'I .. 1148.206.53.84/tesiuami/UAM21170.pdf · - tual.idnd inportantes descubrimientos y aplicaciones comerciales en cadi uno clc 1.0s campos de la Biotvcnología, incluyendo las que

Ramirez Jiménez Szlvador ! 'I

NomhF2:

,- Tei.6fono: . . 1 589- 03-- 1 3

Matrícula : 802 ;i 30 38 "

Clave : , No. 2 3 1 4 023/%

Carrera :

T r i c e s t r e : 120.

Horas semana: 22 hrs.

Lugar donde 8e l l o d a cabe: I n s t i t u t o de Inv i s t i gac ionas Bionikrli--

B i o i o g f z con área de concentración en Ecologfa

cas de l a U.N.A.M.

Fecha de i n i c i o : 4 de noviembre de.1935

Fecha de terminación: 25 de a b r i l de 1986

Tv to r :

Firma Tutor: *

,

M. en C. Rosa de l -Carmen Mateos Yarcos, TEcnico - Aca<j&mico T i t u l a r "A", Tiempo Completo. 2stu.diante

d e l %ctorn?o en Biotecnoiocia.

Adscripci6nr Depakamento de S io tecno log ía as1 Ins ' ' i.

t i t u t 3 de Invest igac iones Bio&dicac de iá U.N.A.N.

ftEstudio dz l a Regu7u;ack6n por. Nitr6geno de la i3i.o-

PROYECTO FINAL

1. Titu1.0: "7stu6io de l a R e ~ p i n c i ó n por Nitrógeno de l a Bios ínte-

siis de P e n i c i l i n a en Pen i c i l l i u !n chrysoqenum"

- 8

1

2, Introducción.

'Como s e mencionó en e l Proyecta I n i c i a l , en l a c a r t e d i rkg ida a l

K. en C. Prancicco F. Pedroche, a l encontrarme desarro l lando.e l s e r - v i c i o s o c i a l en un proyecto de inves t i gac i ón para obtenm e l grado

de Doctor po r parbe de m i t u t o r l a M. en C. Rosa d e l Carmen Yateos

Marcos, no podré presentar Ün~~-informe f i na1~ - de l o s datos obtenidos ~'

n i de l a s ac t i v idades desarro l ladas durante e l mismo. S in eabzrgo,

y -con su autor izac ión desa r ro l l a r é un informe de las ac t i v idades ge - nera l e s en forma.teÓrica., d6ndole én fas i s a un aspecto que IlanÓ - bastpnte m i a.tención d u r a t e l a peramenc ia en e l l abo ra to r i o del -

~. .~ . ~~~~ ~ ~~

'

Dr. Sánchez: l a biotecnolotzfa.

De i gua l manera, en dicho Proyecto I n i c i a l s e r e a l i z ó una amplia

exposicíón desfie l o s as?ectos h i s t ó r i c o s de l a p en i c i l i na y l a re%

laciÓn.de su b i o s í n t e s i s ( p o r fuente de n.itrÓP;eno, fuente de carbo-

no ;y otras ) , hasta e l panel eco lóg i co de l o s an t ib i ó t i cos , por l o - QÚe abunaar en e l l o s e r í a innecesario.

. ! .,

I

, 3. Objetivo.

Mostrar a l p m o s de l o s a s Q c t o s más importantes de l a S i o t e cno l g

g í a , y que, cono ac t i v i dad -desa r ro l l é durante m i s e r v i c i o s o c i a l . ." ', I "1

7

a .-

r , .

E::L en t ra - cn contacto con :Los procesos de l a inves t i gac ión hási-

ce. ~ c n i e n l o en cr1ctnt.t un f i n común, su ap l i cac ión para b ene f i c i o de

1 la sociedad.

.La natura leza de l a b i o t e cno l og í a como Ú l t ina f i na l i dad de toda

es ta investiga.ción q u ~ se desa r ro l l a en e s t e Departamento.

4. I f laterial 10 ac t i v i d zdes a desarro l la r .

Equipo de uso comÚn en un l s b o r e t o r i o como:

Tubos de ensayo, niatraces Erlen Weyer, ca jas de P e t r i , r e j i l l a s ,

. ~~ ~potenciometro, b&culas (granatar ia ~ ~~ y ~. a n a l í t i c a ) , . . calentadores, ~~ ~~ ~~ .~ a g i ~.

tadores, homogenizedor Brown, encubadoras, equipo de f i l t r a c i ó n , - papel f i l t r o , eibudos, asa, espátulzs, pinzas; papel. parafi lm, 16x1 - para de l u z UV, . centr i fugas , p ipetas , matraces Perb Back, tanques

de v sc i o , p zpe l ai.umin.io, navajas y autoclaves.

,

Al& enuipo de empleo en t écn icas s o f i s t i c adas como l a s ul t ra -

centr í fugas y %as cente í fugas d i g i t a l e s (con l a f a c i l i d a d de con--

t r o i a r basta l a temneratura de l proceso. de centrifupRdo) ,' col.umnss

para n i v e l p i l o t o con Sus r esaec t i vos controladores d.e t i -avo para

.'la toma -& rcuestrss, micropipetas o p ipe tas automdticas, eouipo de

re l evado joara e i e c t r o f o r e s i s , piacas de g a i ( s i l i ca -ge i ) , .micropo-

r e y equipo fie secado nara polvos.

.Además d e l gran número de r e a c t i v o s empleados como amino&idos,

medios para ctkltivo, s a l e s , a lne ra l e s , ácidos, bases, soluciones - amortiguadoras, azúcares y otras . zontando,como último, con? cuarto

de temperatura constante (29 " ) , cuarto f r í o y una computadora. -. .5

--

, *.

~ I ' .

I

5. Resultados o ac t i v idades desarro l l zdas 1

Introducción I

I I I

De acuerd, con e l informe Spinks (1980) l a Biatecnoloqfa se de-

ne como l a u t i l i z a c i d n de organismos v i vos , o b i en s i s t e m s o proce - sos b i o l 6 g i c o s para l a producción indus5ria l o SU empleo m>os ser-

v i c i o s de saneamiento. Desde un p r i n c i p i b l a Biotecnología fue con-

siderada como creadora de una nueva indust r ia con bajas denmdas e-

. * I i' . .

1.

- nergét icas . 3110 se debe a que e l crecimiento de microorganismos r e - presenta un% fuente de energfa renovable que disminuye l a dependen-

c i a con respecto a los escasos y costosos depósitos f ó s i l e s e x i s t e 2 -

,

t e s , o bien de l o s productos qufnicos de e l l o s derivados. Los micro - - orpn ismos t i enen diversos usos entre los cpe s e incluyen l a produc - - ci6n de cerveza mediante levaduras; l a producción de enzimas o b i en

de alimentos (prote ína de orpnismos unice iu leres , SCP).

Resulta ev idente oue para comprender todas l a s pos ib i l i dades que

o f r e c e l a S i o t e cno i og i a es necesar io un nrofunfio conocimiento de - 13s c ienc iqs básicas nue s e encuentran en e l l a inpl icadzs. Sin em--

I

bare0 es f á c i l i d e n t i f i c a r algunas áreas en l a s que l a s m t e r i a s - primas naturales, entre l a s que se incluyen l o s alimentos y l o s de-

sechos a g r í c o l a s pueden transformarse ca ta l í t i camente en productos

útiles mediante e i uso de microorganisrnos o de las e n z i m s que se - obtie?en de e l l o s . Entre estos procesos se incluyen a1,nnoc que son

b i e n conocidos y se explotan industrialmente, como es l a producción

de cerveza, que sesonniderr, como una-parte de 12 Biotecnol-fa enz i - - .

máticn y d? fbrmentaci6n. En l a s o t r w áreas s e encuentre e l t ra ta -

miento de residuos, que t i e n e como o b j e t i v o l a desconteminación am-

b i en t a l medi2nte 1-a cual, y de manera secundaria, l a mqs3 de micro-

- organismos obtenida (biomasa,SCP) puede usarse como alimento para - animales, o b ien, como fuente para l a obtencidn de productos qufmi-

1

cos t a l e s cono e i metano. Une gran par te de l a Biotecn01og í~ i impii-

ca e l descubrimiento y l a subsiguiente optimieación de l o s procesos

b i o l ó g i c o s y bioquímicos necesar ios para exp lo tar la's fuentes de ma - t e r i a prima natura ies . ( i ) ( 2 )

A l n i v e l mundial e l i n t e r é s por l a B io tecno log ía es indudable, - como s e v e a tr2.vks d e l f recuente abordaje de t a l e s temzs en l o s pe - r i ód i c o s , l i b r o s y medios de comunicación. Algunos descubrimientos

ú t i l e s serán una consecuencia d i r e e t a d e l uso de l a s t écn icas de i n - g en i e r í a gené t i ca que l o g r e n t ran ' s f e r i r determinados genes ( a vgces

inc luso genes humanos) a un determinado microorganisno apropiado, - para hacer e l producto que e s precisamente requeri6o en e l mercado.

Determinidas a r o t e h a s humanas y algunas enzimas requeridas en Nedi - - tina' s e conseguir& de e s t a forma en e l futuro. Otros muchos b ene f i - c ios , se r& e l resul tado de l a . fabr icac ión mediante t écn icas de f e r -

mentación, de anticurrpos e spe c í f i c o s para f i n e s a n a l í t i c o s y t e ra -

péuticos. Estos anticuerpos monoclonzles s e producirán mediante e l ' '!

I

j

, crecimiento de c é lu l as en grandes tanques de c u l t i v o , u t i l i z ando e l

conociniento biotecnol6&co adquirido por e l c u l t i v o de microorga--

nicmos en &Tandes fermentadores, como por e jenplo , l a produccron &e - . I 'i

~ ..

a

ant ib i ó t i co3 como l a pen i c i l i na . Se esti5.n desarrol lando i n 11, ac--

- tual.idnd inportantes descubrimientos y ap l i cac iones comerciales en

cad i uno clc 1.0s campos de l a Biotvcnolog ía , incluyendo l a s que tie nen luga r en l a s industr ias de fermentación, l a b io t ecno l og í a de - l a s enzimas y c é lu l as inmovil izadas, e l tratemiento de residuos y

l a u t i l i z a c i ó n de subproductos. Aquellos procesos que resu l t en pro - du.ctivos serán ú t i l e s 2, i a sociedad, a t r a c t i v o s para ia in8.ustria

p o r motivos conerc ia l es y en algunos casos recibir,& e l apoyo de - l o s respec t i vos gobiernos. ( 3 ) ( 4 ) :

. ~. ~~ . . . ~ ~ ~ ~.. ~~~~~ ~~ ~~ ~~~ P e n i c i l i n a ~~ ~ ~ ~ ~~ ~~ ~ ~ . . ~- ~

E l descubrimiento de l a p e n i c i l i n a en 1923 por Alexander Fleming

ha t resp isado ya e l mundo e s t r i c t o de l a microbio log ía . Un- co l on ia

contaminante de hongos en un c r í l t i vo de p l ac z de Pe t r i " p rovoc6 l a

l i s i s .de al'gunas co lonias de Staphylococcus que s e encontraban crg

ciendo en acar. La conclusión de es ta observación f>x.e que un coz--

puesto antii?iicrobiano sol.uble en agua s e había excretkdo p o r l a co - l o n i a qe l hongo. Esta obsermc ión i n i c i ó e l desa r ro l l o de rnuchos - o t r o s antibiótico?.. Sin embargo l a p e n i c i l i n a permmece, hasta e l

momento, 'co-no e l a n t i b i ó t i c o m6s a c t i v o y menos t ó x i c o de l o s de - uso c i í q i c o noriaair

E l nombre de p e n i c i l i n a s e a p l i c a a un número de sustancias pro -

d.ucid-3.s por Pen i c i l l i um y o t r o s hongos. Las pen i c i l i na s nz tura les

t i e n m estructuras c í c l i c a s c o m e s a I n s cuales s e unen d i f e r en t e s -,, .,

cadenns t a t e r a i e s de t i p o a c i l o ( ver - Proyecto I n i c i a l ) . 7

_ , I . .

-6 = ,I

1 , ..,AL-> 7 , . . . --

. . 1,

Las fermentaciones g r im i t i v a s de - Pen i c i l l i um $roüucía.n princip3.L I

mente 'penic i l in?. F, pero ia adic ión de malezas

subproducto \le l a industrix. d,el almidón de maíz) 'al medio de cu l t i -

vo no sólo mejoró e i rendimiento en p en i c i l i na t i t a i s ino nue tuvo

un e f e c t o c u s l i t a t i v o , siendo la, p e n i c i l i n a G 51 princinal. producto

Bsto es debido a que i a maleza de maíz contienen ácido f en i i a c é t i c o , '

s i z (que es un I i

i - . .

un precursor de l a p e n i c i l i n a G. La ad ic ión de o t r os compuestos a l

aedio p e r a i t i ó l a producción de un gran número de pen i c i l i nas que - no se obtienen normalmente. Actualmente se producen un gran número

de Den ic i l inss semis in té t i cas que s e fabr ican mediante conversión - mímica de 12 pen i c i l i na G. La p e n i c i l i n a V se f a b r i c s modiante f e z

mentación d i rec ta .

Pen i c i l l i um chrysogenum.-El género Pen i c i l l i um - pertenece a l a

c l a se de l o s asconicetos dentro de l a Eunicotiaa. Los géneros I_ Peni-

- '

n i c i l l i u m y A s w r g i l i u s son l o s m&s conocidos entre los hongos. El

giénero Pen i c i l l i um forma esporas asexu i i es que s e conoceii como coni - d ios y cue representan una proporción s i g n i f i c a t i v a d e l ni ice l io a&-

- reo. A.lgunos Pen i c i l l i um forman también f ases sexuales t í p i c a s , l o

que da lugar a l a producción de ascosporas en i a estructura l lanada

cl.. e i F" t o t e ca..

. , . I .

!

.i

I En - P.chrgsopenum e x i s t e un cic1.0 parssexual a travé,s de una fu--

, sj6n de l a s h i f a s v ege ta t i vas haploides s e forma u? mice l i o que con

t i e n e una mezcla de l o s núcleos de l a s dos especies. Pstos, a su vez

fimiien formando nficleos d ip l o ides que pueden p e r s i s t i r dura2ite mu-- 4

>: '. & :

< . I

1

Fig. 1 cicJ.0 aa,rasexu,a1 de Peniciilium chrysoeenum. 3icho ClC?-O - es eino'!.:?.do con nrocesos de mutagénesis para producir cepas -

- I

cA+ b' ___b @ fliiÓn suverproductoras (7). d ~ e núcleos

haploides desiguales

Núcleo diploide hetrocigót ico i

b ' . Entrecnizcmiento mitó- tic0 coi? forriación de

Yicelio heterocariótico ha9loide

t núcleos diploides I

Fusión de hifas

/ ' \ ??úci e o s dio 1- o io es

Baploidización

J I

io no c& i ó t icas I

Gems haploides i

Recombinantes haoloides y tipos parentzles

,

ch-2.s d i v i s i ones mitriticas existierid0 entrecruzaxieato ccm uria fre--

cu.encia ba2a. A p a r t i r de ah$ t i e n e l u ga r l a formación de ca lu las - haploides qu,e dan l'ugar a un repar to a l azar de l o s pares de cromo-

somas. 31 aroceso d i f i e r e , po r tanto, de l o s c i c l o s sexuales en que

no'hay meiosis, (5) (61, ( p i g . i) . i

E l c i c l o para.sexua1 se ha u t i l i z a d o junto con l a mutagénesis pa-

r a nroducir cepas superproductoras. Las e f i c i e n c i a s de conversión - d e l carbono en penic i l ina . en l a s cepas actuales de p r o d u c c i h osc i -

1.m a1.rededor del 70%. (7)

l I

i

~ . ~. ~~ .~ .~ .. Produccldn ~ ~ ~ .~~ . ~~~~~~ . ~ ~~~ . . .

-k .formi general presentare un diagroma de flujo de l a secuencia.

para l a inoculación de Pen i c i l l i um zhrgsogenurni

- In f luenc ia de l a temnera.tura de l c u l t i v o sobre e l c rec in iento y :!

l a .oroductividad de P e n i c i l l i u v chrysopenum: J -. .,

i

I

30 '2 Aunento -de bfiomasa veiocici%d ad r r sp i rac i6n Producción d,e p e n i c i l i n a 25. 'C:

!

Par ine t ro Ternperaturai6ptim

22-24 O r :

- .I 1

-Empleo de un p e r f i l de contro l de temperatura para l a producción

de p e n i c i l i n a en cu l t i v o s de P en i c i l l i um chrysoaenum. Tomado de -- Constamtinides y co l . (1973) Pes0

/ I'

horas i

Esta es una de l a s áreas en e l informe donde s e verá l in i i tada l a

in fornac ión por razones exnlicsdas en un p r inc ip i o .

Aplica.ci6n de l o s p r in c i a i o s de p m 8 t i c a microbima a l a b io tec -

noiogís..

E l p r inc ipa l o b j e t i v o de l a genét i ca niicrobizna en e l cam?o de 1

l a b io tecno loc ín hs s i d o a l t e r a r l a composición genét ica de l o s m i -

croore?nismoo de importancia i ndus t r i a l para. incromontar ia e f i c i e n

c i a r l obs i d e l nroceso para e l Que s e emplee a l microorgnnisao. A X

nue el. o5jei;iV.o f i n a l es increment- e l rendiniento de LEI proCucto 3 :

,

*

que conducen a ~ l a producción de^ metabolitos de i n t e r é s co l ierc ia l , - así como de los mecanismos de cont ro l que regulan esas rutas. A pe-

. ..

f e rentes prutcinns, inc luso cuzndo esas necesidades no s e a f e c t en - por l a s condiciones externas., A h rn&s,los n i v e l e s de l o s llamados

enzima6 cons t i tu t i vas

en ' l as confiiciones, como son Los oue a fec tan R l a ve loc idad de cre-

cimiento d z l microorgznismo. Los pr inc ipa l e s pargmetros ,me a f e c tan

a l o r nivel-ss de producción de t a l e s enzimas y que son,por tanto , - suscenti 'cles de m i j o r a r mutacionnl o de m.?nipul?ciÓn mediante recoa

binación i n v i t r o , son l o s s iguientes :

pued.en ?.fectarse por cambios no e spe c í f i c o s

a) E l núniero de 'copias del^ gen~~ impl i cado . Un aumento d e l número.

de coains en e l gen es de esaerar nue c!onduzcs.E un auaento dp l 3rg

ducto de l gen. Awquc es to ocurre narnalmente, e l aumento no es, a

rnenndo, VroDorcional a l número de cop ies de l gen.

b,) La . ? f i c i enc i i . do l promotor. Yzaa gen, o cada. grupo de gznes - t r ansc r i t o co? .ect ivmente ( e s dsc i r , integra(ioc en un o7sr5n) están

unidos a una r eg i ón de l DNA danominrdo pronotor. Zste es e l s i t i o - reconocJdo por l a E N pollmeram previ3mente a. la i n i c i z c i ó n de l a

t rascr ipc ió i i ( e s d . ic i r , 1a h i o s ín t e s i s d e l 9NA nienszJero sobre un - .'molde de 'DDp4). Los prorno%ores var ían consid.?rablenente en su e f i c i e n - c i a , y hay, por c,3nsiguiente, una considerable var iac ión en e l ni--

vel. de t ranscr ipc ión de l o s d i f e r en t e s genes. Puesto que Is i n t e r a s

c ion entre el. RNA polirrera.sa y e l promotor tomhi&¡ de-ende de l a e s

pec i f i c i dad de l a polimcira.sn., un buen promotor en un orgmismo pue-

d2 no f imc ionm e f e c t i v m e n t e s i t a l . as t rans f e r i do 2 o t r a espec ie .

, ., .

.,. u

.i

. .

&to e s pari:icul.~rmente i !n?ortmte, en e l t r z ba j o ; dc? racorcbinzicih - i n v i t r o , dpnd- l o s genes- pueden s e r t rans fe r ido$ a organi3nos muy-

!

di f - rentes . I I I . /

c ) La presencia de aten?xadores. rJn atenuador esun s i t i o de term2

b nación de l a t ranscr ioc ión dentro de un operón due conduce a un n i -

v e l reducido en l a t ranscr iac ión de l o s genes nue se encuentran m&

a l l b de ese s i t i o . Un atenuador también puede e x i s t i r en ia r eg i ón

p r i na r i a de un gen ( l a oue s e t ranscr ibe en primer lugar ) , es d e c i r ,

en t re e i s i t i o que comienza 1.a t ranscr ipc ión y e i gen estructura l .

Los 3tinuadores están implicados en e l cont ro l dc l a expresión de - un número riz onerones cue conducen,a l a b i o s í n t e s i s de ami?oScidos

en 7~ r o c~ r i o . t e s ; f a ausenci?. d ? l ariiino6cido en cu i s t i ón se spione que

provoca e l estacionmhento di? l o s ++.bosomis en un punto e s o e c í f i c o

d e l RNA men?,zjero. Zs to , E su vez, causa cambios en l a estructura - d o l rna mcnc,3,j?ro cue permite CUP 1.3. Erma pol inerasa con.tinÚe histe

el. s i t i o de terminacion (2-tenuador), ( 8 ) (9 ) . E1 mecanimo &?-I ate-

nirridor puedi! s e r , a l menos en pZ.rto, responszble d;? In r o p k c i b n -

. , .?,

depnn6iente de l a velccidec? de crecimiento observad?. en mu.&~.?s e n z i

mas fji3). \

a) Controles de tr.a.8ucciÓa ( e s d z c i r , durmte l a b i o s f n t e s i s .de

prote ína ) . ~h RQLUIO~ casos, e i n i v e l de una' proteínsi puede verse - . .. 1

l im i tada rnediz-.n.te l a regulac i6n de la t rzducc ión ( l a . iu i i6n cle unos

a,mino::cidos con o t r o s sobre un nolde de &A rnensajzro unido i l o s - ,

\

i rib3Cjon?s) en l_u,Tzr de sobre l a t ranscr ivc ibn. Ffucho menos emoc i - - <!

do:; 8011 l o s mccsnismor de cont ro l de l a traducción, que se es-e?ra - . 3 - . 'I

i

l d -,d.

7. ConclusionAs.

E3 de cox?,render que a l es tar ' 1 7 ~ e?- Depii.i;cix?nto de Biotecnolo-

gír, es t e infornie f i n a l tuvo un Ftnfocue con esa c a r s c t e r f s t i c s , pero

todo e l l o re2,acionado con 1.a de activid.ades que, como se i n d i - ca eri el crori3,Trzna del. a r o p c t o j . n i c i a i , teEír-t w e dssar ro i i a r du-'

rante m i s e r v i c i o soc i a i . sí, e l aroiongsido tema de genética niicro -

L

t

.

bizn-2 c31io ejcmnio.

E l haber pY.rticipsdo en un nroyecto dr inves t i gac ión y haber ad-

qu i r ido conocimiento y destreza. en ei empleo de esuipo de u s o coxúri

en un l akQre to r i o , así como, de al.l?u?os s z f i s t i c ados observ2.r SII ma - nejo.

Tl opt rar en contricto con l o s nrocescs de l a inves t i gac i6n bási-

ca.

La natiuna'leza de l a bíotecnolo?f:z como Últ;.mr, f ins?. ided '35 t o &

es ta activid?r! de m i , :e-vicic soc in l .

A IR ÍII. nn Z. Ros^ del Carinon !:atoos Fmcos por su vali.osz ayuda L

! y comnrensión en el transcum-r de to20 $1 s e r v i c i o soc ia l . c ' . . A l Dr. Sergio 35nchez E . por haber f c c i l i t a d o mi particineción

en su l abo ra to r i o con su erpi.T,o ?e trabz, jo.

I A Tere Lueas, Ma. Slena Velrrsc~, L m r a Esczi.e.nte, Amelit-. Farrés,

L e t y , L a ~ r a y 3rendan po r su :irnist?d.

.

c

. I

8. Se f e renc ies

i

. , *I . .

l a , s Surbuj?.& ,iysoosz.s 0u.e s s oro12ucei1 s e colznsah nroducer: oild8.s de

choque que constfituven .los ol.?%eiltos destructore$ de e s t e nrocedi--

miento. Parr:, un niejor result%do dsbe emplearse e; ?@, tecilJeretura. y 1 ,

e l s f e c t o nu.3 aroduce la aqi t í i c lón en presencia de comouri,toc abre-

s i v o s y de l a roturzt por c i z : i l l edura en meciio i h u i d a . No hag p e l i - . .

g ro ü.: desna’.tura.lizaciÓn t é rn i ca de l a enzima ya a,ue,se trc.ha.ja a - tempemturao de -20 ‘2.

f ) .%x-iceisdo y descon~nlaoo. Siempre que se suirde w.5: oas ta ce - l u l e r a -20”: se l a sonetará, inevitablemente E un proceso de conge-

i.ado y descongelado. La. f~r!i?i.‘ci&i de- los c r i s t i l e s ‘de hielo dterz.

?l. mztzrizd cs l i i la , r , l o su f i c i en t e cono ?sra . ?ern i . t i r 13. !.ib?rlici.h

ii.2 aikguna.s protiínam (uue ocun7:i a?..rededor d e l s?:: d e l e w $ c i o c e i u - la:-). . j i.

g) Choque osmótico. Las prote ír izs enz inát icas y i a s no enzin3-

t i c n s s e aueden ex t rae r de l :?s bsc t e r i s s G r a n ne<.ativas yus son l e e

mlc delic3d;ís, suspen?icnJo l a s cél-ui-s,s ei? una so luc ión t‘s-tnnnzdz -

con un% alta. pres ión o-:.nótic;l (en saccrosa 2i 23s); después de PUB

s e alcanza e l e n u i i i b r i o y se concentren por centr i fuqec i6n, se sus

. penclen en a.,pa..

1 .%ctraccíón por me+ios quíiricos: , *

i,os métodos f í s i c o s son r ~ ~ a t i v a m e n t e v i o?on tos y pueden oczc io-

nay nro’slenns a l desinte,yrar 1;:s pa’redec crlul.zres, dificii.I.trindo *L? ‘ j

-Ci.erif i cnción

o t r o o znzimni; y proteInas., ácic?os nuc lé icos , sa l e s , otro5 inet:iboli-

t o s d c bs j o m s o molecular, otro^ csmonentes d e l w d i o y o?. m t e r i - - al d e ex t r a c c i i n en C?,RO nue se Li.ti1.i.ce.L Pare SU separación deber&

. :

t , I

. empl-earse d i f e r en t e s técnicas.

a) SentriPugsciÓn. La csn",ifurociÓn a esce.13. ds l z bo r ? t ? r i o es

el. m6todo i d c a l pa,ro. ia eli.mi:iz.ci6rL de productos s j l i d o s de s o l u c i o

nes $?bid0 a ?un e x i s t e en cu.?lcui:?r laborP,torio. La cantr i fuaoc ión

no t:s edecuo.da, sir? enib-rro, ?or.? o-veraciones a grm escRl.aI, aebido ,

! 8 "iie no ex i s t en a.uari-.tos de estos de @ron cawx idad o Ermriec di--

mensiones. La e f icac is . de 1.u centritu:?ación silmonta con e l trlniH.ño - de Lns part<cülac', con 7a di:'er+ncin de l a Censidsd entre ?nrtícu.ias

I

y 01 f lu i t lo y cumdo 7.- vis-ocidnd iln esta see. baja. Los d i fnrentes

t i 7 o s de centr í f i lFa son:

!le r o t o r tubu.l.m-, de -otol. m l t i c & w r % y de ciisco, Ue r o t o r nncizo

c m e,:mra en eF.nira1, de rotor de xi-~qulc f i j o o b.i.?.incín :: Se ro-

t o r perfor:.do.

b) Fi l tr>ciÓn. La ,ve loc idad i 1i que im l f m i d o neer 3 tr?.véc - de un f i l t r o ion 'un 6rez do f i l . t rnc i6n cue sea l a unidad d s p m d e - de ?.a r i i f w e n c i s de pres ión n a l i c ? h , l e r e s i s t enc i a de!. m i t e r i a l - . :'I de 'nu+: es tá construido e i f i l t r o , l a visco?.i?a.d d e l l i qu i do y 13. re ..'

I I , - .. , ..

s i s t enc ia nmducida por el. materiz.7. que se denDsita. De esta x m e r a

13 e f i c i enc i e . de un f i l . t r o ser6 airy a , i ta r i i n r i n c i p i c , aunaxc riizrri - :.I I , ,

II

' I

..

. . .. .. - .. nuirn. ír me<ic?:r que se :t,cun?i>.la, P! r.i*,eriel. w e , en; ' . - T O d . ,.uqos (??: -O- , , - L'!

cluso se .cn:norime. I

I

I . ,I'

c ) P locu l? 1-ión y con¿?laciÓn. La f'ocuiscióz~ t i m e 1uFZ-r cua.ncio

.un a.gente que a menudo se encuintrz en soluciones muy ñiluídss,une

l a s nar t í cu las para. producir a ~ r i p d o s . E l asente f l o cu lan te puede

encontrarse !resents d-.sde e l p r i n c i p i o d e l >roc?.so, o como ocurre

con frecuencin, ser añsdido en e1 rdaento más: O i?Or t l rnO . La ccagula-

c ión, n o r su Darte, es l a adhesión de unas uartícTJl¿is con 3trCs Zi-

rectzniente , corno ocurre cumd.o se neut ra l i zan si17 cargas y ge Fro-

duc5 3.2 coaiescencie. Tsta técnica 3 0 Quede a p l i c a r a célul3.s ente-

ras , r e s t os 6 % cé lu las o b i en n ?rot-fnao solubles.

1) V4lul?.:: enteras. Phchor; po!.<aeros naturales y s i n t5 t i c o s co -

mo 13s .,@?1.Rtl.nR.s o Ins p o i iacr i l -?a id?s for~?cl.as con d i s t i n t a s pro--

, . po,rci.ones de ?'ciao a c r i l i c o , pueden iisa.rse ps.ra f l o c u i a r i 3.s cSiu--

12s microbimns, da l a mima ni- invz que l o h a c x ].as s z l e s f.n~rg5hL

caci d" e,luminio, hierr'o y ce.!.c:i.o. La verdadera f l o cu l ec ibn ea ~q - prUces3 nug e f i c i e n t e , ye Tue se requ ie re de proaorciones nwy aeq.ug

ñas del agente f l o cn lan te . Xu necesar io e l e g i r cuida3ssamente e l a-

gente f l o cu l sn t e para m e no inhibn. l a r ic t iv idzd e n z i d t i c a o i n t e r

fieri.3 con 1-05 s igu ientes grocesos t a l e s como l a inmovi l i zzc ión de' - c6luJ.a.s.

-

. 2)Reatos csl-ul.ires y p r o t p h n s . Antes d2 qur se uue-an recupo--

r a r Ea$ enzim-is in t rncc lu la r es de un rnxterilrl cue s:? ha ro to , s e de -

bcn e'Lim.i.nar 7.0s r e s t o s d ? pa,recies celu1.a.res. Para 13. e l i m i w c i ó n - de e.rs2.s pert$cul.os sn pu-?cn u t i l i z a r ai t .écnic.s de f locu~:?,~; ióa Q

, f

. .

. I

coaw lac i6n , V imnre Los mq.tzrisles 3. eao l e z r no debe:] inso lubi l i - -

zar a 1a.s enzimas. ~

Las zrizimas so lubles s e qii-clen &>:igul.ar con Acid0 t¿riico, trunque

e s t e tr->.t.?>niento i m c t i v a il c i e r t a s enzinm.

-Concentreción.- Las enzi:-:s en so luc ión se pueden concentrar - por m a s e r i e de &todas nue a continuación so recuaen. (Fie;. 43

Fig . 4 forms de concentra:. enz i i as . - -.- I_

- Técnica 'tx!~~j.ca. P r e c i o i t ? c i ón

&pert t R 1 5 F. r) 2 t < f i. cr) 5 Tfect 5.vi.d-d 1ncr)nvenic.nte

Sa les inor&nicas Sui.f3to a.&nico Cloruro só? i co Su i fa to co , -~.c í? Acetato d l c i c o

Diso lventes Dr&- Acetona n i c o s E t mlol

Isnnronanol

I l l

1

1 1

1

F e l i a r o de i" c su5 io

1 1

i t

1 1

Secado Rot svmor Pu !ve r i z n c i ó n L io ' f i l - i zac i in

1

1 Calor I l l

con ~ 2 ' l a i i o 1 1

/ * l Excelente , l l Vuy h ? n o , ' l Bueno , ' iegulzr .

I

.. Y

,’ El fundaqento de l a pur i f i cnc i6n por cromatograf iz cons is te en -

el retrs.so quo s x f r e l a m3lécule de so lu to cu=,ndo se pesa uns. solu-

c ión rj ,través de una coiu;nna que contenga nartícular, de mater ia l s i - . !

I r :

l i d o . m e s t o y e , 10 aut? Se cons ime es e i r r t r a so y no ia uqión - ’ . oernmente , el n a t e r i s l clue se va s . o u r i f i c a r debe “unirse”, a. l a f a -.

se s ó l i d a para oue se nrsdirzcs el- su f i c i en t e re t raFo pero clue vuei- ~

va a, entrar en 12 so luc ión r n h ta rde y pueda s e r eluido. & o t r a s - palabras, debe s e r citQ2z d e reo? . r t i rse enere la fa.se s6lid.l y l a fg

I

s e ] .huida. La s i p i e n t e tzblz. r m u m o ~ l a s b i s es de 12 s e r i r a c i ón y i pur i f i c a c i ón d.e enzinas rneiji:..nte 12.s Dr inc iga ies técnica.; cromto--

g r á f i c%s , (fic. 5).

Fig. 5 Tipos de cromato-rafía.

Tino Fundzn. d e i 2 reasraci6n &rrdrm. e e l f recc imc.~ i l . :nto

En g e l RerJ:.rto entrc i c l l í q u i d o Flujc, contínu? d o l d i s3 l v es t e aentro de lo-, i3oros d,? - or i e ina l ( f o ra? , . de els. ir e l so

e l rosto .

-- - ..

La fese e ~ t = . c i o 2 s r i a y - Tam39 niolecular - luto ) - -

Cambio f 6 n i r o !Jni6n e leat?o?t6 . t ics en- Di fe renc ie de czr-2 oritrc , e l tr-. el. soi i i to ::r 1% f a s e so lu to y e l cznbi idor . es tac ionsr ia . Canbio de l a f u o f z i ir:rica o

. I - el pY o e.xbzs ( f o r m de e l u i r e l soi .uto)

De ?finidrid Unión entre l r i mo!.Xcu?a Unión o no. biolÓ.Ticaaent- nctivi- y !In ii:xj.c~3 con rniyor s f i n i d a d y un l i endo esn ic l i - i co - nor 10. enzima !que e l ciie f o r -

do r?:no l o s - m.? q r r t o d r l a columm.Cainbio cust r:zto [i , 20 f :~> e t ores ( EA? d e 12 fucrze. i6nica .s:c “ib i o de A’L~P ) , I e c t in? .? , co?.o r-qnt e s ux , B. m n t es c3otr53 i co s , e t c. ( mt icue rqos , e tc . for:ni d e e i u i r e; soLi:r;o)

, I

I . ~o lu-mas cje. croaato p.&..- :,;,. i . i i ci.ei:.cia d:: {L~L sistem? crr>n:::to---

p r&f i co se d.ebe juzczr por su ~21)'i.cid a m a r e s o l v e r nezc1a.s de mg

t e r i s l e s sn::l.ogos, o bien, oe'ra perni -L i r l a e luc ión de un co!puonen-

I

; I

I . . ,

i t e Único on irn volúnen riiínim iie eiuyentes. La resoluci,Ón donende - 1

" i

I d.e l a ve7.ocl.dsd d i f e r m c i s l d? :nigración de 18.8 b-indas de F r o t e h a s I i

! y dc l a ve loc idad de a i fue i ón d e &Stas b3rida.s cue se oaone si efec- I

I ! t o de l a s ve loc idades d i f e r enc i a l e s de migraci¿n. 21 valor de la ve -

1ocide.d d i f e r e n c i a l de miqración, v i $ne dcter!nineda por Is. nstur?.le I

i i i za d.e 1a.s ornte ínas , zsf corno, de l a f a s e estaci.cnsria y Ií?.J.ida. - ,

1

- I

E,% le . ta.bla !si-uiente s e resu.rwri !.%s e.russs ?el ensa.nchmii.ent3 r ie -

1a.u zonas :y se. indica. como p u c d z mini r i z r rse . Li-icemente ci ensan-

.chsciento d e l a s binrirjs no pu.&e e v i t a r s e totalmentr pero Quede li-

mitzrse a l mínizo cuando R ~ c ~ z ' . - un ni.vei en. 1.0s distint<sri p a r h i - -

%ros pera c ~ d e . coiurna, (Hg. 6) .

t i 1 i 5

i 1 . z~ co lu~~r i as de mejor ron?imient,o q 3 . w l a c r 3 m t b p a f f a en gel - i

i . . a ,qre.n esc-7l-i cons is to en wi.dc.c?es miJ.tio1.es cai-tni, y anch-e conec-

t zdas on s e r i e .

Pa.re la cromitngrs f ía de :!.finr?a.d y ci.rnbi.0 i 6 i i i c c , e i cii3;2Xo de - l a columna es menos c r í t i c o , ??imnue no í i~2be o l v ida rse ?ut. l o p can--

b iw iores i h i c o c tambj.6n. sufren carnbios de v o l t h e n rue en á 1 . a n o s -

casos pueii.in resul t - i r bastante es-ectrjcul-erec. .

.

. . Difusión esaonthea Sepr;r;-.c.i.6n r60id.3. Columnas wchas y cortas

. Formzci6n de un estrecho c c i ~ r i i S e i a r a c i Ó n m6.s l en t3 en ia m?i~mna nor un ti.emrio do eqv,izolum?as - m& 0orte.r ‘libra.rlo i nnof i - c i en te

. Di fus i jn awremolinmia rl l í +on$: F:noaiuetRI’ co r rec tsaer te puede habor. d i f e r enc ias en l a velrj-la columne. cida.d de f l u j o

. .

. Can:í.i i zfi. c i. ón

. Aplici .ci6n desipua!.. del. m?:t e r i a l iJt ili.¿a;_. colixnras ds cijL1idr.a c ~ n sobre 1% fslcie s6l i .3~~. Desi.p:..?. ca- :?d.~-~cu?*os sictemzs en ?.os sxtrs- l i - a por e l f inal. de l a colu.rna I n m d2l 1 zcho.

1-:,-:----- . L _

?

6 b i s tu's i6r i ,/

conocirnj.anto y la cnseñ?ilza. ep. un canino tan amulio cono es le.

b io tecno ioc fo , so v e diPlcu!.te.do por l a inca.acidad que encuentran

10s estudiantes y esnscisl- istar da cada:una Ge las 5rea.s c i e n t i f i - -

cas que l e con st i tuy en ( 9 i o 1. o i ~ l I- Xi. cro b i.0 lo -1' FL-, Ing vni r r <a Qu < m i ca ,

Siocufmicz y S í a i c a ) , ?a??. c o m r m d r r e l l enguaje v.sacio por cada - una. Zsto se debe prir.cina.l.mente, a que cada una de es t es r6.>irts c&.-

r e ce de l o s conocia2entos bgs icos reoueridos Tar?" compren6es e in--

t erriretor inc luso 1.0s conceot;os rn5s fi;nda.rirntales que t re tsn 1a.s de - más. E l bionuin:icc n e c e s i t z y o s e w a lexnos concentos de l o s o r i n c i -

p i o s d~e l a Ing. Cuimica ns;m poder considersrak un especial ist?. en

3iotecnoloEfe.; ES^, l o s ingenieros ::ii&nicos 6sberán comcr?ncier 102

p r in c i a i a s bás icos a.cercH. de la S i o q u h i c a de l a s enz ims , ~.:.í coa0

de IC. microbio Ioq ía d e los o.rgaais?os, dentro de un rea.ctor.

. ! .

l

A mcnui?o es 6. i f íc i . i conc;equir cruzar 1a.s b3rrerc.s. i n t e r o i e c i p i i -

nnri7.s ni?. cedz. una de ias pro3ia.n 6r.ea.s de t r z b s j o o u e ex i r? " in den-

t ~ o de d 1 Rio tecno loc ía , 3.0 o u c ~ p o r otr-r per t? , es fundement::i nEra

zemirir la nccv::a.ria miiuurei en E?. rireR. nccesidac! de nus ioc

ingsn ie ros 3iif.?:icüs, b ió logos , b i o a u h i c o s 7 mímicos t rabe jen uni-

dos curze de l a 0risntr:ción o r5 c t i c a OUI er; esenci31 a la. Siotecno - lo*i.?i. Ya ?!.¡e, ru:3nrin s e c o m i s e un :mmce9 nornaimente 4ste se trs .-

, r duSs en un kx i t o econÓ7iic0, aden:$s c ik .n t i f i c o y e l l o , d-ra l a . -

. I .

I

! j

t o de sus .grocesos. i

!

t a . especiq.lidsd, obuoygo cLc:?ta?. l.ic:Ftr:lt%s ??.re. ' e l b J i 3 %tendini31 - ,. 1 I

I I

.I -. Siendo la. genéticc. microh:isna y In. purification de las eneimas .-

dos de los a.opectos cue est&] hacierido avanzar a pasos Eigñntrs o. - 18, Bio tecno log ia (sin rnonosarecisr sus a.spectc:? tecnol6g icos , que - co!no ya virnoc,todo e s i n t e r d i ~ ; c i p l i n a r i o ) , l o s se l ecc ione ?-.rs. de--

sa r ro l l a r l o s tornando en cuentr, Que, durunte m i s e r v i c i o 5 o c i d . . tuve

.

contscto con es tos teinac y z'lp-ums de sus t écn icas ,

.

i

1.

..

NRRL 1.951 103 xnidades)m?

I I

esn ont +.neo

250 unidades/’mL . , B 25

li 1 I . I r n g o s X

503 unidades/ml 1 . - i

! .I

X 1612

rayos (iuz) ~;;r

900 unidades/n1 I

Q 175

. Fiy . 2 Pri-rieroc pesos en e l d e s a r r o l l o de la producción de g.chryeoFe--

La rnzy.0.r parte , si no tockis, de l a s cepan comercislmente i q o r t -

t e c de __. Pen ic i l l iu_ - @ ~ ~ - o y m ’ c ? i s m descendientes de l a CF?-.IE. or ig i - -

nal.,.NRXL 1 9 5 1 (cep;? ernFle.da &ur?nte e l tr&.bajo de: i rmest i goc ión de

m i s e m i c j ~ o s o c i a l ) , que P i e eis lzdr , on 1943. Para sega f r e l desa--

rrol1.0 de ez5t;a.s cElulas es important& recordar Que e l n iv -1 de Dro-

ducci6n de ori, i ici i i n i y d:? o t r w mcbobolitos secundarios es muy ser. -

sib15 E va r l i c i one c en iin w i p l i o r a n s o de condiciones t? cu l t i vo . - Ttos v;alorec o’bteniaos pinir?.cn, por t<iiito, d i f e r i r roisider2,bieaente I

i

i .$

. .._. &---

m6.s oroductoms. Sin cnbib?r,w l a n-itacénesis POT rayos X di6 ne jores

recultadon Ilpvan8o zl a i s l m i e n z o de la ceps X 1612, que cr3duce - 5QO unidader/ml, que es 30s v i c e s 1.a de B 25 y cinco veces 1% de l a

cena. o r i g i n z l NP8L 1951. Ls cenn Y 1612 fue l a progenitors de l a fs m i l i a "Wisconsin" de - P. chrysonenuni.

t

La radi3-ciÓn u l t r a v i o l e t a de ia cepa X 1612 aronujo, entre o t ras

co ionias Q U ~ muestren una. produccfón i gua l o m e n o r de ?enic i ' l ina , 0

- tra., l a Q i 7 6 con una producción muy aunenteda de penici l ina. (unas

903 unidzdes/ml). Esta cepa (que Cue a i s l ada 9n 1945, se us6 e n s e m i -

da de una rnciner3 muy amplia no sólo como una cepa productors, s ino

oars l l e v a r a cabo otros FrogrF.1riz.s de desa.rrol.10 de c e p s . I-osterioy

mente se obtuvieron 1.2s c e p s s SL3-DlO rne.',iant;a i r r ad iac i ón V'? del - Q 176; con trstamiento ü.e ga rm:'taza se produjo ir. cepe 52-935; y

a s í cmt ínua mediante d i f s r en t z s t$cn i ca? , l a prcd.ucci6ri Ge cepas mg

j0rclda.s p o r l o s ' i nves t i gador r s . . ( i 9 ;23 ,21 ,22 ,23 ,1~ ,25 y 25)

A i s lan iento y p ur i f ; c?ci6n - de enzimes.

-Introducción.- La? enziniai: son l o s ca ta l i zadcres b i o l ó g i c o s - qyue 13s céiui-s u t i l i z a n par:? y e a i i z a una s e r i e de conversionos e-

{

I

i

i quín ices o,ue s e consideran como l a "quíxica de la vida". ~ r i d a céiu-

I . ia. contiene utz ?ran número de enzimas aue poseen l a capaci6sd de - 1.

i t ransformw una moi.écuis,. ruí:qj.ca detprminada o una porción c?e ei?-i.

en una forma nodific-idr, d e €!sa. lioiéculñ. Desde e?'nunto ? e vists. -

qufnico muchac:. de . estnc: . reacc iones son nuy s enc i l l a s , C O ~ yu.ede -.

s e r la s i Tp l e ad ic ión 3e un AtDmo d e iiid.rótueno o m c mo?.écul? de a-

gua a i,*.n-i determinade moiéciil;.. Vns' de l a , ~ ca r zc t ey í s t i cas rz..znci.~-

!.

!;

,

_ r

L =, m. .

L

l e s de !ss rutas bi0lÓgica.s l o co tx t i tuye ~ F I 1.2rg2 s e r i e 'de r e?cc i o - nes sucesivas oue eerniiten obtenSr - ~ 1 deterrninad.0 producto a p z r t i r

de uno o va r i o s mater ia les ? e par t ida muy d i f e r en t es químicamente.

No obctante, e s t e aspecto de l rnetabclismo intermediar io no t i ene , - L

en 1.a nayor pa r t e de los casos, niii&i in te r6s en b io tecno log ía , en

donde se buscn coiiceguir un cet?-liYu.dor natUr.21 para. r e s o l v e r UE p-

problema prGctico concreto.

Muchas 5 , l a s enzinias obtcinisis a p a r t i r . de d i s t i n t o s t i n o s de - organisrri.os pueden t ene r un uso coas rc i a l parp. l o que deben s e r sepa

rado.: dr 'Las c6 lu los uue los 3roducen y our i f i cados . En cualquier - caso l a enzimn deberá pu r i f i c a r s e l o mínimo c e c e s z r i o ?ara e l iminar

!

i i!

l a s xct iv idadeo oue produce? i n t e r f e r enc i a amque,psra algunos ea-- c

90s j ' corn3 las. detern i in~c ion~i ; . ,Eula . l í t i cas ,

t o s nl-vnl.es de pur i f i cac i ón . kctuzlxente se v-nden en toso el irnind.0 i. ?

I , 599 t one l i das ' de ene-Fm?-s no r año. No obs tm%e , 1,250 toneS3da.s de i

es necesayio u t i l i z s r .?.l- I I ;

t o & esta cantidad l o constituyen col&;laente cuetro enzidas cue son

l a s orotessas bacteria.na.s rue ;e u t i l i z a n en dctergentes, l a gluco-

ami.i:?su, l a oc~nni l ssa bacter iana y la. glucosz isornerasa q,ue s e u t i -

l i z a 1 nar2 la. f ab r i c z c i ón de jarebes de glucosa y f r u c t c s i a p a r t i r

de almidón. El r e s t o de 109 o t ros c i en tos .de enzimac que se venden

en todo e l aundo s e purific:iri hasta hoaogeneid~nd por l o que s o n inug

caros y se venflen solmiente miiiqramoc por año y su ap i i cac ión es - l a de s e r uti'l.iz,aCcos en i.nveutiqzciÓ.n. (27)

. .

,

Ai. conform:ir d.ure.nte m i isel-vicio scicial par te de!. estudio sobre

enzimns, por ello he de der.i.rrol1.r a.spectos de importmcia como e l

*

aia'Lamieiito ;y nurifiaaciOn. 3,: v?t*3.::. (23) (29)

- -%entes ',i:?.ra l a obtencirín, 3.3 enzixas.- hiis enziaas SF exuen--

t r an presentes er. t o d o e l o s peres vivos y s i s e t i e n e cuidsdo para I '

> ; p r o t e p r 1 . e ~ se pueden ais1q.r d e CUR: qu i e r organismo. La pJr?.ii nago--

ría de l a s e.nzimr,s c u e se irti .Lizm en 1.2 i ndus t r l z t i m e n o r i g en - . bact eriano, aunque h ~ y alE.m:tc exceñciones que inciuger? 18.9 d i s t in -

i i

t8.s p ro t emas do plan-t;?s, cono l a na.r>sína, l a bromelaha, 13 f i c i n a ,

a s í como l a s arotesscs de orj..yrn e.ni-n?i como la renina y iz pepsina.

Las enziaas que se u t i l i z a r i :)are 'La i .-nvwtigación 'se ais1c.n a, u a r t i r - ,

de todos l o s t i a o s de oreanisnos, s l p n o s de l o s cuales c2.i d i f í c i l

mente obtenidas, cono ,uor ejemplo 12 cul.fatesa'de1 tubo 3i:Fzstivo - de car-icoies y l a s d i i t i n t a s enzirnas obtenidLc u - a r t i r d e l veneno

de serp iente . , - , , ,

iL iber3c iÓn de l ~ s enzirnrle c?e 1 ~ s c6l-ul.ss que l a s ?roCu.?me- 31

primer paso en cuaicuier Dur i f i cac i ón c o i s i s t e en uoizer i n . enz,ima -

en d iso luc ión despuk? iie s e r :.ib?r:>.32 de 1% c é lu l a qui l a ?i'Oduce.

,

enziaas durante su aisla!nierito y pur i f i c -c iÓn (Pig. 3)

.Materialec se nart ida :

'a) 28lulris v s p t a l e e . En gsnera.1 s e pusda d.ecir que lo:; vegetz-

l e s o 103 t e j i d o s vc! . t a l e s no son unos a . i t e r i z lEs rcug i:.+?r:i

r a ei ñiq?!a!niento de eneimrts. Lar; oient2s no t i enen nin<gh 'hociio.-; . . .

F r í o

Acción de uro- La mayoría farecuent e Inhi'bidorss $.e pr,oter.sas tensas Frio

Se-aracibn rS r i ?a

.Prc ?uct os Plantas y 13nstan.ke fre-- Agentes reductores oxid-;cFÓn d.r f e - hongos cuerit e no l e s

Oxidación Cualauiera Precuent e ?,\?iter eg i tac iórr Agentes rsdurtorec

C i zit11 adura 3-1~1 q u i era j3ast:inte f r e c . 3 v i t a r efec.ae ci.::.alLa.

.. Pérdida de fag Cua lmie r z 3astTnto fre-- . :<ea?ici jn del . fEc-t;Di t o r o s de esta- cuente. b i l i z a c i ó n (in. ne? net..'iicos, :3ustrrito, e t c . \ I

.., .

Fig. 3. Factores que inac t i van l a s x z i n a s durc-nte sv. s i s l ? ? i e i t o

c:: ,cry- ~

, , ,

9

ra elirnin-Ir 10:: m , . ~ t c r ? % l ~ s de d.-:recho D o r l o quo se zc~iii~i~I:?n en IE-

cuolas. C u ? . n d ~ se ronpen ?.:is c61uIas , l o que req,uiere g r ~ n cantidad

de energ59 para romper la. gru;.sa pared ce lu la r , e l contizir lo de l e

vacuola se l i b e r a ooniéndose en contaxto con l a s enzimas groducién-

do ' e f ec tos desfavorables.

~

r

b) Tsj idos animales. E l n r inc ipa l efienigo p w a . la pur i f i c a c i ón

, de enzim?.c de o r i gen zninizl 1.0 coi ist ituye l a h i d r ó l i s i s 301' l a s prg

tensas i i b2 r .da . s d u r m t o l r z r o t u m cie 1% célu.!s. E s t e e f s c t o puede

reducirse incluyendo en el- ejctractü algunas nrots ínas ad ic iona les ,

1 !

r t !

cono por e jenplo , l a s albthinas, manteniendo e l t e j i d o 2 b ? j ? te-- i

I r z tura üurmte la extrncción,o bi.en, z.isisnr!o 12 enzima ~n c x s t i 6 n i

l o más r&;iida.mento pos ib l e . z , 0 ) ' Cél.ulas microbianr,s. Idi p a n m y o r í z de los aicroorrmismos I

i hl-cen aún m$.s d i f í c i l l a genere.liza.ci<n de l a s precsucionec que se

deben obser-vm- durante la extr,?xciÚn do SUS enzirnric. LE d?strv.cciÓn

por protea5ss es un n e ' l . i ~ r o conct,-,nts, a l misao t i o m a rue %u--

chog hopor: son nug r i c o s en fino1 o:?i.dma.. P3r tod~o e l l a ' es necesz - i i

r i o realiza.!, l as oa.?ra.Cionaz rl9 n i n i - - n i o a t o co~? reik!:.ez y 2 b?.jas - ! i

.'teniper;:tu-l*iie:, aunclui algun%s enzimns son X?.bi?zs a l f r í o . i

i i i

f

!

-Extracción p o r medios f í s i c o s :

a ) Homo&~"i;lcsción. Se puedo d e c i r que, en .yeneral, l o s t,eji?.os

a t ~ p n o j ~1130s se emplean ?.ct?r i t zs pm-1:. ayil2.w a l i b e r w l a s de l a

membrana. J , O ~ a.op,ratos e m ~ l e 8 ~ . i a o c p i r i tejid.0. snimaies y v r g e t a l e s -

I no se e?inle:in par:3. 1.2 r o t u r a de cdl-ulr!s nicrobiznas nor rioseer De-- . . I . ,

redes celulrires nucho ni& robuctis.

b) Agiti,ciÓn con ahrrsivcis. 21 molino de ho1.z.s es uno d e los n?e - jores métx?oc: oar2. la roti.rrtz: de c.6lulvs. E l apsreto conc is ts en un

r e c i p i en t e que contiene -eouoi;ns Ooias de v i d r i o que se so9isto a una

v ibrac ión r z v i da y q~’e crea fuerzas d e ciza1.l;l debid.0 2 105 -radien

t e s de va l o i i aad , nor e l cho.,.!üe. de dos bo las de v i a r i o o i.& c o l i s i ó n

ent re una bol?. de’ v i d r i o y u.11 microorganismo. -El n i v e l de desintegrz. -

ciÓn depemierz de l a ~nten2:dad de, l a v ibrac ión, de l a p:-ooorciÓn - ent re l.3.~. bol:.^? de v i d r i o y (21. t i enpo de contacto.

c ) C i z á l l k i lfrluida. Ci~ri:j.t> s e h ~ . c e uotiar un?. susuens i6n ce1ul.ar

som?tida. 2. eleva.da, prosi6rj a t r avés de u n p i f i c i o rstrscho, l a r b i -

caían de o r vs i ón proaorcion:: un r i & t q d o nug + f i c r z 3 3 ~ i-i rotura

de 1.~~5 celulns. Ca.mbi:tndo l-i ores ión a.olica.da, sc. riuede r o m e r 12 - cSiuir* co:r.oists.monte o s ó l o :!o suficiente COW ?:ire nile se l i b e r e n

.las srihima.s oerip~.ásmiczs. gi.. eouioo uszcio más frecuente,qentc es e l

e

. t ~

c r Xanton-Seulin.

d) SonicaciÓn. Cuando se ,?:ilican frocuencins que es t& uor enc i - ma de l l í m i t e ne rcep t ib l e or e l hornbr?, es dec i r , . l o s ultrz.sonidos

con frecuxc-lzt sunerior 2. 29kYz, se n.roduce l o nue se dena~iina. “ca- , .

l v i t a c i h -:!?eosa“, es d e c i r , n.:)a.recen ;$reas donde se Fro6uce e1 r g - i

,; 7

nido intcvcarnbio d e fcn6nenos d e .cornnrensibn y exriinsi-Ó?l. Cuando - -

.~*,*.-

..

! ne entre 1.0s agen-te.! rnuta&.icos ,?uinicos 1 3 3 i:oapuestos n i t r osa

en r,?rtl;;u12 ' l a N-metil-N-ri-itro-n-nitroso~uanidinFi (MNNG), han si-

i do ut i i i z adg : j , ampiizmente, Sa YNNG proruce 0-6 ' a l k i l a c i o n e s de i33

r e s t o s de ml?.nina y su acc ión mutaphica puede deberse a l a rep l ic - . .-

c ión equivoca.da; s e ha sugerido t a m b i h que in?.eracciona directamen

. t e c m la mequinaria de r ep l i c a c i ón d e l DNA (11). Su acc ich se cen-

t r a prefermternente en e l panto de repl.icacibx del DNA y ti.end,e, - por ' tmto , a producir a g rupc i ones de m@tsciories enlazadas. Aunque

es t e hecho no es ileszable, en genera l , uuesto que s e tre.duce en 2 1

acuaulación de mutaciones adiciona.fes 'a l a rsquerida, 1% cormutacibii

puec'e usarse como una ayuda ?,are el: aisiamisnto ds .aut?ntis que no

son por sf nismos fác i lmente i d e c t i f i e ados , medisnte 19 sa l e ce i ón - de nutantes en un gen estrechamente reYacion'edo. Adern& di? la des--

venta ja de producir rdcacioner; d i t i n l e s , l a 4;:iNJ es muy r>eligrosa

en s u uso. :c un notezte czrcin6gezo y puede ex - l o ta r s i se ca l ien-

ia, (32) . Otro agente nuta;?éiiico, memc potente amque rngs se-uro, .I

ni?e tnmbio'r. actúa produci.-ndo a l cu i l e c i ón es ei sul.fonz%o d o e t i l -

n?iut-:ao (EMS') .

7 *

<.

7 ,

Además de l o s méto6os señalzdos que se u t i l i z a n para aumeatar - l a s var i sc iones , se disnone de un número considzrable d.2 o t ras he--

r r an i en t i s ?ara o 1 genetist:? microbizno, aunnile 2un no han s i do u t i - l i z adao en microorgnnicno3 Cie imaortsnciz conercip.1. Lac olecientos

extracro!nocomal.es, t a l e s c.o~!.io l o s ol:said~os y 'Los fagos trrlnnduc.L3-

r e s espec ia l i zados .pueden u.si7.rse pap. l a t r anc l e r rnc in de k m s s en-

, 7

5

-. ..

t r e ceras d i f e rentes , ssf COTO risr:> íixnentar e l nilzero de c:;?irls d.

un gen. de - I i

I

Vuchos plásmidon h: ic tor imos pc3seen también secuen2ias I

DNA,se conoezn como'tr&saoaonss. Estos son c i e r t e s re,gioner; d i 1 - i . 1 ! DN.4 que incluyen uno o más genes reconoci.bles y que son cemces de

pronover su nropia transp3siciÓn 8 o t r o pl6sniid.o de l a n i c m c é lu l a

o al cronosoma. 'bacteriano. Esto no q6l.o crasiona e l reapunz7i.ento

de 10s genes cue l l e v i e l transnosón nismo, s ino que ta.mbi6o des t r s ~

ye l a función d e l gen en e i cu.:il el transposón s e inserta. 12s se-- #

I

!

i

cucncias de inserción, que son tzmbién capaces d P inactivar- gsnes - I I

i por inserc ión, son s im i l a r es , en nuchos aspectos, a l o s trasriorones

pero, cono czn-ecen de qenes rbeconocibles, son menos f6cil.nen.te m m i .

nuIablL-s.

I

i Otro t i n o de va.r iación r e v e r s i b l e ( m i l o g e . 2. la t r m ~ o o s i c i 6 n ) - es t6 arovocado por el. m v i n i e a t o de un gen desde un s i t i o " u i l r n c i g

SO'' a un s i t i o de e r l r e s i ó n Cieritro d e l cromosonz. Da es t? 'li~mira 12

c6lula. pi isdo rli?voner dc un irÚnoro di3 versionas ai.tsrna%ivas de UI

gsn e s a s c i f i c o , de l o s cu,?le% im3 s i l o es tg loc~li7sdo en' el s i t i o

!

i.

!

i de exoresiór. ( y Gor t zr i to l afset:xi20 al. f e n o t i p o ) e;.? c u e ~ c u i s r mo-- i

i

i i'

. .

'mentc. Se' piznsa que aun es to t i n o ds var iac ión en es tor mnsntos,

no es todavi- exnlotab le en -!os orogramns de niiejora de cepzc. E l l o

subraya la necesidad de a s e g u m r a? alguna manei-a l a est?.bi l i ; iad de

lcs cenr-s mcy~r-idas con que s e cuent3. (13) ,

b) SeconbinaciÓn. i3n ?gricu7tura, los progrsmíls de "xe j a r a de ce :!

pzs" s e han exnlotado duranti? !nil.es de anos sin un conocinirnto f o r . .

!' I

;:, - . j .

-.

ma1 de l o s ?nec?~ni?:rnos gengticns. Gran m r t e d e e l l o s se han l lrv~. ido

a cabo medi:;nte .:;s7e~:iÓ:i 62 v í r h n t e s es?ont$.neas, uero taabién se !

! , ha reconocirilo dende hr.ci nucho tiempo e l crucci de dos c e m s con d i -

f e r en t e s c 8 w c t w í s t i c a s -desza:bles en una buena manera de a lcanzar . , I

a.Ún mayores m e j o r a s , no só lo medinnte 12 combinación cie ost-.s c amc -

t e r í s t i c a s sino t m b i k n nor 'La nronierlad a h mal de f in ida , del. "vi-

gor d e l n ih r ido" . % t u s e atrit-uge normalmente e l t t e l in lnac i ón de

l o s e f e c t o s nerju,dicia,7..es d e wtac innes r e c e s i v i s cue s e acuwil5.n -

en cepas a.l.t~.aent e riutofeci~m3adcls. .:.unoue es arriesgado extender l a

m a l o , & . a, l o s microorpanisnos, es c l s r t o en iouchos c?,cos, que wia

cepa. some.tida a un8 s e r i e fie pasos d ~ s autación y se lecc idn, au-ciue

nuestra un sumento en l a nroducción de un producto e s c e c f f i c o , a l - misino tiemoo, s u f r i r 5 un deterioro en o t r a s prociedzdes t a l e s cano

sus cnr?cter<stica,s de c r e c i x i en t c o su 'capacidad par2 - s . J o ~ u ~ z ~ . * -

La. aroducci6n de recombinantes entre ' dos cepas de p a n pr;:uiciÓn,

nued?, n o r t:-irito, .ser_ una via de restaurar a:.p d e l vipor d e 'Las 02

pas s i l v e s t r z s , así cono de r-!.?.c-nz.ar un u-Ltori<jr eunonto en I;? pro-

ducción. ( 1 4 ) ( 1 5 )

La. técnicq. d.e - fusión -- d'3 or.ot3z1..?.d.os aued.e r g l i c a r s e R l:~.s b2c--

t e r i a s h a b i k i o r e u t i l i z a d o c,on mcho é x i t o m - o e r t i c u l a r can a l a - ...

n3s esoec ies de - Strentomyces. Otroc. :nétorios de interzaxbio Eoét ico

en bacteri:+- conc is te en 13. t r s n s f ? r m c i a de sbianentr, mia parte , a

menudo mug pe.uue!i?, de cromsoma d?n?nte. a l a c é lu l a recr - t r r z . Ia

fusión dc n r o t o n l r i t o s d.a lu .~ 'a r , cono canstrn.ste, a 12. f o r m c i 6 r i -

d- est-.,dos "rj,u?,si diploidas", conteniendo e l :yer,óms de anbzs Zélu--

,

f

i

.. i

i .3. ?I irnins.ciÓn de fr:ags,i..il?tos l a r g o s de DX?:.

4 . Inserci6n de DNA dentro de u, m n destruyendo lí? funcidn de

. ese P C ~ .

5. Otros reagruoamientos de DNA t a l e s como l a . t rasnos ic ión e in-

verciSn y l o s reagruprmientos de cro!nosoin~is en euczriontec.

Un conocimiento elemental de . l a s í n t e s i s F ro t e í ca y l a fw l c i ón -

enzim5ticr. muestra que, en una m2n mayoría de l o s casos, es tos cam -

b i o s son ne r jud i c i a l e s y que es,gor tanto , más f á c i l ' obtecer mutan-

t e s que s e m defectuosos con resoecto a iina enzima espez f f i ca . Ts - mucho ni& d i f í c i l obt:ener v a r i m t e s cue con.tengin o pmduzcan una -

enzima con activirla.6 molecul,w aumentada o cc;i u32. espec i f i c i dad a l - ternda. Se pu.ede obtener, s i n enbargo, un 8.urnonto en l a oroCiucciÓn

de una enzima (en l u g s r d e l euaento de ac t i v id5d de l a m l é c u l a de

enzima) nediante a l t e rac i ón mutational de l o s mecsnisrnos de cont ro l

. ,

.~vus pueden I-estringir. l a orodu.cciÓn de l a enzima en l a cena s a l v a j e

d e l orFmisxo .

Las aoblncionec microbianss son, n o r regla. general', extr iord ina-

r.iac!-.n-t;e hornagéneas. Una población FLa 10' bac t e r i as contiene aucña - menos a'Lt ern.cj.Ón genét ica m o una no'rlctción equivalente de seres hu - - mmos. N= obstante ex i s ten var iac iones espontAneas, auncpe a un ni -

v e l ba jo , d!?bido a "errcres" ocacionnles inherentes a l proces3 de - '

, la r ep l i cac i ón d e l DNA que se sscaoan a l o s mocznismos de com?roba-

c i ó n , e l in inac i ón y ron%r;ciÓr> que so11 l o s resaonsables de mantener

.. SERVICIOS DOCUMENTALES %

- IZTAPAUPA

coif0 (?e la irderuada pnc i inc i a y un motodo de pruebz rzp ido , se pue-

der. hacer avances s i g n i f i c a t i v o s ana.iizando elsvado número de colo-

n ias . Las mejores i n i c i a l e s en i a producción de pen i c i l i n i . s e a l c e ,i * \

I zaron przcisammte de esa manera.

!

E l procnso g l oba l se puede a,celerar considerablemente uscando

agentes nuta.&nicos pma. a.iia!?ntm- l a producción de nutznt es' en una

población. Hay dos gruaos pr inc ipe l e s de rnut&nos: la i r r ? d i z c i ó n

y l o s mutkpenos o u í n i c o s . Lc: i r r a d i i c i ó n uitravcho~eta, que se usa -

-

frecuentemente, es .sólo indirectamente rnutaginica. %i e f e c t o p r i m -

r i o es arovocar la forrnación de dímeros de p i r imid ina, es d e c i r , I s

creación de un .enlace 'cova! ente ent re r e s t o s de t imina y c i t o s i n a -

.~ ~.

adyacentes en. 12 misms c?d.ena ds DNA. Estos dímeros d3..piriq;c!ina - son l e t ó l e s a. menos que e e m re;riw?,dos. Se han i d en t i f i c edo ut1 c i e r -

t o número de mocnnicmcs d e renarnción en - E.co l i -9 l e m y o r par te de

l o s cual.es se pueden c ons i d e rw "me~s.nismos sin error',', que restau-

ran In secuencia de DNA ori:inal can, a l menos, e l niismo grc.do de - exact i tud que loz méto^or nor?ie.les de r sp l i c a c i ón del DNA. ;:as muta -

.cion?s' surgen de l funcionaaiento de un mecanismo de r e n s r o c i h que

t i e n i c i e r ta . wosibilidzid de "errar", en cuyo ceso, auaentm l a s go-

o

. , .

sibil-idades de m e se introduzca? bases incorrectas. La ex-ozición

a ra.yos Y s e ha u t i l i z a d o tan ib ih , en a l g u n o s czsos con gran e f i c z -

c i a , pn.rs auxontar l a proporcibn de var iantes aunrue es !nucha oeor

ope l a i r r a6 iac i ón u l t rn . v i c l e t z ye que produce un mayor dzño g l oba l

a l crom3somz.

,

9

. - - i

r

I ..

se.?. ?isnos inipbrtzlr,te en condiciones nDrrr,eles, puesto ?ue e s un des-

p i l f a r r o p:'tra 1% cC1-usa. proc?).cir mKs RNAm - s í n t e s i s de t a l proteína. Sin embargo, en c i rcustanc ias en que l o s

co l i t ro les t r znsc r inc i ona l e s :hay?A s i do r.holidos p o r mutación., O don - de se hag<% insertado genes s i n t é t i c o s o extraño. medi-mtn cl-onaje.,.

l a cantidad de p r o t e h % producida puede se r l imi tada. Esto u.uede -

ocurrir,medinnte,o a t r avés do l a e f i c i e n c i a de l s i t i o de unión del.

ribosona a l RNAm, l a d i suon ib i l idad de ribosonac, y 13 cor::-snonden - c i a entre los codones usados y l a s moléculas de RNA de transseren--

ci-. ?ortz.dores de aainoácidos hasta e l s i t i o donde son polimeriza--

dos p i r a formar 13. proteína.

del requerido para l a

\

Xvidrntexente en muchos czsos l a proclucci6n de en z ims s o ve zfec

teda., de hecho, p o r 1.a composición d e l neciio de crecimien+o, cono -

se considerz. z continusción:

a) IndccciÓn. Este fenómeno ocurre p s r t i cu l e rmn to con enzimas -

dngr;dntivan t a l e s como l a p-ga?.sctosi?asa (en -I_ E . c o ~ i ) , :WE no s e - Droduce a menos 'iue la hcto::a. o a l g ú n o t r o inliuctor apro-irdo se - encuentre presente en e l medio. Este e f e c t o s e d?be a un?, F r o t e h a

represora q u e se uiie .?1. s i t i o de l opemdos d e l o p e r h l a c CUE es -

una porción di-7. QWl Fue se s o 1 a . p con el. nromotor e impide le. tr3n.s - - trio ción.

b) RepreniÓn. En e l caso 'dc enzimas'cue e s t& implic2,das en ru-- 1 ,

. tzs biosintét-Lhss, se requ ie re que 13 producción de una rinzi.ma ten-

1 p, l .u, ,qir solamente en ausenci:; de un-producto esrJec f f i co de, esa ru- i

en oue t i e n e e f e c t o s menos e saec í f i c os . E l onerón 1-c de 3 . c o l i en

preser ic i i de una f ü m t e de carbono y ,energía f6ci lmente u t i l i z a b l e ,

como es 1.a glucos2,, IS 1a.cto::a es incaptiz de funcionar como induc--

t o r de l a 9-galactosidasa y tie 0tra.s enzimas d e l . o p e r 6 n l ac .

5 :

1

Vemos, p o r tanto , que s i estamos.interesados en l a optimieación

de 1.9. pro&ucción de una pro te ína e snec í f i ca , hay va r i o s rnocT.nisnos

de cont ro l suscept ib les de mutaciór; u o t ras manipulaciones. S i se -

I

extiende e l rnzonsmiento n w a i n c l u i r l o s productos de l metabolisno

p r i m r i o o secundqrio s e introducen dos nuevos f a c t o r e s s i r n i f i c a t i - vos. 71 ?rimero es qae en e s t e C ~ E P es t& inplbcados m5,s de u;??. en-

z i w y, e¡ cepin6o cons is te en que, hay que t ene r en cuenta que l a

8.ctivid.a.d me t ibó l i c c de una c é l u k se l l e v o a cabo no s ó l o v a r i m 3 o

l a cantidnd de enziina produci.da s ino también msi f i canc io 12 a.ctivi-

dad de ésta, . 3110 ouede o c u r r i r mefi.iente a c t i m c i ó n o , CDTO ocurre

nias fmcuentemente en Las rutas de s í n t e s i s m6s conocidas, n e d i - x -

t e inhi 'bición n o r product6 f i n a l de l.2 ruta ( r e t r o i nh ib i c i j n ) .

-lilanipulación i n vivo.- Iia piedra angular de l a s t écn icas gen&

' t i c a s i r i "vipro es e l proceso d.e se l ecc ión . %I 1.a genktic;. b a c t s r i m a

concrctnmente, el término "selección" s e emoleu en,'un sent ido a l g o

espec is l i z edo , puesto m e l a nobkc i ón de bac te r ias e s t5 somstida - a condiciones ba jo l as c u a l e s s ó l m e n t e l a s espec iss zlterecies son

- ,

t .. . can8ces ¿ie s:,brevivir y c recer , es dec i r , condiciones s e l o c t j vas . +' L

1 h i e s t c que la aoblación puede s e r muy grznde (con mxhas b z c t e r i a s .. rn i

.. s e pueden ob.tener f&c i l r rents 10' c&ulo.s/rnl), l a s ¡ esnecies 74.:. t e r adm,

flue se. encue:qtr.;n en nroporci.Ón niuy ba ja ( d e l oraen de 10') se pue-

den a is js i r d,i se dispone de &as condiciones seLec t i vas su f i c i en t e -

mente potentes; % t e s e r í a el. ca.so de muchos tj.pos de r e s i s t enc i a a

I

\

l - ,

I e

.. an t i b i ó t i c o s , l a capa.cida.d. d& u t i l i z a r sustratos e s s e c í f i c o s , o La

r e c i s t e n c i c I un dotermiriado bz.cterbófago. S i no r e puecien consegil ir

condiciones s e l e c t i v z s e l g ene t i s t a bacteriano t i e n e oue pntresacpr

l a s co lon j zs in*ividu:j les en un medio no e e l r c t i v o y z inx l i z , l i r 12s - ca r e c t e r f s t i c a s reqUeridas. % t e es un procedimiento murho rrienos r i - giroso, en e l que inc luso COIL l a s t6cnice.z r6.pidas t a l e s CODO e l p-

pi.tquca8.o a n r b p i i c a o e i ensayo de co lonias i n c i t u , s o r i 3 niug i a -

bor,ioso a i c l a , r mutantes ?-de se presentan COI: l a s bajr;is f recuenc ias

antes. ind.icsdas. A h nhs, en l..? mayor p a , r t e de los-prbgra

j o rac de c e p s de importancizi. coriicrcial, l e s condlciones sel_sctivns

er, el. senti53 ranterior no SOLI aseouibles, y son g-ec isammte e s t e -

t i 7 0 de procesos de seI.ecci,óri l o s -.;e han de emplzerse. 31 término

se l e cc i ón s e u.sa en e l sentiti.0 de i c e n t i f i c a c i ó n y e i e c c i j n de i a -

es-ecie con c a r r c t o r í s t i c a s mejorenas.

a) Nhitncijn. Sin mayor discusión en 7.a esencia de 11: mui?-ción - d ipmos aue, es una. g r a n variedad de cainbios en 1.a estrvctix-2. d e l - DN.4 c0-0, por ejenplo:

1. Un canibio en un n a r e spe c í f i c o do b.rses ( c u s t i t ü c i h de bases) ,

Que puede r e s u l t a r en '-u1 ca.mbio en 12 seciiencis de aminoáci?.ou o en

una sonal terminF1ción en l a cadena poi ineptíüica.. T

2. AdicF6n o e l i a i nac i ón de un? b doc; bases (corrinl iento) .~ Y .,

' NOMBRE: T3LEFONO:

MATRICULA :

CLAVE:

JCARRERA :

I N F O R H E I N I C I A L

Ramírez Jiménez Salvador

589- 03- 13

80223038

cb5 LlC. Biologíy con área de concentración en Ecologfa

TRIMESTRE: 120.

HORAS SEMANA: 22 hrs.

LUGAR DONDE SE LLEVARA A CABO: instituto de investigaciones Biom6-

dicas de la 1J.N.A.M.

FECHA DE INICIO: 4 de noviembre de 1985

'PECHA DE TERMINACION: 25 de abril de 1 9 9

J TIITOR: M. en C. Rosa del Carmen Mateos Marcos, Técnico Aca-

dkmico Titular "A'*, Tiempo Completo. Estudiante del

Doctorado en Biotecnologfa.

Adscripci6n: Departamento de Biotecnología del Insti

tuto de Investigaciones Biomédicas de la U.N.A.W.

, ,

4ITULO: '' Estudio de la Regulaci6n por Nitrógeno de la Biosintesis

de Penicilina en Penicillium chrysogenum It

FIRMA ALUMNO: Ramírez Jiménez Salvador

FIRMA TUTOR: M. en C. Rosa del Carmen Mateos Marc

PROYECTO I N I C I A L

1. Titulo: I' Estudio de la Regulación por Nitrógeno de la Biosinte-

sic de Penicilina en Penicillium chrysogenum I'

2. Naturaleza del Proyecto: Básica

Justificación: Completar el conocimiento de los fenómenos rela-

cionados con la biosíntesis de la Penicilina ( el

antibi6tico de mayor empleo en la medicina contem-

poránea ). Para un servidor, el iniciarme en el - campo de la investigación básica traerá como conse

cuencia, el comienzo de uno de los campos de inte-

rés que me han atraído hacia el final de mi carre-

ra. De esta forma, p o d r é aportar algo pequeño pero

significativo al proyecto global de investigación

que se desarrolla en el Instituto de Investigacio-

nes Bioriiédicas de la U.N.A.M.

3. introducción.

Hacia el año 1927, Alexwu3er Fleming descubre la accidn antibió-

tica de l a Penicilina producida por la cepa Penicillium notatum, l o

que marca el inicio de la medicina moderna mediante el control de - l a s enfermedades infecciosas y, para la industria de las fermenta--

ciones por su producción a gran escala. Dicha capacidad de inhibir

el crecimiento de otros nicroorgonismos por l a presencia de compuea

tos de origen microbiano, es conocida desde principios del siglo pg

ro no se pu40 interpretar satisfactoriamente (1,2,3).

A l igual que otros metabolitos secundarios ( producidos tanbidn

en el rein9 vegetal 1, los antibidticos no presentan una funcidn - auarente para el crecimiento de los microorganismos que los produ-

cen. A la aenicilina se ie atribuye selectividad para bacterias - Gram positivo y psra algunas espiroquetas y diplococos üram negati-

vo (3,4). Diversos microorgxnismos presentan una resistencia natu--

ral a la accidn de la nenicilina; dicha resistencia resulta de la - síntesis de elactamasas, enzimas que hidrolizan el anillo -1actá-

mico. ?

Mediante estudios cristalográficos se determind hacia el año 1945

ia estructura quimica de ia penicilina (5). Consta de dos anillos,

uno tiazoiidinico y otro fLiactámico, que constituyen un núcleo cen

tral denominado ácido 6-amino-penicil6nico ( 6 - A P A 1, producto de - ia condensación de los aminoácidos L-cisteína y de la D-vaiina. La

estructura posee además, una cadena lateral acíiica unida ai núcleo

6 - A P A y de cuyas características depende la penicilina resultan-

(6,7), ver fig. 1. anillo -1actámico anillo tiazoiidínico aporte de L-cisteina aporte de D-valina grupo aciio o cadena iaterak--w----------

I' - - - - - - I - * - ,' I R- ~ + N H - CH- CH,~' 7: CH ' CH

I f A - I c I o = c $ni - CH - COOH

I I I I I

I C I i ! € J 0

Estructura química de la Penicilina

(fig. x )

demostrado que la biosíntesis de 6-APA se produce mediante una rara

forma de CDrl?enSaCi6n de la L-cisteína y de la D-valina.

La síntesis se inicia con el ácido d-aminoadípico ( a su vez,pre - cursor de la síntesis de L-lisina). 31 primer paso de la biosfnte--

sis es l a catálisis por la enzima &(Ld-aminoadipil)-L-cisteina

sintetasa, que lleva a cabo la unión de ol-aminoadípico con el amino - ácido L-cistefna, dando lugar al primer intermediario el d-aminoadi - ail-L-cisteína. Este Último,se condensa con el aminoácido L-valina

y da lugar a un trioéptido: o(-aminoadipil-cisteinil-valina (3,9) - (ver fie. 2). Asi mismo, Adriaens et.al. (6) encontraron aue el tri

dptido ae encuentra estructurado como LdC-aminoadipil-L-cisteinil-

D-val ina . cis t e ína valina

1, rn L-ci-amino a dip i 1-L c i s t e ína

I,DP+Pi ATP ADP+Pi

ácido q-aminoadípico

ATP

+ Eoc-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina ( tripéptido M-aaa-cis-val )

(fig. 2) Estructura química de los precursores e intermediarios en l a formación del triuéptido á-aminoadipil-L-cisteinil-D-va- lina.

Continúa la biosíntesis pars completar la formación de los fal--

tantes anillos &-lact&nico y tiazolidínico. E l tripéptido ccaaa-cis-

val es convertido mediante una ciciización en la isopenicilina N, - este último, aor ia entrada de l ácido feniiacético da origen a l a

pen i c i l i na G o benci l-penici l ina, como producto f i n a l de l a biosín-

t e s i s , ver esquema general ( i , i O , l i ) .

o(- cetog lutarato + Acetil-COA

1 J: 4 5.

Homocitrat o

Homoisocitrato

Ozaloglut arato

d- cetoadipato I

eacaropina

El i s ina -1

a l i na

L-CC-aminoadipil-Lcisteinil-D-val

I sopen ic i l ina N 4

I

f en i lace ta to F Benc i l oen ic i l ina

Esquema general.- Intermediarios metabólicos de l a v í a de b ios ínte-

s i s de L- l i s ina y de l a pen i c i l i na G.

Regulación de l a b i os fn t es i s de penici l ina.- A l s e r l a p e n i c i l i

na un metabolito secundario s in te t i zado en l a f a se t a rd ía de l c r e c i

miento, son muchos los f a c t o r es y mecfmismos que regulan su produc-

ción. Las rutas metabólicae en l o s microorganismos son rigurosamen-

t e controlsdos, suelen s e r por ejemplo,modulando s í n t e s i s y a c t i v i -

dad enaimá.tica.

Los factores cue determinan la formación de penicilina apenas - empiezan a esclarecerse. Sin embargo, es evidente la relación que

existe entre la formación del antibiótico y el consumo y concentrg

ción de la8 fuentes de nitrógeno y de carbono del medio de cultivo.

a) Regulación por fuente de carbono.

La mejor fuente de carbono para el crecimiento de 2. chrysop;e-- un - num es la glucosa, sin ernda!rgo, no l o es para la producción de

metabolito secundario como ‘Lo es la penicilina,

fuente de carbono resultó ser la lactosa. Otras c i 467

como la sacarosa,fructuosa :y galactosa, afectan

la acción de la glucosa. El polímero de glucosa

para tal, la mejor

fuentes de carbono

en grado similar a

almidón, inhibe - parcialmente la síntesis del metabolito secundario. En cambio, en

el efecto positivo hay que incluir a la rhamnosa.(l2)

b) Qegulación por fuente de nitrógeno. $ 0 . ,l

Sánchez y colaboradores encontraron cambios importantes en la -

concentración intraceiuiar de giutamato y giutamina durante la fa-

se de producción de penicilina en diferentes condiciones de culti

vo. Adicionalmente,se estableció que la concentración de glutamato

sobrepasa :a l a del resto

precede l a síntesis de penicilina.(8,13,14)

de los aminoácidos y aue su acumuiación

Otrss fuentes de nitrógeno como el amonio, también influyen en

la forwición de penicilina. Dicho ión afecta negativamente la for-

meción del metabolito secundario y su acción es nroporcional a la

concentración que guarda en el medio de cultivo.(pl).

Se puede considerar que e l incremento en l a concentración i n t r a - ce lu la r de giutqmato, a i f i r i a i de l crecimiento iogar i tmico de - P. +’

chrysogenum, induce l a s í n t e s i s de pen i c i l i na e incrementa l a poza

de giutamina; l a m e a SU vez podria +onar los grupos &-amino de - los sminogcidos precursores de l a molécula de pen i c i l i na y en es ta

forma in icnar su s ín t es i s . 13ajo estas consideraciones, es aos ib i e

predec i r cue cual ’-uier mecinismo que a f e c t e d i r e c ta o indirectamen

t e l a foraac ión de glutamina, a h cuando l a poza de glutamato se - encuentre elevada, r eoercut i rá negativamente en l a s í n t e s i s de l a g

t i b i ó t i c o .

4 4

Otros t i p o s de regulación pueden ser : regulación por producto - f i n a l , regulación por metabolitos primarios l o s cuales incluyen a

o t r os precursores para su rea l i zac ión . (16,17)

‘El empleo de Pen ic i l l ium chrysogenum en es te proyecto se debe a

que, es e l microorganismo m e más ha destacado comercialmente en - l a producción de pen ic i l ina .

Papel ecológiuo de los Ant ib i ó t i aos . -

A l p r i n c i a i o s e pensó que l a producción de an t ib i ó t i cos no era

más que e l resultado de una r e l ac i ón eco ióg i ca fundamental (antibig

s i s ) entre organismos competitivos, es dec i r , un fenómeno opuesto

a l a simbiosis. Sin embargo, ex is ten var ias razones para descartar

e s t e punto de v i s t a : 1) Los microorganismos capaces de producir

t i b i ó t i c o s constituyen tan sólo una minima parte de l a t o ta l i dad -

. .

c

.I

.-

,.I.

I. ..,

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I -

. ...

.-.

..

I-

.- * -

de la población microbiana que se encuentra en las muestras d e sue

lo, por l o que la producción de estos comuuestos no parece consti-

tuir ventaja alguna desde e:L punto de vista evolutivo. 2) Las cepas

que se encuentran en la naturaleza producen sólo cantidades mínimas

de antibióticos; para que 12% producción sea rentable es necesaria

l a seieccidn de mutantes producidas por la mano del hombre. 3) Los

antibióticos se producen tan s610 después de que se interrumpa el

crecimiento, y no durante l o s procesos competitivos que dan lugar

a este mismo Crecimiento.

-

Los comuuestos formados después de parar el crecimiento reciben

el nombre tie "metabolitos secundarios". Se trata de un amplio con-

junto de comuuestos, entre :Los cue los antibióticos han adquirido

un papel estelar, tan sólo en función de la facilidad con que son

detectados y de su valor comercial. La fantástica variedad estruc-

tural de l o s metabolitos secundarios es indicativa de una activi--

dad arbitraria de las enzimis, que producen tipos moleculares nue-

vos siempre w e sus metabolitos normales se acumulan impidiendoles

intervenir en los importantes procesos de crecimiento. Otro factor

indicativo de que el origen de los ~ntibióticos es más casual que

selectivo viene dado Dor su liaitsda camcida? de biosíntesis; mu-

chos microorganismos excretan un grupo de comuuestos relacionados,

en lugar de producir un antibiótico único: diversas penicilinas, - las nctinoaicinaa A a D, etc.

El oue l os antibióticos sean oroducidos tan sólo por organismos

que esporu1.m no parece s e r

t o s a n t i b i ó t i c o s

s u nroduccl6n puede s e r bloqueada por

con las primeras f a s e s de drcho proceso. La esporuiación s e acompg

ña de le s i n t e s i s Be un nuevo t i p o de pared c e l u l a r y de l a degra-

dación de 1.a pared antigu-i., y e s t a s paredes cont ienen compuestos - uoco c o r r i e n t e s ( D-amino&idos, -izÚc.ires de t i p o nuevo, e tc . ) pg

r e c i d o s R. l o s que s e encuentran en muchos

que e l ?ietnbolismo anormal de 1~ uared de l o s organiqmos e s p o r u l s

t e s aueda d a r l u g a r a los precursores que acaban forrnando los a n t i

b i b t i c o s . Por o t r a p a r t e , se ha indicado oue l a actividad i n h i b i t 2

r ia de los a n t i b i ó t i c o s t e n d r í a un papel regulador

importantes cambios metabó1:tcos clue s e producen durante e l Droceso

de l a esporulación. Ish e s t o s momentos, ambas i n t e r p r e t a c i o n e s se

encuentran en e l t e r r e n o de l o t e ó r i c o . (13)

producto de l a casual idad; además es-

s e producen en e l inomento de l a esporuiación, y

mutaciones que i n t e r f i e r e n

a n t i b i ó t i c o s . De ahí

sobre l o s más

4. Antecedentes: Teniendo en cuenta las citas b i b l i o g r á f i c a s y las

i n v e s t i g a c i o n e s l i e v a d a s a cabo hastp. e l momentm - s e procede a l a i n v e s t i g a c i ó n .

5. Obje t ivos : P a r t i c i n a r en e l proyecto de i n v e s t i g a c i ó n para ad--

a u i r i r conocimientos sobre equipo s o f i s t i c a d o de lab2

r a t o r i o a l i -mer l que d e s t r e z a en su emoleo.

Comorender l o s l i n e a n i e n t o s de l a i n v e s t i g w i ó n b á s i

ca y como poder a p l i c a r l o en b e n e f i c i o de l a comuni--

dad.

6. Programa y metodología de trabajo:

En vistEi de que en e l aroyecto donde me encuentro corresponde a

una i n v e s t i p c i Ó n de doctorado, como se c i t a en l a carta d i r i j i d a

a l NT. en 7. Francisco F. Pedroche, no se me permite ind icar e l pr2

." grana n i 1~1 mstodología de 1;rabajo. S i n embargo, l a s act iv idades e

en i a s oue estaré invoiucrado serán:

a ) Obtención de diversos mutantes de Pen ic i l l ium chrgsogenum

b) Optinización de l a s técnicas para medición de l a s act iv idades

I

.*I

enzimáticas involucradas en l a s í n t e s i s de pen i c i l i na y gluta- P -.

, . t i d n en dicho hongo. .~"

c ) Caracterización de l a s erizimas antes mencionadas en l a s mutan-

..,. t e s obtenidas.

.- d) Ap l i cw iÓn de tkcnicas dti separación de p6UtidoS y aminoácidos .~-

.. en extractos mice l iares cfe E. chrgsogenum.

.-.

a-.

. .I ".-

. ,.

.-

7. Cronograma de act iv idades :

".I

8. Literatura

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19. Se proaorcionsr; más inforaación bibliopáfica conforme se va -

avanianA3 en el proyecto. For necesidad de presentar este proyes

to inicial se tomaron las lecturas iniciales o de introducción

a la investigación a desarrollar en forma genera1,teniendo en - cuenta desde la historia de l a penicilina hasta los trabajos de

la conformación quí.nica y de regulación de la biosintesis.