ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Lê Thị Tú Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012
22
Embed
ĐẠI H ỌC QU ỐC GIA HÀ N ỘI TR ƯỜNG ĐẠ ỌC KHOA H ỌC T Ự ... · còn non, phi ến lá hình elip ho ặc elip h ẹp, kích th ước 5-11 x 2-4 cm, mỏng nh
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA H ỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lê Thị Tú Anh
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH H ỌC LOÀI MÍT LÁ ĐEN
ARTOCARPUS NIGRIFOLIUS C.Y.WU
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA H ỌC
Hà Nội - 2012
Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN VĂN TUYẾN
Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN
Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS. NGUYỄN QUANG HUY
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn, họp tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
vào hồi 16 giờ 15 phút , ngày 28 tháng 12 năm 2012
Có thể tìm hiểu luận văn tại:
Trung tâm thông tin – Thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội.
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng.
Tổng số loài thực vật đã ghi nhận ở Việt Nam khoảng 10.500 loài
trong tổng số 12.000 loài theo ước tính. Trong số đó, nguồn tài
nguyên cây làm thuốc chiếm khoảng 30%. Trong thời gian qua, nước
ta đã có hơn 3.000 loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược được cấp số
đăng ký, chiếm gần 1/3 trong tổng số thuốc mới được cấp số đăng ký
lưu hành hàng năm. Như vậy nhu cầu sử dụng cây dược liệu chế
xuất thuốc trong nước là rất lớn.
Chi Artocarpus (họ Dâu tằm, Moraceae) là một chi thực vật
khá phổ biến ở Việt Nam với 15 loài. Trong đó, ngoài giá trị làm
thực phẩm nhiều loài còn được sử dụng trong y học dân gian để chữa
các bệnh như thấp khớp, hạ huyết áp, tiểu đường như mít
(Artocarpus heterophyllus), xa kê (Artocarpus altilis)…Thành phần
hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi
Artocarpus đã được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên
cứu từ lâu, nhiều hợp chất mới với những hoạt tính tốt đã được công
bố [31]. Tuy nhiên, ở Việt Nam mới có một số ít loài được nghiên
cứu. Các nghiên cứu này cũng đã tìm ra được một số có hoạt tính
sinh học tốt có thể ứng dụng vào cuộc sống và là tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo [6]. Ở Việt Nam loài mít lá đen Artocarpus
nigrifolius C.Y.Wu mới được tìm thấy và bổ sung vào danh mục
loài của chi mít (Artocarpus) năm 2011 do nhóm tác giả PGS.TS
Trần Minh Hợi, viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật . Nhóm tác giả
cũng đã công bố hoạt tính sinh học của cây và cho các kết quả rất
đáng quan tâm. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn loài cây này làm đối
tượng nghiên cứu và thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa
học và hoạt chất sinh học loài mít lá đen Artocarpus nigrifolius
C.Y.Wu”.
Mục tiêu của luận văn là nghiên cứu thành phần hóa học và
phát hiện các hợp chất hóa học có hoạt tính sinh học của loài
Artocarpus nigrifolius C.Y.Wu. Để đạt được mục tiêu trên chúng tôi
thực hiện các nội dung sau:
- Thu hái và định tên cây
- Xử lý mẫu
- Tách chiết, phân lập, xác định cấu trúc các thành phần hóa
học của cây
- Thử hoạt tính sinh học các mẫu cao chiết và các hợp chất
tinh sạch được.
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1 Đặc điểm thực vật của loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Chi Artocarpus thuộc họ dâu tằm (Moraceae), là một họ thực
vật lớn gồm khoảng 60 chi và hơn 1400 loài, phân bố chủ yếu ở các
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Theo Phạm Hoàng Hộ, chi
Artocarpus ở Việt Nam có 15 loài và dưới loài [4].
Trong đó (1) và (2) cho giá trị MIC là 32 µg/ml với P.aeruginosa,
giá trị này cao hơn cả chất kháng sinh đối chiếu là chloramphenicol .
1.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào
Suhartati và cộng sự đã tách được một số hợp chất phenol từ
rễ cây Artocarpus rotunda là artoindonesianin L (4), artonin M (5),
artonin E (1) và artonin O (6), cycloartobiloxanthone (7) . Những
hợp chất này đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế
bào P388 bạch cầu chuột với LC50 lần lượt là 0,6; 7,9; 0,06; 4,6 và
0,9 µg/ml.
1.3.3 Hoạt tính chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật
ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học do khả năng
tăng cường sức khỏe, giảm các bệnh tật kinh niên của chúng. Thành
phần hóa học của loài thuộc chi Artocarpus chứa nhiều hợp chất
phenol là nhóm hợp chất có tính chống oxy hóa cao, có khả năng
ứng dụng vào thực tiễn như là thực phẩm bổ sung.
1.3.4 Một số hoạt tính sinh học khác:
Ngoài hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào trên các dòng ung
thư, chống oxy hóa; những hợp chất được tách chiết từ chi
Artocarpus còn có nhiều hoạt tính khác có thể ứng dụng trong lĩnh
vực y dược học.
1.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro:
Với sự phát triển của khoa học công nghệ, hiện nay trên thế
giới đã phát triển nhiều phương pháp thử các hoạt tính sinh học in
vitro cho kết quả chính xác cao và thời gian thực hiện tương đối
ngắn. Ở phần tiếp theo, chúng tôi sẽ đề cập đến những phép thử phổ
biến nhất.
1.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng sinh in vitro:
� Phương pháp dùng khoanh giấy trên môi trường đặc. � Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc � Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng � Phương pháp vi định lượng trong môi trường lỏng. � Phương pháp sinh tự ký ( Bioautography)
1.4.2 Các phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử
nghiệm trên các dòng tế bào ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện
nay người ta thường sử dụng hai phương pháp là: phương pháp MTT
và phương pháp SRB.
� Phương pháp MTT � Phương pháp SRB
1.4.3. Các phương pháp nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in
vitro của chất:
Để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro của các chất,
hiện nay có một số phương pháp sau:
� Phương pháp sử dụng DPPH � Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II � Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc superoxyd
O2*-
� Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gốc peroxyhydro H2O2
Chương 2 - THỰC NGHIỆM
2.1. Mẫu thực vật và thiết bị, hóa chất
2.1.1 Mẫu thực vật
Mẫu thực vật loài Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu thu tại khu
Bảo tồn thiên nhiên Copia, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào
tháng 6 năm 2010. Số hiệu mẫu PVT 419. Tiêu bản do TS. Nguyễn
Tiến Hiệp định tên và được lưu giữ tại Phòng tiêu bản thực vật, Viện
Sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
2.1.2 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật
� Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau. � Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy
Brucker Avance 500MHz � Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol,
aceton, etanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính sinh học
� Các môi trường nuôi cấy Merk: MHB, MHA; TSB, TSA cho vi khuẩn; SDB, SDA cho nấm, RPMI 1640 cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1; huyết thanh bò FBS
� Chất tham khảo (Sigma): ampicillin , streptomycin, amphotericin, ellipticine. (DPPH): chất tạo ra gốc tự do
� Các máy móc thiết bị thực nghiệm sinh học.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết tách
Mẫu cành, vỏ thân, rễ và lá cây Mít lá đen được làm sạch,
sấy khô ở nhiệt độ 400C, xay nhỏ và chiết riêng biệt từng loại nhiều
lần ở nhiệt độ phòng với methanol, loại dung môi thu cao chiết.
Cao chiết MeOH được chiết lại lần lượt qua các dung môi
có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan, etyl axetat. Cất loại
dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết tương ứng.
Phân lập các cao chiết nhận được bằng phương pháp sắc ký
cột thường, sắc ký cột nhanh với các dung môi thích hợp.
2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng sự kết
hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-
MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT)
và hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY).
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng sinh:
Phương pháp tiến hành: thực hiện dựa trên phương pháp vi
định lượng trên môi trường lỏng. Đây là phương pháp thử hoạt tính
kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng
khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt
tính là MIC (nồng độ ức chế tối thiểu), IC 50 (nồng độ ức chế 50%),
MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)
2.2.3.2 Phương pháp thử độc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC
gồm: KB (Human epidermic carcinoma), Hep G2 (Hepatocellular
carcinoma), LU (Human lung carcinom), MCF-7 (Human breast
carcinoma).
Phương pháp thử độ độc tế bào: được Viện Ung thư Quốc ga
Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các
chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở
điều kiện in vitro.
2.2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự
do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất
nghiên cứu.
Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu
của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517
nm.
2.2.4 Phương pháp sử lý số liệu:
Các số liệu được xử lý bằng phương pháp xác suất thống kê.
2.3 Thực nghiệm chiết tách, tinh chế và số liệu phổ, thử hoạt tính sinh
học của các hợp chất từ loài nghiên cứu
2.3.1 Chiết mẫu thực vật
Các mẫu lá, vỏ thân, cành, rễ được nghiền nhỏ và tiến hành
chiết riêng biệt.
2.3.2 Sàng lọc hoạt tính các cao chiết bộ phận:
Cao chiết lá, vỏ thân, cành, rễ sau khi loại hết dung môi, làm khô
tiến hành cân và pha loãng theo các nồng độ được sử dụng thử các hoạt
tính : kháng sinh, gây độc tế bào và chống oxy hóa DPPH theo các
phương pháp đã trình bày trong phần trên (2.2.3)
2.3.3 Chiết tách và phân lập các chất từ cao chiết vỏ thân:
Phân lập các chất từ cao chiết
Tiến hành phân lập các chất từ cặn chiết diclometan thân sử
dụng sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel, dung dịch rửa giải là n-
Hexan/EtOAc tăng dần tỷ lệ từ 0-100% thu phân đoạn. Sau khi xử
lý các phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột lặp lại với các dung
môi thích hợp, kết tinh lại thu đươc các hợp chất AFD2, AFL2,
AFD3, AFD6.
2.3.4 Thử hoạt tính các chất đã phân lập
Các chất đã tinh sạch được tiến hành thử hoạt tính theo các
phương pháp đã nêu trong phần 2.2.
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính các dịch chiết tổng từ
Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Tiến hành ngâm chiết riêng các mẫu (theo phương pháp đã
nêu ở phần 2.3), lượng cao chiết mỗi bộ phận thu được như sau:
Bảng 3.1 Hiệu suất ngâm chiết các bộ phận cây mẫu
STT Tên mẫu Khối lượng mẫu khô
(gam)
Khối lượng cao chiết thu được
(gam)
Hiệu suất chiết (%)
1 Vỏ thân 40 2,46 6,15
2 Thân 40 1,30 3,25
3 Rễ 40 1,28 3,20
4 Lá 40 2,65 6,62
Vậy, bộ phận lá và vỏ thân cho hiệu suất chiết cao nhất đạt
hơn 6%.
3.1.1 Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng sinh các cao chiết tổng Artocarpus nigrifolius C. Y. Wu
Bảng 3.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của cao chiết