sin producto antibacteriano); Vp
(ostión con Vp sin producto antibacteriano); CL (ostión con Vp+cloranfenicol); DKP (ostión
con Vp+dicetopiperazina); AO (ostión con Vp+ácido oleico).
3.7. Publicaciones
Publicación 1: Yanett Leyton y Carlos Riquelme. 2008. Vibrios en los sistemas marinos
costeros. Revista de Biología Marina y Oceanografía 43(3): 441-456
Publicación 2: Yanett Leyton and Carlos Riquelme. 2010. Marine Bacillus spp. associated
with the egg Capsule of Concholepas concholepas (Common Name “Loco”) have an
inhibitory activity toward the pathogen Vibrio parahaemolyticus. Microbial Ecology
60(3): 59. DOI 10.1007/s00248-010-9674-x.
Publicación 3: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas and Carlos Riquelme. 2011. Probiotic
activity of bacteria associated with egg capsules of Concholepas concholepas (common
name “Loco”). Aquaculture Research. 1-7. DOI: 10.1111/j.1365-2109.2011.02912.x
Publicación 4: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz-
Marrero and Carlos Riquelme. 2011. Oleic acid produced by a marine Vibrio spp. acts as
an anti-Vibrio parahaemolyticus agent. Marine Drugs. 9: 2155-2163.
DOI:10.3390/md9102155
Publicación 5: Yanett Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz and
Carlos Riquelme. 2012. Diketopiperazines produced by a Bacillus sp. inhibit Vibrio
parahaemolyticus. En prensa en Aquaculture Research and Development.
Publicación 6: Yanett Leyton and Carlos Riquelme. 2012. Oleic acid and
Diketopiperazine produced by marine bacteria reduce the load of Vibrio parahaemolyticus
in the scallop Argopecten purpuratus. Enviada a Aquaculture Research.
Resultados
Page 58
58
3.7.1. Publicación 1
Título: Vibrios en los sistemas marinos costeros.
Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme
Resultados
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59
3.7.2. Publicación 2
Título: Marine Bacillus spp. associated with the egg capsule of Concholepas concholepas
(Common Name “Loco”) have an inhibitory activity toward the pathogen Vibrio
parahaemolyticus.
Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme
Resultados
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60
3.7.3. Publicación 3
Título: Probiotic activity of bacteria associated with egg capsules of Concholepas
concholepas (common name “Loco”).
Autores: Yanett Leyton, Rodrigo Varas-Psijas y Carlos Riquelme.
Resultados
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61
3.7.4. Publicación 4
Título: Oleic Acid produced by a marine Vibrio spp. acts as an anti-Vibrio
parahaemolyticus agent
Autores: Yanett. Leyton, Jorge Borquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz y Carlos
Riquelme.
Resultados
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3.7.5. Publicación 5
Título: Diketopiperazines produced by a Bacillus sp. inhibit Vibrio parahaemolyticus
Autores: Yanett. Leyton, Jorge Bórquez, José Darias, Mercedes Cueto, Ana Díaz y Carlos
Riquelme.
Resultados
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63
3.7.6. Publicación 6
Título: Oleic acid and Diketopiperazines produced by marine bacteria reduce the load of
Vibrio parahaemolyticus in the scallop Argopecten purpuratus.
Autores: Yanett Leyton y Carlos Riquelme.
Resultados
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65
4.1. Actividad probiótica de bacterias marinas
Los Vibrios son un grupo de bacterias que tienen múltiples interacciones con los demás
componentes del ecosistema marino. Varias especies pertenecientes a este grupo son
indispensables para la supervivencia y subsistencia de numerosos organismos marinos
(Leyton y Riquelme 2008b). No obstante, se pueden encontrar también muchos Vibrios
patógenos. La interacción entre cepas bacterianas antagonistas y patógenos marinos ha sido
considerada de interés para la acuicultura (Riquelme et al. 1997, Ochoa-Solano y Olmos-
Soto 2006, Merrifield et al. 2010), por los efectos positivos que estas bacterias probióticas
ejercerían en los cultivos de organismos de importancia comercial, donde su producción y
comercialización se ven afectadas por la contaminación de bacterias patógenas (García de la
Banda et al. 2010, 2011) como el V. parahaemolyticus, entre otros (Yi-Cheng y Chengchu
2007; Balcázar et al. 2007; Leyton y Riquelme 2010).
Debido a esto, desde hace 15 años se trabaja en el desarrollo y aplicación de
bacterias probióticas antagonistas, ya que éstas a través de la secreción de metabolitos
permiten desplazar o inhibir el crecimiento de otras bacterias. Estos efectos inhibidores
pueden deberse a la producción de antibióticos, bacteriocinas, lisozimas, proteasas y/o
peróxido de hidrógeno, así como la alteración de valores de pH por la producción de ácidos
orgánicos (Tao 2009). Parés y Juáres (1997), discuten que las moléculas antibióticas
producidas por bacterias suelen ser péptidos con capacidad de inhibir procesos de los
metabolitos primarios esenciales. Existen evidencias de los beneficios que produce la
aplicación de bacterias probióticas en sistemas de cultivo (García de la Banda et al. 2010,
2011). Por ejemplo, las bacterias del género Bacillus han demostrado tener propiedades
probióticas (Avella et al. 2010, Cutting 2011), como beneficios en la sobrevivencia,
tolerancia a estrés y estado inmunológico de larvas de camarón (Liu et al. 2010),
propiedades antibacterianas contra el patógeno V. harvey (Gullian et al. 2004), V.
alginolyticus, V. parahaemolyticus (Balcázar et al. 2007) y Legionella pneumophila
(Temmerman et al. 2007), y como bioinsecticidas (Ben Khedher et al. 2011). Las enzimas
provenientes de Bacillus son muy eficaces en transformar en unidades más pequeñas una
gran variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas (Ochoa-Solano y Olmos- Soto, 2006),
además crecen de manera eficiente con muy bajo costo de carbono y fuentes de nitrógeno
(Siefert et al. 2000). Al-Dohail et al. (2011) indican que el uso del probiótico Lactobacillus
Discusión
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66
acidophilus es un buen candidato para usarlo como biocontrol contra bacterias patógenas
como Staphylococcus xylosus, Aeromonas hydrophila y Streptococcus agalactiae en cultivo
de peces juveniles (Clarias gariepinus). Igualmente se han atribuido propiedades benéficas a
bacterias del género Vibrio, por ejemplo, V. halioticoli es la especie dominante en
organismos sanos de Haliotis discus discus, H. diversicolor aquatilis, H. diversicolor
diversicolor y H. midae. Sawabe et al. (2003) sugieren que la abundancia de poblaciones de
V. halioticoli en el intestino de abalón puede ser importante para la conversión de alginato a
ácido acético lo que contribuiría a la nutrición del hospedador. Los Vibrios producen ácidos
grasos poliinsaturados, nutrientes esenciales para muchos organismos marinos en la cadena
trófica (Nichols 2003). Además, son conocidos por participar en muchas de las vías de
reducción del nitrógeno como: fijación del nitrógeno gaseoso a nitrógeno; reducción del
nitrato a dióxido de nitrógeno o amonio (Herbert 1999). La asimilación del nitrato es
requerida para el transporte a través de la membrana celular (Chou et al. 1999). Por otro
lado, los Vibrios expresan enzimas extracelulares que participan en la degradación del
fósforo para la producción primaria (Thompson et al. 2006). La actividad enzimática
periplasmática contribuye a la función de los Vibrios en la remineralización del fósforo
orgánico e inorgánico y pueden servir para enriquecer su entorno de nutrientes. Además, son
capaces de hidrolizar polímeros tales como quitina (Thompson et al. 2006), que puede ser
uno de los procesos enzimáticos extracelulares más importantes en el ambiente marino (Li y
Rosemam 2004). No obstante, habiendo antecedentes del efecto probiótico de varias
bacterias, es importante identificar los metabolitos activos para evaluar la factibilidad de
usarlos en sistemas de cultivo como suplemento al aportar con requerimientos nutricionales
que favorezcan la sobrevivencia de los organismos y además para conocer el o los
metabolitos que tienen efectos antibióticos contra los patógenos, lo que permitiría
comprender mejor su ecología.
En base a esto nace el interés de este estudio por buscar bacterias nativas con
potencialidades probióticas, estudios preliminares permitieron comprobar la presencia de
bacterias en el interior de cápsulas (huevos) de Concholepas concholepas, con resultados
positivos considerando que no hay información respecto a la microbiota asociada a C.
concholepas, ya sea, para larvas o adultos. Por ejemplo, un 71% de los tratamientos de
larvas expuestas a las diferentes cepas bacterianas aisladas tuvieron sobrevivencia larval
Discusión
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67
mayor al control, esto demuestra que la mayoría de las cepas aisladas desde las cápsulas no
son deletéreas para las larvas, si no lo contrario, cumplirian alguna función benéfica para
ellas. Posterior a esta investigación, se evidenció que 8 de las bacterias aisladas desde
cápsulas (huevos) de C. concholepas tienen efectos inhibidores contra el clon pandémico de
V. parahaemolyticus, las que resultaron ser en su totalidad del género Bacillus (una de éstas
fue usada en esta tesis). Según los análisis filogenéticos, los Bacillus aislados pertenecen a
las especies B. pumilus, B. lincheniformis o Bacillus sp. (Leyton y Riquelme 2010).
Las cepas bacterianas usadas en esta tesis se escogieron por su capacidad de inhibir
el crecimiento del patógeno V. parahaemolyticus. Según la base de datos GenBank, la
bacteria C33 resultó tener como especie más cercana (primer hit), a la especie Vibrio sp.
52B8 (JF346764.1) con 100% de similitud, la especie siguiente (segundo hit) correspondería
a V. neptunius (Leyton et al. 2011b) la misma especie presentó antagonismo contra
patógenos en el trabajo de Wietz et al. (2010). Los resultados demostraron que los productos
aislados son metabolitos activos, excretados durante el término de la fase estacionaria,
período en el que según Parés y Juárez (1997), el crecimiento del microorganismo se reduce
y se desarrolla a su máximo nivel la información genética necesaria para producir
metabolitos secundarios (MS) con capacidad de inhibir procesos metabólicos primarios
esenciales. El tamaño molecular de las sustancias activas fue menor a 1000 Da,
encontrándose dentro del rango del tamaño de los MS según Parés y Juárez (1997) y de
Hancok and Scott (2000), quienes indican que los péptidos antimicrobianos están
comprendidos entre 12 a 50 aminoácidos.
El uso de metabolitos activos debe garantizar seguridad en el ecosistema marino y en
la ingesta de organismos comerciales tratados y/o consumidor final como el hombre. En este
trabajo se probó la actividad hemolítica de las bacterias vivas versus su producto
antibacteriano, en el que se comprobó que los productos extraídos de la bacteria no
presentan actividad hemolítica al compararlo con las bacterias vivas, indicando que no se
encuentra presente la hemolisina directa termoestable (TDH). Las moléculas identificadas
como los metabolitos activos mayoritarios fueron ácido oleico (AO) en Vibrio sp. (C33) y 5
dicetopiperazines (DKP) en B. pumilus (C32).
Discusión
Page 68
68
4.2. Antecedentes bioactivos de dicetopiperazines (DKP)
Las DKP son derivados de piperazinas, estas últimas se conocen hace más de un siglo y sólo
recientemente las 2,5-dicetopiperazinas han atraído la atención por sus propiedades
biológicas antibacterianas (Park et al. 2006; Ren et al. 2010). Las DKP se han aislado desde
esponjas marinas como Dysidea sp. (Ren et al. 2010), hongos marinos como Chromocleista
sp (Park et al. 2006), bacterias Gram negativas (Jayatilake et al. 1996) y bacterias Gram
positivas (Stierle et al. 1998). Entre las propiedades atribuibles a DKP, estos metabolitos
están dotados de propiedades citotóxicas, antineoplásicas (Kikuchi et al. 1983),
antileucémicas (Varoglu 1997), antitumorales (Kanzaki 2000), antivirales (Sinha et al. 2004)
y antibacterianas (Fdhila et al. 2003). Otra característica interesante de las DKP se debe a su
función en el mecanismo de señalización celular bacteriano llamado quorum sensing (QS),
donde se ha demostrado que las DKP son capaces de activar o desactivar el sistema de
LuxR, receptor que promueve la expresión de un grupo de genes para regular respuestas
fisiológicas hacia una señal química (Degrassi et al. 2002). Las DKP constituyen una nueva
familia de compuestos de señalización, sin embargo, el papel exacto que desempeñan en el
QS aún no se establece. No obstante, se destaca su potencialidad para prevenir la formación
de biopelículas bacterianas, por intermedio de pequeñas moléculas solubles que actúan como
auto-inductores, generando un sistema de protección contra agentes tóxicos para las
bacterias que la conforman y/o prevención de la formación de biopelículas bacterianas
(Abraham 2005, De Kievit y Iglewski 2000). Es importante destacar el estudio realizado por
Michel y Blanc (2001) que indican que la capacidad de las DKP aisladas no pierden su
actividad frente a cambios de salinidad y temperatura del medio, al contrario de lo que
ocurre con antibióticos comerciales como cloranfenicol, florfenicol, flumequina y
trimetoprim/ sulfadiazina.
Entre los estudios que describen la presencia de DKP se destacan varios ejemplos
como el de Uhegbu y Trischman (2005) donde el extracto orgánico purificado del cultivo de
B. pumilus tiene como compuesto activo a leucina y prolina, presentando actividad contra la
bacteria marina Mycobacterium marinum. Kelecom (2002) menciona que metabolitos
aisladas desde Bacillus son derivados de la vía biosintética nitrogenada, los que podrían ser,
entre otros, péptidos cíclicos. Fdhila et al. (2003) demuestran que las DD-
dicetopiperazinas obtenidas desde bacterias aisladas del bivalvo Pecten maximus
Discusión
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69
presentaron actividad inhibidora contra el patógeno V. anguillarum. Resultados similares
son descritos por Vega et al. (2004), quienes encontraron 5 DKP extraídas desde bacterias
marinas Roseobacter sp. (CECT 5718) y R. gallaecensis (CECT 5719), aisladas desde
cultivos larvarios de P. maximus, quienes presentaron actividad antibateriana contra V.
anguillarum, cuyos compuestos activos fueron: Z54: ciclo(D)-prolina-(D)-leucina; Z56:
ciclo(D)- prolina-(D) -Isoleucina; Z57: ciclo(D)-prolina-(D)-valina; Z59: ciclo(D)-prolina-
(D) -fenilalanina y B717: ciclo(D)-trans-4-hidroxiprolinil-(D)-fenilalanina. La adición de
estos compuestos en una concentración de 0,5 mg/ml a cultivos de moluscos, crustáceos y
peces, aumenta su supervivencia en valores que oscilan entre el 12% y el 33%. Estos autores
postulan que la actividad inhibidora es comparable a la de los antibióticos utilizados
actualmente en acuicultura, lo que constituye un buen antecedente para el uso de DKP en
sistemas de cultivo intensivo.
Las diferentes acciones biológicas reconocidas en las DKPs las hacen aún más
interesantes para su investigación como potencial clínico (Milne y Kilian 2010) y acuícola.
Además, debido a su estructura rígida, naturaleza quiral y variadas cadenas laterales, son
atractivas para el diseño de fármacos (Martins y Carvalho 2007).
4.3. Antecedentes de la bioactividad de los ácidos oleicos (AO)
La acción antibacteriana de los ácidos grasos se suele atribuir a ácidos grasos insaturados de
cadena larga como el ácido oleico, ácido linoleico y el ácido linolénico, cuyo mecanismo de
acción es inhibir la síntesis de ácidos grasos (Zheng et al. 2005). Grasian et al. (2011)
igualmente atribuyen actividad antibacteriana contra el patógeno V. parahaemolyticus
a ácidos grasos de cadena corta (acético, propiónico y butírico) al disminuir la mortalidad en
el cultivo de Artemia franciscana. La producción de ácidos grasos poli insaturados (PUFAs)
mayormente se ha caracterizado a partir de microalgas (Nichols 2003).
El AO es un ácido graso monoinsaturado de cadena larga, denominado omega (ω) 9
debido a la posición de su doble enlace y está compuesto por 18 átomos de carbono
(Nicolosi et al. 2004). En bacterias, la relación entre la estructura y la actividad
antimicrobiana del AO no está clara, parece que el número y posición de dobles enlaces, así
como tener tanto una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica podría influir en la actividad
Discusión
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70
antimicrobiana afectando la membrana bipolar de la pared celular bacteriana actuando como
una barrera contra sustancias hidrofóbicas (Balcázar et al. 2007). El AO es conocido por
ser bactericida de importantes microorganismos patógenos (Seidel y Taylor 2004, Sun et
al. 2003), incluyendo Staphylococcus aureus (Farrington et al. 1992), Helicobacter pylori
(Sun et al. 2003), y Mycobacteria (Seidel y Taylor 2004) y se ha sugerido que proporciona
numerosos beneficios para la salud humana. Su uso moderado puede bajar los niveles de
colesterol y reducir la arteriosclerosis (Nicolosi et al. 2004). Además, participa en la síntesis
de fosfolípidos de la membrana, contribuye en la fisiología de la membrana celular, en
mecanismos tales como transducción de señales y proliferación celular (Ziboh et al. 2000).
Lunde et al. (2009) sugieren que el efecto antibacteriano de los AO se podría relacionar a la
capacidad de penetrar las membranas celulares de bacterias y hongos.
Huang et al. (2010) reportó por primera vez una amplia actividad antibacteriana de AO
contra microorganismos orales incluyendo Streptococcus mutans, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Candida albicans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium
nucleatum y Streptococcus gordonii sugiriendo que se necesitan más estudios para
demostrar que AO se puede usar como una biomolécula complementaria para incorporarla
en las personas a través de diversos vectores para atacar in situ infecciones orales, caries y/o
enfermedades periodontales, usando diferentes métodos como goma de mascar, pasta de
dientes, enjuague bucal, entrega de flúor, jugos, yogurt y leche. Por otro lado,
Cardoso et al. (2010) proponen que el AO modula la inflamación en heridas y aumenta la
respuesta de reparación in vivo en lesiones cutáneas y sugieren que éste podría ser usado
como tratamiento para heridas cutáneas especialmente en quemaduras, diabetes o úlceras.
4.4. Actividad de ácido oleico (AO) y dicetopiperazinas (DKP) en bivalvos Argopecten
purpuratus
Los resultados del Número Más Probable (NMP) en ostiones infectados y tratados con
producto antibacteriano de las bacterias Vibrio sp (AO) y B. pumilus (DKP), revelaron
disminución de la bacteria patógena en el tejido de los ostiones respecto al tejido de los
tratamientos control, demostrando que la actividad del producto se mantiene dentro del
organismo. El uso de productos comerciales permitió usar volúmenes y número de
Discusión
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71
organismos mayores al que se trabajó en el experimento con producto antibacteriano
(debido a la reducida cantidad de producto que se puede obtener de la extracción
bacteriana). El ácido oleico es un producto fácil de obtener (aproximadamente
$80.000+IVA/litro). Sin embargo, para el producto DKP no se encontró una molécula
comercial con igual estructura química, no obstante, en el mercado existen otros
derivados (y con valores mucho más altos comparado con el ácido oleico), por lo que se usó
uno cuya estructura molecular fuera lo más cercana a la obtenida desde la bacteria C32 (B.
pumilus). Los resultados de los productos comerciales revelaron una disminución en el NMP
de la bacteria patógena en el tejido de ostión, avalando los resultados preliminares obtenidos
en el experimento con los productos bacterianos.
El antibiótico cloranfenicol usado como control en los tratamientos (a una
concentración de 1 mg/ml), muestra un aumento significativo en la mortalidad bacteriana en
los tratamientos. Además, se observó a las 48 horas un 100% de mortalidad de los
individuos tratados, no ocurriendo lo mismo en los tratamientos en los cuales se usó 1
mg/ml de metabolitos activos bacterianos, en donde hubo 0% de mortalidad de ostiones.
Respecto al antibacteriano comercial similar al DKP extraído de la bacteria, se observó que
éste tiene efecto antibiótico similar al cloranfenicol, mostrando una disminución en el
NMP de bacterias patógenas en los tejidos de ostión, con la diferencia que no se
obtuvieron organismos muertos durante las 48 horas de experimento. Esto indica que
este producto comercial es un buen candidato para combatir patógenos, garantizando
inocuidad en los organismos.
Considerando los resultados obtenidos en este estudio, respecto a la actividad
inhibidora de los productos obtenidos desde las bacterias y por otro lado, su baja producción
en las condiciones de cultivo actual, es importante evaluar futuras investigaciones para
optimizar la producción bacteriana manipulando diferentes parámetros con el objetivo de
alcanzar mejor rendimiento del metabolito deseado. En el medio de cultivo M9 usado en
este trabajo para el Vibrio sp (C33) y M9 modificado para B. pumilus (C32), la mejor
extracción de productos activos se obtuvo a las 96 horas de cultivo con una producción
aproximada de 3,3 mg/L en ambas bacterias. Sin embargo, permanece abierta la posibilidad
de considerar nuevas modificaciones en los medios de cultivo, como la incorporación de
Discusión
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72
iones metálicos tales como magnesio, hierro y zinc conocidos por ser claves para el
desarrollo de MS en bacterias del género Bacillus (Parés y Juárez 1997). O desarrollar
nuevas tecnologías para la optimización industrial de la producción de estos antibióticos,
mediante la síntesis de estas moléculas, o bien la aplicación de técnicas de ingeniería
genética o utilización de tratamientos mutagénicos, tal como sucedió en el aumento de la
producción de penicilina en Penicillium chrysogenum desde 5 mg/l en 1941 a 10.000 mg/l
en 1970 en función de la selección de mutantes superproductores (Parés y Juárez 1997). Las
condiciones de cultivo dependerán de las condiciones óptimas de crecimiento de la cepa,
tales como, temperatura, aireación, pH, tiempo de incubación y/o nutrientes, que pueden
afectar la producción del metabolito deseado (Betina 1994, Shimada et al. 1996). Para ello,
la cepa de interés se puede cultivar en una gran variedad de condiciones en paralelo y luego
evaluar las diferencias en sus espectros metabólicos (Bills et al. 2008, Knight et al. 2003).
De esta forma, se podrá facilitar el desarrollo de productos a mayor escala para su futura
comercialización. Es por esto que se debe aprovechar las bacterias marinas con actividad
antagonista que crecen en medios clásicos (Staley y Konopka 1985, Ward et al. 1990), para
aislar y purificar con las herramientas de elucidación estructural existentes (Penesyan et al.
2010) y usar estas moléculas activas contra patógenos.
Si bien son muchas las variables que se deben seguir investigando para comprender la
ecología del clon pandémico de V. parahaemolyticus, el análisis de factores ambientales y
evolución de las pandemias brindará la posibilidad de comprender las causas y mecanismos,
por los cuales, este microorganismo se disemina en lugares específicos. Además, la baja
incidencia de casos clínicos en la región de Antofagasta, otorga la oportunidad para analizar
los factores que favorecen e impiden un brote epidemiológico. Esta investigación evidencia
por primera vez que las cepas de Vibrio sp. y B. pumilus tienen importantes metabolitos
benéficos como ácido oleico y dicetopiperazinas que reducen la carga del patógeno
V. parahaemolyticus en ejemplares adultos de A. purpuratus, sin afectar la viabilidad de los
bivalvos. Estos resultados significan un aporte a lo discutido por Bhatnagar y Kim (2010),
al indicar que los microorganismos marinos no han recibido la atención que merecen,
existiendo una visión muy limitada de las capacidades y potencial bioactivo en la literatura.
El efecto antibacteriano de las bacterias se puede generar como consecuencia de una
interacción ecológica que puede utilizar para competir con otras bacterias u organismos que
Discusión
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73
se encuentren presentes en su mismo hábitat. El uso de estos productos antibacterianos en
sistemas de cultivo como método de depuración podrá actuar como agente de biocontrol
contra V. parahaemolyticus, optimizando el sistema de cultivo. De esta forma, permitirá
asegurar la producción de organismos comerciales libres de este patógeno, además, de
favorecer la economía del mercado interno y externo, constituyendo un aporte no sólo en la
industria acuícola sino también a nivel clínico. Por otro lado, estos resultados validan aún
más el potencial probiótico ya reportado de la cepa bacteriana B. pumilus (Leyton et al.
2010, 2011a) y Vibrio sp. (Jorquera 1999, Leyton et al. 2011b). Respecto a la aplicación de
probióticos en acuicultura, Merrifield et al. (2010) plantean que los estudios son muy
variados, y que es difícil planificar una estrategia de aplicación eficaz a nivel comercial, por
lo que, sugieren que futuros estudios deberían centrarse en proporcionar aplicaciones
prácticas a escala industrial.
Finalmente, La investigación realizada en esta tesis es una conjunción de
microbiología básica y aplicada, cuyos resultados obtenidos representan un aporte a
las investigaciones recientes sobre bacterias marinas productoras de sustancias
inhibidoras y podrá servir como base para estudiar la naturaleza de las sustancias
inhibidoras de otras bacterias antagonistas para su posible aplicación en acuicultura
intensiva.
Discusión
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74
5. conclusiones
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75
La identificación de las bacterias inhibidoras del patógeno V. parahaemolyticus
revelaron que C33 es Vibrio sp y C32 B. pumilus.
Las sustancias secretadas por las bacterias correspondieron a los metabolitos
ácido oleico para C33 y dicetopiperazina para C32.
Los metabolitos aislados desde las bacterias son menores de 1kDa y
termoestables.
Los análisis con metabolitos comerciales de ácido oleico y dicetopiperazinas
confirmaron que estos presentaron actividad inhibidora del crecimiento del
patógeno V. parahaemolyticus.
Finalmente, se puede concluir que la investigación realizada responde a la
hipótesis afirmada que bacterias marinas nativas tienen potencial inhibidor de
V. parahaemolyticus y sus metabolitos secretados podrían ser usados en el
control de este patógeno.
Conclusiones
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76
6. Perspectivas futuras de
investigación, innovación y aplicación
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77
A continuación, se expresan algunas propuestas basadas en los resultados obtenidos de esta
tesis, como nuevas líneas de investigación, innovación y aplicación. Estas perspectivas se
pueden tomar considerando las bacterias ya estudiadas en esta tesis u otras.
6.1. Nuevas estrategias para combatir bacterias patógenas del género Vibrio.
En la revisión bibliográfica expuesta en esta tesis se manifiesta que los metabolitos
secundarios estarían afectando las respuestas fisiológicas de las bacterias, alterando la
comunicación celular o QS usadas para supervisar su densidad poblacional, sincronizar su
comportamiento y actuar recíprocamente (Van et al. 2007). Se propone como futura
investigación confirmar que las bacterias usadas en esta tesis secretarían los metabolitos
activos que interrumpen el QS como una estrategia de competencia por espacio. Lo
propuesto es posible debido a que se ha documentado la capacidad de monitorear la
densidad celular y regular la expresión de genes de virulencia por medio de QS para el
patógeno Vibrio parahaemolyticus (Henke y Bassler 2004).
6.2. Optimización de cultivos bacterianos a mayores escalas
Una de las grandes problemáticas enfrentadas en esta tesis se debió a la baja producción
obtenida del producto activo por litro de cultivo. Para mejorar esta producción se plantea la
necesidad de evaluar sistemas masivos de cultivos bacterianos (fermentadores industriales)
que permitan manejar mayores volúmenes y manipulación. Sumado a esto, se debe
investigar la optimización de los medios de cultivos propuestos en esta tesis como la adición
de nuevos nutrientes que permitan optimizar la producción del metabolito deseado.
Perspectivas futuras de investigación, innovación y aplicación
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78
6.3. Aplicación del uso de productos activos en larvas y otros organismos de
importancia comercial.
Esta tesis deja abierta la posibilidad de aplicar y evaluar el comportamiento del producto
activo en larvas y otros organismos de importancia comercial con diferente metabolismo y
estado de desarrollo. Por lo cual, se requiere de ensayos previos de toxicidad. Estudiar las
potencialidades benéficas, mecanismos de acción y optimización de la producción de estas
moléculas activas es un desafío que se debe considerar en futuras investigaciones para
combatir a este patógeno el cual nos permitiría también comprender mejor su ecología.
Así como también, evaluar la utilización de estos metabolitos obtenidos en sistemas
de depuración en cultivos de invertebrados marinos donde se requiere de breve tiempo (12 a
24 horas) para reducir patógenos.
6.4. Síntesis de los productos activos
Una alternativa en particular para la producción de la sustancia activa dicetopiperazina
(DKP) encontrada en este estudio y la cual no está disponible en el mercado, sería estudiar
la factibilidad de realizar su síntesis química.
En base a estos resultados se espera generar interés en la comunidad científica dedicada al
estudio de probióticos para dilucidar la estructuras química y mecanismos de acción de
moléculas activas bacterianas, mas allá de identificar actividad antagonistas.
Perspectivas futuras de investigación, innovación y aplicación
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Anexo 1: Publicación: Yanett E. Leyton, Carlos E. Riquelme. 2008. Use of specific
bacterial-microalgal biofilms for improving the larval settlement of Argopecten
purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.
Aquaculture 276 (2008) 78–82.
Anexo 2: XVIII Congreso Latinoamericano de Microbiología. Pucón 2006
Anexo 3: XII Congresso Latino-Americano de Ciências do Mar - XII COLACMAR.
Florianopolis, Brasil 2007.
Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y el IV Congreso Chileno de
Microbiología e Higiene de los Alimentos. Viña del Mar, Chile 2007.
Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Micobiología de Chile. Santa Cruz, Chile 2009.
Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle , USA 2010.
Anexo 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología. Antofagasta, Chile 2010.
Anexos
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7.1. Anexo 1: Publicación: Yanett E. Leyton, Carlos E. Riquelme. 2008. Use of specific
bacterial-microalgal biofilms for improving the larval settlement of Argopecten
purpuratus (Lamarck, 1819) on three types of artificial spat-collecting materials.
Aquaculture 276 (2008) 78–82.
Anexos
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7.2. Anexo 2: XVIII Congreso Latinoamericano de Microbiología. Pucón 2006
Estudio de bacterias intracapsulares en Concholepas concholepas (Bruguière, 1789).
Leyton Y, Varas R and Riquelme C
El presente trabajo determina la presencia de bacterias intracapsulares y evalúa el efecto de
éstas en la sobrevivencia de larvas tempranas de C. concholepas. Se recolectaron 32
cápsulas del intermareal en las bahías San Jorge, Antofagasta (2005) y Tongoy, Coquimbo
(2006), se agruparon en función de su estado: inmaduras, maduras e inviables (coloración
púrpura). El contenido intracapsular se diluyó y se sembró en medio de cultivo Zobell para
la obtención de bacterias cultivables y se determinó la presencia de Vibrios mediante la
técnica de Hibridación Fluorescente in situ (FISH). Para cada cepa aislada se realizaron
bioensayos de 48 horas con larvas en placas multipozos. En un 78% de las cápsulas hubo
presencia de bacterias, pudiendo aislar 53 cepas de las cuales un porcentaje significativo
corresponden al género Vibrio. Se observó alta sobrevivencia larval con la mayoría de las
cepas aisladas. Se vislumbra la existencia de bacterias con potenciales probióticos para las
larvas. Estas bacterias pueden ser de utilidad para mejorar la sobrevivencia en la etapa de
cultivo larval de C. concholepas.
Financiamiento: FONDEF DO4/1203
Anexos
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7.3. Anexo 3: XII Congresso Latino-Americano de Ciências do Mar - XII COLACMAR.
Florianopolis, Brasil 2007
Bacterias intracapsulares y sus efectos en la sobrevivencia en larvas de
Concholepas concholepas
Leyton Y, Varas R and Riquelme C
El presente trabajo determina la presencia de bacterias intracapsulares y evalúa el efecto de
éstas en la sobrevivencia de larvas tempranas de C. concholepas. Se recolectaron 32
cápsulas del intermareal en las bahías San Jorge, Antofagasta (2005), se agruparon en
función de su estado: inmaduras, maduras e inviables (coloración púrpura). El contenido
intracapsular se diluyó y se sembró para la obtención de bacterias cultivables en medio de
cultivo Zobell 2216 (Difco), ST10 (medio general para bacterias) y Extracto de loco+ST10.
Para cada cepa aislada se realizaron bioensayos larvales por 48 horas en placas multipozos.
Se determinó la presencia de Vibrios mediante, técnica de Hibridación Fluorescente in situ
(FISH), se evaluó el crecimiento de cada cepa en medio thiosulphate citrate bile-salt sucrose
agar (TCBS, Difco). En un 78% de las cápsulas hubo presencia de bacterias, pudiendo aislar
53 cepas de las cuales un alto porcentaje corresponden al género Vibrio. Se observó alta
sobrevivencia larval con la mayoría de las cepas aisladas. Se vislumbra la existencia de
bacterias con potenciales probióticos para las larvas. Estas bacterias pueden ser de utilidad
para mejorar la sobrevivencia en la etapa de cultivo larval de C. concholepas.
Anexos
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7.4. Anexo 4: XIX Congreso Chileno de Microbiología y el IV Congreso Chileno de
Microbiología e Higiene de los Alimentos.Viña del Mar, Chile 2007.
Bacterias marinas asociadas a estados larvales de Concholepas concholepas inhibidoras
de Vibrio parahaemolyticus
Leyton Y y Riquelme C
En Chile y otros países del mundo, el V. parahaemolyticus es responsable de enfermedades
gastroentéricas causada por moluscos y pescados contaminados extraídos de ambientes
marinos. En el presente estudio, se examinaron bacterias marinas asociadas a estados
larvales de C. concholepas con actividad inhibidora de Vibrios patógenos en particular de V.
parahaemolyticus para el cuál no existen medidas de control biológico. Se analizaron
microbiológicamente el contenido de 32 capsulas recolectadas en la zona intermareal de la
bahía San Jorge Antofagasta. Aislando 54 morfotipos de colonias bacterianas, a cada una se
les realizo ensayos de producción de sustancias inhibidoras mediante el método de Dopazo
et al. (1988). La presencia de un halo de inhibición del crecimiento alrededor de la colonia
se consideró como resultado positivo. Para estas cepas fue secuenciado el fragmento el 16S
para determinar su identidad en el GenBank. Se determinó actividad inhibitoria de V.
parahaemolyticus en 8 de las cepas aisladas (14,8%). Las bacteria con actividad inhibitoria
pertenecieron al genero Bacillus y dentro de las cuales se detecto Bacillus pumilus el cual ha
sido recientemente reportado como bacterias habitante del medio marino (Oguntoyinbo,
2007). Los resultados evidencian la presencia de bacterias marinas asociada a larvas de C.
concholepas con actividad inhibidoras del crecimiento de V. parahaemolyticus los cuales
podrían ser utilizados como herramienta de control biológico de esta especie patogénica.
Financiamiento: FONDEF DO4I1203
Anexos
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7.5. Anexo 5: XXXI Congreso Sociedad de Micobiología de Chile. Santa Cruz, Chile 2009.
Detección e Identificación de Vibrio parahaemolyticus desde muestras ambientales,
durante la aparición de nuevos casos clínicos en Antofagasta, Chile.
Hengst M, Garcia-Bartolomei E, Leiva JC, Cáceres M, Leyton Y, Varas R and Riquelme C.
Vibrio parahaemolyticus (Vp) constituye el principal agente causante de gastroenteritis por
consumo de mariscos crudos en todo el mundo. En Chile fue detectado por primera vez en
Antofagasta, durante un brote patógeno del clon pandémico O3:K6 en la temporada estival
1997–1998, con 300 casos clínicos. Durante los últimos años, nuevos brotes han ocurrido en
la zona sur de Chile (Puerto Montt) alcanzando a más de 13.000 casos clínicos; sin embargo
no se han registrado nuevos brotes masivos en Antofagasta. El objetivo de este trabajo fue
detectar e identificar potenciales cepas patógenas de Vp, aisladas desde distintos
componentes ambientales en la Bahía de Antofagasta y evaluar la existencia de variaciones
temporales en la cultivabilidad (CFU), la abundancia y la presencia de genes de virulencia,
en muestras obtenidas durante el período febrero-abril de 2008. Los resultados mostraron
que Vp estuvo presente en todas las muestras colectadas asociado a: sedimento, columna de
agua, macroalgas y moluscos bivalvos (A. purpuratus), siendo macroalgas y moluscos, los
que presentaron las mayores abundancias de Vp cultivables. Adicionalmente se obtuvo un
total de 20 aislados bacterianos los que fueron caracterizados en base a: 1) las secuencias del
gen 16S rRNA y 2) a la presencia de los factores de virulencia toxR, tlh, trh, tdh2, ORF8.
Los resultados mostraron que los aislados pertenecen a distintos géneros cuyas abundancias
se distribuyen en 30% de V parahaemolyticus, 20% de otras especies de Vibrio, y 50% de
otros géneros. El análisis de los factores de virulencia mostró los siguientes genotipos: (tlh+,
tdh+, ORF8
+); (tlh
+, trh
+, tdh
+); (trh
+, tdh
+); (tlh
+, tdh
+). Financiamiento.
FONDEF MR07/1006
Anexos
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86
7.6. Anexo 6: ISME-International Society for Microbial Ecology. Seattle, USA 2010.
Caracterization of an anti Vibrio parahaemolyticus substance produced
by a marine Vibrio
Leyton Yanett, Jorge Borquez y Riquelme Carlos
La bacteria pandémica V. parahaemolyticus es responsable de enfermedades gastroentéricas
causada por la ingesta de organismos marinos contaminados. Aún existen inconvenientes
para controlar la proliferación de V. parahaemolyticus y depuración de moluscos marinos
contaminados cuando ocurren brotes de esta bacteria. El objetivo de este trabajo es
identificar productos excretados por una bacteria marina inhibidora de V. parahaemolyticus.
Métodos : Se realizó la identificación de sustancias antibacterianas de una bacteria marina
(C33) contra la bacteria patógena V. parahaemolyticus mediante el método de doble capa.
Se hizo una extracción y secuenciación del gen 16S rRNA de la cepa C33, se estimó su
curva de crecimiento y paralelamente se hizo extracción por solventes orgánicos a las 24, 48,
72, 96 y 120 horas de cultivo para estimar el tiempo óptimo de producción. Los productos
activos se analizaron con Infrared Spectroscopy, Nuclear Magnetic Resonance y High
Performance Liquid Chromatography para su elucidación estructural. Igualmente fueron
separados por tamaño poniendo sobre placas de Müller-Hinton bolsas de diálisis de 1, 3.5,
7.5 y 10 KDa, con el cultivo de la bacteria en su interior, luego de 24 horas se retiraron las
bolsas y sobre el agar se sembró V. parahaemolyticus. Finalmente se estimó la sensibilidad a
la temperatura usando el mismo procedimiento anterior pero con bolsas de 10 kDa y luego
de las 24 horas se expuso por 1 hora el agar a 100ºC, se plaqueo nuevamente y se inoculo el
V. parahaemolyticus. Resultados: La bacteria C33 pertenece al género Vibrio, sus productos
inhiben el crecimiento de V. parahaemolyticus, es un metabolito secundario, menor a 10
kDa, termoestable, bacteriostático y orgánico. El Infrared Spectroscopy arroja presencia de
OH/Carbonilo. Conclusión: La molécula antibacteriana podría ser usado como biocontrol
contra V. parahaemolyticus y constituir un aporte a nivel clínico y en la industria acuícola.
Anexos
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87
7.7. Anexo: 7: XXXII Congreso Chileno de Microbiología. Antofagasta, Chile 2010.
Efecto de bacterias marinas productoras de antibacterianos sobre el crecimiento de
microalgas y su microbiota asociada
Martínez Marcela, Leyton Yanett, Heghst Martha, Infante Claudia, Riquelme Carlos
Existe evidencia que el crecimiento de microalgas puede ser afectado positiva o
negativamente por la presencia de bacterias, interacción que puede estar regulada por
vitaminas u otros compuestos orgánicos. De esta forma las bacterias asociadas a microalgas
pueden ser un factor clave en el crecimiento de estas. A su vez las microalgas utilizadas
comúnmente como alimento en acuicultura son un potencial vector de bacterias con
propiedades antagonistas de patógenos. El objetivo de este estudio es evaluar el efecto de
bacterias productoras de antibacterianos sobre el crecimiento de dos microalgas bentónicas
(Nitzschia sp, Navícula sp), dos microalgas de vida libre (Isochrysis galbana T-ISO y
Chaetoceros gracilis) y su microbiota asociada, además de evaluar la factibilidad de
establecer consorcios de microalgas con bacterias antagonistas de patógenos. Se evaluó el
crecimiento de la microalga (microscopía de campo claro) y el recuento de bacterias totales
(microscopia de epifluorescencia), en tratamientos con la adición de las bacterias
antagonistas Bacillus sp. C32 y Vibrio sp. C33 añadidas en la fase logarítmica del cultivo
microalgal. También se evaluó el efecto de estas bacterias sobre la microbiota cultivable
heterótrofa asociadas a la microalga (Dopazo). Los resultados evidencian que el crecimiento
de las microalgas se correlacionan positivamente con sus bacterias asociadas. Las bacterias
antagonistas mostraron una significativa inhibición de las bacterias cultivables asociadas a
las microalgas. Las bacterias antagonistas presentaron efectos tanto estimulatorios e
inhibitorios del crecimiento de las microalgas estudiadas. Las bacterias antagonistas C32 y
C33 favorecieron el crecimiento de C. gracilis y inhibieron el crecimiento de Navícula sp. I.
galbana y Nitzshia sp., mientras que el Mix (C32+C33) inhibió el crecimiento de todas las
microalgas estudiadas. En base a nuestros resultados C. gracillis sería una buena candidata
para ser utilizada como vector en el alimento de los sistemas acuícolas como un alimento
probiótico amigable con el medio ambiente ya que podría ayudar a reducir el uso
indiscriminado de antibióticos en los sistemas de cultivo. Financiamiento: Financiamiento:
FONDEF MR07I1006.
Anexos
Page 88
88
8. Referencia bibliográfica
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