IDB HC3 en HC4 Enzymen en enzymkinetiek Michaelis Menten Inhibitie van enzymen Ivo Horn
Jun 18, 2015
IDB HC3 en HC4Enzymen en enzymkinetiek
Michaelis Menten
Inhibitie van enzymen
Ivo Horn
Te bestuderen
• Wilson and Walker, Principles and techniques
of biochemistry and molecular biology: blz
581-588
• Campbell and Farrell, 7e editie: H6, 6.1-6.7
optioneel:
• Campbell and Reece, 9e editie: H8: 8.4
Biologische katalyse
• Katalyse is de belangrijkste functie van eiwitten
• Katalyse: versnellen/efficienter laten verlopen van
een reactie
• Biologische katalytische eiwitten: enzymen
• Verhogen de snelheid 1020. niet-enzymen komen tot
104
• Er zijn enkele niet-eiwit katalytische biomoleculen:
ribozymen. Dit zijn katalytische RNA’s
Biologische wasmiddelen• Bevatten enzymen
• Unilever research
• Hittebestendig maken van
eiwitten!
• Normale enzymen werken
optimaal bij 37 graden
Celsius
Een enzym betrokken bij ziekten
• Het GTPase Ras is een
enzym
• Zet GTP in GDP om
• Verandert daarbij van
conformatie/vorm
• De GTP –gebonden vorm
is aktief en geeft
signalen door in de cel
• In bijvoorbeeld bepaalde
tumoren is Ras
gemuteerd en constant
in de aktieve conformatie
Acetylcholine esterase (ACE)
Bij Alzheimer: het enzym acetylcholine esterase wordt geremd waardoor afbraak van acetylcholine tegen wordt gegaan
Functies van eiwitten:
• Enzymen: versnellen reacties• Structurele eiwitten: collageen (in bot)
en keratine (in haar)• Opslag eiwitten: albumine (in bloed) en
caseïne (in melk)• Transport eiwitten: Hb (O2 in bloed),
albumine (bili in bloed)• Hormonale eiwitten: insuline, glucagon• Receptor eiwitten• Contractiele eiwitten in spierweefsel• Defensieve eiwitten: antilichamen
PKMζ
Indeling van enzymen:
• Transferases (verplaatsen groepen op eiwitten)
• Hydrolases (maken water vrij)
• Ligases (“lijmen” DNA stukken aan elkaar)
• Kinases (fosforyleren eiwitten)
• GTPases (zetten GTP om in GDP)
• Fosforylases (verwijderen fosfaatgroepen)
• etc
geheugenfunctie
• PKMζ is betrokken bij geheugenvorming
• Muizen kregen saccharine toegediend
• Misselijkheid werd opgewekt direct daarna
• Reactie later op saccharine: misselijkheid
(geheugen!)
• Injectie ZIP in de cortex, geen misselijkheid.
Remming enzym PKMζ
Voorbeeld groep 1
CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH+ H+
ethanol ethanalAlcoholdehydrogenase (alcohol:NAD oxidoreductase)Nummer 1.1.1.1 (EC-rules)1.Hoofdgroep1.CH-OH is donor1.NAD+ of NADP+ is acceptor1.Eerst gevonden enzym in deze groep
Verwijdert protonen en vormt daardoor ethanal uit ethanol
Overzicht
• Katalytisch vermogen,specificiteit, regulatie
• Introductie enzymkinetiek • Kinetiek van enzym-
gekatalyseerde reacties • Enzyminhibitie • Ribozymen
Enzymen
• Enzymen laten cellen beschikken over
het vermogen om reacties zo snel te
laten verlopen als nodig is voor de cel
• Enzymen zijn de stoffen die gerelateerd
zijn aan een metabolische functie
Gekatalyseerde reacties
vergen minder
activatie energie
De DG waarde
• Negatief: exergone reactie. Spontaan
verlopende reactie; er komt energie vrij
• Positief: endergone reactie. Reactie vraagt
energie om te verlopen. Energetisch dus
ongunstig
• Nul: exergoon noch endergoon. Evenwicht
situatie
De Gibbs vrije energie, DG
• DG = Gproducten – G reactanten
• DG is onafhankelijk van de gekozen route
• DG zegt niets over de snelheid van de
reactie
• Indien negatief: dan kan de reactie plaats
vinden. Dat wil niet zeggen dat het
merkbaar of snel gebeurt!
Relatie tussen vrije energie en evenwichtsconstante K
• DG = DG0 + RT ln K
• K is quotiënt van de concentraties
reactanten
• K = [AB]/[A][B]
• R is de gasconstante
• DG0 is de standaard vrije energie (vaste
waarde)
Allosterische enzymen: sigmoidale curve
Allosterische enzymen
• Binden een bepaald molecule
• Veranderen dan van vorm
• Kunnen nu efficiënt aan substraat
binden
• Hemoglobine kent een allosterisch
effect door zuurstof binding
Gekoppelde enzymatische reacties
Co-factoren, co-enzymen en prostetische groep
• Veel enzymen hebben andere verbindingen
nodig
• Zijn klein t.o.v. het eiwit
• Anorganisch: Co-factor
• Organisch:
– Covalent: prostetische groep
– Niet-covalent: co-enzym (vaak afgeleid van
vitamines)
Prosthetische groepen en cofactoren: zijn nodig voor enzymatische activiteit
Katalytisch vermogen
• Enzymen kunnen reacties versnellen tot 1016 x zo snel als niet-gekatalyseerde reacties!
• Urease is een goed voorbeeld: – gekatalyseerd: 3x104/sec – Niet gekatalyseerd: 3x10-10/sec – Ratio is 1x1014 !
Specificiteit
• Enzymen herkennen hun substraat (substraat-specificiteit)
• Enzymen leveren een opbrengst van meer dan 95% (reactiespecificiteit)
• Specificiteit wordt bepaald door de unieke “fit” tussen het substraat en het enzym
Enzymatische modellen
De cyclus van een enzym
Enzymatische werking
Schematisch de werking van een enzym
Een voorbeeld van een enzym
Wat enzymen doen....
• Enzymen versnellen reacties door
verlaging van de activeringsenergie
• Enzymen doen dit door de “transition
state” van de reactie beter te binden dan
het substraat
enzymreacties
Foutje in tekstboek: DP is niet negatief, want wordt gevormd!
Enzymreacties
k1 k2
E + S ES E + P k-1
E is enzymS is substraatES is het complex van E en SP is productk zijn snelheidsconstantesK is (k-1 + k2) / k1
VerzadigingBij kleine hoeveelheid enzym
t.o.v. substraat
Enzym op maximale snelheid
Enzym kan niet sneller omzetten
Verzadiging van het enzym
Reactiesnelheid is afhankelijk van de concentratie substraat
Bij hoge S concentraties nadert v de Vmax waarde
Michaelis - Menten
Leonor Michaelis Maud Menten
Michaelis Menten kinetiek
• De basis voor de meeste niet-
allosterische enzym-reacties
• Ontwikkeld in 1913
• Karakteriseert enzym-activiteit in
termen van snelheid en binding aan
het substraat
Reactieschema
k1 k2
E + S ES E + P k-1
Michaelis-Menten vergelijking
Michaelis-Menten's theorie
• Gaat uit van de vorming van een enzymsubstraatcomplex
• ES is in een snel evenwicht met E en S
• De reactie van ES naar E en P gaat langzaam
Eerste orde kinetiek: er is een lineair verband tussen enzymatische snelheid
en substraat concentratie
Michaelis-Menten mechanisme
snelheid vorming ES = k1.[E].[S] snelheid van afbraak van ES
= (k-1+k2).[ES] a Km = [E].[S] = (k-1+k2)/k1
[ES]Km = Michaelis-Menten constante
Michaelis-Menten – vergelijking:
Vmax.[S] v = ---------------- Km + [S]
De Vmax
• Vmax is een “constante”
• Vmax is de theoretisch maximale snelheid van de
reactie
• Vmax vereist dat alle enzymmoleculen aan het
substraat gebonden zijn
• Vmax wordt benaderd als de substraatconcentratie
hoog is
De steady state• Er is weinig enzym-substraat
complex aanwezig
• Complex vorming en afbraak zijn in
evenwicht
• Enzymen bereiken snel de steady
state fase: zijn efficiënt in het
katalyseren van de reactie
Het turnover getal
Een maat voor de katalytische activiteit
• is het aantal substraatmoleculen omgezet in product per
enzymmolecuul per sec, als het enzym (E) is verzadigd met
substraat.
• k2 = kcat = Vmax/[Et]
• kcat varieert per enzym (minder dan 1/sec tot vele
miljoenen/sec
Enzymen beschrijven we middels kcat en Km
De Michaelisconstante Km
• Km is een constante waarbij de Vmax
half-maximaal is• Km is afgeleid van de reactiesnelheid-
constanten• Kleine Km: sterke binding; hoge Km:
zwakke binding
Bepaling Km
Lineaire Plot van Michaelis-Mentenvergelijking
V0 = Vmax.[S]/(KM + [S])
Lineweaver-Burk: zet in reciproke vorm
1/V0 = (KM/Vmax).1/[S] + 1/Vmax
Vergelijk met : y = a.x + b
Lineweaver-Burk-plotDoor de Michaelis Menten curve lineair te maken zijn Km en Vmax eenvoudig te bepalen
Invloed pH
Invloed temperatuur
• Hogere temperatuur:
• Moleculen bewegen sneller
• Reactie verloopt sneller
Te hoge temperatuur: enzym denatureert
Dus enzymen hebben een optimum
Invloed temperatuur
b.v. Taq DNA polymerase
Enzym inhibitie
• Enzymen kunnen specifiek geremd worden
• Farma bedrijven proberen soms een miljoen “lead compounds”
• Uiteindelijk blijft er 1 over die precies past in het enzym en
specifiek de activiteit remt
• Ontwikkeling kost soms miljoenen euros
• Terugverdienen via octrooirecht op het uiteindelijke
geneesmiddel
• Ethisch: derde wereld ziekten en ontwikkeling medicijnen
• Medicijnen zijn soms heel duur
Enzymremmers
Reversibel versus Irreversibel
• Reversibele inhibitors: niet-covalente
binding
• Irreversibele inhibitors: (bijna)
covalente binding
Remming van enzymen• Competitief - inhibitor (I) bindt aan actieve plaats
• Niet-competitief- inhibitor (I) bindt elders
Competitieve remming
• Een remmer bindt op de plaats van het substraat
• Er is meer substraat nodig om de remming op te
heffen
• De Km wordt dus groter
Competitieve remmingCompetitieve remming
Niet-competitieve remming
Het enzym wordt ten dele geremd doordat een
remmer op een andere plaats bindt dan het
substraat, maar wel de katalyse beinvloed
Niet-competitieve remming
De Michaelis curve bij remming
Irreversibele remming
• Remmer bindt zeer sterk aan het
enzym en laat vrijwel niet meer los
• Zowel remmer als enzym gaan dus
verloren in het irreversibele complex
Enzymactiviteit bepalen...Hoe?
Kies de
o de substraatconcentratie......?
o het substraat.....?
o de pH........?
o de aard van de buffer.....?
o de temperatuur.....?
Enzymactiviteit bepalen...Waarom?
• Diagnostiek: veel eiwitten spelen een rol in medische
situaties
• Eiwitzuiveringen, isolaties, research
• Met hoeveel enzym(in Units) begin je?
• Hoeveel enzym (in Units) heb je nog over?
• Hoe zuiver (U/mg) is het?
Diagnostiek
Enzym NormaleWaarden (IU/l)
Verhoogd wijst op
Creatine- fosfokinase
40-240 (man)40-200 (vrouw)
Hartinfarct
Alkalische fosfatase
30-125 galstuwing
Zure fosfatase 2,5 Prostaat- carcinoom
Lactaatdehydro-genase
200-450 leverziekten
Waarom Units en geen mol/l?
• Eiwitten ingewikkeld mengsel• Eiwitten kunnen denatureren
Kijk daarom naar de activiteit van het enzym!!!
1 I.U = die hoev.enzym die in staat is om 1 mol substraat/min om te zetten (onder bepaalde condities)
Voorbeeld enzymbepaling
• Zorg voor:
– Substraat met kleine KM, goede affiniteit
– Hoge [S]
– Optimale temperatuur
– Optimale pH
– Optimale buffer
En meet A/min en activiteit enzym
Km en Kcat• Belangrijkste parameters voor
enzymen
• Hiermee karakteriseren we enzymen!
• Km: affiniteit voor substraat en = ½
Vmax
• Kcat: turnover getal, dus mate van
katalytisch vermogen ten opzichte
van het substraat
Voorbeeld: enzym remming bij AIDS
• Tegen drie cruciale virale enzymen zijn remmers
ontworpen
• De enzymen zijn “gekristalliseerd”, dwz, de structuur is
onderzocht en bekend
• Er zijn “gericht” medicijnen gemaakt tegen deze enzymen
Virale enzymen en AIDS
Anti-virale middelen en enzymatische targeting
Samenvatting
• Enzymen zijn zeer efficiënte katalytische eiwitten
• Michaelis en Menten beschreven een zeer goed model voor
niet-allosterische enzym activiteit
• Uit een Michaelis Menten curve kan men de Km bepalen
• Kcat kan berekend worden uit de hoeveelheid gevormd
product (is k2)
• Enzymen kunnen competitief niet-competitief geremd worden
• Bij competitieve remming verandert de Km
• Bij niet-competitieve remming verandert de Vmax