HÜKÖK Dergi Sayı: 1

Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre Öğrenci Topluluğu Dergisi

hükökdergi

Kök Hücreler ve

Kök Hücre

Kök Hücre Etiği

Kök Hücre

Reprogramming

Transdiferansiyasyon

Röportajlar

izler

Biyolojisi

Klinikte

Epigenetiki

sayı mayıs 2012

1

hükökmayıs 2012 1

dergi

Hacettepe Üniversitesi Kök HücreÖğrenci Topluluğu DergisiMayıs 2012 Sayısı

Editörler

Kapak TasarımıNatali Miletli

Grafik&DizgiMehmet Yener ÇalışkanerYazarlarRıza Mert ÇetikOğuzhan DuvarBetül KubatBetül İçliElif HaznedaroğluEce HocaoğluCansu AyvacıoğluTolga Bacakİrem OzarlıYusuf YıldırımSena BocutcuCeyda AcılıoğluÇağrı KüçükkayıkçıYener ÇalışkanerGörkem YavaşTuna ÜstünkayaÖmer UludağArmağan KeskinCeren YağmurElif Reyhan GüneşElvan AçıkgözOğuzhan SerinAyşe Zehra KaradereÜlke KocademirDamla ErimhanFatma YamanBerşan ÖzcanBarış BoyrazGüldehan NuğralGökhan UrukFatma DenizSelda KaraaslanMerve YılmazMerve Cansu Kaya

Mehmet Yener ÇalışkanerBarış Boyraz

içindekiler

mayıs 2012 2

Hematopoetik Kök Hücreler ve Niş Kavramı Rıza Mert Çetik 6

Kök Hücreye Genel Bakış Betül İçli 11

Farklılaşma Yeteneklerine Göre Kök Hücreler Oğuzhan Duvar 13

Kökenlerine Göre Kök Hücreler Betül Kubat 14

Nükleer Yeniden Programlamaya Genel Bakış ve Yamanaka'dan Önce Yeniden Programlama Cansu Ayvacıoğlu 21

Yamanaka'nın Hayatı ve Yeniden Programlama Elif Haznedaroğlu 28

Yeniden Programlamanın Işığındaki Gelişmeler Ece Hocaoğlu 33

iPS Hücre Eldesinde Daha Etkili Bir Yöntem: RiPSHücreleri Tolga Bacak 37

mikroRNA Tarihçesi, Moleküler Özellikleri veRNA İnterferansi İrem Ozarlı 39

iPSC Üretiminde Alternatif ve Yüksek Verimli BirYöntem: miRNA Kullanımı Yusuf Yıldırım 44

Epigenetik ve Kök Hücre Sena Bocutcu 47

iPS Hücrelerin Epigenetiği Ceyda Acılıoğlu 54

Bir Method Olarak: Optogenetik Tuna Üstünkaya 58

Extreme Makeover: Çağrı KüçükkayıkçıConverting One Cell into Another Mehmet Yener Çalışkaner 61

3 Faktör Ne Yapabilir? Cevap: Sinir Hücresi Mehmet Yener Çalışkaner 66

İndüklenmiş Sinir Hücreleri Ömer Uludağ 70

Yetişkin Pankreatik Ekzokrin Hücrelerinin In VivoOrtamda β Hücrelerine Yeniden Programlanması Armağan Keskin 74

Dırect Conversıon Of Human Fıbroblast To Multilineage Blood Progenitors Ceren Yağmur Doğru 77

Kök Hücreler ve Kardiyak Onarım Oğuzhan Serin 82

Multipl Skleroz ve Kök Hücre Tedavisi Görkem Yavaş 92

mayıs 2012 3

Doku Mühendisliği ve Hücre Bazlı Terapiler; Benchten Kliniğe: Yedekleme, Onarım Ve Rejenerasyon Potansiyeli Ayşe Zehra Karadere 99

Kök Hücre, Kanser ve Damla Erimhan, Ülke Kocademir,Kanser Kök Hücreleri Merve Cansu Kaya 106

Kök Hücre Etiği Elif Reyhan Güneş 121

Ayşen Günel Özcan Röportajı Yusuf Yıldırım, Betül İçli 124

mayıs 2012 4

mayıs 2012 5

Hepinize merhaba!

HÜKÖK'le 15.03.2011'de tanıştım. Tıp Bayramı'nda yazlıktan arkadaşım Emir Charles Roach ile fakültede karşılaştım, bana heyecanla bazı fikirleri olduğunu ve beni yakın zamanda arayacağını söyledi. Gerçekten de hızlıydı, ertesi gün telefonda bana kız arkadaşı Gamze Gezgen'le (şimdi nişanlılar, tebrikler!) Hacettepe Üniversitesi Kök Hücre Öğrenci Topluluğu adı altında bir kulüp başlattıklarını ve bu kulüpte aktif olup olmak istemeyeceğimi sordu. Açıkçası başta çekindim, önceki kulüp deneyimlerim pek keyifli değildi ve bunlara bir yenisini daha eklemek istemiyordum. Öte yandan, Emir çok değer verdiğim bir ağabeyimdi ve beni çok da sıkıntılı bir şeyin içine sokmayacağını düşünerek kabul ettim. Şimdi baktığımda herhalde üniversite hayatımda şu ana kadar verdiğim en doğru kararlardan biriydi, iyi ki Emir'in aklına gelmişim.

HÜKÖK, tamamen amatör bir ruhla çok önemli bir şey başardı bence. 'Önem' kelimesinin altında şimdilik büyük bir araştırma projesi ya da uluslararası bir çalışma yatmıyor ama bu kulübü değerli kılan tıp öğrencileri arasında modern biyolojik kavramların konuşulabileceği bir ortam yaratması. Sene boyunca düzenlediğimiz ve devam ettiğimiz makale saatleri, oluşturulan bu öğrenci ağı ve ,eğer ki her şey yolunda giderse, kongremizde elinizde tuttuğunuz bu dergi bence ilk sene için 'önem' kelimesinin altını yeterince dolduruyor.

Kök hücre biyolojisi, hala çok temel kavramlar üzerinden ilerleyen ve insanları fazlasıyla düşünmeye iten bir alan. Bu alandaki çalışmaları okurken ben, beynimin büyüdüğünü hissediyorum. Biyoloji tarihindeki bir alanın çok temel düşünceler üzerinden gelişmesini gözlemlemek bence büyük bir şans, bir de böyle tıp öğrencileriyle oluşturulmuş bir ağ olarak herhalde biz bu keyfi birkaç katına çıkarıyoruz. Umarım bundan sonraki senelerde de HÜKÖK gerek fakülte içinde gerekse başka ortamlarda popüler bir kulüp olur ve bizim oluşturduğumuz bu keyifli ağa birçok insan daha dahil olur. Sene boyunca bizle birlikte çalışan ve bize destek olan tüm hocalarıma ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.

Başta Yener Çalışkaner olmak üzere bu dergide emeği geçen herkes adına,

Barış Boyraz

hükök

çok önemlidir. İnsan HKH'leri CD34+, CD59+, Hematopoetik Kök Hücreler:Thy1/CD90+, CD38-, c-kit-, lin- olarak tanımlanır (2). Bazı çalışmalar sonucunda kemik iliğinde, ematopoetik kök hücreler, kısaca kanın CD34- olması açısından diğer HKH'lerden farklı olan hücresel elemanlarını oluşturmaktan küçük bir hücre populasyonu daha ortaya Hsorumlu hücreler olarak tanımlanabilir. çıkarılmıştır. Bu kök hücreler, “uzun dönem Her 10,000-15,000 kemik iliği hücresi ve her kan hematopoetik kök hücre” olarak da adlan-100,000 kan hücresi içerisinden birinin hemato-dırılmaktadır. Kan hücresi üretimine fazla katkıları poietik kök hücre (HKH) olduğu düşünülmektedir. olmadığı, kemik iliğindeki hematopoetik kök hücre populasyonunun devamlılığını sağlamakla görevli HKH'ler, asimetrik bölünme geçirerek (bölünme olduğu düşünülmektedir. sonucunda bir projenitör hücre bir de kök hücre

oluşur) bir yandan HKH havuzunun devamlılığını Yukarıda da bahsedildiği üzere insan vücudunda sağlayarak bir yandan da kan hücresi üretimini hematopoezden sorumlu olan organ, kemik iliğidir. devam ettirirler. Fetal dönemde ise kan hücresi üretimi kemik iliğine gelene kadar birçok kez yer değiştirir(3). İlk olarak Hematopoetik kök hücrelerin keşfi, McCulloch ve sarı kesede (yolk sac) başlayan hematopoez işlemi, Till'in farelere radyasyon vererek yaptığı çalış-daha sonra aort-gonad-mezonefroz (AGM) bölgesi, malara, yani 1960'lara dayanmaktadır (1). plasenta, fetal karaciğer,timus, dalak ve kemik iliği Radyasyon verilen farelere yapılan kemik iliği nakli organlarında farklı zamanlamalarla devam eder(3-işlemleri sonrasında kan hücrelerin yenilenmesi, 4). Fetal kara-ciğer ile kemik iliği HKH çoğalması ile kemik iliğinin kök hücreler barındırdığına kanıt farklılaşmasını sağlayan temel organlardır. Ancak olmuştur. bu iki bölgeden köken alan HKH'lerin farklı özelliklerde oldukları gösterilmiştir. Karaciğer HKH'lerin fenotipik özelliklerinin iyi bilinmesi, kökenli olan kök hücreler, kemik iliği HKH'lerinin ak-yapılacak çalışmalara temel oluşturması açısından

Hematopoetik Kök Hücreler ve Niş Kavramı

Kemik iliği, insan vücudunda hücre bölünmesi ve sayısal artışın en yoğun olarak gerçekleştiği organlardan birisidir. Bu durum bize, kemik iliğindeki kök hücrelerin önemi üzerine bir fikir verebilir. Esas görevi hematopoez (kan hücresi üretimi) olan bu organ, barındırdığı kök hücrelerin henüz sadece bir kısmı aydınlatılabilmiş olan inanılmaz çeşitlilikteki fonksiyonları sayesinde, organizmanın tüm sistemlerine katkıda bulunmaktadır. Hematopoetik kök hücrelerin evi olarak nitelendirebileceğimiz bir mikro çevre olan “niş” ise, kemik iliğindeki hücrelerin fonksiyonlarının ve patolojilerinin anlaşılması yolunda mutlaka incelenmesi gereken bir konudur. Bu yazıda kemik iliğindeki hematopoetik kök hücreler, niş kavramı ve niş içerisinde bulunan diğer hücre türleri anlatılacaktır.

Rıza Mert Çetik

hükök

mayıs 2012 6

DERLEME

mayıs 2012 7

hükök derleme

-sine genellikle dolaşımda bulunur ve simetrik gerçekleşen bütün olaylar gibi çok sıkı bir şekilde bölünme geçirerek kan hücrelerini oluşturur. regüle edilmektedir. Sitokinler, bilinen en etkili

çevresel regülatörlerdir; fakat her geçen gün HKH HKH'lerin esas kaynağı ve en yoğun bulundukları üzerine etkili olan yeni faktörler bulunmaktadır ve yer, kemik iliğidir. Birçok hastalığın tedavisinde niş içerisinde HKH'lerin etkileşimde bulundukları kullanılan bir yöntem olan “hematopoetik kök her hücre türü, direkt veya indirekt olarak hücre transplantasyonu işlemi” için ilk basamak, hematopoezi etkilemektedir. HKH'lerin eldesidir. Uzun yıllar boyunca kemik iliği aspirasyonu, HKH eldesi için tek yöntem olarak G-CSF, GM-CSF ve IC-3 ve diğer bazı sitokinler uygulanmışken, HKH'lerin kanda da bulunduğunun hücreyi proliferasyona gitmesi yönünde uyarırken; gösterilmesi ile periferik kandan aferez ile HKH Plt-3 ligand ve kit ligand gibi sitokinler ise HKH'leri eldesi yöntemi günümüzde ilk tercih olmuştur. apoptozdan korur.

Kök hücrelerin kana geçmesine “mobilizasyon” CXCL12, diğer bir adıyla Stromal Derived Factor-1 denir. Periferik kanda bulunan kök hücreler, normal (SDF-1), HKH'lerin regülasyonunda adı en sık geçen koşullarda çok az sayıdadır (1 / 100,000 hücre kemokinlerden birisidir. HKH'lerin kemik iliğindeki oranında). G-CSF gibi bazı mobilize edici ajanların niş bölgelerine yerleşimi, diğer niş elemanları kullanılmasıyla bu oran artırılabilir, ve klinik tarafından salgılanan SDF-1'in katkılarıyla gerçek-uygulamalarda aferez ile HKH eldesi öncesinde bu leşmektedir. Aynı zamanda “homing” olayı da yöntem uygulanmaktadır. G-CSF'in yetersiz olduğu (ihtiyaç durumunda kök hücrelerin başka bölgelere durumlarda adjuvan olarak siklofosfamid ve göç etmesi) HKH'lerin SDF-1 konsantrasyonunu AMD3100 (CXCR4 antagonisti) gibi maddeler de takip etmesiyle gerçekleşir. Son çalışmaların kullanılmaktadır (detaylı bilgi için bkz: ref. 5-6). sonuçları göstermiştir ki, SDF-1 kemik iliğindeki

endosteal niş bölgesinde bulunan HKH'lerin Hematopoetik kök hücrelerin kemik iliğindeki dormant halde tutulmasında da da görev yap-aktiviteleri ve hematopoez, insan vücudunda maktadır(7-8).

Hematopoezin regülasyonunu sağlayan etkileşim-lerin biri de Wnt sinyalleriyle sağlanmaktadır. Bu sinyal yolakları, HKH'ler ile diğer niş elemanları arasındaki ilişkinin çok önemli bir boyutunu oluşturur; ve kök hücrelerin nişte yerleşimi ve kendini yenileme potansiyelinin devam ettiril-mesinde rol almaktadır. Wnt sinyallerinin Wif1 gibi inhibitör faktörler kullanılarak bloke edilmesiyle yapılan deneylerde, HKH'lerin zamanla tükenme eğilimi gösterdiği tespit edilmiştir(9-10).

(Şekil: Mikkola HKA, Orkin SH (2006) The Journey of Developing Hematopoietic Stem Cells. Development 133: 3733-3744)

yerleşimli olan, oldukça fazla damar içeren alanlar Niş Kavramı: olan “perivasküler nişler”dir.

iş; hematopoetik kök hücrelerin içerisine Endosteal Niş: Vasküler sinüsoidlerin az yerleştiği, kemik iliğinde bulunan, bulunduğu, HKH'lerin çoğunlukla dormant halde Nkompleks çok boyutlu bir mikroçevre-olduğu nişlerdir. Osteoblastlar, osteomac'lar, dir(11). HKH'lerin görevlerini yerine getirebilmesi mezenkimal kök hücreler (MKH), sempatik sinir için uygun koşullar “niş”te sağlanmıştır. uçları, vasküler endotel hücreleri, adipositler ve kondrositler bu nişin elemanlarıdır. Hücresel Niş kavramı sıklıkla hematopoetik kök hücreler için elemanların çokluğu, niş yapısının ne kadar kullanılıyor olsa da, vücutta başka bölgeler de niş kompleks olduğu konusunda bizlere bir fikir olarak adlandırılabilmektedir (bağırsak kök hücre verebilir. nişi, saç kökü nişi gibi). Niş kavramı ilk olarak 1978

yılında ortaya atılmıştır; fakat daha sonra Droso-Mezenkimal kök hücreler ve osteoblastlar başta phila ile yapılan çalışmalara kadar oldukça az ilgi olmak üzere niş elemanları, HKH'lerin devamlılığını görmüştür(12). sağlayan çeşitli maddeler salgılarlar. Bu maddeler; CXCL12 (SDF-1), stem cell factor (SCF), ang-1, Niş, kök hücreleri dış etkilerden korur. Fonksi-osteopontin ve IL-7'dir. Bu maddelerin dinamik bir yonlarını gerçekleştirebilmeleri için gereken fiziksel denge halinde bulunması, HKH fonksiyonu ortamı ve sinyalleri üretir, entegre eder. Organiz-açısından oldukça önemlidir. Örneğin; G-CSF alan mayı, kök hücrelerin sınırsız çoğalma potansi-kişilerde CXCL12 ekspresyonu azalır, ve HKH'leri yelinden korur. Gördüğümüz gibi “niş”in hemato-nişte tutan sinyaller azalır. G-CSF'in mobilizasyonu poezde son derece hayati bir rolü vardır. Günümüz-bu yolla sağladığı bilinmektedir. Aynı zamanda de nişin yapısını detaylı bir şekilde anlayabilmek ve MKH'ler ile temas halinde olan sempatik sinir uçları çeşitli patolojilere açıklama getirebilmek için da, gün içinde HKH'lerin mobilize olduğu sirkadyan yürütülen birçok çalışma vardır. “Niş”, tıp bir düzen oluşmasını sağlar(12).dünyasının en gözde konularından birisidir.

Perivasküler Niş: Vasküler sinüsoidlerin yoğun Fareler üzerinde yapılan en güncel çalışmaların bize olarak bulunduğu, ve HKH'lerin aktif halde olduğu sunduğu bilgiler ışığında, memelilerin kemik nişlerdir. Perivasküler MKH'ler, CAR (CXCL12 iliğinde 2 ayrı türde niş bulunduğunu bilmekteyiz. abundant reticular) hücreleri, makrofajlar bu niş Bunlardan birincisi, kemik trabeküllerinin bölgesinin elemanlarıdır.endosteal yüzeyleri üzerinde yerleşik olan

“endosteal nişler”dir. İkinci grup ise, daha merkezi

(Şekil: Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 2011 (208) 421-428)

hükök

mayıs 2012 8

derleme

Osteoblastlar tarafından salgılanan TPO, HKH'leri Her ne kadar hematopoetik kök hücreler, üzerinde dormant halde tutan önemli faktörlerden birisi en çok çalışma yapılan kök hücreler alanlarından olarak gösterilmiştir. Endosteal ve perivasküler birisi de olsa, bildiklerimizin henüz bilmedik-nişlerdeki HKH'ların aktivite farkları, bundan lerimize kıyasla ne kadar az olduğu, çok açıktır. kaynaklanmaktadır. Durmak bilmeyen bilimsel gelişmelere bizim de

gelecekte büyük katkılar yapacağımızı umarak, Makrofajlar ise, niş bölgelerinin yeni tanımlanan yazımı bir alıntıyla bitirmek istiyorum:elemanları olarak MKH'lerle ilişki içerisindedirler. Kemik iliğindeki makrofajların yok edildiği hayvan “Bildiğim bir şey varsa, o da hiçbir şey modellerinde, MKH'lerin aktivitesinde çok belirgin bilmediğimdir.” – Sokratesazalmalar görülmüştür. G-CSF'in de etkisini makrofajlar üzerinden yarattığı düşünülmektedir; çünkü yapılan araştırmalar bu molekülün reseptörünün sadece makrofajlarda bulunduğunu göstermiştir(14).

Hematopoetik kök hücre nişlerinin –özellikle endosteal nişler- bir başka özelliği de, oksijen yoğunluğunun çok az olduğu alanlar olmasıdır. Hipoksi durumunda indüklenen HIF (hypoxia inducible factors) faktörlerinin HKH'lerin devam-lılığı ve dormant halleri üzerine etkisi kanıtlan-mıştır(15).Beyin, testisler, kıl kökleri gibi bazı vücut bölümleri, immün sistemin etkilerinden uzak tutulur ve bu bölgelere “immune-privileged” denir(16). Kemik iliğindeki kök hücre nişlerinin de bu özelliklere sahip olabileceği, son yıllarda yapılan bazı çalışmalarla ortaya atılmıştır(17).

(Şekil: Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 2011 (208) 421-428)

mayıs 2012 9

hükök derleme

15. Rehn M, et al (2011) Hypoxic Induction of Vascular Referanslar:Endothelial Growth Factor Regulates Murine Hematopoietic Stem Cell Function in the Low-Oxygenic 1. McCulloch EA, Till JE (1960) The Radiation Sensitivity Niche. Blood 118 1534-1543of Normal Mouse Bone Marrow Cells, Determined by

Quantitative Marrow Transplantation into Irradiated 16. Niederkorn JY (2006) See No Evil, Hear No Evil, Do Mice. Radiation Research 13; 115-125No Evil: the Lessons of Immune Privilege. Nature Immunology 2006 (7) 354-3592. Koçyiğit İ, Kaynar L, Çetin M (2008) Hematopoietik

Kök Hücre Biyolojisi. Türkiye Klinikleri J Hem Onc 1(2): 17. Fujisaki J, et al (2011) In Vivo Imaging of TReg Cells 16-22Providing Immune Privilege to the Haematopoietic Stem Cell Niche. Nature 2011 (474)3. Mikkola HKA, Orkin SH (2006) The Journey of

Developing Hematopoietic Stem Cells. Development 133: 3733-3744

4. Kansu E, Çamurdanoğlu BZ (2009) Erişkin ve Hematopoietik Kök Hücreler. TÜBA Kök Hücre Biyolojisi ve Klinik Uygulamalar: 41

5. Winkler IGi et al (2012) Hematopoietic Stem Cell Mobilizing Agents G-CSF, Cyclophosphamide or AMD3100 Have Distinct Mechanisms of Action on Bone Marrow HSC Niches and Bone Formation. Leukemia 1-8

6. Mohty M, Ho AD (2011) In and Out of the Niche: Perspectives in Mobilization of Hematopoietic Stem Cells. Experimental Hematology 39:723-729

7. Tzeng YS, et al (2011) Loss of CXCL12/SDF-1 in Adult Mice Decreases the Quiescent State of Hematopoietic Stem Cells and Alters the Pattern of Hematopoietic Regeneration After Myelosuppression. Blood 117 (2) 429-439

8. Itkin T, Lapidot T (2011) SDF-1 Keeps HSC Quiescent at Home. Blood 117

9. Schaniel C, et al (2011) Wnt-inhibitory Factor 1 Dysregulation of the Bone Marrow Niche Exhausts Hematopoietic Stem Cells. Blood 118 2420-2429

10. Ichii M, et al (2011) The Canonical Wnt Pathway Shapes Niches Supportive for Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Blood

11. Scadden DT (2006) The Stem-Cell Niche as an Entity of Action. Nature 441 1075-1079

12. Moore KA, et al (2006) Stem Cells and Their Niches. Science 311, 1880

13. Ehninger A, Trumpp A (2011) The Bone Marrow Stem Cell Niche Grows Up: Mesenchymal Stem cells and Macrophages Move In. J Exp Med 208 421-428

14. Winkler IG, et al (2010) Bone Marrow Macrophages Maintain HSC Niches and Their Depletion Mobilizes HSCs. Blood 116 4815-4828

hükökderleme

mayıs 201210

ücudumuzdaki 200'den fazla tip özelleşmiş ya da kansere neden olan kontrolsüz bölünmede hücrenin, döllenmiş bir yumurtadan nasıl nasıl düzenlendiğini anlamak açısından çok önem Vmeydana geldiği oldukça şaşırtıcı bir taşıyor.

konudur. Belirli bir zamana kadar eş özelliklere sahip hücreler, bir yerden sonra nasıl farklılaşmaya Kök hücreler dokuya özgü özellik göstermiyor. başlarlar? Mesela hiçbir zaman yanındaki hücrelerle birlikte

vücuda kan pompalayamıyor ya da oksijen Çok farklı görevleri gerçekleştiren hücrelerin taşımıyor.türediği ortak yapı “kök hücre” olarak adlandırılır. Kök hücreyi bu kadar ilgi odağı yapan özelliği ise Ama farklılaşma süreciyle birlikte birçok hücre tıpta birçok tedavide kullanılabilme potansiyeli tipine dönüşebilme potansiyeline sahip. Bu olmasıdır. Bunların başında organ üretimi ve farklılaşmayı tetikleyen içeriden ve dışarıdan gelen yenilenmesi gelmekte. Kök hücreden üretilen sinyaller var. İçten gelen sinyaller hücrenin kendi dokular kanser, şeker hastalığı, kalp hastalıkları gibi genleri tarafından kontrol ediliyor. Etraftaki diğer birçok yanlış işleyişte insanlara umut veren bir hücreler tarafından sentezlenen kimyasallar, noktada. komşu hücrelerle olan fiziksel etkileşimler ve

mikroçevrede bulunan belli bazı maddeler dıştan Tüm kök hücrelerin, kaynağına bakılmaksızın, 3 gelen sinyallerden sayılıyor. Bu sinyallerin ortak özelliği vardır: uzun bir süreç boyu bölü- etkileşimleri, epigenetik değişikliklere neden nebilme ve kendini yenileyebilme, özelleşmemiş oluyor ve böylece hücre farklılaşmaya başlıyor. Bu olma, başka hücre tiplerine dönüşebilme. süreç aşama aşama gerçekleşiyor ve her seferinde

hücreler biraz daha özelleşmiş oluyor.Bir kök hücre popülasyonu laboratuvarda aylarca tutulduğunda, sürekli bölünüp sayısını milyonlara Bu kadar üzerinde çalışılan bir konu, ne zamandır çıkarabilir. Sonda oluşan hücreler de ilk popü- bilim dünyasının dikkatini üzerine çekiyor?lasyondaki hücreler gibi özelleşmemiş ise bu özelliğe uzun süreli kendini yenileyebilme(? Long- Genel olarak bir tarihine bakalım;term self-renewal) denir.

Kök hücre sözcüğü 1908 yılında Rus histolojist Bilim insanları bu özellikle ilgili 2 önemli sorunun Alexander Maksimov tarafından Berlin'deki bir cevabını aramakta: neden embriyonik kök hücreler hematoloji kongresinde ortaya atıldı.laboratuvarda bir sene belki daha fazla sürekli çoğalabiliyor da embriyonik olmayanların çoğu 1950lerde kemik iliğindeki bazı hücrelerin başka bunu başaramıyor ? ve normalde canlı vücudunda dokuları oluşturabilme kabiliyetinin farkedilmesi, kök hücrelerin bu bölünmesini düzenleyen fak- insanlardaki kök hücre araştırmaları için bir törler neler? Bu soruların cevaplarına ulaşmak başlangıç noktasıydı. Hasar görmüş, işlevini yerine ,hücre çoğalmasının normal embriyonik gelişmede getiremeyen dokuların bu yöntemle yeniden oluş-

hükök

mayıs 2012 11

MAKALE

Kök Hücreye Genel Bakış

Betül İçli

hükök makale

turulabileceği düşüncesi bilim adamları için ilham like stem cell) Bu tipin, erişkin kök hücreden daha kaynağı oldu. 1956 yılında Amerikalı doktor E. fazla tür dokuya dönüşebilceğini savundular.Donnall Thomas (1990'da J. E. Murray'le birlikte Nobel Ödülüne layık görüldü) tarafından ilk kemik 2006'da Kazutoshi Takahashi'nin ve Shinya iliği nakli gerçekleştirildi. Lösemili hastanın vücudu, Yamanaka'nın fare indüklenmiş pluripotent kök uygulanan radyoterapinin ardından, tek yumurta hücresiyle ilgili makaleleri yayınlandı.(iPS)ikizinden yapılan nakli reddetmedi ve işlem başarılı oldu. Bugünlerde kemik iliği nakli bilindiği üzere 2007'de amniyotik sıvıdan kök hücre üretildi. lösemi, lenfoma, multiple myelom gibi kanser- Bunun araştırmalarda ve tedavide embriyonik kök lerde; orak hücre anemisi, ağır immün yetmezliği hücreye alternatif olabileceği düşünüldü.sendromu, talasemi gibi kemik iliği üretimini etkileyen hastalıklarda ya da kemoterapi dola- Yine 2007'de insan olgun fibroblastlarından yısıyla kemik iliği hasarı ileri düzeyde olan hasta- indüklenmiş pluripotent kök hücreler elde edildi. larda uygulanmakta. Günümüzde sadece fibroblastlar değil başka insan

hücreleri de bu iş için kullanılabilmekte.1981'de Martin Evans ve Matthew Kaufman tarafından yeni bir teknik denendi: Uterusta 2008'de insan diz kapağında otolog erişkin gelişmekte olan fare embriyolarından blastosit mezenkimal kök hücrelerden kıkırdak doku aşamasında kök hücrelerin izole edilmesi. Yine aynı oluşumu gerçekleşti.sene Gail Martin “embriyonik kök hücre” terimini kullandı ve bu embriyoların in vitro olarak da 2009'da deri hücrelerinin doğru manipülasyonlarla yetiştirilebileceğini yazdı. 1988'de ise yetişkin hastaya özel, indüklenmiş pluripotent kök hücreye farelerden hematopoetik kök hücreler saflaştırıldı. dönüştürülebilineceği ortaya atıldı ve bunun nasıl 1992'de insan beynindeki kök hücreler tanımlandı yapılacağına dair bir yol da açıklandı.ve böylece modern nöroloji biliminin babası olarak bilinen Cajal'ın “yeni nöronlar oluşmuyor” hipotezi Ve son yıllarda yapılan birçok başarılı çalışma yanlışlanmış oldu. daha…

1998'de James Thomson ilk kez insan embriyonik Hastalıkların tedavisini derinden etkileyecek kök hücrelerini izole edip çoğaltabilceği bir yöntem kökten değiştirecek özelliği, son zamanlarda ortaya koydu ve bu kök hücre biyolojisinin insan yapılan çalışmaların umut verici başarısıyla ayağı için önemli bir adım oldu. birleşince, tüm dünyada ilgi gösterilen, büyük

bütçeler ayrılan bir alan olma niteliğini 2000li yıllarda erişkin kök hücrelerin farklı kaybetmeyecek gibi.hücrelere dönüşebildiğine dair birçok rapor yayınlandı.

2001 yılında çekirdek transferiyle fare embriyonik hücresi oluşturuldu.

2002 yılına gelince fare embriyonik kök hüc-resinden üretilen pankreatik hücrelerin, fare-lerdeki diabete iyi geldiği görüldü.

2003'te Dr. Songtao Shi ve ekibi çocukların süt dişlerinden kök hücre elde etti.(DPSC-dental pulp stem cell)

2004'te ise Parkinson hastalığı dolayısıyla kaybedilen bir sinir hücresi tipinin insan embriyonik kök hücrelerinden üretildiği duyuruldu.Kingston Üniversitesi araştırmacıları 2005'te göbek kordon kanından elde edilen bir kök hücre tipini belirlediler.(CBE- cord-blood-derived embryonic-

hükökmakale

mayıs 201212

mbriyonal gelişim sürecinde kök hücreler İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC): değişik doku ve organları oluşturmak üzere Pluripotent olmayan bir hücrenin dışarıdan bir Efarklılaşmaktadırlar. Canlılarda döllenme takım etkilerle gen ekspresyonunun değiştiril-

sonrası oluşan zigot bölünerek değişik farklılaşma mesiyle oluşturulan yapay pluripotent hücrelerdir. yetenekleri olan kök hücreleri meydana getirir. Aynı Derginin ilerleyen sayfalarında ayrıntılı olarak kalıtsal materyale sahip olmalarına rağmen farklı anlatılacağından, şimdilik bu kısa bilgiyi vermekle genlerin ifade edilmesi, insan vücudundaki kök yetiniyoruz. hücrelerin farklılaşma yeteneklerinin birbirinden farklı olmasının en önemli sebebidir. Kök hücreler Multipotent kök hücre: farklı hücre tiplerine dönüşebilme kapasitelerine Embriyonal gelişimin ileriki dönemlerinde ortaya göre aşağıdaki şekilde gruplandırılmıştır: çıkan ve sadece belirli hücre tiplerine farklılaşma

yeteneği bulunan kök hücrelerdir. Multipotent kök Totipotent kök hücre: hücreye en iyi örnek hematopoetik kök hücredir. Embriyonal gelişim sürecinin başlangıcında Hematopoetik kök hücreler bütün kan dokusu yumurta sperm tarafından döllenir ve vücuttaki hücrelerine farklılaşabilirler.bütün hücre türlerine dönüşebilme yeteneği olan zigot meydana gelir. Döllenmeyi takip eden ilk dört Oligopotent kök hücre: gün içerisinde(morula evresi) zigot bölünerek 16 Farklılaşma yeteneği multipotent hücrelerden hücreli yapıyı oluşturur. Bu hücrelerin her biri daha az olan hücrelerdir. Lenfoid ve myeloid totipotent kök hücrelerdir. Totipotent kök hücreler hücreler oligopotent hücrelere iyi birer örnektir. bütün embriyonal ya da ekstra embriyonal dokulara farklılaşabilirler. Unipotent kök hücre:

Yalnızca tek bir hücre tipine farklılaşabilen öncü Pluripotent kök hücre: hücrelerdir.Morula dönemindeki 16 hücreli yapıdaki totipotent hücreler bir ileriki aşamada farklılaşarak blastosisti Son yıllarda yapılan bazı araştırmalar bilim oluştururlar. Blastosist, trofoblast ve iç hücre kitlesi adamlarını bu gruplandırmanın kalıcılığı üzerine adı verilen iki farklı yapıdan oluşur. İç hücre düşündürmeye başlamıştır. Çünkü laboratuvar-kitlesindeki hücreler pluripotent kök hücrelerdir. larda yapılan yeni çalışmalarla tamamen Pluripotent kök hücreler her üç embriyonal tabaka farklılaştığı düşünülen bazı hücrelerin dışarıdan (endoderm, mezoderm, ektoderm) hücrelerine de birtakım etkilerle pluripotent hücrelere dönüşe-farklılaşabilirler. Pluripotent kök hücrelerin bildiği gözlenmiştir. Yine tamamen farklılaşmış totipotent kök hücrelerden farkı ekstra embriyonal hücrelerin dışarıdan birtakım etkilerle farklı doku doku hücrelerine (plasenta gibi) farklılaşama- türlerinin hücrelerine dönüştürüldüğü bazı malarıdır. Dolayısıyla totipotent kök hücreler deneyler mevcuttur.bölünmeye bırakıldıklarında canlı bir organizma oluşturabilirken pluripotent hücreler oluştura-mazlar.

MAKALE

Farklılaşma YeteneklerineGöre Kök Hücreler

Oğuzhan Duvar

hükök

mayıs 2012 13

ök hücreler; tüm insanlarda, gelişimin ilk Kök hücre çeşitlerini kesin bir sınıflandırmaya tabi evrelerinden son evrelerine kadar var tutmak zor olsa da bu hücreler belirli başlıklar Kolmaktadırlar. Kök hücreler; içinde bulun- altında toplanabilir:

duğu gelişim evresine, dokuya vb. ne göre, gerek farklı dokulara dönüşme kapasiteleri gerek doku Embriyonik Kök Hücreler:içinde bulunma oranları gibi özelliklerle birbir- Embriyonik kök hücreler blastosistin iç hücre lerinden ayrılırlar. Örneğin embriyonik kök kütlesinden(inner cell mass) türeyen pluripotent hücreler, insan gelişimin oldukça erken safha- kök hücrelerdir. Blastosist, memelilerin erken larından elde edilip vücuttaki tüm hücre çeşitlerine embriyogenez döneminde moruladan sonra dönüşme kapasitesine sahiplerken; yetişkin kök oluşan, 4-5 günlük embriyoya verilen isimdir. Bu hücreleri, gelişimini tamamlamış insanın belirli yapı; normal gelişim sürecinde embriyoyu oluş-dokularından elde edilip belirli hücre tiplerine turacak iç hücre kütlesini (inner cell mass) dönüşme kapasitesine sahiplerdir. Ayrıca ayık- (embryoblast) ve plasentayı oluşturacak dış hücre lanma kolaylığı bakımından; yetişkin kök hücreleri katmanını(trophoblast) içerir. İç hücre kütlesi, içinde bulundukları olgun dokunun hücreleri gelişimin erken evrelerinde implantasyon öncesi arasından ayırmak, embriyonik kök hücrelere oluşur ve embriyonik kök hücreler bu kısımdan elde nispeten daha zordur. Bu gibi farklılıklar sayesinde edilir. Ayrıca gelişmekte olan bir fetusun primordial kök hücreler daha iyi anlaşılmakta ve çeşitli germ hücrelerinden de embriyonik kök hücrelere çalışmalarla yeni kök hücrelerinin keşfi hızla benzeyen hücreler elde edilebilir. İnsan embriyonik gerçekleşmektedir. germ hücreleri,

Kökenlerine Göre Kök Hücreler

Betül Kubat

mayıs 201214

hükök

DERLEME

fetusun bir parçası etmektir. Bulundukları ortama göre farklı davranış olan gonadal yapı- özellikleri gösterirler. Örneğin; hematopoietik kök dan köken alan pri- hücreler, olgunlaşmış kan hücrelerine dönüşmek mordial germ hücre- üzere kemik iliği tarafından sürekli üretilirler. Bu lerinden elde edilir. hücrelerin en önemli görevleri kan hücrelerini

yenilemektir. Bu durmun aksine, ince bağırsaktaki Embriyonik kök hüc- kök hücreler sabittir (sürekli üretilmezler) ve reler(ES) blastosist- fiziksel olarak oluşturdukları matür hücrelerinden ten elde edilmek kolaylıkla ayırt edilebilirler. Kök hücresi içerdiği

istendiğinde blastosistin dış kısmı çıkarılır ve iç bildirilen erişkin organ ve doku listesine her gün bir hücre kütlesi elde edilir. Elde edilen bu hücreler, yenisi eklenmektedir. Bunlar arasında kemik iliği, hücrelerden ES lerin elde edilebileceği besince periferik kan, beyin, spinal kord, diş kökü, kan zengin kültür ortamlarına alınırlar. Bu ortamda, damarları, çizgili kas, derinin epitel tabakası, hücrelerin özel hücre tiplerine uzunca bir süre sindirim sistemi, kornea, retina, karaciğer ve dönüşmeden çoğaltılması sağlanır. Kök hücre pankreas bulunmaktadır. çalışmalarında kök hücreler, in vitro fertilizasyon ve çekirdek transferi olmak üzere iki temel kaynaktan Bir hücreye erişkin kök hücre denebilmesi için o elde edilirler. hücrenin kendini yenileyebilmesi ve bu hücrelerin

klonlanabilmesi gerekmektedir. Diğer bir deyişle; Kök hücre tedavilerinde kök hücreleri, farklı- ihtiyaç olduğunda olgunlaşmış hücrelere dönüşe-laşmamış halde hastaya vermek risklidir. Çünkü; bilecek, kendisiyle aynı genetik özelliklere sahip geniş bölünme kapasitelerinden dolayı hücreler, hücreler oluşturabilecek özelliğe sahip olmalılardır. bulundukları yerde teratoma denilen tümore Dönüştüğü hücrelerin tamamıyla matür bir hücre neden olabilirler. bu yüzden ES hücreleri ile tedavi fenotipinde olması, bulunduğu dokuya entegre yapılabilmesi için hücrelerin transplanttan önce olması ve o dokuya ait fonksiyonu yerine getire-spesifik hücrelere dönüştürülmüş olması gerekir. bilmesi gerekir.Ayrıca, bu tedavilerin hepsinin hipotetik ve deneysel aşamada olduğunu belirtmek gerekir. Yetişkin kök hücreler çeşitli hücre tiplerine ayrılırlar.

Hematopoietik kök hücreler, mamal kök hücreler, Yetişkin(Erişkin) Kök Hücreler: bağırsak kök hücreleri, mezenkimal kök hücreler, Yetişkin kök hücreler; embriyonik gelişim sonra- endotelyal kök hücreler, nöral kök hücreler, sında vücut doku hücreleri arasında bulunan, farklı- burun(olfactory) kök hücreleri, sinir ucu (neural laşmamış ve farklılaşma kapasiteleri embriyonik crest) kök hücreleri vb. yetişkin kök hücre tipleridir.kök hücreler göre daha sınırlı olan kök hücrelerdir. Dokularda nadir olarak bulunurlar. Birincil görevleri Hematopoietik Kök Hücreler: bulundukları dokuda hücre ölümü veya doku hasarı Bu kök hücreler kemik iliğinde bulunup kan hücre meydana geldiğinde kısmen dokuyu tamir çeşitlerinin tümünü oluşturabilecek kapasiteye sa-

İn vitro fertilizasyon çekirdek transferi

mayıs 2012 15mayıs 2012 7

hükök derleme

hiptirler ve multipotent kök hücrelerdir. Ayrıca bu Sinir sisteminin ana görünümünü oluşturan, kendi kök hücreler kemik iliği dışında; periferik kan, kendini yenileyebilen multipotent kök hücrelerdir.umblikal kord kanı ve plasentadan da elde edilebilirler.

Mamal Kök Hücreleri: Bu kök hücreler; ergenlik dönemi,hamilelik ve meme karsinogenezi sırasında meme bezlerinin büyümesini sağlayan hücrelerin kaynağını oluş-tururlar.

İntestinal Kök Hücreler: Bu kök hücreler düzenli olarak hayat boynca Olfaktori Kök Hücreler: bölünürler ve bağırsağın içini astarlayan hücreleri Olfaktori kök hücreler, insan burun mukoza oluştururlar. Ayrıca intestinal kök hücreler, ince ve hücrelerinden elde edilirler. Burun mukoza kalın bağırsak kanserlerinin olası kaynakları olarak hücreleri burnu astarlar ve koku duyusunun görülürler. alınmasında görev alır. Bu hücrelerin doğru

kimyasal ortamlara verilmesi halinde bu hücreler, Mezenkimal Kök Hücreler: embriyonik kök hücreler gibi birçok farklı dokuya Hücrelerin bağ dokularında bulunurlar. Dokuların farklılaşma özelliğine sahip olurlar. Herkesten desteğini başka bir deyişle çatısını oluşturan stroma kolaylıkla elde edİlebilirler. Kök hücre terapilerine hücrelerinin temelini oluştururlar. Plasenta, yağ özelikle ihtiyaç duyan yaşlı kişilerde bu kök dokusu, akciğer, kemik iliği ve kandan izole hücrelerin önemi büyüktür.edilebilirler. Her ortamda farklılaşma kapasitesine sahiptirler. Bulunduğu dokudan hasarlı bir dokuya geçerek bu sayede hasarlı doku tamirini sağla- Sinir Ucu (Neural Crest) Kök Hücreleri: yabilirler ve bu sayede birçok organda yapım- Bu kök hücreler; nöronları, Schwann hücrelerini, onarım işlerini yürütebilirler. Ayrıca ortamdaki kondrositleri ve melanositleri oluşturma kapa-farklı koşullara bağlı olarak farklı bir görünüm sitesine sahiptirler.kazanabilirler. Bu nedenle, ortamlarda yetenekleri değişebilir ve her yetenekleri kesin değildir. Fetal Kök Hücreler:

Adından da anlaşılacağı üzere fetal kök hücreler, Endotelyal Kök Hücreler: fetusten elde edilmektedir. Fetus, üçüncü gebelik Endotelyal kök hücreler, kemik iliğinde bulunan ayı başından doğuma kadarki devre içinde ana multipotent kök hücre çeşitlerinden biridir. Nadir rahmindeki canlıya verilen addır. Fetusteki birçokbulunurlar ve kan damarlarını astarlayan endote- doku kök hücre içerir. Bu kök hücreler, hızlı büyüme lyal hücrelere farklılaşma yeteneğine sahiptirler. ve organ gelişiminden sorumludurlar.

Nöral Kök Hücreler:

Mamal Kök Hücreleri (kırmızı) Mamal Kök Hücreleri (yeşil)

mayıs 201216

hükökderleme

Fetal kök hücreler ile yetişkin kök hücreler arasında hücrelere; teratoma oluşturmaları, belirli kök hücre bazı benzerlikler bulunmaktadır. Yetişkin kök genlerinin ekspresyonu, blastosiste enjekte hücreler gibi fetal kök hücreler de genelde dokuya edildiğinde yeni oluşan bireyin vücut hücrelerine özgüdürler ve yine yetişkin kök hücreler gibi katkıda bulunma gibi yönlerden benzerler.bulundukları dokunun olgun hücrelerini oluşturma kapasitesine sahiptirler. iPSC ler elde etmek için; yetişkin hücreler, çeşitli

yöntemler kullanılarak yeniden programlanır. Fakat Kordon Kanı Kök Hücresi: bu yöntemin insanlarda kullanımını sınırlayan Bebek doğduktan sonra göbek kordonunda ve önemli riskler oluşabilir. Örneğin; hücreleri plasentanın içerisinde, bebek kanı ile aynı yapıda genomik olarak değiştirmek için virüsler kulla-bir miktar kan kalır ve bu kan genellikle atılarak nılırsa, kansere neden olan genler ekprese olabilir.boşa gider. Oysa bu kan, vücudumuzda bulunan birçok hücreyi oluşturma yeteneğine sahip kök Amniyotik Kök Hücreler:hücreleri büyük miktarlarda içerir. Kordon kanı; hastalıkları tedavi veya belirli kanserlerin tedavi- Amniyonitik sıvı; gelişmekte olan bebeği korur, sinden sonra kan sistemini restore etme amacıyla fetusün hareketini kolaylaştırır, ısı kaybından fetusü kullanılır. Olgun kemik ilğindeki kök hücreler gibi korur. Ayrıca amniyotik sıvı hatırı sayılır miktarda kordon kanı kök hücreleri de dokuya özgü özellik kök hücre içerir. Bu amniyotik kök hücreler, gösterirler. multipotent kök hücrelerdir ve çeşitli dokulara

dönüşme kabiliyetine sahiplerdir. Bununla beraber; araştırmacılar, amniyotik sıvının non-

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre (iPSC): pluripotent kök hücreler bakımından da oldukça iPSC veya iPSler; pluripotent olmayan bir hücreden, zengin olduğunu ortaya koymuşlardır. Bu hücreler, spesifik genlerin 'zorla' ekspresyonu indüklenerek belirli hücrelere dönüşme kabiliyetine sahiptirler. elde edilen pluripotent hücrelerdir. İPS lerin Bu hücreler ise beyin, karaciğer ve kemik türetildiği pluripotent olmayan hücreler genelde hücreleridir. Günümüzde amniyotik kök hücreleri, vücut hücreleridir. Fakat biz bu hücrelere yetişkin özel kök hücre bankalarında korumak mümkündür. kök hücreleri diyemeyiz. Çünkü İPS ler embriyonik Bazı özel şirketler bu uygulamayı, belirli ücretler kök hücreler gibi doğal pluripotent olan kök karşılığında sağlayabilmektedirler.

mayıs 2012 7

hükök derleme

Kanser Kök Hücresi (KKH):Bu hücreler tümörlerde bulunan kanser hücreleridir ve normal kök hücre özelliği gösterirler. Belirli kanser çeşitlerinde,kanserli dokuda bulunan tüm hücrelere dönüşebilirler. Tümörleri oluştur-maları, farklılaşma ve kendi kendilerini yenileme yoluyla olmaktadır. Son çalışmalarla KKH'lerin ilaç ve radyasyon tedavisine dirençli oldukları gösterilmiştir. Gelecekteki çalışmalar, kanserin tedavisi için KKH'leri hedef alan tedavilerin geliştirilmesine öncülük edecektir.

Amniyotik Kök Hücre Eldesi

mayıs 201218

hükökderleme

Embriyonik kök hücre, embriyodan oluşan sınırsız varlığıyaşam kapasitesi olan ve birçok hücre dizisini nda bu oluşturabilen hücredir. Embriyonik kök hücre özelliklerihücre, erken embriyonun (4.-5. gün) blastosit ni korumak-evresindeki iç hücre grubunun hücre kültürlerin- tadır. Destek den elde edilir. Ancak bu kültüre hücreler hücreler ve LIF or-embriyonun normal gelişimindeki gibi hareket ta m d a n u za k l a şt ı r ı d ı ğ ı n d a hücreler ara-etmezler. Embriyonik kök hücre sonsuz üreme sında kümeleşme ve sonrasında Embriyoid Cisim potansiyeline sahiptir; pluripotent bir hücredir yani oluşumu gözlenir. Embriyoid cisimcikler (embrioid embriyonun her üç germ tabakasından (endoderm, bodies) embriyonik kök hücrelerden elde edilen ektoderm, mezoderm) hücreleri oluşturabilir ve hücre kümeleridir. Bu kümeler üç ana germ vücutta yaklaşık 200 hücre tipine dönüşebilirler. tabakasından kaynaklanan çeşitli hücre tiplerine Embriyonik kök (EK) hücreleri iki çok önemli yönlenmiş hücrelerden, farklılaşmamış olanlara özelliğe sahiptirler ve bu özellikler sayesinde kadar değişen hücreleri içermektedir. Kültürlerden rejeneratif tıbbın odak noktası haline gelmişlerdir: elde edilen embriyonik kök hücrelerde aşağıdaki kendini-yenileme süreci ile farklılaşmaksızın hücrelere değişim gözlenmiştir;prolifere olma becerisi, farklılaşma için indüklen-diklerinde özelleşmiş hücre türleri oluşturma -Pankreas adacık hücresine benzer, insülinpotansiyeli. salgılayan hücreler (fare ve insan çalışlmaları)

-Kasılma gösterebilen kalp kası hücreleri Günümüzde, kök hücrelerin farklılaşmasının (fare ve insan)kontrolü üzerinde durulmaktadır. Bu amaçla kültür -Kan hücreleri (fare ve insan)ortamına çeşitli büyüme faktörleri, sitokinler ve -Bazı beyin kimyasallarıın salgılayan sinir kimyasallar eklenmiş, farklı destek hücreleri hücreleri (fare)kullanılmış ve gen aktarımı ile farklılaşmanın yönlenmesi yönünde çalışmalar yapılmaktadır. Rejeneretif tıpta diabetes mellitus, nöronal Embriyonik kök hücrelerin farklılaşmadan kendini onarım, kardiak restorasyon, hemapoietik yenileyebilmesi için birçok faktörün denge içinde transplantasyon, ortopedik hastalıklar gibi alan-olması gerekmektedir. In-vitro olarak farklılaşmayı larda embriyonik kök hücre uygulamalarında kontrol etmek için kültür ortamında destek çalışılmaktadır. Ayrıca bilimsel ve politik engellerin hücreler ve sitokinlerden yararlanılmaktadır. İnsan üstesinden gelindikten sonra, insan embriyonik kök embriyonik kök hücreleri, fare embriyonik fibro- hücre alanının yanık travması ve diyabetik blast hücreleri ve "Leukemia Inhibitory Factor"-LIF ayakyaraları gibi belli hastalıklarda ve aynı zamanda

Parkinson hastalığı, Tip 1 diyabet, romatoid artritve myokard enfarktüsü gibi deje-neratif hastalıklarda önemli farklılıklar yaratacağı öngörülmektedir.

Embriyonik kök hücre çalışmalarında dönüm noktası olarak tanımlanabilecek 3 önemli çalışma vardır.Konuyu daha iyi kavrayabilmek için bu çalışmalara değin-mekte fayda vardır.

hükök tek sayfa

EMBRİYONİKKÖK HÜCRE

Selda Karaaslan

Embrioid Cisimcikler Destek kültüründe üreyen embriyonik hücreler

mayıs 2012 19

hüköktek sayfa

mayıs 201220

Konuyla ilgili ilk önemli gelişme Lewis j. Kleinsmith ve G.Barry Pierce tarafından yapılan çalışmadır(1964)Bu çalışmayla embriyonal karsinoma hücrelerinin pluripotent özelliğe sahip olduğu gösterilmiştir.Bunu göstermek amacıyla in vivo klonlama tekniği kullanılmıştır. Embriyonel karsinoma hücrelerinin orijini teratokarsinomlardır(germ hücreli tümör). Fare teratokarsinomasının dönüşü-münden embriyonel karsinoma hücreleri içeren embriyoid cisimcikler elde edildi. Embriyoid cisimcikler tripsinle tek hücrelere(single cell) ayrıştırıldı ve bunlar kılcal tüplerde toplandı ve bunlar fareye aktarıldı. 1700'ün üzerindeki aşılamadan 44'ünde klonal dizi elde edildi. Bu klonal dizilerin 43'ü embriyonel karsinomun 14 kadar vücut dokusuna farklılaşabilen teratokarsinomalardı. Bunların farklılaşma dereceleri, büyüme hızları farklıydı. Kalan klonal dizi sadece embriyoid karsinoma, vitellüs kesesi ve tropoblastı üretebilecek sınırlı farklılaşma kapasitesine sahipti. Bu çalışmalar embriyoid karsinomaların pluripotent özelliğini göstermiştir.

Embriyonik kök hücrelerin elde edilmesiyle ilgili ilk başarılı çalışmalar Martin Evans ve Matthew Kaufman tarafından Cambridge Üniversitesi'nde, Gail Martin tarafından San Francisco Üniversitesi'nde fare embriyonik kök hücre dizisi eldesiyle gerçekleştirilmiştir(1981). Embriyonik kök hücre dizileri farelerde blastositlerin iç hücre (inner-cell mass) kitlelerinden izole edilmişler ve fare fibroblast hücre dizileri üzerinde in-vitro şartlarda kültürlerde üretilmişlerdir. Embriyonik kök hücrelerin besleyici tabakadan ayrılması agregasyonu ve basit ya da kistik embriyoid cisimciklere farklılaşmayı uyarır. Bu aşamada uygun indükleyici ajan kullanıldığında farklı hücre hattı yolları boyunca farklılaşma mümkündür. Kullanılan kültür koşullarına bağlı olarak, fare EK hücrelerinin epidermal hücreler,tip II alveoler epitelyal hücreler, telensefalik prekürsörler, osteoblastlar ve kardiyomyositler de dahil olmak üzere değişik yönlere farklılaşabildikleri daha sonraki çalışmalarla gösterilmiştir. Ayrıca Martin Evans bu keşfiyle 2007'de Capecchi ve Smithies ile Nobel Ödülü'nü paylaşmıştır.

İkinci büyük gelişme Dr. James Thomson ve arkadaşları tarafından Wisconsinsin Üniversitesi'nde insan embriyonik kök hücre dizisinin eldesiyle gerçekleştirilmiştir. Bunun için infertilite nedeniyle in-vitro fertilizasyon için tedavi programına alınan çiftlerden geriye kalan artık embriyolar kullanılmıştır. Thomson ve arkadaşları blastosit iç hücre kitlesindeki 160 ile 180 embriyonik kök hücreyi lazer diseksiyon mikro-cerrahi yöntemiyle blastosit içinden ayırmışlar ve fare ambriyonk fibrolastları üzerinde petri kutularında kültüre koymuşlardır. Fare fibroblastları üzerinde çoğalan embriyonik kök hücreleri pasajlar yaparak ve yeni petri kutularında kültür ortamlarına ekerek uzun süre hücreleri diziler halinde koruyabilmişlerdir. Embriyonik kök hücrelerinin embriyoid cisimcikler olarak eldesi mümkün olabilmektedir. Bu ve bunu izleyen çalışmalarda fare EK hücrelerinde olduğu gibi insan EK hücrelerinde de farklılaşma olmadan kendini-yenileme becerisi ve pluripotent bir yapı olduğu gözlenmiştir. Bu özellikler rejeneratif tıbbın geleceği ve genel anlamda medikal araştırmalar için büyük ümitler vaat etmektedir.

Lewis Kleinsmith

Martin Evans

James Thomson

ök hücreler; embriyo ve post natal organiz- kardiyomiyosit olmaz. Ancak çalışmalar hücrelerin mada farklı kaynaklardan elde edilebilen, plastisite özelliği olduğunu ileri sürmektedir: yani differansiye hücreleri oluşturma ve kendini farklı bir mikroçevreye maruz kalan hücrenin K

yenileme özelliğine sahip hücrelerdir. Memelilerde çeşidini değiştirebileceği söylenir.1960'ların sadece zigot ve ilk blastosistler totipotenttir ve başında, Hadorn ve Gehringin (D.Melanogasterden extraembriyonik dokular dahil tüm organizmayı alınan disklerin, yetişkin sineğin karnına transplan-oluşturan hücrelere farklanabilirler. Omurgalıların te edildiğinde orijinal olarak genital hücre oluş-erken embriyolarında iç hücre kitlesi(inner cell turacak hücrelerin bacak ve kanat oluşturması) ve mass) 3 germ tabakasına da farklılanabilecek olan Lievre ve Douarinin (Bıldırcınlardan alınan nöral pluripotent hücrelerden oluşmuştur. Multipotent krest hücrelerinin tavukta farklı yönlendirilmesi) hücreler ise tek germ tabakasındaki hücrelere çalışmaları plastisiteyi kanıtlamaktadır.farklanabilme yeteneğine sahip hücrelerdir. Normal gelişimde, hücreler totipotent zigottan, Uzunca bir süre farklanmış hücrelerin, farklanma pluripotent İCM'ye, epiblast ve en sonunda çok süreci içerisinde kromozomlarını geri dönüşümsüz daha sınırlanmış, farklanmış hücrelere dönüşürler. bir şekilde inaktive ettikleri düşünüldü.Ancak Differansiye olmuş hücreler genelde çeşitlerini Nükleer Tranfer- Hücre Füzyonu- Transdüksiyon değiştirmezler; yani bir hepatosit bir anda Faktörlerinin Transdüksiyonu yaklaşımları ile birkaç

istisna hariç (lenfositlerdeki homolog rekombinas-yon gibi) ES hücreye dönüşmek için gereken tüm genleri barındırdığını ve inaktivasyonun kalıcı olmadığı anlaşıldı. Ve ayrıca bu 3 yaklaşım, farklanmış hücrenin hücresel hafızasının sürekli olarak kontrol halinde olduğunu ve transkripsi-yonel faktörlerin değişimine bağlı olduğunu gösteriyordu. Buradan yola çıkarak bilim adamları, somatik diferansiye hücreleri başka tip somatik hücrelere ve kök hücre benzeri hücrelere (iPS) dönüştürmüşlerdir. Bu işleme de hücrenin yeniden proglamlanması (reprogramming) diyoruz.

Nükleer Yeniden Programlamaya Genel Bakış

ve Yamanaka'dan Önce Yeniden Programlama

Cansu Ayvacıoğlu

mayıs 2012 21

hükök

DERLEME

reprogramming faktörleri olduğunu gösterir. Nükleer transfer:Sonrasında, Jeanisch ve grubu, son derece farklanmış koku ya da B hücrelerinden yeniden Somatik hücre çekirdeği, nukleusu çıkarılmış oosite programlamayla fare kolonisi üreterek, kontami-transplante edilince reprogramming gerçekleşir; nasyon iddialarına son verdi. Kuzu ve fareye ek bu hücreden köken alan hücreler pluripotent olarak köpek gibi bir çok hayvan klonlandı. Ve 10 özellik kazanır, blastosist gelişir ve somatik sene sonra hücre dondurulması deneyleriyle hücrenin aynı özelliklerini taşıyan Dolly gibi klon bir birleştirilerek iyileştirme amaçlı saklama fikrinin organizma oluşur. Bu olaydan; tam bir organizma çıkışı sağlandı. Hala SCNT 'den elde edilen kök oluşumu için gerekli tüm genlerin somatik hücrede hücreler (ntES hücreler) nükleer klonlamada daha korunduğunu, reprogramming için gerekli etkiliydi. ntES hücrelerin üretimde normal kök faktörlerin de oosit içinde aktive olduğunu anla-hücreyle eşit etkinliği vardır. ntES hücre klondan yabiliriz. NT çalışmaları nükleer reprogramming elde edildiği için çok fazla sayıda bölünmeyi mekanizmalarının anlanmasında, örneğin oosit gerektirir. Hala primatların klonları yapılmamasına içeriğindeki reprogramlama faktörlerinin nasıl rağmen, ntES hücreleri başarıyla elde edilmiştir.hücreyi dönüştürdüğünün anlaşılmasında önem-

lidir.Klonlama işlemi, reprogramming problemleri yüzünden implantasyon ve yaşama başlama 1952'de Briggs ve King tarafından kurbağalarla aşamasında birçok klonun ölümü ve anormalili yapılan çalışmada(erken blastosistten, çekirdeği kolonlar doğmasından dolayı çok efektif değildir. Bu çıkarılmış oosite transfer)genlerin kaybolmadığı ilk yüzden iyileştirmek amaçlı hastaya özel kök hücre defa gözlemlendi. Ancak daha farklılanmış yapımında reprogramming hatalarını belirlemek hücrelerle yapınca anormal doku oluşumu önem kazanıyor. Klonlanmış canlı normal görünse beliriyordu. Bu sınırlama hücre ileri farklandığında de, SCNT'de fenotipik olmayan defektler yüzünden plastisite özelliğini kaybeder şeklinde yorumlandı. embriyo gen ekspresyonunda anormallik, telomer Sonrasında Gurdon farklı bir kurbağa türüyle elongasyonu, yetişkinde obezite, bozulmuş immün yaptı.(tamamen farklanmış kurbağa bağırsak sistem ve kansere yatkınlık gibi anormallikler hücresini, başka bir kurbağada bulunan oosite barındırabiliyordı. Gelişim defektleri, epigenetik implante etti) Tür seçimi ve sonuçların hafızanın silinmesindeki yetersizlikten, DNA yorumlanması kritik noktaydı; insidans çok sekanslarındaki değişime bağlı olmayan gen düşük(insidans, kök hücreden hücre çekirdeği ekspresyonlarının kalıtımsal etkilerinden, genomik alınarak nükleer transplantasyon yapımına oranla reprogramminge bağlı problemlerden dolayı yaklaşık 30 kat daha düşüktü) olmasına rağmen-ki ortaya çıkıyordu. Bunların üstesinden gelmek için bu bazı araştırıcılar tarafından oluşan kolonilerin oosit aktivasyonu, enükleasyon zamanının kontaminasyon kökenli olduğunu düşündü-değişimi, sitokinez inhibisyonu ve nükleer rüyordu- Gurdon, sonucu, differansiyasyon enjeksiyon yerine hücre füzyonu kullanmak gibi sırasındaki olayların geri dönüşümsüz olmadığı testler yapıldı ancak bunların sadece klon şeklinde yorumladı.NT ile üretilen organizmalar, oluşturma sıklığını arttırdığı görüldü. Bu bulgular farklılaşmış hücrelerin fixe olmadığını, embriyonik yeniden programlamanın, hücre tipine, gelişim duruma yeniden dönüştürülebileceğini kanıtla-basamağına ve epigenetik faktörlere bağlı maktaydı.olduğunu gösterir. Epigenetik faktörler, gen ekspresyonunda DNA metilasyonu, histon 1997'de ilk memeli klonu olan Dolly'yi, Wilmut ve modifikasyonu ve yerdeğiştirmesi ve ATP bağımlı meslektaşları üretti. Fusogenik elektriksel atım kromatin modelleri dahil paternlerin devamlılığını kullanarak; meme hücresiyle nukleusu çıkarılmış sağlayan faktörlerdir.oositi birleştirmişlerdir.1 sene sonra Wakayama ve

meslektaşları tarafından, Dolly'e oranla çok daha nazik hücrelerle çalışılarak-bunu sağlayan piezo Hücre Füzyonu:elektrik attım sayabilen enükleasyon pipetinin kullanılmasıydı- fare klonu elde edildi. Sonrasında Hücre füzyonu 2 ya da fazla hücrenin tek bir çok sayıda labda SCNT (somatic cell nuclear birliktelikte birleşmesidir. İki hücre birleştikten transfer) deneyleri yapıldı. SCNT, sadece oosit değil sonra ya hibrit ya heterokaryon oluşturur. Birleşim fertilize yumurtayla da yapılabiliyordu ki bu bize sonrası proliferasyon görülüyorsa hibrittirler, gelişimin fertilize yumurtada aşamasında da bölünme sırasında kromozom miktarı 4n'e çıkar.

mayıs 201222

hükökderleme

Eğer karışık türlerin hibritleri oluşturulduysa kro- olduğundan, reprogramlamanın hesaplanabilir mozom kayıp ve rearanjmanıyla aneuploidi duruma geldiğini kanıtladı. İlk başarılı deneyde görülebilir, ancak aynı türlerse euploidi korunur. multinukleuslu (hücre bölünmesini önlemek ve Heterokaryonlar ise bölünmez, çok çekirdekli-kısa gen dozajını arttırmak amaçlı) ve post mitotik fare ömürlü hücreler olarak kalırlar. Kromozom kaybı kas hücreleri, füzyon partneri olarak da plastisitesi yoktur, çekirdekler ayrı ama etkileşim içindedir ; bu çok yüksek olan insan amniyon hücreleri da mixed türlerin oluşturduğu heterokaryonlar için birleştirildi. Oluşan heterokaryonlarda kas hücresi her iki çekirdeğin de gen ürünlerinin ayırt olmayan amniyotik hücreden kas genleri aktive edilebilmesini sağlar. Bu yapılar nukleus oranına edildi, insan kas proteinleri eksprese oldu. göre istenilen hücre türüne farklandırılabilir. Sonrasında fare kas sinsityasının, insan fibroblastı Heterokaryonlar ideal olarak reprogrammingin (mezoderm), hepatositi (endoderm) ve keratinositi erken moleküler evrelerini incelemede uygundur. (ektoderm) ile heterokaryonları yapıldı; her 3 germ Hibritlerde ise çoğalma nedeniyle erken gen yaprağı kökenli hücreden de kas geni aktivasyonu ekspresyonları değerlendirilemiyor. gözlendi. Devamında, kas hücresi için geçerli olan

aktivasyon diğer hücre türleri için de bulundu Füzyon çalışmaları, 1960'ların sonunda bir (eritroid ve hepatosit sprsifik genler fibroblast genomun diğerine etkisi ve bu şekilde fare kökenli heterokaryonlarda aktive oldu). Beraberce fibroblastının, hamster melanositi ya da hepatositi bu çalışmalar değişik hücre tiplerinin başka hücre ile birleşmesi sırasında melanin ve tirozin amino- tiplerince indüklenmesiyle in vivoda bile gen transferaz sentezinin gerçekleştiğini dolayısıyla ekspresyonunun değişebileceğini, hücrelerin sadece cis çalışan DNA elementlerince değil, trans geridönüşümsüz bir şekilde farklanmadıklarını çalışan represörlerce de kontrol edildiğini kanıtladı. gösterdi.Birkaç yıl sonra kanser olmayan hücreler ve tümör hücreleri füzyona uğratılınca normal hücre tümör Füzyon deneylerinde, farklı somatik hücrelerle, hücresini domine etti ve tümör süpresör embriyonik karsinoma hücreleri,ES hücreleri ve EG proteinlerin varlığının anlaşılmasını sağladı. Cell hücrelerinin hibritleri, parental embriyonik fusion ile bundan sonra memeli hücrelerinin fixe hücrelerle bir çok özelliği paylaşarak, bu füzyon olmadığı, hücrelerin içinde bulundukları durumu ürünlerinde pluripotent fenotipin baskın olduğunu korumaları için devamlı regülatör etkinin gerektiği kanıtladı. Pluripotans genlerinin aktivasyonunu eklendi. Birçok çalışmada, önceden bir hücre sağlamak için hibrit çalışmaları aneuploidinin tipinde sessiz olan gen aktive olmuştu ancak önlenmesi amacıyla aynı türler kullanılarak yapıldı. füzyonda hibritler ayırt edilemediği için kromozom Tada, Surani ve meslektaşları, dişi embriyonik germ düzenlenmesi olduğundan, çoğalabilir hibrit hücrelerini yetişkin fare timositleriyle birleştirince kullanılarak gözlenen ekspresyonun, represör oluşan tetraploid hücrelerin pluripotent olduğunu genin inaktivasyonundan mı yoksa aktivatör genin buldular.Daha sonra somatik hücrelerle kök aktivasyonundan mı değiştiği kesin değildi. Hibritte hücreleri – ki kök hücre füzyon partneri olarak germ gözlenen rearanjman problemini 1983'te HMB hücresinden farklıdır, tetraploid hücrede imprinted heterokaryonlarla çözdü. Önceden sessiz olan genler demetile değildi- birleştirince somatik genlerin heterokaryonlar oluşturarak aktive hücrelerin hibritlerinde pluripotent özellik edilebileceğini ve çekirdekler ayrı kalıp etkileşimde kazanabileceğine moleküler bir kanıt gösterdiler.


hükök derleme

(Erkek fare kök hücresiyle, dişi fare timositleri birleşince inaktif X kromozomu aktifleşiyor ve normalde kök hücrelerde bulunan 'Oct 4 GPF reporter'ı timositte aktif hale geliyor). Devamında aynı araştırma grubu alt türler arasında hibrit oluşturdu, somatik genomun ES ile hibritlerinin pluripotent halde korunduğuna dair kanıtlar(histon metillenmesi) elde ettiler. Cavan ve meslektaşları bu işi, insan somatik hücreleriyle genişlettiler. Smith ve meslektaşları da farede Nanog'un (pluripotans transkripsiyon faktörünü kodlar) reprog-rammingde oluştuğunu gözlemlediler.Bu deneyler, açıkça, proliferasyon sonrası pluripotans regülatörlerinin, farklılaşma regülatörlerine baskın olduğunu kanıtladı.

Heterokaryonlarda ise bölünme olmadan büyüme, pluripotansın kaybolacağı beklentisini doğuru-yordu. Ancak insan B hücreleri ve fare ES

koşullarda nerdeyse tüm hücre tiplerine fark-hücreleriyle yapılan deneyler, 1 gün içinde Oct4 ve lanabilen ve aynı zamanda kendilerini de Nanog'un aktive olduğunu ve promotörlerin de-yenileyebilen hücrelerdir. Bu iki hücre tipi metile olduklarını gösterdi. Pluripoteansın etkin üzerindeki çalışmalarla reprogramming oluşu-olması heterokaryon oluştururken kullanılan munu açıklayabiliriz. Embriyonik ES'nin tersine iPS hücrenin tipine-özellikle farklı türler seçimi hücreleri erken embriyoya zarar vermeyi gerektir-önemli(resim)-gen aktivasyonu ve DNA metilas-mez bu yüzden etik ve immunolojik sorunlar olan yonu gözlemleme zamanına bağlıdır. Hetero-durumlarda doku tamirinde kullanılabilir. Dahası, karyonlar reprogrammingin başlamasındaki bu hücreler hastanın kanından alındığından ilaç moleküler mekanizmaların açıklanmasında adaylarını göstermek ve insan hastalıklarını hibritlerden daha uygundurlar. Örneğin HMB ve modellemede araştırıcıya yardımcıdır.meslektaşları, heterokaryon kullanımında, AID'in

(sitozin rezidülerini deamine eden enzim) Transkripsiyon faktörleri üzerinden gidilen çalış-pluripotans reprogramming indüksiyonunda malarla somatik bir hücreyi başka bir somatik önemli bir rolü olduğunu açıkladı. Füzyon hücreye çevirmek mümkündür. İlk olarak 1987'de metodunda yeniden programlanmakta olan Gehring, hücrenin kaderinin tek bir doku spesifik hücrelerin tetraploidisi ve büyük ölçüde genomik transkripsiyon faktörü overexpresyonu ile değişe-kararsızlık riskinden ötürü hücre terapisinde bileceğini kanıtladı. D.Melanogaster larvasında kullanmakta kusurlar çıkıyor. Bu yaklaşım klinik homeotik bir genin overexpresyonu ile heat shock açıdan kullanışlı hücre üretiminde uygun değildir gen promotörünün kontrolü altında anten yerine fakat yeniden programlamanın moleküler bacak oluşumunu gösterdi. 10 sene sonra mekanizmasının aydınlatılmasında önem taşır. Bu “eyelass”in (farede Pax 6)ektopik ekspresyonu ile çalışmalar, hücre füzyonundaki engelleri çözmeyi bacakta antende ve kanatta fonksiyonel bir göz ve başarılı bir reprogramming gerçekleştirmeyi oluşumunu sağladı. Yine 1987'de Weintraub farede araştırmayı sağlar.ilk master regülatör transkripsiyon faktörünü buldu. MYOD proteini ile myojenik kökenli

Transkripsiyon Faktör Transdüksiyonu:fenotipik değişim gerçekleştirilebileceğini ispat-ladı. 1979'da John ve Taylor, fibroblast kültüründeki

Bu yaklaşım retrovirüsler kullanılarak (başka flamentöz yapıları demetile eden anti-kanser yöntemler de geliştirildi) pluripotent hücrelere özel ajanı(5-azacytidin) ile muamele ettiğinde sinsityal transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin miyotüpler oluştuğunu buldu. 2004'te Graf,farede overekspresyonu ile hücrenin pluripotent özellik C/EBP ailesi transkripsiyon faktörünün lenfositten kazanarak, kök hücre benzeri iPS hücreleri makrofaja dönüşümde rol aldığını gösterdi.Bu üretimini tanımlar. iPS hücreleri ve embriyonik kök şekilde transkripsiyon faktörlerince indüklenen hücreler oldukça benzer-ancak farklılıkları trans differansiyasyona bakarsak, memelilerde de-konusundaki çalışmalar devam etmekte-, uygun

mayıs 201224

hükökderleme

ğişimin, yakın hücre tiplerine fenotipik değişim Fbx15-iPS hücrelerin tamamlanmamış reprogram-şeklinde olduğunu, dolayısıyla transkripsiyon fak- ming gerçekleştirdiği söyleniyordu. Nanog ve Oct4 törlerinin etkisinin bağlama bağlı olduğu düşü- endojen genlerinin aktivasyonu ile tam repro-nülmelidir. gramming gerçekleştirildi. (Bu durumda faktörü

kodlayan transgenler sadece iPS hücresinin üretim Bu yaklaşımla somatik hücrelerin pluripotent aşamasında bulunur, hücreler oluştuktan sonra hücreye dönüştürülmesi düşünüldüğünde son 6 retroviral transgenler sessizleşiyor ve endojen yıla kadar mekanizmanın çok kompleks belki de genler faktörleri kodlamaya devam ediyor. Böyle-yüzlerce gen tarafından kontrol edildiği düşü- likle iPS hücrelerinin kendini yenilenmesi ve nülüyordu. Sonradan S.Yamanaka 24 tane pluri- pluripotent özelliğinin devamı sağlanıyor. Bundan potans ile ilgili gen trandüksiyonu sonucu hücrenin yola çıkarak, iPS hücrelerinin neredeyse tamamlan-pluripotent olacağı hipotezinden yola çıkarak, mış bir reprogramming geçirdiği önce sürülür.)retroviral vektörlerle ES den elde edilen 24 genlik mini komplementer DNA yı, fare embriyonik ve İps hücrelerinin izolasyonu, retrovirüs ile onkogen yetişkin hücrelerine taşıdı(2006) ve Fbx 15 aktif(ES transdüksiyonuna ve madde bağımlı Fbx15,Oct4 hücrelerine özel bir gen), büyüme özellikleri,gen veya Nanog aktivasyonu seçilimine dayanıyordu. ekspresyon özellikleri ES hücreleriyle aynı Bu iki deneysel gereklilik sırasında in vitroda fareler klonlar(iPS hücreleri) elde etti. Bu klonlar fare içine üzerinde yapılan deneyler kanserle sonuçlanıyor-enjekte edildiğinde pluripotanslarını belli edecek du. Tehlike ilerleyen çalışmalarla aşıldı.Örneğin, şekilde teratom oluşturabiliyorlardı ancak kimerik 2007'de fare ve insanda iPS hücrelerinin cMYC'nin canlılar oluşturamıyorlardı. Faktörlerin katkısı over ekspresyonu olmadan da üretilebileceğini belirlenmek istendiğinde, -Oct4,SOX2,KFL4 ve (ancak 4lü kombinasyon kadar efektif bir sonuç cMYC - 4 faktörün hücreyi pluripotent yaptığı alınmadan ve ileri aşamaların soru işaretleri devam anlaşıldı. (Oct4 ve SOX2, hücrenin pluripotent ederek) kanıtlandı.Bu durumda hangi faktörler olarak devamlılığını sağlar ve diğer 2 faktöre oranla gerekiyordu? C-myc nin etkileri olduğu aşikardı etkileri daha belirgin ve vazgeçilmezdir. cMYC; bir ancak çıkarılabilirdi de.Şimdi araştırmacılar farklı proto-oncogendir.Hücrede proliferasyon, büyüme, faktörler ve belirli küçük moleküllerle değiştirile-farklılanma ve apopitosisle ilgili genleri kontrol bileceği konusunda çalışmalar yapıyorlar ancak eder. Aşırı miktarı, tümör oluşumu ve kanserle anahtar faktörler-Oct4 gibi- çıkarılayamayacağı ilgilidir. Klf-4;proliferasyon, differansiyasyon ve kesin bulgu olarak korunuyordu. Ayrıca reprogram-hücre siklusunu kontrol eder. Olay şu şekilde mingde başka faktörlerin de önemi örneğin, gerçekleşir: Transgenler hücrenin genomuna hipoksik çevrenin ve vitC'nin verimi arttırdığını entegre oluyor, böylece transgenlerin uzun süre kanıtlandı.Tümör supresor protein p53 ile sinyal ekspresyonu sağlanıyor. Sonra bu genlerden yolağı bozulduğunda yine verim artıyordu. sentezlenen 4 transkripsiyon faktörü,DNA üzerine MicroRNA'ların da reprogrammingde pozitif bağlanıyor ve normalde diferansiye olmuş hücrede etkileri tanımlandı. Daha da ileri çalışmalarda iPS eksprese olmayan genlerin transkripsiyonunu hastalıklar doku oluşumları üzerine gidildi. Günü-kontrol ediyor, bir transkripsiyon kaskadını indük- müzde de çalışmaları devam etmekte.lüyor. Bir periyod sonrası fibroblastın gen ekspres-yon profili değişiyor ve pluripotent kök hücrede 3'lü değerlendirme:eksprese olan genleri eksprese etmeye başlıyor. 3 metodun birbiriyle farklılıkları belirgindir ancak Aynı zamanda yeniden programlanmış hücreler sonuçları sinerjisttir. Bunları karşılaştırmak bazı morfolojik değişiklikler geçiriyor.Embriyonik kök mekanizmaları ve genel özellikleri (pluripotans gen hücrelerin gelişimi gibi sıkıca toplanmış koloniler promotörlerinin demetilasyonu, Oct4 ve Nanog'un şeklinde büyüyor. Bu kolonilerin oluşumu reprog- aktivasyonu ve ES hücre spesifik gen dizilimi gibi) rammingin gerçekleştiğinin kanıtıdır.) Takip eden ortaya çıkarır.Her durumda, regülatör dengesi çalışmalarla 1 yıl içinde insan iPS hücreleri de elde pluripotansı teşvik ediyorsa epigenom değişir ve edildi(2007). pluripotent özelliği sağlayan proteinlerin regülas-

yonu olur. Bunu pluripotent durumun korunması 2006'daki ilk deneyde Fbx15 aktif hücrelerin için feed back loopları ve pluripotansın pozitif ve pluripotent durumlarını korumak için viral negatif transkripsiyon regülatörlerinin(oct4 gibi) transdüksiyon ile Oct4 ve Sox2 ekspresyonunun otoregülasyonu takip eder. Yine her 3 durumda bazı devamlılığı şarttı, çünkü endojen Oct4 ve Nanog somatik hücre tipleri diğerlerinden daha kolay genlerinin ekspresyonu sağlanamamıştı.Bu yüzden reprogramlanır ve hepsi için DNA demetilasyonu


hükök derleme

şarttır. Teknik açıdan bazı farklar gösterirler (pluri- reprogrammingin pratik alanda kullanımına katkı potans geninin indüksiyonunun etkinliği, reprog- sağlayacak ve böylece in vitroda hastalıklar ramming için gereken zaman gibi) Farkları, reprog- modellenebilecek, terapatik ajanların araştırılması ramming mekanizmalarının açıklanması ve tedavi sağlanabilecek. Şimdiye kadar pek çok araştırmacı amaçlı ele alınabilir. Nükleer transfer, hızlı reprog- pluripotent hücreye dönüşümü araştırdı, yakın ramming, embriyonik gelişimin prensiplerinin zamanda ise bazı araştırmacılar daha sınırlanmış aydınlatılması ve reprodüktif biyolojide ES hücre olan multipotent hücreye dönüşüme odaklandı. verimini sağlamak için uygundur. Cell fusion, Reprogramming çalışmaları hızla devam edecek.reprogrammingin başlangıç nükleer mekaniz-masının aydınlatılmasında uygundur ama tedavi amaçlı hücre üretiminde sınıfta kalır. Pratik amaç için (hastalıkların mekanizmalarının , ilaç çalışma-ları, hücre terapisinde) temini de rahat olan traskripsiyon faktör transdüksiyonu kullanılır. Baş-ka bir farkları da reprogramming sırasında altlarında yatan mekanizmalardır ve geliştirilmeye devam edilmektedir. Örneğin, iPS hücrelerinin oluşumu için bir pasif DNA de-metilasyon mekanizması önerildi. Bu mekanizmada hücreler yayıldıkça de-metillenmeye devam ediyor, DNA replikasyonu sonrası metilasyon devamlılığını koruyamıyor. Buna karşın AID ile düzenlenilen ve replikasyondan bağımsız aktif de-metilasyon mekanizmasında; nuclear transfer sonrası heterokaryonlardaki gibi hücre bölünmesi ve DNA replikasyonu varlığında pluripotans genleri aktive oluyor ve promotörleri de-metilleniyor. Gelecek çalışmalar reprogramming mekanizmalarının ve hücre farklılaşmasının açıklamasının geliştirecek,

Genel bakış: Reprogramming hikayesi renkli ve yaklaşık 50 yıllık genç bir süreçtir. Aşağıdaki, tabloda yukarıda anlatılanların toplu kronolojik sırası gösterilmiştir

*Ayrıca 2008'de Parkinson ve ALS hastalığı araştırmalara dahil edilmiş.2009'da virüsler yerine DNA kasetlerinin ve sonrasında, genlerin taşınımı yerine Yamanaka faktörleri ile kodlanmış proteinlerin kullanılabileceği bulunmuş.iPS hücreleri fare yapmış ve p53 ün reprogrammingdeki etkisi bulunmuş.

mayıs 201226

hükökderleme

Referanslar:

1. Shinya Yamanaka and Helen M. Blau Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Nature. 2010 June 10; 465(7299): 704–712.

2. Jaenisch R, Hochedlinger K, Eggan K. Nuclear cloning, epigenetic reprogramming and cellular differentiation. Novartis Found Symp. 2005;265:107-18; discussion 118-28.

3. Rideout WM 3rd, Eggan K, Jaenisch R.Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome.Science. 2001 Aug 10;293(5532):1093-8.

4.Yang X, et al. Nuclear reprogramming of cloned embryos and its implications for therapeutic cloning.Nature Genet 2007;39:295–302. [PubMed: 17325680]

5. Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W.Epigenetic reprogramming in mammals.Hum Mol Genet. 2005 Apr 15;14 Spec No 1:R47-58.

6. Blau HM, et al. Plasticity of the differentiated state. Science 1985;230:758–766. [PubMed: 2414846]

7.Blau HM, Baltimore D. Differentiation requires continuous regulation. J. Cell Biol 1991;112:781–783. [PubMed: 1999456]

8. Rudolf Jaenisch and Richard Young Stem Cells, the Molecular Circuitry of Pluripotency and Nuclear Reprogrammingj.cell.567-582

9. Rideout WM, Eggan K, Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001;293:1093–1098. [PubMed: 11498580]

10. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663–676.


hükök derleme

hükök

MAKALE

Yamanaka'nın Hayatı ve Yeniden Programlama

Yamanaka'nın pluripotent hücreler konusundaki çalışmalarından önce difere olmuş hücrelerin embriyonik kök hücre füzyonu ya da nükleer içerik transferiyle embriyo- benzeri bir duruma getirilebilecekleri biliniyordu. Fakat hangi faktörlerin bu durumu gerçekleştirebilecekleri konusunda pek fazla bilgi yoktu.

Elif Haznedaroğlu

Shinya Yamanaka, Kobe Üniversitesinden 1987'de MD ünvanını, Osaka City Üniversitesinden 1993'de PhD'sini aldı. Osaka hastanesinde ortopedik cerrahi asistanlığından sonra San Francisco'daki Gladstone Enstitüsünde kardiyovasküler hastalıklar konusunda uzmanlaştı. Amerika dönüşünde “Post America Depression” diye tabir ettiği bir durumla karşı karşıyaydı, çünkü Japonya'da imkânları çok kısıtlıydı. Bilimde çığır açan çalışmasında farelerini kendi almak durumundaydı. 1999–2003 arasında Nara Teknoloji Enstitüsünde yardımcı doçent olarak, 2003–2010 arasında profesör olarak çalıştı. Şu anda Kyoto Üniversitesinde “iPS Hücre Araştırma ve Uygulama Merkezi” direktörlüğünü yapmakta. 2006'da fare f ibroblastları, 2007'de insan fibroblastları üzerinde yaptığı çalışmalar bilim dünyasına iPS hücrelerini, ona ise birçok prestijli ödül ve saygınlık kazandırdı.

amanaka, öncelikle 2006'da fareler üzerinde yaptığı çalışmayla fare embriyonik veya ye-tişkin fibroblastlarından pluripotent hücre in-Y

düksiyonunu gösterdi, 4 faktör ile: Oct3/4, Sox2, c-Myc ve Klf4. (embriyonik kök hücre kültür koşul-larında) Induced pluripotent cell (iPS ) ismi konan bu hücreler embriyonik kök hücrelerin morfolojisini ve büyüme özelliklerini gösterirken embriyonik kök hücre marker genlerini de taşıyorlar.

Memelinin iç hücre blastosistinden elde edilen embriyonik kök hücreler (ESc) pluripotentliği korurken süresiz olarak gelişerek üç germ yaprağına da farklanabilme özelliğine sahiptiler. Yamanaka bu çalışmasında

mayıs 201228

hükök makale

embriyonik kök hücrelerin oluşmasını sağlayan uygulandı. Bu yöntem ile Ecat1 dışındaki marker faktörlerin somatik hücrelerde de pluripotentliği genlerinin çoğunu taşıdığı anlaşıldı. iPS-MEF4 ve sağlayıp sağlayamadığını anlamak için yola iPS-MEF10 hücrelerinin embriyonik kök hücrelere çıkmıştır. benzer olduğu, ama aynı olmadığı ortaya kondu bu

deneylerle.Oct3/4, Sox2 ve Nanog erken embriyolarda ve embriyonik kök hücrelerde pluripotentliği sağlayan iPS-MEF3 klonlarında Ecat1, Esg1 ve Sox2 genleri transkripsiyon faktörlerindendir. Stat3, E-Ras, c- aktive değil, Nanog ise iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'de myc, Klf4 ve b-catenin de embriyonik kök olduğundan daha az olmak üzere indüklenmiş. hücrelerin hızlı proliferasyonunu ve fenotiplerini Oct3/4 bazı iPS-MEF3 klonlarında zayıf aktive korumalarını sağlarlar. Yamanaka bu çalışmasında olmuş, bazılarında ise hiç aktive olmamış. E-Ras ve bu faktörlerin somatik hücrelerde pluripotentlik Fgf4 ise iPS-MEF3'de iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'a indüklemelerini araştırdı. 24 gen bu hipoteze göre göre daha fazla aktive olmuş. Bu bilgiler iPS-MEF3 aday faktörler olarak seçildi . hücrelerinin iPS-MEF4 ve iPS-MEF10'dan farklı

olduğunu gösteriyor.Bu 24 aday geni geliştirmek için bir assay sistemi geliştirildi, Fbx15 geni üzerinden. Faktörler için Embriyonik kök hücreler, iPS hücreleri ve Fbx15 teker teker koloniler yetiştirildi, ama Fbx15 geninin geni aktif olan fare embriyonik fibroblastlarının aktive olduğu hiçbir koloni gözlenmedi. 24 faktörün global gen ekspresyon profilleri DNA microarraylari tümünün kullanıldığı kolonilerde ise bazı klonlarda kullanılarak karşılaştırıldı, bazı genlerin ise hem iPS embriyonik kök hücrelere benzer morfoloji hücrelerinde hem embriyonik kök hücrelerde daha gözlendi, yuvarlak hücre biçimi, büyük çekirdekçik, sık upregüle olduğu tanındı. Bazı genler ise az sitoplâzma. Bölünme hızları da embriyonik kök embriyonik kök hücrelerde daha fazla upregüle hücrelerle benzerdi. Bu hücrelere iPS -MEF24 olmuştu. Bu bilgiler iPS hücrelerinin embriyonik denildi, “fare embriyonik fibroblastlarından 24 kök hücrelere benzer olduğunu, ama aynı faktörle indüklenen pluripotent kök hücreler”. Bu olmadığını doğrular nitelikte.klonlar bazı embriyonik kök hücre markerlarını fenotipte gösteriyorlardı. Bu markerlardan bazıları Teratoma oluşumunda iPS hücrelerinin pluri-demetile iken ( Fbx15, Nanog ) Oct3/4 metile potentlik özellikleri araştırıldı. “Nude” farelere deri durumdaydı. Bu bilgiler 24 faktörün bir çeşit altı enjeksiyon sonucunda 5 iPS-MEF10, 3 iPS-kombinasyonunun MEF kültüründe embriyonik MEF4, 1 iPS-MEF4wt ve 6 iPS-MEF3 klonunda kök hücre markerlarını eksprese ettiğini gösteri- tümor elde edildi. Histolojik gözlem sonucunda 2 yordu. iPS-MEF10 klonu, 2 iPS-MEF4 klonu ve iPS-

MEF4wt-4 klonunun üç germ yaprağına da Bundan sonra bu 24 aday arasından hangilerinin farklandığı tespit edildi, nöral hücreler, kıkırdak kritik olduğunu anlamak için bazı faktörler dokusu ve prizmatik epitel dahil. iPS-MEF10-6 ve çekilerek deneyler yapıldı. Bu deneyler sonucunda iPS-MEF10-1 dışındaki iPS-MEF10 kolonilerinde ve 24 faktör kullanıldığında oluşandan daha çok ESc iPS-MEF4-10 kolonisinde ise farklanma gözlen-benzeri koloni üreten 10 faktör belirlendi. Bu 10 medi. Bu bilgiler çoğu iPS-MEF4 ve iPS-MEF10 faktör arasında da aynı yöntem uygulanarak fare kolonisinin, ama hepsinin değil, pluripotentlik embriyonik fibroblastlarından iPS indüklemeyi gösterdiğini gösteriyor. Tersine, iPS-MEF3 koloni-sağlayan 4 transkripsiyon faktörü belirlendi: lerinin birçoğu difere olmadan kaldı. Bu da her ne Oct3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc. kadar Oct3/4, c-Myc ve Klf4 embriyonik hücre

markerlarını indüklüyor olsa da, pluripotentlik Hiçbir iki faktör kombinasyonu Fbx15 lokusu aktif gösteremediklerini ifade ediyor. kolonileri oluşturamadı. Üç faktör kombinasyonları ise ya üretilemedi ya da embriyonik kök hücre iPS-MEF10, iPS-MEF4 ve iPS-MEF3 hücreleri plastik morfoloji göstermediler. Sadece Oct3/4, Klf4, c- kültür ortamında embriyonik cisimler oluşturdular, Myc kombinasyonu ile Fbx15 lokusu aktif koloniler iPS-MEF10 ve iPS-MEF4 hücreleri ortamın tabanına oluştu, ama bu koloniler morfoloji olarak iPS-MEF4 bağlanarak farklanma gösterdiler, 3 günün ve iPS-MEF10'dan farklılık gösterdiler. sonunda immün boyama hücrelerde düz kas aktini

(mezoderm markerı) , a-fetoprotein (endoderm iPS hücrelerinde ES hücre markerlarının eksprese olup olmadığını araştırmak için RT-PCR yöntemi

mayıs 2012 29

markerı) için pozitiflik tespit etti. iPS-MEF3 yandan, Klf4 p21'i aktive ederek hücre proliferas-hücreleri ise gelatin kaplı ortamda bile diferasyona yonunu baskılıyor. Klf4ün bu fonksiyonu p21'i uğramadan kaldılar. Bu bilgiler iPS-MEF10 ve iPS- baskılayan c-Myc tarafından inhibe edilebilir. Klf4 MEF4 hücrelerinin pluripotentliği ile iPS-MEF3 ve c-Myc'in dengesi bu yüzden iPS hücrelerinin olu-hücrelerinin nullipotentliğini in vitro olarak şumunda önemli olabilir.doğrular nitelikteydi.

Çalışmanın akılda bıraktığı bir soru iPS hücrelerin Bundan sonra seçilen dört faktör dört adet 7 kökeniydi. Yapılan çalışmada multipotent doku kök haftalık erkek Fbx15 aktif farenin kuyruk dibi hücrelerin iPS hücrelerinin orijini olmadığı anlaşıl-fibroblastlarına sunuldu. 3 koloni elde edildi, dı.hepsinden iPS hücresi elde edilebildi. Ayrıca bu faktörler 12 haftalık dişi Fbx15 aktif farenin kuyruk iPS hücrelerinin dört faktör içeren retroviral dibi fibroblastlarına da sunuldu. Elde edilen bilgiler vektörlerin varlığında in vitro ve in vivo olarak yetişkin fare fibroblast kültüründen de seçilen 4 farklanabildiği anlaşıldı bu çalışmayla. Oct 3/4 ve faktörle pluripotent hücre indüklenebileceğini Sox2 proteinlerinin miktarlarının in vitro farklanma gösterdi. sırasında oldukça azaldığı fark edildi. Ayrıca iPS

hücrelerinin transgenlerin ve Nanog'un protein Bundan sonra bu 4 faktörün ve diğerlerinin iPS seviyelerini azaltan bir mekanizmaya sahip olduğu hücrelerindeki ekspresyonu karakterize edildi. anlaşıldı. Bu mekanizma farklanırken de gelişebilir.Gerçek zamanlı PCR Oct3/4 ve Sox2'nin endojen ekspresyonunun iPS hücrelerinde embriyonik kök Bu çalışmanın beklenmeyen bir verisi de Fgf4 ve hücrelere göre daha düşük olduğunu doğruladı. iPS Fbx15'in Oct3/4, Klf4 ve c-Myc kombinasyonu ile hücrelerinde Nanog ve E-Ras proteinleri tespit verimli aktivasyonu oldu, çünkü bu genlerin Oct3/4 edildi, ama embriyonik kök hücrelere göre daha ve Sox2 tarafından regüle edildiği gösterilmişti düşük oranda. p53 seviyeleri de iPS hücrelerinde önceki çalışmalarda. Ayrıca Nanog'un iPS fare embriyonik fibroblastlarına göre daha düşük, hücrelerinin indüksiyonu ve korunmasında vazgeçi-embriyonik kök hücrelere eşitti. Southern Blot lebilir olması da şaşırtıcı oldu.analizi her klonun kendine özel bir transgenik integrasyon şekli olduğunu gösterdi. iPS hücreleri- 2006'daki bu çığır açan çalışmadan sonra akıllarda nin kültürde feeder hücreleri olmayınca diferensiye kalan en önemli soru tabi ki insanlarda da olmamış şekilde kalamadıkları anlaşıldı. Bu ve farklı diferensiye olmuş hücrelerin faktörlerle pluri-gen ekspresyonu patternleri iPS hücrelerinde potent safhaya gelip gelemeyecekleri idi. Böyle bir önceden kalan ES hücrelerinin kontaminasyonu buluş hastaya ya da hastalığa yönelik spesifik kök ihtimalini elimine etti. iPS hücrelerinin subklonları hücreler yaratılmasına olanak verecekti. Yamanaka alkaline phospatase enzimi için pozitiflerdi ve in yaptığı çalışmayla bunun olası olduğunu gösterdi: vitro olarak üç germ yaprağına farklanabiliyorlardı, yetişkin insan dermal fibroblastlarından dört bu da klonal doğalarını doğruluyordu. faktörle (Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc) indüklenmiş

pluripotent kök hücre (iPS) gelişimini ortaya koydu. Oct3/4,Sox2 ve Nanog önceki çalışmalarda pluripotentliği korumak için kritik faktörler olarak Embriyonik kök hücrelerin özellikli tedavi için elde gösterilmişti, ancak bu üçü arasından Oct3/4 ve edilmeleri zor olduğundan iPS hücrelerinin bu Sox2'nin temel olduğu anlaşıldı bu çalışmada, tedaviler için kullanılmaları ve elde edilmeleri şaşırtıcı olarak Nanog vazgeçilebilirdi. Buna ek önemliydi. Daha önce yapılan çalışmada farelerden olarak c-Myc ve Klf4 de esansiyel faktörlerdendi. C- embriyonik fibroblast ve kuyruk-dibi fibroblast-Myc proteininin proliferasyonu ve transformas- larından dört faktör ile iPS hücrelerinin elde edildiği yonu geliştiren birçok downstream hedefinin gösterilmişti. Bu çalışmada ise yetişkin insan olduğu bilinmekteydi, bunlardan birçoğunun iPS somatik hücrelerinden retroviral transdüksiyon ve hücrelerinin gelişiminde rolü olduğu düşünül- kültür koşullarında iPS hücrelerinin gelişmesi mekte. Klf4'ün p53ü direk baskıladığı biliniyordu, araştırıldı. p53 proteininin de Nanog'u baskıladığı bilinmek-teydi. Bu yüzden Klf4'ün bu dönüşümdeki rolünün Yetişkin insan dermal fibroblastlarında (HDF) trans-Nanog'un ve diğer ES-spesifik genlerin aktivasyonu düksiyon metodları optimize edildi, sonrasında olabileceği düşünülüyor. Başka bir teoriye göre de insan Oct3/4, Sox2, Klf4 ve c-Myc içeren Klf4 Myc-indüklenen apoptosu önlemesi. Öbür retrovirusler hazırlanan HDF'ye verildi. HDF 36 yaş-

hükökmakale

mayıs 201230

hükök makale

ında beyaz bir bayanın yüz dermisinden elde doderm) için pozitiflik tespit edildi. RT-PCR ile de edilmişti. Transdüksiyondan 6 gün sonra feeder teyit edildi. Bu bilgiler iPS hücrelerinin in vitro hücrelerin bulunduğu kültür kabına ekildi. Yaklaşık olarak üç germ yaprağına da farklanabildiklerini iki hafta sonra morfolojik olarak insan embriyonik gösteriyor. Ayrıca PA6 hücreleriyle co-culture kök hücrelerine (hES) benzemeyen granüllü yapıldığında iPS hücrelerinin dopaminerjik koloniler belirdi. 25. gün civarında düz, hES hücre nöronlar dâhil nöronal hücrelere farklanabildikleri kolonilerini andıran koloniler gözlendi. 30.günde gösterildi. İn vitro olarak kardiyak myositlerine de oluşan hES-benzeri koloniler toplandı ve disagrege farklanabildikleri başka bir deneyde ortaya kondu. edildi. Bu kolonilerin izole edilmesi zordu çünkü granüllü hücreler çok yoğundu. hES-benzeri İn vivo pluripotentliği test etmek için insan iPS hücreler feeder hücrelerin üzerinde artarak sıkıca hücreleri immun eksikliği olan farelerin deri altına paketlenmiş ve düz koloniler oluşturdular, bütün enjekte edildi. Enjeksiyondan dokuz hafta sonra hücreler insan embriyonik kök hücrelere benzer tümör formasyonu gözlendi. Histolojik araştırma morfoloji gösteriyorlardı, büyük çekirdek ve az tümörün bağırsak benzeri epitelyal doku sitoplâzma ile. Ayrıca bazı hücrelerde hES (endoderm), çizgili kas(mezoderm), kıkırdak hücrelerinde olduğu gibi kendiliğinden diferan- (mezoderm), nöral doku(ektoderm) ve keratin siyasyon gözlendi. Bu şekilde elde edilen hücrelere içeren epidermal doku (ektoderm) taşıdığı fark insan iPS hücreleri ismi konuldu. edildi.

Genel olarak insan iPS hücreleri stage-spesifik İnsan iPS hücrelerinin genomik DNA'larında yapılan embriyonik antijen ifade etmediler, buna karşılık PCR dört retrovirüsün integrasyonunu gösterdi. 16 hES hücre-spesifik yüzey antijenlerini eksperese kısa tandem tekrar da insan iPS klonları ile parental ettiler. Ayrıca RT-PCR yöntemi birçok diferensiye HDF arasında tamamıyla eşleşti. Ayrıca kromozo-olmamış ES hücre marker genini eksprese mal G–band analizi iPS hücrelerinin normal bir ettiklerini gösterdi. Western-blot yöntemi de 46XX karyotipine sahip olduğunu gösterdi, bu da OCT3/4, SOX2, NANOG, SALL4, E-CADHERIN ve insan iPS hücrelerinin HDF'den elde edildiğini, hTERT protein seviyelerinin iPS hücreleri ile insan çapraz kontaminasyona uğramadığını gösteriyor. ES hücrelerinde benzer olduğunu gösterdi. DNA microarray analizleri de iki tip hücre arasındaki iPS hücreleri fibroblastların yanında insan global gen ekspresyonu patternlerinin benzer fibroblast-benzeri synoviosit (HFLS)'lerden de elde olduğunu ama aynı olmadığını gösterdi. edildi. Bu hücreler 69 yaşında beyaz bir erkekten

alındı ve HDF'den elde edilen iPS hücreleri gibi Bisülfit genomik sıralama analizleri Oct3/4, Rex1 ve embriyonik kök hücre kolonilerine benzeyen Nanog gibi pluripotentlik ile ilgili genlerin fazlasıyla koloniler oluştu, bunlar da üç germ yaprağına unmetile olduğunu ortaya çıkardı, yani bu farklanabiliyorlardı. promotorlar insan iPS hücrelerinde aktif.

Sonuç olarak bu çalışmada iPS hücrelerinin yetişkin İnsan iPS hücreleri yüksek telomeraz aktivitesi insan dermis fibroblastından ve başka somatik gösterdiler. Eksponansiyel olarak en azından 4 ay hücrelerden Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc faktörlerinin boyunca prolifere oldular. Eşleşme zamanları da retroviral transdüksiyonu ile elde edilebildiği hES hücrelerinin eşleşme zamanlarına eşit ortaya kondu. Bu hücreler morfoloji, proliferasyon, bulundu. feeder bağlılığı, yüzey markerları, gen ekspresyonu,

promotor ve telomeraz aktiviteleri, in vitro İnsan iPS hücrelerinin in vitro olarak farklanma diferensiasyonları ve teratoma formasyonu kabiliyetleri test edildi, 8 gün sonra kültürde açısından insan embriyonik kök hücrelerine embriyoid yapılar oluşturdular. Bu top-şekilli benziyorlardı. Farelerde ve insanlarda iPS hücre yapılar 8 gün boyunca jelatin kaplı plakalara oluşumu için aynı faktörler kullanılmasına rağmen transfer edilip orada geliştirildi. Bu hücreler çeşitli pluripotentliği korumak için kullanılan ekstrinsik morfolojiler gösterdiler. İmmunositokimyasal faktörler ve sinyaller farklıydı. Bu çalışma hasta ve yöntemler ile hücrelerde bIII-tubulin (ektoderm hastalık-spesifik pluripotent kök hücreler için yeni marker), glial fibrillary acidic protein (GFAP, bir sayfa açtı. Retroviral integrasyonun riskleriyle ektoderm), düz kas aktini (a-SMA, mezoderm), bile insan iPS hücreleri hastalık mekanizmalarını desmin (mezoderm), a-fetoprotein (AFP, anlayabilmek, ilaç geliştirmek ve toksikoloji için endoderm) ve vimentin (mezoderm ve parietalen- kullanışlı olacağının işaretini verdi. Güvenlik

mayıs 2012 31

konuları da aşıldıktan sonra insan iPS hücreleri KAYNAKLARrejeneratif tıp için kullanılabilir ve embriyonik kök

Takahashi (2007) Induction of Pluripotent Stem Cells hücrelerin yerini alabilir. from Adult Human Fibroblasts by DefinedFactors. Cell.

Yamanaka, S. & Takahashi, K. (2006) [Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblast cultures]. Tanpakushitsu Kakusan Koso, 51, 2346-2351.

hükökmakale

mayıs 201232

PS hücreleri tipik olarak olgun kök hücrelerden kaldırmaktalar. Bu nedenle son yıllarda yapılan elde edildiği için embriyonik kök hücrelerin çalışmaların çoğu vücut hücrelerinden üretilen İPS ikullanımını kısıtlayan bazı etik tartışmalarını adı verilen bu kök hücrelerin oluşturulmasıyla

önler. Başarılı bir şekilde vücut hücrelerinden ilgilenmekte. Aynı zamanda bu kök hücreler nadir yeniden programlanan pluripotent nitelikteki bir hastalığı veya mutasyonu olan kişilerden de hücreler hastaya ve hastalığa özgü kök hücre üretilebilir. Böylece bu hastalıkları yapay hücre üretimine olanak sağlayabilir. Üretilen bu kök ortamı olarak adlandırdığımız in vitro koşullarda da hücreler kısaca İPS(induced pluripotent stem cell) inceleyebiliriz. Daha sonra bu hastalıklar bu yapay olarak adlandırılır. İnsan İPS hücreleri morfolojileri, ortamlarda anlamlandırılıp,tedavi geliştirilebilir. çoğalmaları, yüzey antijenleri, gen ekspresyonları Çeşitli ilaçların etkisi araştırılabilir.ve telomeraz aktiviteleri bakımından embriyonik kök hücrelerle benzerlik gösterirler. Aynı zamanda Gelecekte iPS hücreleriyle yapılması öngörülen bu hücreler de embriyonik kök hücrelerdeki gibi temel araştırmalar:teratom hücrelerine de dönüşebilmekte. Ancak yapılan çalışmalarda yeniden programlama iPS kolonilerinin genel olarak paylaşılımı yapılırsa, Yamanaka faktörleriyle, retrovirüslerle gerçekleş- bu heyecan verici alandaki gelişim kolaylaşabilir. Bir tirilmiştir. İPS kolonisinin özellikle hangi özel çalışma için

uygun olduğunu tahmin etmek imkansızdır. Yani bu Memeli blastosistinin iç hücre kitlesinden elde hücreleri tedavi edici hücrelere mi dönüştürmeliyiz edilen embriyonik kök hücreler hem pluripotent yoksa ilaçlara verilen cevapları mı incelemeliyiz olma özelliğini korur hem de sınırsız olarak bilemeyiz. Gelecekte araştırmacıların temel bölünme potansiyeline sahiptir. Bu eşsiz hücrelerin deneyleri klasik yöntemlerle, İPS ve türevleriyle ,hastalıkların mekanizmalarını çözmekte,etkili ve gerçekleştirmek istemeleri olasıdır. Genom dizi güvenli ilaçları tespit etmemizde,çeşitli hasta- taramasıyla hastalıkların patogenezi ve tedavisi lıkların (omirilik yaralanması ve diabet gibi) ve hakkında yeni hedefler belirlemede yeni anlayışlar yaralanmaları olan hastaların tedavisinde kullanıla- ortaya çıkabilir.bilecek olması herkesi heycanlandırmaya başla-mıştı ancak çeşitli etik sorunlarına bağlı olarak İnsan kök hücrelerini insan olamayan canlıların bahsettiklerimin uygulanması teorik olarak müm- beyinlerine enjekte ederek Parkinson,Alzheimer ve kün görülse de hayata geçirilememiştir. Çünkü bir inme gibi hastalıklardaki yeni geliştirilen terapi-insan embriyosunun embiyonik kök hücre(ES) lerin klinik öncesi testleri bu canlılarda uygula-kaynağı olarak kullanılması etik olarak büyük bir nabilir.sorundur. Aynı zamanda hastaya veya hastalığa özgü embriyonik kök hücre üretilmesi çok zordur. İPS hücreleriyle gelecekte yapılabilecek hassas Vücut hücrelerinin indüklenip,yeniden program- araşırmalar:lanmasıyla oluşan ploripotent nitelikteki hücrelerin bu sorunların üstesinden gelebileceği düşünül- İPS hücreleriyle yapılabilecek transplantasyon ve mektedir. Basit olarak etik sorununu ortadan reproductive araştırmaların gelecekte tartışmalı

hükök

MAKALE

Yeniden Programlamanın Işığındaki Gelişmeler

Ece Hocaoğlu

mayıs 2012 33

olabileceği öngörülmekte. Çünkü bu araştırmaları yapmak için vücut hücresi vericilerinin izni gerekmekte ve bu vericilerin de buna karşı çıkacağı düşünül-mekte. Şu anki tekniklerle İPS hücrelerinin insanlara nakli ola-naksız çünkü ploripotentliği ortaya çıkarmak için hücrenin başka bir DNA'yla etkileşime geçmesi gerekli. Ancak genel olarak beklenen dışardan bir DNAyla etkileşime girmeden önümüzdeki birkaç yıl içerisinde ploripotentliğin ortaya çıkarı-labileceği şeklinde. Bu şekilde insanlara transplantasyonu müm-kün olacağı düşünülüyor. İlk üretilen İPS hücreleri 24 adet

liklere maruz kalabilirler. Örneğin, küçük plasmid-faktörle oluşturulmuştu. Ancak daha sonra yapılan lerle etkileşime girebilirler ya da kimyasallarla çalışmalarla 4 faktörle de bu hücrelerin uyarılmış mutasyonlar gerçekleşebilir.Bu nedenle oluşturabildiğini kanıtlamıştır. Bilim adamların de bu değişiklikleri saptamak için, İPS hücrelerinin ortak görüşü ne kadar az faktör kullanılırsa o kadar tam olarak dizi analizi yapılmalıdır. gerçek embriyonik kök hücre gibi hücreler

üretilebileceği şeklinde. İleriki çalışmalar “İPS İnsanlara Nakli:hücreleri sadece OCT ¾ adı verilen ve pluripotentlik

için büyük önemi saptanan bu faktörle ürete-Organ naklinde olduğu gibi vücut hücrelerini veren bilebilir mi?” sorusunu öne çıkarmakta.insanların bu araştırmalar için izni gerekmektedir. Bazı kişiler diğer insanların hayatını kurtarmak için Viral entegrasyon genellikle endojen genlerin böyle bir çalışmaya istekli bir şekilde izin verirken içinde yer alır ve gen aktivasyonuna neden olabilir. bazıları ise diğer insanların büyüyen bir parçası Bu nedenle bu şekilde üretilen hücreler, retrovirüs olamaktan çekinip izin vermek istemeyebilir.ve lentivirüslerle üretilen hücrelere göre daha az

hücre güvenliğini sağlamakta. Yapılan iki çalışma Dokuyu alırken bu izni almamız gerekmekte. Bu viral entegrasyon olmadan İPSlerin üretilebile-dokuyu İPS hücrelerine dönüştürüp organ elde ceğini göstermiştir. Son yapılan çalışmalarda etmemiz yıllar alabilir. Aynı zamanda, bu zaman adenoviruslerle, lentivirüslerle, plasmidlerle veya diliminde vericiler kanser olmuş olabilir veya transposonlarla da üretilebilecekleri gösterilmiştir. ailesindeki kanser öyküsü artmış olabilir. Transfer Plasmidlerle üretilen hücrelerin ise konak hücre-edilecek hücrelerin taramasının yapılması alıcıların lerin genomuyla hiçbir etkileşim göstermediği PCR karşı karşıya kalabilecekleri riskleri saptamaya ve Southern Blotting tekniğiyle gösterilmiştir. yetmeyebilir. Kalıtsal olarak kalıtılan kanser Ancak bu şekillerde üretilen İPS hücrelerinin verimi türlenin tümü saptanamamıştır bu nedenle de çok düşüktür.tarama da yapsak tam olarak sonuç alamayabiliriz. İPS hücrelerini passajlara ekerek çoğaltabilir ve çok Viral entegrasyon olmadan bir de kimyasallar ya da sayıda hücre elde edebiliriz. Bu da bu hücrelerin küçük moleküller yardımıyla da İPS hücreleri gelecekteki risklerinin saptanmasının çok önemli üretilebilir. Birkaç çalışma grubu,bir veya iki olmasını sağlamakta. Çünkü eğer kalıtsal hastalık yeniden programlama faktörüyle yerdeğiştirebilen taşımayan bir İPS hücresi elde edilebilirse, bu hücre kimyasalları tanımlamıştır. Belki de sadece yeniden çoğaltılıp, transplantasyona ihtiyacı olan çoğu programlamada esansiyel görevi olan OCT3/4 adlı hastaya nakledilebilir. Bu nedenle de donör olan faktörün endojen genlerinin kimyasallarla sağlam kişilerin sürekli olarak tıbbi ve aile hikayeleri bir aktivasyonu yapıldığında İPS genlerini alınmalıdır. Bu tip çalışmalar da izinin kapsamına üretmede yeterli olacak.İPS hücrelerinin transgen-girmelidir.lerle etkileşimi olmasa da başka genetik değişik-

hükökmakale

İPS hücreleriyle yapılabilecek genel araştırmalar:

Hücrelerin genetik modifikasyonu

İPS hücrelerinin veya türevlerinin insan olmayan canlıların beyin de dahil olmak üzere organlarına enjekte edilmesi

Geniş genom dizi taraması

Hücre kolonilerinin diğer araştırmacılarla uygun gizlilik korumalarıyla paylaşılması

Bilimsel araştırmaları donörlerle hiçbir hak paylaşımı olmadan patentlemek ve yeni ticari testler geliştirmek

mayıs 201234

hükök makale

Reproduktif Çalışmalar:

İnsan İPS hücreleri ilkel üreme hücrelerine sonra da olgun gametlere dönüştürülebilir. İPS hücre-lerinden üretilen bu gametler gametogenesizi anlamak ve kısırlık tedavisi için bir potansiyel olabilirler. İPS hücrelerinden türeyen gametler somatik hücre vericisiyle aynı DNAyı taşır.

Bazı insanlar yeni bir gamet yaratıp canlı oluşturmaya, doğal dengeyi bozduğunu düşünerek karşı çıkmakta. Ama bazıları da kısırlık tedavisinde çığır aşacağını düşündüğü için desteklemekte. Bu nedenle somatik hücre donörlerinin izni olmadan hiçbir çalışma yapılmamalıdır. Ancak etik olarak karşıt çok fazla görüş oluştuğu için bu çalışmaların yasaklanması istenmektedir.

mayıs 2012 35

hüköktek sayfa

ücrelere pluripotent özelliği kazandırmak veya başka hücrelere dönüştürmek amacıyla hücrelerin yeniden programlanmasında Hkullanılan bir teknoloji de retrovirüslerdir

(eski adıyla RNA tümör virüsleri). Retrovirüsler, yapılarında RNA'dan cDNA oluşturabilecek revers transkriptaz (ters transkiptaz ya da RNA'ya bağlı DNA polimeraz) enzimi içeren RNA virüsleridir (RNA'dan revers transkriptaz enzimiyle oluşan DNA'ya cDNA Bir diğer teknoloji ise retrovirüslerin bu özelliğinden denir.). Bu tür virüslerin en çok tanınmış olanlarından yararlanılarak, onları retroviral vektörler olarak biri de HIV'dir (aynı zamanda bir lentivirüstür). kullanıp her türlü bölünebilen hücre içersine, çok

rahat bir şekilde gen taşınması yapılabilmesidir. İlk Retrovirüslerin DNA'yı çoğaltma yolları uzun bir süre defa 1984 yılında MIT'ye bağlı Whitehead Insti-anlaşılamadı. İlk defa 1970'te birbirlerinden bağımsız tude'de Constance Cepko ve Richard Mulligan olarak Wisconsin Üniversitesi'nden Howard Temin ve retroviral vektörleri kullandılar.MIT'den David Baltimore, RNA tümör virüslerinde RNA'dan cDNA oluşturabilen bir enzim tanımladılar. 1996 yılında Luigi Naldini ve ekibi bölünemeyen Adı revers transkriptaz olan bu enzimin buluşu ile bu hücrelere de gen taşıyabilen, retroviridae familyasına iki bilim adamı 1975'te Fizyoloji veya Tıp alanında ait lentivirüsleri, lentiviral vektörler olarak kullandılar. Nobel Ödülü'nü İtalyan bir virolog olan Renato Günümüzde ise lentiviral vektörler, retroviral Dulbecco ile paylaştılar. vektörler içinde en yaygın kullanılan cinstir. Hücre-

lerin yeniden programlanmasında ise transkripsiyon Revers transkriptaz enziminin buluşu ile 1974 yılında faktörlerinin taşınması için lentiviral vektörlerden Princeton Üniversitesi'nden Beatrice Mintz ve Rudolf yararlanılmaktadır. Jaenisch (şu anda MIT'de) bir makale yayınlayarak, retrovirüs-lerin revers transkirptaz enzimi ile RNAlarından oluşmuş cDNAlarını, konak canlının genomuna entegre edebildiklerini ve bu sayede enteg-re edilmiş DNA'nın, konak canlının kendi DNA'sı gibi davranabildiğini (endojen DNA) ileri sürdüler. Jaenisch bu bilgiye dayanarak 1976 yılında, ilk transgenik fareleri üretti ve bunun bir fare retrovirüsünün fare eşey ana hücresine entegre edilmesinden kaynaklandığını gös-termiş oldu.

Retrovirüslerin, revers transkriptaz aktiviteleri dışında trandüksiyon (bir bakteri hücresinden bir bakteri hücresine veya dışarıdan bir bakteri hücresine virüsler yoluyla gen ta-şınması olayı) özellikleri de vardır.

REVERSTRANSKRİPTAZ

ve

RETROVİRÜSLEROnur Can Zaim

mayıs 201236

ilim her zaman olduğu gibi bugün de birikimli ilerlemeye devam ediyor. Son yıl-larda kök hücre alanında yaşanan geliş-Bmeler de bunun bir ispatı. Bilindiği üzere kök

hücre araştırmaları tıp dünyasında büyük umutlar vaat ediyor fakat bu araştırmalarda embriyoların kullanılması da etik sorunları beraberinde getiriyor. 2006 yılında Yamanaka ve arkadaşlarının fibroblastlara 4 farklı transkripsiyon faktörüyle (KLF4, Cmyc, OCT4, SOX2(KMOS)) köklük özelliği kazandırmaları bu sorunların çözümü için atılan büyük bir adım oldu.(Takahashi et al. 2007; Takahashi and Yamanaka,2006) iPSC(Induced Pluripotent Stem Cell) adını alan bu hücreler hESC (Human Embryonic Stem Cell) benzeri yapılar olduğundan embriyoya gerek kalmadan erişkin hücrelerden pluripotent kök hücre elde edilmesine imkan tanıyabileceği düşüncesiyle son yıllarda kök hücre araştırmacılarının göz bebeği olmuş durum-da. Bu araştırmacıların başında 2011 yılında TIME'S ın en etkili 100 insan listesinde yer alan ve halen Harvard Tıp Fakültesi Kök Hücre ve Rejeneratif Biyoloji Anabilim Dalında profesör olan Derrick J. Rossi geliyor.

bilmeleri, protoonkogenleri onkogenlere dönüş-Bilindiği üzere Yamanaka ve arkadaşları fare ve türmeleri ve kansere neden olabilmeleri gibi bazı insan hücrelerinde yapmış olduğu deneylerle problemlere yol açtığından retrovirüslerin iPS hüc-fibroblastlara sadece 4 faktör vererek onlara köklük re eldesinde kullanılmaları bilim camiasınca etkili özelliği kazandırmıştı. Yamanaka bu faktörleri bir yöntem olarak görülmedi. Bu durum bilim retrovirüsler aracılığıyla vermişti. Retrovirüsler adamlarını daha etkili yollar aramaya sevk etti. Bazı revers transkriptaz enzimiyle RNA şeklinde olan bilim adamları retrovirüsler yerine adenovirüs ve genomlarını DNA ya çevirerek içine girdikleri plasmitleri denediler fakat genomik integrasyon hücrenin genomuna bu DNA parçasını ekleyen vi-olmamasına rağmen beklenen verimi alamadılar.rüsler. Genomun istenmeyen yerlerine integre ola-

hükök

MAKALE

iPS Hücre Eldesinde Daha Etkili Bir Yöntem: RiPS

HücreleriTolga Bacak

Derrick J. Rossi, PhD

mayıs 2012 37

mayıs 201238

Bazı bilim adamları ise transpozon vektörlerini ve halka daha ekleyeceğe benziyor.sendai virüslerini denediler ve onlar da bekledikleri verimi alamadılar. Bazı bilim adamlarıysa fibro-blastların köklük özelliği kazanması için gerekli Referanslar:faktörleri protein halinde verdiler fakat proteinler stabil kalamadığı için bu yöntem de etkisiz oldu. 1. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and (Chang et al., 2009; Kaji et al., 2009; Okita et al., Directed Differantiation of Human Cells with Synthetic 2008; Stadtfeld et al., 2008; Woltjen et al., 2009; Yu Modified mRNA,2010et al., 2009; Kim et al., 2009; Zhou et al.,2009;

2. http://www.hsci.harvard.edu/newsroom/hsci-Fusaki et al., 2009) researchers-achieve-major-breakthrough-cell-reprogrammingRossi ve arkadaşları işte tam da bu aşamada devreyi

girdi ve bu faktörleri mRNA halinde vererek 3. http://www.boston.com/news/health/blog/2010/09

sentezletmeyi düşündüler. Sonuçta fibroblastlara /harvard_scienti_3.html

köklük özelliği kazandıran Yamanaka'nın bulduğu transkripsiyon faktörleriydi ve bu faktörler protein 4. http://news.sciencemag.org/sciencenow/2010/09/ yapıdaydılar. Rossi bu noktada santral dogmadan a- better-way-to-reprogram-cells.htmlhareketle proteinden önceki basamak olan mRNAyı kullanmayı düşündü. Böylece genomik integrasyon olmayacak ve gerekli faktörler sentezlenecekti fakat bu işlemin immün sistem tarafından baskı-lanma sorunu vardı çünkü eğer mRNAyı direk olarak verselerdi hücre onu yabancı bir genom olarak algılayacak ve bu da immün sistemi tetik-leyerek interferon cevabı oluşmasına yoaçacaktı. Rossi ve arkadaşları bu noktada türev bazlar kullanarak (5-metil-sitozin,psödoüridin,) ve immün sistemi baskılayarak (NF-kB bağımlı yol) in vitro transkripsiyonla bunu başardılar ve bu modifiye mRNA' yı hücrelere cationic lipid delivery vesicles ile endositozla ileterek RiPSC (RNA Induced Pluripotent Stem Cell) adını alan hücreleri elde ettiler. Ekspresyon kinetiğini sitometri ile takip ettiler ve 12-18 saat arasında maksimum ekspresyon ve hemen sonrasında hızlı azalma tespit ettiler. Ayrıca yaptıkları kontrollü çalışmalar sonucunda mRNA yönteminin klasik yönteme kıyasla 2 kat hızlı ve 100 kat daha etkili olduğu görüldü. Rossi ve arkadaşlarının çalışması “Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differantiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA” adıyla Cell Stem Cell Dergisinde 2010 yılında yayımlandı.

RiPS hücreleri pluripotent özellik taşıması ve elde edilme yönteminin daha verimli olması nedeniyle rejeneratif tıp için büyük umut vaat ediyor. Rossi'nin çalışmasında ayrıca bu hücreler oluş-tuktan sonra bunların kas hücresi miyosite çevrilmesi (MYOD transkripsiyon faktörüyle) de bunun bir kanıtı. Rossi ayrıca buldukları yöntemin protein eksikliğinden kaynaklanan hastalıkların tedavisinde de işe yarayabileceğini belirtiyor. Devam eden her çalışma bilimin biriken zincirine bir

hükökmakale

ikroRNA lar yaklaşık 20 nükleotit larva gelişiminde L1 evresinden L2 evresine geçişte uzunluğunda, kodlanmayan RNA(non- gereklidir. Bu buluşun perde arkası ise şöyledir:McodingRNAs) başlığı altında incele-

diğimiz küçük, tek zincirli RNA parçalarıdır. Hedef 1987 yılında Ferguson ve arkadaşları C.Elegans'ta mRNA'nın 3'-Translasyonu Olmayan Bölgesine lin-14 geninde, anlamsız-lin-4 mutasyonu sonucu (3'UnTranslated Region, UTR), 5'-Translasyonu oluşan fenotipi geri döndüren bir baskılayıcı Olmayan Bölgesine(5'UTR) ve hatta kodlanan mutasyon keşfeder. Aslında, lin-14 genindeki bölgelerine bağlanarak, mRNA translasyonunu anlamsız mutasyon sonucu oluşan fenotip, lin-4 önler ya da mRNA yıkımına öncülük eder. genindeki anlamsız mutasyon sonucu oluşan Yani,miRNAlar post-transkripsiyonel olarak gen fenotipin tam zıttıdır. Lin-4 ve lin-14 genlerindeki ekspresyonunu düzenleyen moleküllerdir. Hücre- defektler sonucu ortaya çıkan bu ilginç fenotip nin yaşamsal döngüsünde rol oynayan çeşitli zıtlığını açıklamak için şöyle bir hipotez ortaya atılır: önemli olayları (apoptoz, proliferasyon, diferan- Lin-4, lin-14'ün negatif kontrolünden sorumludur. siyasyon, metastaz gibi) kodlayan genler dahil 1989 yılında, Ambros ve Ruvkun lin-14 genini olmak üzere, miRNAlar kodlanan genomumuzun klonlamaya karar verirler ve tam bu noktada yaklaşık %30'unun regulasyonunda görev alırlar. Ambros'un lin-4, Ruvkun'un lin-14 üzerine

yoğunlaşmasıyla iki meslektaşın yolları ayrılırlar. MİKRORNA'NIN TARİHÇESİAmbros, Lee ve Feinbaum ile birlikte; lin-4'ü içeren 700-baz çifti içeren bir fragment izole eder ancak ünümüzden 20 yıl öncesine kadar değil başlangıç ve bitiş kodonlarını saptamakta bu kadar önemi, varl ığından bi le haberdar şanslı değildir. Yürüttükleri birtakım deneyler Golmadığımız miRNA'nın tarihçesine ve sonucu, lin-4 geninin open reading frame dizisinde gelişimine bakacak olursak; mutasyonlar oluştururlar. Bu mutasyonlar sonucu fenotipte bir değişim beklerlerken tam tersi bir 1993 yılında Ambros ve Ruvkun adlı iki bilimadamı, sonuç ile karşılaşırlar: Lin-4 fonksiyonu değişme-bir nematod olan Caenorhabditis Elegans üzerinde miştir. Buna dayanarak Ambros, lin-4'ün herhangi yaptıkları deneyler sonucu ilk miRNA olarak kabul bir protein kodlamadığı sonucuna ulaşır.edilen Lin-4'ü keşfeder. Lin-4, etkileri izole edilen

anlamsız-mutasyon sonucu anlaşılmış, hetero-Diğer cephede, Ruvkun ile meslektaşları Wightman kronik bir gendir. Lin-4 fonksiyon kaybı ile sonuç-ve Ha, lin-14'ün post-transkripsiyonel aşamada lanan mutasyonlara sahip hayvanların zamansal baskılandığını ve lin-14 genindeki3'-translasyonu gelişimlerinde (bazı erişkin yapılarda eksiklik, (3'-UTR) zamansal düzenleme için yeterli olduğu yumurtlama yeteneğinde kayıp gibi) birtakım sonuçlarına ulaşır. anomaliler gözlenmiştir. Ayrıca lin-4 aktivitesi,

hükök

mayıs 2012 39

mikroRNA Tarihçesi, Moleküler Özellikleri ve

RNA İnterferansiİrem Ozarlı

DERLEME

Sonuç olarak, 1992 Haziranında, 2 grup henüz yere sahiptir. Şimdiye kadar insanlarda ve diğer yayınlamadıkları bilgilerini birbirleriyle paylaşır ve türlerde binlerce miRNA keşfedilmiş ve internet ortak bir sonuca varırlar: lin-14 genindeki 3'- üzerinde de online miRNA sekans depoları translasyonu olmayan bölgedeki tekrarlanan (miRbase database gibi) oluşturulmuştur.sekanslarla lin-4 geninin transkriptleri birbirinin komplementeridir. Aralık 1993'te, Ambros ve miRNA fonksiyonel olarak “RNA İnterferansı” Ruvkun'un Cell dergisine, birbirlerinden bağımsız olarak tanımlanan bir gen baskılama mekanizma-olarak gönderdikleri makalelerinse anlattığı şudur: sının iki ana kahramanından biridir. Fonksiyonel Küçük, protein kodlamayan transkript (lin-4), lin- özelliklerini ve önemini daha iyi kavrayabilmek 14'ün 3'UTR'sine bağlanarak, regulasyonundan adına RNAi'nin tarihsel gelişimi ve kısaca moleküler sorumludur. mekanizması üzerinde durmakta fayda vardır:

2000 yılında Reinhart ve arkadaşları; C.Elegans'ta, RNA İNTERFERANSIlin-4 gibi heterokronik bir gen ürünü olan let-7'yi keşfederler. Let-7, L4 evresinden erişkin evreye NA İnterferansı(RNAi),çift zincirli RNA'nın geçiş için gerekli olan 21 nükleotid içeren bir (dsRNA) hücreye girdiği zaman komplemen-miRNA'dır. Let-7 aktivitesi kaybında, larvaya ait Rter mRNA dizisinin parçalanmasına yol bazı özellikler yeniden ortaya çıkmakta; artmış let-7 açması ile sonuçlanan transkripsiyon sonrası gen aktivitesi sonucunda da erişkin evreye ait bazı susturma mekanizmasıdır. RNAi, doğal bir özellikler erken dönemde gözlenmektedir. mekanizmadır ve fonksiyonunun virüs kalıtım Mekanizma ise, lin-4&lin-14 birlikteliği ile oldukça materyali ve transpozonlar gibi hareketli genetik benzerdir: Let-7, lin-41 genindeki 3'-translasyonu elementlerin istilasına karşı genomu koruyarak olmayan bölgede yakın yerleşimli 2 bölgenin hücresel savunma olduğu düşünülmektedir.Bugün regulasyonundan sorumludur. RNA interferansı, modern biyolojide ve tıpta

önemli gelişmelere yol açacak bir fenomen olarak Let-7 geninin C.Elegans'ta keşfedilmesinin düşünülmektedir ve RNAi, fonksiyonel genomik ardından yapılan araştırmalar göstermiştir ki, Let-7 araştırmalarında üzerinde yoğun araştırmalar sineklerden insanlara kadar çeşitli türler arasında yapılan yeni bir alandır. RNAi, Science dergisi korunmuştur. Bu sonuç, miRNA tarihinde bir tarafından 2001'de “yılın molekülü” ve “2002 kırılma noktası sayılabilir çünkü bu farkındalık ile yılının en önemli bilimsel hamlesi” seçilmiştir. Yine birlikte diğer türlerde özellikle insanlarda miRNA 2006 yılında Andrew Z. Fire ve Craig C. Mello adlı çal ışmalar ı baş lar ve küçük-kodlanmayan araştırıcılar RNA interferans ile ilgili yaptıkları RNAlar(small ncRNAs) haklı olarak kendi isimlerine çalışmalarla Fizyoloji/Tıp alanında Nobel Ödülü kavuşurlar: mikroRNA. Günümüzde ise miRNA'lar almışlardır. başta kanser olmak üzere pek çok hastalığın etyopatogenezini anlamak adına çok önemli bir RNAi TARİHÇESİ

1980 l i y ı l lar ın baş lar ında Jorgensen ve arkadaşları, daha mor petunyalar elde etmek amacıyla, petunya bitkisine ekzojenik olarak petunyada pigmentasyondan sorumlu chalcone synthase(chs) enzi-mini kodlayan geni aktarırlar. Ancak beklenilenin aksine, daha mor petunyalar yerine morlu beyazlı, alacalı petunya-lar elde etmeye başlarlar. Bu-nun üzerine, aktardıkları ekstra genin chs ekspresyonunu art-tırmak yerine azalttığı sonucu-na varırlar. İzole ettikleri nük-leuslarla yaptıkları çalışmalar, sitozolik mRNA konsantrasyo-

mayıs 201240

Grafik. Yayın yılına göre yayınlanan miRNA sayısı dağılımı

hükökderleme

mayıs 2012 41

nunda herhangi bir azalma olmadığını gösterir ve Bitkilerde ve funguslarda gen baskılanmasının sonrasında Jorgensen ve arkadaşları bu durumu gösterilmesinin ardından, endojenik genin açıklamak için Post-Transcriptional Gene baskılanma mekanizmasını açıklayan yaygın görüş, Silencing-PTGS (transkripsiyon sonrası gen baskı- transgenik antisense RNA'nın mRNA ile hibridize lama) ifadesini kullanırlar. Yürütülen deneyler so- olarak translasyonu inhibe ettiği yönündedir. nucunda, belirtilmesi gereken bir diğer nokta da Ancak, 1995 yılında Guo ve Kempheus isimli şudur; aktarılan transgen kendi ekspresyonunu araştırmacılar nematod türü bir solucan olan baskılamakla kalmayıp, açıklanamayan bir Caenorhabtidis elegans'ta gen ekspresyonunu mekanizma ile endojenik –orjinal- genin baskılamak için sense RNA'nın da, antisense RNA ekspresyonunu da etkiliyordu. Jorgensen ve arka- kadar etkili olduğunu tespit ederler. Ardından daşları bunu da co-supresyon şeklinde tanımlarlar. yürüttükleri deneyler ile, dsRNA'nın gen ekspres-Daha sonra yapılan çalışmalarla gösterilir ki, trans- yonunu baskılamada sense ve anti-sense RNA'ların genin ekspresyonu çift zincirli RNA(dsRNA) oluşu- tek başına gösterdikleri etkinin on katından daha muna yol açmakta ve böylelikle PTGS/co-supre- fazla bir potansiyel etkiye sahip olduğunu syon'u başlatmaktadır. gösterirler. Daha sonra, Craig Mello ve Andrew

Fire, Ceanorhabditis elegans'ta dsRNA'nın gen Bitkilerde PTGS raporları birikirken, funguslarda ekspresyonunu spesifik ve selektif olarak inhibe gen baskılama üzerine ilk rapor 1992 yılında Pandit ettiğini ilk defa deneysel olarak kanıtlarlar.ve Russo isimli iki araştırmacıdan gelir. Aynı yıl, Romano ve Macino adlı iki araştırmacı, Pandit ve Bu keşifler, RNA interferansı için bir kırılma noktası Russo gibi Neurospora crassa üzerinde yaptıkları sayılabilir çünkü bu keşiflerden sonra, bahset-

tiğimiz PTGS, quelling ve antisense RNA ile gen baskılama mekanizmalarının aslında C.elegans'ta gösterilen RNAi'nin farklı mekanizmaları olduğu anlaşılır ve RNAi'nin tüm ökaryotlarda gözlenen doğal b ir mekanizma olduğunu sonucuna varılır. Andrew Fire ve Craig Mello ise RNAi konusunda yaptıkları çalışmalar için 2006 yılında Nobel ödülü ile taçlandırılır.

RNAi MEKANİZMASIGen ifadesinin susturulmasını sağlayan RNAi yolakları, small interfering RNA (siRNA) ve mikro RNA (miRNA) adı verilen RNA parçacıkları aracılığıyla gerçekleşmektedir. Bu iki tür kodlamayan RNA'nın sentez ve olgunlaşma süreçleri ortak aşamalardan geçmekle beraber aralarında önemli farklılıklar vardır.

Başlangıç molekülü çoğunlukla, RNA bağımlı RNA polimerazın kalıp olarak

deneyler sonucu, Pandit&Russo ikilisinin endojen veya ekzojen kaynaklı bir RNA'yı "baskılamanın sadece transgenik sekanslarda kullanarak sentezlediği çift zincirli RNA'dır. miRNA olduğu" tezinin aksine baskılamanın transgenik ve için ise, RNA polimeraz II tarafından sentezlenen endojenik sekanslar üzerinde olduğunu gösterirler primer mRNA'nın intron bölgelerinde saç tokası ve Neurospora crassa'da gözlenen bu yeni şeklinde kıvrılıp eşleşmiş kısımlardır. Bu yolla fenomene quelling ismi verilir. 1994 yılında da transkripsiyon sonucu oluşan ilk miRNA Matzke isimli başka bir araştırmacı tarafından, molekülüne pri-miRNA adı verilir. Pri-miRNA Homology Dependent Gene Silencing-HDGS molekülüne etki eden RNaz III grubu bir (Homolojiye Dayalı Gen Baskılama) ifadesi ortaya endonükleaz (Drosha), bu kıvrılmış RNA parçasını sürülür. zincirin geri kalan kısmından ayırır ve böylelikle

Şekil1.Petunia'da chs geninin ekspresyonunun baskılanması ile değişen pigmentasyon(1)

mayıs 2012 7

hükök derleme

pre-miRNA molekülü oluşur. Pre-miRNA çekirdek mRNA'nın 3'-translasyonu olmayan bölgesindeki zarında bulunan özel bir taşıyıcı sistem ile b e l i r l i n ü k l e o t i d l e r i l e ( y a n i k ıs m e n ) sitoplazmaya taşınır. eşleşebilmektedir.

Bu aşamadan sonra miRNA ve siRNA aynı Doğada zaten var olan ve protein sentezi düzen-işlemlerden geçer. Sitoplazmada bulunan diğer bir lenmesiyle ilgili olan RNAi mekanizması, araştırma RNaz III enzimi (Dicer) ATP bağımlı bir etkileşim ile ve tedavi amaçlı olarak geniş bir uygulama alanına RNA'ya bağlanır ve önce RNA'nın ucundaki kıvrımlı sahiptir. RNAi yolağında yer alan siRNA'ların hedef kısmı koparır. Daha sonra dupleks RNA molekülünü dizilerine mükemmel eşleşme göstermesi onları helikaz aktivitesi ile açar ve 21-23 nükleotid gen işlevinin araştırılmasına çok uygun araçlar uzunluğunda kısa RNA parçacıkları halinde keser. haline getirir. RNAi uygulamaları bugüne kadar Dicer enzimi tarafından bu şekilde oluşturulan tedavileri sorunlu olan nörodejeneratif hastalıklara RNA'lar daha sonra yine ATP bağımlı bir biçimde yeni bir yaklaşım sunmaktadır. siRNA uygulamaları RNA ile İndüklenen Susturum Kompleksine (RISC, genel olarak en iyi sonucu tek nükleotid polimor-RNA-induced silencing complex) aktarılır. RISC, fizmlerine bağlı hastalıklarda göstermelerine RNA ve RNA bağlayan proteinlerden zengin bir rağmen uygulama alanı bu hastalıklarla sınırlı komplekstir. Olgun siRNA veya miRNA zincirinin kalmamaktadır. mRNA ile etkileşimi de RISC kompleksi içinde gerçekleşir. RISC yapısında bulunan substrat siRNA IRNAi'NİN UYGULAMA ALANLARIise, hedef mRNA dizisiyle birebir eşleşir ve mRNA Ÿ · Fonksiyonel genomik analizmolekülü eşleşme bölgelerinden endonükleazlar Ÿ · Hedefe yönelik ilaçlarile kesilerek ortamdan uzaklaştırılır. Eğer RISC Ÿ · Transgenik hayvanlaryapısında bulunan substrat miRNA ise, hedef

mayıs 201242

Şekil2. RNAi mekanizmasında rol alan miRNA ve siRNA'ların sentez ve etki yolakları(6)

hükökderleme

mayıs 2012 43

RNAi'nin tedavi edici etkisi ile ilgili deneysel Referanslar:çalışmalar:

1. Carolyn Napoli, Christine Lemieux, Richard Jorgensen (1990). lntroduction of a Chimeric Chalcone Synthase Başta kanser, otoimmun hastalıklar, infeksiyon Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression hastalıkları, nörodejeneratif hastalıklar üzerine of Homologous Genes In trans. The Plant Cell, 2, 279-289terepatik etkileri çalışılan RNAi'nin etkisinin

gösterildiği bazı hastalıklar: Huntington Hastalığı, 2. Rosalind C. Lee, Rhonda L. Feinbaum, Victor Ambros

Alzheimer, ALF, Machado-Joseph Hastalığı, (1993). The C. elegans Heterochronic Gene lin-4

Parkinson, Hepatit B ve C, HIV/AIDS… Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity to lin-14. Cell,75, 843-854

Özetlemek gerekirse;

3. Annette S. Pickford, Caterina Catalanotto,Carlo miRNA, yer aldığı “RNAi” mekanizması sayesinde Cogoni,and Giuseppe Macino(2000). Quelling in

Neurospora crassa.çeşitli hücresel olayların düzenlenmesinde rolü olan önemli bir moleküldür. Özellikle immün

4. Ahmet Karagüzel, Ersan Kalay, Figen Celep(2007) RNA sistemin normal fonksiyon göstermesi için gerekli İnterferans (RNAi): Gen Sessizleştirilmesi veTedavi Edici düzenleyici etkisi sayesinde otoimmün hastalıklar; Uygulamaları. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi,

onkogen ve tümör supressör genlerin üzerindeki 33, 41-44

düzenleyici etkisi sayesinde de kanser başta olmak üzere, çeşitli hastalıkların hedefe yönelik 5. T F Duchaine, F J Slack (2009). –Rna Interference and tedavisinde miRNA'nın yeni ufuklar açtığı ve MicroRNAOriented Therapy In Cancer: Rationales, açacağı süphesizdir. Promises and Challenges. Current oncology Toronto Ont

16 (4) , 61-66

6. Ebru Bodur, Ediz Demirpençe(2010). Kodlamayan RNA'lar ve Gen Susturumu. Hacettepe Tıp Dergisi, 41, 82-89

7.Maria I Almeida, Rui M Reis, George A Calin (2011) MicroRNA history: Discovery, recent applications, and next frontiers. E-pub,Elsevier '11.

hükök derleme

ök hücre araştırmalarında embryonal kök blastlarının yeniden programlanmasında valproik hücrelerin kullanılmasındaki ciddi kısıt- asidin spesifik olarak Hdac2 proteinini parçaladığı Klamalar bilim adamlarını diğer kaynaklara için gerekli olduğu da gösterilmiştir. Bu yüzden

yöneltmiştir. Bugün kök hücre elde etme çalış- miR302/367 ekspresyonu ve Hdac2 baskılanması malarının büyük bir kısmı iPSC(induced pluripotent bilinen herhangi bir yeniden programlama faktörü stem cell) üzerine yoğunlaşmaktadır. iPSC elde kullanmadan yapılan etkili bir iPSC üretici yöntem etmenin çeşitli yolları bulunmaktadır, standart olarak karşımıza çıkmaktadır.prosedür ise fibroblastlara Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Sonuçlar: miR302/367 fibroblastları iPSC ye Yamanaka, 2006) ' nin ekspresyonu sağlatılarak yeniden programlariPSC elde etmektir. Son dönemde sıklıkla adından söz ettiren yöntemlerden diğeri ise miRNA(micro Bu araştırmacılar miR302/367 ekspresyonunun RNA) kullanımıyla İPSC elde etmedir. MiRNA'lar somatik hücreleri yeniden programlayabildiğini gelişim ve diferansiyasyonun regülatörleridir ((Lee göstermek için miR302/367 genini farenin et al., 1993; Ruvkun,2001). Bu miRNA'lar embyonik fibroblastına(MEF) enfekte edecek embryonik kök hücrelerde(ESC) yoğun olarak lentiviral vektörler oluştururlar. Bu deneye işlemi bulunan ve ESC fenotipinin sağlanmasında etkin hızlandırması için VPA da eklerler. Şaşırtıcı bir olan miRNA'lardır(Babiarz et al., 2008; Wang et al., şekilde işleme başladıktan 6-8 gün sonra ESC'ye 2007, 2008; Wang and Blelloch,2009;). benzer morfolojide hücreler elde ederler. Bu

“klon”ların çoğu Oct4-GFP ve alkalin fosfataz ESC ve iPSC'lerde üretilen miRNA'lar arasında pozitiftir. Bu klonlarda ayrıca Nanog, Sox2 ve SSEa1 miR302/367'nin, Oct4 ve Sox2'nin doğrudan hedefi ekspresyonu da gözlenmiştir. OSKM faktörleriyle olduğu görülmektedir(Card et al., 2008). bu yöntem karşılaştırıldığında bu yöntemin daha miR302/367 seviyesi ESC'nin erken embryonik hızlı olduğu görülür çünkü OSKM faktörleriyle 6-8 gelişiminde Oct4 transkripsiyonuyla orantılıdır ve günde herhangi bir şey elde edilememektedir. ESC'nin homeostazında ve pluripotent özelliğinin Ayrıca bu deney göstermektedir ki VPA eksikliğinde korunmasında önemli bir rol oynamaktadır (Card et bu yöntem etkisiz kalmaktadır.al., 2008). Pensilvanya Üniversitesi'nde yapılan araştırmalar gösteriyor ki bilinen PSC trans- Bu yöntemin etkinliğini ölçmek için dizilim analizi kripsiyon faktörleri eksikliğinde dahi miR302/367 yapıldığında R1 ESC dizilimindeki global gen ekspresyonu fare ve insan hücrelerini iPSC'ye ekspresyonuyla çok büyük paralellik gözlenmiştir. dönüştürmektedir. OSKM faktörleriyle birlikte Ayrıca fare kök hücreleriyle aynı gen eks-kullanıldığında ise bu yöntem 2 kat daha etkili presyonuna sahip oldukları Q-PCR ile gösterilmiştir. olmaktadır. Ayrıca bu çalışmada fare fibro- Bu sonuçlar gösteriyor ki miR302/367 ve VPA

hükök

MAKALE

iPSC Üretiminde Alternatif ve Yüksek Verimli Bir

Yöntem: miRNA KullanımıYusuf Yıldırım

mayıs 201244

mayıs 2012 45

hükök makale

farenin embryonik fibroblastına herhangi bir yeni- etkinliğini görmek için sünnet derisi ve dermal den programlama faktörü vermeden uyguladığımız fibroblastlara miR302/367 lentivirüsleri gön-zaman hızlı ve etkili bir şekilde iPSC elde derirler. 12-14 gün içerisinde klasik insan ESC etmekteyiz. morfolojisinde klonlar elde ederler. İmmün boyama yöntemiyle ise OCT4, SSEA4, TRA-1-60 ve

TRA-1-81 ekspresyonunu gözlerler. 3 farklı klon OSKM ile karşılaştırırsak:üzerinde Q-PCR uyguladıklarında ise insan ESC dizilimi HUES'e denk bir şekilde pluripotent Eşit sayıda sünnet derisi fibroblastı ile yapılan özellikte marker ekspresyonu görürler. Bunların deneylerde işleme başladıktan 18-26 gün yanında miR302/367 ile yeniden programla ile sonrasında miR302/367 ile yeniden programlama üretilmiş insan hücre klonlar herhangi OSKM virüs ile oluşan embryonik kök hücreye benzeyen koloni tamamlayıcısı da içermemektedir. işin ilginç yanı, sayısının OSKM faktörlerine göre 2 katı kadar daha insan fibroblastları ile yeniden programlama fazla olduğu gözlenir. Yine farelerde yapılan yaparken VPA kullanmak gerekmemektedir ve bu deneylerde de gözlendiği gibi Q-PCR uygulandığı durum herhangi bir performans düşüklüğüne yol zaman miR302/367 ile yeniden programlanmış açmamaktadır. 7 farklı miR302/367 ile yeniden hücrelerde OSKM faktörleri uygulanmış olanlara programlanmış insan iPSC'si ile teratomlar nazaran çok daha fazla pluripotent özellikli gen oluşturulmuş ve 3 germ tabakasının da oluştuğu ekspresyonu olduğu gözlenmiştir. Tüm bunlar gözlenmiştir.göstermektedir ki miR302/367 ile yeniden

programlama OSKM faktörlerine göre çok daha etkili bir yöntemdir.

Yorum

- Daha önce de belirtildiği gibi miR302/367 ile iPSC üretimi için şu an ki strateji birkaç pluripotent yeniden programlama OSKM faktörlerine göre kök hücre faktörünün ekspresyonunu sağlatmaya daha hızlı bir yöntemdir.dayalıdır. Fakat bu araştırmada tek bir miRNA grubunun, miR302/367, standart OSKM meto-- miR302/367 ile yeniden programlamada OSKM dundan daha etkili bir şekilde fibroblastları yeniden faktörlerine göre 2 kat daha fazla iPSC elde programlayabildikleri görülmüştür. Devam eden edilmiştiravantajlarıyla miRNA'larla iPSC üretimi yalnızca yalnızca temel kök hücre çalışmalarında değil, - Deneyin 10. Gününde miR302/367 ile yeniden geniş hasta popülasyonlarında da uygulanabilir.programlanan klonların %79.8'i Oct4-GFP içerirken

OSKM faktörleri ile elde edilen klonların %50'sinde bu ekspresyon görülmüştür. Referanslar:

1. Highly Efficient miRNA-Mediated Repro-gramming of Bu deneyler göstermektedir ki miR302/367 ile Mouse and Human Somatic Cells to Pluripotencyyeniden programlama OSKM faktörlerini kulla-

nılarak yapılandan daha üstündür.

3 germ tabakalı teratom

Pensilvanyalı araştırmacılar, miR302/367 ile yeniden programlama ile oluşturulan İPSC 'lerin pluripotent özelliklerini daha iyi karakteize etmek için bunlarla immün sistemi baskılanmış fareler üzerinde teratom oluştururlar. Yaptıkları deneyler sonucunda her üç germ tabakasından da dokuların elde edildiği gözlenmiştir.

İnsan üzerinde de Oskm'den iyi

Pensilvanyalı araştırmacılar miR302/367 ile yeniden programlamanın fibroblastlarındaki

en ifadesinin düzenlenmesinde yon, genotipi değiştirmeden fenotipi etkileyen rol oynayan önemli bir olay, DNA herhangi bir modifikasyon olarak tanımlanabilir. bazlarına metil grubunun eklen- DNA metilasyonu, kalıtımla geçebilen, enzimatik G

mesi ya da bu bazlardan metil grubunun bir işlemdir ve diyetle düzenlenebilir. Cinsiyet çıkarılmasıyla ortaya çıkan kimyasal farklılaşmasını düzenleyen önemli olaylar örneğin;

değişikliktir. Birçok ökaryotik organizmanın “genomik imprinting” (genlerin sadece paternal ya DNA'sı, metil gruplarının enzim (DNA metil- da sadece maternal olarak ifade edilmesi, paternal

transferaz) aracılığıyla bazlara eklenmesiyle gen aktif ise maternal gen suskundur), X-replikasyondan sonra değiştirilir. Metillenme, kromozom inaktivasyonu ve embriyonik gelişim DNA'daki CG çiftleri halinde bulunan sitozinlerden DNA metilasyonu ile ilişkilidir.ve genellikle de her iki zincirde birden olur. Metilasyon, DNA dizisindeki guaninin önünde Yapılan Çalışmalar:yerleşmiş sitozinlerin (CpG) 5. konumundaki Metillenmenin gen ifadesinin düzen-karbonuna metil grubu bağlanması ile lenmesindeki rolü ile ilgili en kuvvetli gerçekleşmekte ve bölgesel hiper- bulgular baz anologları ile yapılan metilasyon, promotor bölgede çalışmalardan elde edilmiştir. Bir (gen ifadesini başlatan bölge) baz anoloğu olan 5'-azasitidin bulunan CpG adacıklarını nükleotiti, DNA› da sitozinin etkileyerek genin aktivitesini yerine girer ve bu molekül durdurmaktadır. CpG adacık- kimyasal olarak metillene-ları, sıklıkla promotor bölgeleri mediği için, girdiği bölgelerde olarak işlev görürler ve ayrıca DNA'nın metillenmesi engel-replikasyon başlangıç bölgeleri lenir. 5'-azasitidinin DNA'ya oldukları düşünülmektedir katılması, gen ifadesi olayını

değiştirir ve inaktif X kromozomu DNA metilasyonu gen ifadesini üzerindeki allellerin ifadesi uyarılır nasıl kontrol eder? Üç olası mekaniz- (Bird 2002).ma ile özetlenebilir:

2003 American Society for Microbiology1-Metillenmiş promotor bölgelerine bağlana-bilen Same Genome, Dıfferent Epıgenome:proteinlerin hedef dizilere (sekanslara) bağlanarak,

esas bağlanması gereken transkripsiyon faktör-Agouti bölgelerindeki CpG metilasyonundaki lerinin buralara bağlanmasını engelleyerek, çeşitlilik genetik olarak özdeş farelerde kürk 2-Transkripsiyon faktörlerinin metillenmiş sitozine renginde farklılıklara sebep olur. Beslenme; agouti bağlanmasını engelleyerek,bölgesindeki CpG metilasyonunun derecesini 3-Kromatin yapısını değiştirerek transkripsiyon değiştirerek yavruların fenotipini etkiler (Reprinted miktarında bir değişim gerçekleştirerek .with permission, MolecCell Biol,Aug2003)

DNA metilasyonu, genomun önemli bir “epi-genetik” modifikasyonudur. Epigenetik modifikas-

hükök

Merve Deniz YılmazDNAMETİLASYONU

tek sayfa

mayıs 201246

pigenetik kavramı aynı genoma sahip verilmesinde önemli rol oynar. Epigenetik bilgi, hücrelerin, nasıl farklı hücre tiplerine çevresel koşullara bağlı olarak değişebildiği için, Edönüştüğünü ve herhangi bir genetik çevrenin hücredeki fizyolojik etkilerinin gözlen-

değişiklik olmadan nasıl farklı fenotipler oluş- mesinde önemli bir etkendir. Hücresel epigenetik tuğunu ve bunun sonraki nesillere aktarılma şeklini süreç kavramının karşılaması gereken bazı özellikler açıklayabilmek için ortaya çıkmıştır. Bununla vardır. Bu özellikler: (i) aynı genetiğe sahip iki hücre beraber epigenetik kavramının Aristo'ya kadar arasında gözlemlenebilecek bir fark yaratması, (ii) uzandığı da bilinmektedir. Aristo; embriyonun bu farkın başlangıçtaki uyarı yok olduktan sonra da tamamen gelişmiş minik canlılardan büyüdüğü devam edebilmesi ve (iii) farkın mitotik - ya da bazı fikrine karşın, insanın şekillenmemiş bir yapıdan durumlarda mayotik – bölünme ile sonraki gelişerek meydana geldiğini savunmuştur. nesillere aktarılabilmesidir. Ancak bu özellikler, Epigenetik kavramının isim babası ise, “epigenetik fazla kısıtlayıcı olması sebebiyle bazı durumlarda manzara” kavramının da yaratıcısı olan Conrad görülmeyebilirler.Waddington (1905-1975)'dır. Waddington; hücre farklılaşmasını, bir bilyenin tepeden en alçak Epigenetik modifikasyonlar, çeşitli kimyasal noktaya yuvarlanmasına benzetmiştir. Buna göre, değişikliklerle genlerin aktif ya da inaktif olmalarını hücre farklılaşırken vadilerde ilerlemekte ve sağlar. Hücrenin epigenetik mekanizmaları temel etrafındaki yüksekliği artan kabartılar ise hücrenin olarak üç başlık altında incelenebilir: DNA geri dönüşümünde karşılaşılan kısıtlamaları ifade Metilasyonu, Histon Proteinlerinin Post-Trans-etmektedir. lasyonel Modifikasyonu ve Non-Coding RNA'lar.

Epigenetik sözcük olarak genetik–üstü anlamına Dinlenme evresindeki bir hücrede DNA, kromatin gelmektedir. Daha ayrıntılı olarak, DNA dizilimini halinde nükleusun içinde bulunur. Kromatini değiştirmeden uzun dönemde gen ekspresyonunu oluşturan en küçük birime ise “nükleozom” adı düzenleyen ve bunu sonraki nesillere aktarabilen verilir. Nükleozom sekiz adet histon proteini [ (H2A, yöntemler şeklinde tanımlanabilir. Bu yüzden H2B, H3, H4)x2 ] ve bu proteinlere sarılmış olan 146 epigenetik değişiklikler, hücre döngüsünde, baz çiftinden oluşur. DNA, histon proteinlerine sıkı gelişiminde ve çevresel etkenlere tepki bir biçimde sarılırsa, RNA Polimeraz enzimi DNA'ya

ulaşamaz ve bu DNA yapısına 'Heterokromatin' denir. Ancak, gevşek sarılırsa RNA Polimeraz DNA'ya kolayca ulaşabilir ve transkripsiyon gerçek-leşir. Bu DNA yapısı ise 'ökromatin' olarak adlandırılır.

Histon proteinleri DNA'nın sarıldığı ve genetik regülasyonda rol alan globüler proteinlerdir .Bu

proteinlerin çeşitli bölgelerine yapılan modifikas-yonlarla DNA'nın histonlara bağlanma afinitesi değiştirilebilir. Histon modifikasyonları; hücre döngüsü, gelişimi ve farklılaşması sırasında düzenlenir. En önemli histon modifikasyonları, asetilasyon ve metilasyondur. Bu modifikasyonlar

hükök

Epigenetik ve Kök HücreSena Bocutcu

mayıs 2012 47

DERLEME

sıkı kontrol altındadır. Histon Asetil Tranferaz (HAT) enziminin gerçekleştirdiği asetilasyon, Histon Deasetilaz (HDAC) enziminin görevi olan deasetilasyonla; Histon Metil Transferaz (HMT) enziminin yaptığı metilasyon da çeşitli enzimlerin (ör: LSD, JMJC,...) demetilasyon aktivitesiyle ile dengelenmiştir.

Histon asetilasyonu daima transkripsiyonel aktivasyona yol açarken; H3'ün 4., 36., 79., lizinlerinin trimetilasyonu gen aktivasyonuna, H3'ün 9., 27. lizinlerinin ve H4'ün 20. lizininin trimetilasyonu gen baskılanmasını sağlar.

Bu modifikasyonların tümüne “histon kodu” denir ve “histon kodu hipotezi”ne göre bu proteinlere ekleme yapan (writer) ve kimyasal eklemleri kaldıran (eraser) enzimler sayesinde hücrede spesifik bir örüntü (pattern) oluşur. Bu örüntü efektör (reader) proteinler tarafından okunarak anlamlı bir biyolojik sonuç (ürün) ortaya konur.

Bir diğer yöntem ise, DNA'nın kendisinde ekspresyonunu düzenleyen başka moleküller ise değişiklikler yaparak RNA Polimeraz'ın DNA'ya non-codingRNA'lardır. Bu grup RNA'lar birkaç ile bağlanma afinitesini değiştirmektir. Histon birkaç bin nükleotit dizisinden meydana gelebilirer. proteinlerinin aksine, DNA üzerinde yapılan tek Bu grup RNA'ların bir alt bölümü olan mikroRNA'lar değişiklik metilasyon ve demetilasyonudur. DNA yaklaşık 21-23 baz çiftinden oluşan ve gen metilasyonu, Metil Bağlayıcı Proteinlerin(Methyl ekspresyonunun posttraslasyonel modifikasyo-Binding Protein-MBP) DNA'ya bağlanmasını nunda rol oynayan, protein kodlamayan RNA'lardır. sağlayarak RNA Polimeraz'ın DNA'ya ulaşmasını miRNA'lar genellikle mRNA'ların 3'UTR'lerine engeller. Dolayısıyla genin ekspresyonunu bağlanırlar ve tamamlayıcılık derecesine göre pro-engellemiş olur. DNA Metil Transferaz(DNMT)'lar tein kodlanır ya da baskılanır. Bu miRNA'lar metilasyondan ve demetilazlar da demetilas-embriyonik gelişimde, hücre farklılaşmasında, dön-yondan sorumludur. DNMT1, metilasyonu yarım güsünde, apoptozda veimmün fonksiyonlarda kalmış DNA dizilerinin; DNMT3A ve 3B ise görev alır. Bazı miRNA'lar ise DNA metilasyonu ve metillenmemiş dizilerin metilasyonun sağlar. histon modifikasyonunu hem gen aktivasyonunu Transkripsiyon başlangıç dizilerinde(upstream) sağlayan bazı histon modifikasyonları hem de pro-olan CpG adaları metilasyonun ana hedefidir ve

bunların %80'i metillenmiş halde bulunur. Farklılaşmış hücrelerde, hücre tipine göre kullanılmayan DNA bölümleri baskılanmış, kullanılan diziler ise metilasyona uğramadığı için protein sentezine katıl-mıştır. Embriyonik dönemde DNA metilasyonu, X-inakti-vasyonu(dişilerde) ve geno-mik baskılama mekanizma-larında rol oynar; bu da monoallelik ekspresyona yol açar.

Kromatin yapısını ve gen

mayıs 201248

hükökderleme

moter bölgelerinde DNA metilasyonu içermektedir. içerirler. Primed hücreler, saf hücrelere göre daha Bu bulgulara dayanarak, pluripotent hücreler için çok farklılaşma özelliği taşırlar.Ayrıca bu hücrelerin yeni bir gen regülasyon mekanizması ortaya birbirine dönüşmesi sağlanabildiği gibi, bu konmuştur.Buna göre, hücre farklılaştığında dönüşümün sürekli olması da mümkündür.sentezlenmeye başlanacak olan proteinler kök hücrede sentezlenmiyor, ancak ilerde kullanmak Embriyonik kök hücreler, bir embriyodan elde üzere hazırlanmış oluyorlar. edilen ilk kök hücrelerdir. Embriyonun İç hücre

kitlesinden elde edilen bu hücreler, Oct4, Sox2, PcG(polycomb group) proteinleri de, kök hücre- Nanog gibi temel kök hücre transkripsiyon faktör-lerde gen inaktivasyonunda önemli bir yere lerini sentezleyebilirler. Bu faktörler, hücrenin sahiptir. PcG proteinleri, gen inaktivasyonunu stabilitesini korurlar ve bir feed-forward mekaniz-birden fazla yöntemle sağlarlar:PRC(polycomb masıyla birbirlerinin ve başka bazı faktörlerin repressor complex) proteinlerinin H3K27 trime- sentezini sağlarlar. Embriyonik kök hücrelerde X-tilasyonunu katalizlemesi, birbirinden uzak gen inaktivasyonu başlamamıştır ve bu hücreler sonsuz lokuslarının bir araya getirilmesiyle daha sıkı yenilenme kapasitesine sahiptirler. Ayrıca bu birkromatin yapısının oluşturulması, DNMT'leri hücreler pluripotent oldukları için, teratoma(üç bazı spesifik hedeflere yönlendirebilmesi gibi. PcG germ tabakasından da hücreler içeren bir tür proteinlerinin hücre farklılaşmadan önce baskı- tümör) ve kimera(aynı genoma ve farklı fenotiplere ladığı genlerin, hücre farklılaşınca tekrar aktive sahip hücreler içeren yapı) oluşturabilirler.olabildiği görülmüştür. Ayrıca, PcG proteinlerine sahip olmayan kök hücrelerde de, farklılaşma Epiblastik kök hücreler, embriyonun implantas-sürecinde bazı dokuya özgü proteinler, aşırı yonundan sonra ICM'den farklılaşan epiblast miktarda sentezlenmiştir. Dolayısıyla, PcG tabakasından oluşur. Bu hücreler pluripotent proteinleri, epigenetik açıdan önemli bir konuma olmalarına karşın, embriyonik kök hücrelerden sahiptir. daha az farklılaşma kapasitesine sahiptirler .Bu

hücrelerde X-inaktivasyonu ve hücrelerin farklı-Ortak özelliklerine karşın, kök hücreler de kendi laşmaya bir adım daha yaklaştığının belirtileri aralarında yenilenme veya farklılaşma potansiyel- görülür. Ayrıca epiblast kök hücrelerinde daha az lerine, elde ediliş biçimlerine ve başka özelliklerine Nanog, Rex1 ve Klf ekspresyonu görülürken; göre birbirlerinden ayrılabilirler. Kök hücreler farklılaşmayla ilgili proteinlerin(Fibroblast Growth temel olarak iki grupta incelenebilirler: İç hücre Factor-FGF,Major Histocompatibility Complex-kitlesi(Inner Cell Mass-ICM) benzeri kök hücreler ve MHC,...) miktarları artmıştır. Yani, embriyonik kök post-implantasyon epiblastik kök hücreler. İç hücre hücreler hücrenin farklılaşmasını engelleyen kitlesi -enzeri kök hücrelerin diğer bir adı da saf kök proteinleri, epiblastik kök hücreler ise hücreyi hücrelerdir ve bu tip hücreler embriyonik kök farklılaşmaya hazırlayan düzenleyen genleri kontrol hücreleri ve primordial germ-çizgisi kök hücrelerini eder. Ancak DNA metilasyonu ve histon modifikas-içerirler. Post-implantasyon epiblastik kök hücre- yonları da miRNA'nın çalışmasını düzenlemede rol lerin diğer adı primed(farklılaşmaya daha yakın) oynar. Burada bir cross-talk mekanizması görülür. kök hücrelerdir ve yalnızca epiblast kök hücreleri Ayrıca miRNA'ların transkripsiyonel seviyede de

hükök makale

mayıs 2012 49

hükök derleme

epigenetik kontrolü olduğu düşünülmektedir. göre değişiklik göstermektedir. Bunun mekanizması tam olarak bilinmemekle bir-likte, transkriptlerin yaklaşık 1/3'ünün miRNA'lar Fazla miktarda yalama ve bakım davranışı gösteren tarafından kontrol edildiği düşünülmektedir. annelerin yavrularının hipokampüslerinde gluko-

kortikoid reseptörü(GR) ekspresyonu ve gluko-Epigenetik mekanizmalar birçok yaşamsal fonksi- kortikoid feed-back mekanizmasının duyarlılığı yonda ve çoğu hastalıkta önemli rol oynamaktadır. artarken, hipotalamik Kortikotropin Releasing Hücre gelişimi ve farklılaşmasından yaşlanmaya, Factor(CRF) ekspresyonu azalmıştır. Bu değişiklikler depresyondan otoimmün hastalıklara, genomik sonucunda ise yavrunun herhangi bir stres baskılamadan Barr cisimciği oluşumuna kadar uyaranına tepkisinin daha makul düzeyde olduğu birçok olayda epigenetiğin etkilerini görmek görülmüştür. Bu değişikliklerin mekanizması tam mümkündür. Hücre farklılaşması ve gen ekspres- olarak bilinmese de, bazı çalışmalar, olası bir yola yonundaki işlevinden dolayı, epigenetik, kök hücre işaret etmektedir. Buna göre, yavrudaki bu davranış ve kanser çalışmalarında da gittkçe artan bir öneme değişikliği, annenin yalama ve bakım davranış-sahip olmaktadır. larının oluşturduğu yüksek miktardaki dokunsal

uyaranın etkisiyle oluşmaktadır. Yüksek dokunsal uyaranlar, yavrunun hipokampüsünde serotonin seviyesini artırarak birtakım hücreiçi reaksiyon zincirlerini ve bazı transkripsiyon faktörlerini(nerve growth factor-inducible protein A- NGFI-A,cAMP response elementbinding protein-CREB, specific protein 1-SP1) harekete geçirmektedir. CREB, histon asetilasyonunu sağlayarak, NGFI-A ve SP1'in DNA demetilasyonunu katalizlemesini kolaylaştırır. GR geni, bu modifikasyonlarla ekspresyona hazır hale gelir. Böylece GR miktarı artırılmış olur ve yavrunun stres karşısındaki tepkisi düzenlenir. Bu deney, genetik faktörlerin yavru davranışı üzerin-deki etkisini görmek amacıyla, doğumdan hemen sonra yüksek ve düşük yavrusunu yalama ve yavru bakımı davranışları gösteren annelerin yavruları değiştirilerek tekrarlanmıştır. Bu deney sonucunda

Epigenetiğin sonraki nesiller üzerindeki etkisini in-celemek amacıyla yapılan bir araştırmada uyaran-larca zengin bir çevrede yetişen dişi farenin yavrularında hafıza testlerinde diğerlerinden daha iyi sonuçlar elde edildiği gözlenmiştir. Ayrıca, öğrenmeyle ilgili bazı genetik bozukluklara sahip anne farelerin zengin çevre ve keşfetmeye açık bir ortamda bu bozuklukları tolere edebileceği gösterilmiştir. Anne farelerin, bu yolla edindikleri hafızayı yavrularına aktarma yolu kesin bir şekilde bilinmemekle birlikte, çevrenin annede yarattığı değişikliklerin, hormonal yollarla yavruda da benzer etkiler oluşturduğu düşünülmektedir.

Başka bir araştırmada ise, anne farelerin doğum-dan sonraki ilk hafta gösterdikleri yavrusunu yalama ve yavru bakımı davranışlarının, yavrular üzerindeki etkisi incelenmiştir. Her annede farklı olan bu davranışların, yavruların ileriki yaşamında büyük öneme sahip olduğu belirlenmiştir. Yavrular büyüdüklerinde bir stres uyaranına verdikleri tepkiler, bu yalama ve yavru bakımı davranışlarına

mayıs 201250

hükökderleme

mayıs 2012 51

ise düşük yalama ve yavru bakımı davranışı göste- hücreler, farklılaşmış hücrelerden daha fazla DNA ren annelerin yavruları, yüksek yalama ve yavru metilasyonu olan bölge içerirler. Ancak bu iki hücre bakımı gösteren anne farelerce büyütüldüğünde, tipinde farklı protein bölgeleri metilasyona bu yavrularda da yüksek GR seviyesi saptanmıştır. uğramıştır. Örneğin; OCT4/POU5F1 ve NANOG gibi, Sonuç olarak, yavrunun strese verdiği tepki, genetik hücrenin pluripotent özelliklerinin sürdürül-özelliklerindense, erken dönemde karşılaştığı mesinde görev alan genlerin promoter bölge-bakım davranışının miktarıyla şekillenmiştir. lerindeki CpG adaları, kök hücrelerde metilasyona

uğramamışken, hücre farklılaştığında bu bölgelerin

Kök hücre, kendini yenileyebilme ve birden çok metilasyonu başlar. hücre çeşidine dönüşebilme özellikleri nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken konulardan biridir. Embriyonik kök hücrelerin kendilerine ait miRNA Kök hücreler, benzer bir epigenetik profil dizilerine sahip oldukları da belirlenmiştir. Bu sergilemelerine karşın, tüm kök hücre tipleri miRNA'lar (ör:cancer associated mir17 ve mir372 birbirinden farklı yenilenme ve farklılaşma ailesi), farklılaşmamış hücrelerde yüksek oranlarda kapasitelerine sahiptirler. Örneği; yetişkin(somatik, bulunmaktadırlar. Fareler üzerinde yapılan çalış-multipotent) kök hücreleri, embriyonik kök malarda da bu miRNA'ların indüklenmiş pluri-hücreden daha kısıtlı farklılaşma kapasitesine potent kök hücre elde edilmesinde kullanılmasının, sahiptir. Yetişkinde görülen hematopoetik kök hücrelerin yeniden programlanma verimini hücreler kan hücrelerine, nöral kök hücreler arttırdığı gözlenmiştir.nöronlara ve gliya hücrelerine, mezenkimal kök hücreler ise bağ dokusu hücrelerine dönüşebilirler. Bazı araştırmalar göstermiştir ki; embriyonik kök Ancak embriyonik kök hücre grubunu da içine alan hücrelerdeki birçok baskılanmış gen, aynı anda pluripotent kök hücreler, tüm hücre çeşitlerine proteinleri daha çok kullanıyorlar. Bu durum, iki tip dönüşebilmektedirler. kök hücrenin birbirine zıt mekanizmaları kullan-

dıkları şeklinde de yorumlanabilir.Epigenetik açıdan incelendiğinde, kök hücreler ve farklılaşmış hücreler farklı özellikler gösterirler. Kök Pluripotent hücrelerin, embriyonik ve yetişkin pri-

hükök derleme

hükökmakale

mordial germ hücrelerinden de elde edilebileceği bazı genler incelenmiştir. Bu araştırmada,kültür görülmüştür. Bu hücreler de diğer pluripotent hüc- ortamındaki embriyonik kök hücrelerde, kansere reler gibi kimera ve teratoma oluşturma özelliği yol açabilecek genlerdeki aktivite değişiklikleri taşımaktadırlar. Bu hücrelerin ilginç bir özelliği ise; incelenmiştir. Sonuç olarak; kültür ortamının embriyonik kök hücrelerin aksine, somatik hüc- embriyonik kök hücrelerde, kanserde görülen relerle aynı ortama konduklarında, onların deme- tümör baskılayıcı genlerin baskılanmasına yol aça-tilasyonunu uyarabilmeleridir. Böylece farklılaşmış bileceği belirlenmiştir. Ayrıca, hücre gelişiminde ve hücreler, 'başlangıç ayarlarına dönebiliyor. Ancak proliferasyonda rol aldığı bilinen ve kanser hücre-embriyonik germ hücrelerinden elde edilen kök lerinde baskılanmış olarak bulunan bazı genlerin de hücrelerden elde edilen bu sonucun, yetişkin germ kültür ortamında metilasyona uğradığı görülmüş-hücrelerinden elde edilen kök hücrelerde aynı tür. Yine de, bu bilgilere dayanarak kök hücrelerin şekilde işleyip işlemediği kesin olarak bilinme- epigenetik stabilitesi hakkında kesin bir yorum mektedir. yapmak güç olacaktır.

Son olarak, Takahashi ve Yamanaka, somatik fibro- Kök hücre alanında hızlı bir gelişme sağlanmasına blastlarda Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon rağmen çözümlenmemiş sorunlar varlığını faktörlerinin aşırı sentezlenmesini sağlayarak, sürdürmektedir. Çeşitli kök hücrelerin stabilizas-fibroblastların pluripotent kök hücreye dönüşe- yonunun sağlanması, saf pluripotent hücrelerin bileceğini göstermişlerdir. Bu pluripotent kök elde edilmesi ve bunun devamının sağlanması ve hücrelere, indüklenmiş pluripotent kök hücreler bu kök hücrelerin istenen hücre tipine farklılaşması denir. Bu hücreler, saf pluripotent kök hücrelerin için gerekli kültür koşullarının tespit edilmesi tüm genel özelliklerini gösterirler. özellikle önemlidir. Kök hücre teknolojisini insan

embriyolarına daha etkili bir şekilde uygulaya-Embriyonik kök hücreler ve indüklenmiş pluri- bilmek için, bu sorunlara farklı deneysel ve teorik potent kök hücreler karşılaştırılırken, bu iki hüc- bakış açılarıyla yaklaşılmalıdır.. Bu alandaki renin birbirine denk olup olmadığı sorusu gündeme sorunların çözümlenmesiyle, araştırmacılar belirli gelmiştir. İndüklenmiş kök hücrelerde, farklılaş- bir hastalığa özgü bir tedavi için deneysel şartlar masında ya da transplantasyonda oluşangenetik ya sağlayabilecekler ve kişisel rejeneratif tıp için da epigenetik bir değişiklikten kaynaklanan ve bu gelişmiş çalışmaların temeli atılacaktır.hücrelerin özelliklerinin, embriyonik kök hücrelerin özelliklerinden sapması olasılığı ve bunun isten-meyen sonuçlara yol açabileceği ihtimali göz ardı edilmemelidir.

B lenfositlerinden elde edilen indüklenmiş kök hücrelerle embriyonik kök hücreleri karşılaştıran bir araştırma; transkripsiyon faktörleriyle yeniden programlanmış bir indüklenmiş pluripotent kök hücrenin, önceki hücreden kalan epigenetik hafızayı taşıyabileceğini ortaya koymuştur. Bununla beraber çekirdek transferiyle elde edilen embri-yonik kök hücrelerde bu hafıza görülmemiştir. Bunun sebebi, çekirdek transferini epigenetik ha-fızayı sıfırlaması olabileceği gibi, embriyonik kök hücre kültürlerinde kullanılan ancak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde kullanılmayan ERK inhibitörü(yeniden programlanmayı tamamlamayı sağlayan bir faktör) de olabilir.

Başka bir sorun ise embriyonik kök hücrelerin epigenetik stabilitesinin sağlanıp sağlanama-yacağıdır. Bir çalışmada erken ve geç geçiş dönümündeki hücreler ve bunlarda, kanser hücre-lerinde genelde fazla DNA metilasyonu görülen

mayıs 201252

hükökderleme

Referanslar:

1. Altun G. Laurent L C. Loring J F. Epigenetic remodeling and stem cells. Drug Discovery Today: Technologies. 2008:5:139-142.

2. Brooks W H. Le Dantec C. Pers J O. Youinou P. Renaudineau Y. Epigenetics and autoimmunity. Journal of Autoimmunity. 2010:34:207-219.

3. Buchen L. In their nurture. Nature. 2010:467:146-148.

4. Collas P. Epigenetic states in stem cells. Biochimica et Biophysica Acta. 2009:1790:900-905.

5. Hanna J H. Saha K. Jaenisch R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 2010:143:508-525.

6. Hewagama A. Richardson B. The genetics and epigenetics of autoimmune diseaes. Journal of Autoimmunity. 2009:33:3-11.

7. Juliandi B. Abematsu M. Nakashima K. Epigenetics stem cells and cellular differentiation. Handbook of Epigenetica: The new Molecular and medical Genetics.Editor T. Tollefsbol. London: Elsevier, 2011:315-328.

8. Khamsi R. Twins grow apart as they age: genetic tests reveal how the environment changes our DNA. N a t u r e : 2 0 0 5 : A v a i b l e f r o m U R L http://www.nature.com/news/2005/050704/full/news050704-3.html

9. Maher L. In their nurture. Nature: 2010:467:146-148.

10. Mathews H L. Janusek L W. Epigenetics and psychoneuroimmunology: Mechanisms and models. Brain Behavior and Immunity 2011:25:25-39.

11. McKay R. Stem cell epigenetics: Is it all dowmhill from here?. Cell Stem Cell. 2007:July:15-16.

12. Muyrers-Chen I. Renato P. Epigenetics: Unforeseen regulators in cancer. Biochimica et Biophysica Acta. 2001:1552:15-26.

13. Pannetier M. Feil R. Epigenetic stability of embryonic stem cells and developmental potential. Trends in Biotechnology. 2007:25:556-562.

14. Roloff T C. Nuber U A. Chromation epigenetics and stem cells. European Journal of Cell Biology. 2005:84:123-135.

15. Spivakov M. Fisher A G. Epigenetics signatures of stem-cell identity. Nature Reviews. 2007:8:263-271.

hükök makale

mayıs 2012 53

hükök derleme

on birkaç yıl içinde hemen hemen insan embriyonik kök hücre-Sleriyle(hESC) aynı

olan, yenilenme terapileri için daha fazla potansiyele sahip indüklenmiş pluri-potent kök hücreler(iPSC) elde edildi(Yu ve Takahashi, 2007).iPSCler normal yetiş-kin dokularından köken-lenmiş ancak hESC pluri-potentliği için temel olduğu düşünülen proteinleri üret- oranı çok düşüktü. Dolly ve diğer klon hayvanlar mesi için yönlendirilmiş hücrelerdir. Yetişkinin gibi capcanlı kanıtlar, yetişkinin somatik hücresinin hücrelerine bu ESC proteinlerinin ekspresyonunu yeniden programlanıp embriyo benzeri hücre elde sağlatmak suretiyle görünüş ve fonksiyon edilebilirliğinin bilimsel çevrelerde yeniden ilgi bakımından hESClerle neredeyse aynı hücreler elde odağı olmasını sağladı.edilebilir.

Üretilmesinden bu yana iPSC teknolojisi büyük Yetişkinin dokularından yeniden programlama gelişmeler gösterdi. Araştırmacılar yetişkinin hücre suretiyle embriyonik benzeri pluripotent kök hücre genomunu doğrudan değiştirmeden anahtar elde edilmesi fikrinin ortaya çıkışı iPSClerin yeniden programlama proteinlerini hücrelere eldesinden çok daha uzun zaman öncedir. Ancak dağıtarak iPSCler elde etmeyi başardı.tamamen farklılaşmış bir hücrenin çekirdeğinin yeniden programlanabilip programlanamayacağı SCNT ve transkripsiyon faktöre dayalı yeniden çeşitli gruplara yıllarca tartışma konusu olmuştur. programlama yöntemiyle herhangi bir dokudan Eski çalışmalar embriyodan elde edilen çekirdeği alınan hücrelerin emriyonik hale döndürüle-kullanmış olsa da sonuçlar somatik hücre çekirdeği bileceğini yani pluripotent kök hücre elde edile-transferine(SCNT) temel oluşturmaktadır. SCNT, bileceğini söylemiştik. Bu iki yeniden programlama somatik hücreden alınan çekirdeğin çekirdeksiz yönteminin farklı mekanizma ve kinetikte gerçek-yumurta hücresine yerleştirilip gelişerek yetişkin leşiyor oluşu genomik metilasyon,gen ekspres-bir organizma eldesi; yani çekirdek vericisi yonu gibi epigenetik özellikleri yeniden oluştur-hayvanın klonlanmasıdır. İlk olarak koyun ması sebebiyle elde edilen pluripotent hücrelerin Dolly'nin,sonrasında diğer hayvanların başarıyla de farklı özelliklere sahip olabileceği fikrini akla klonlanması birbirini izledi.Ancak bu yöntemde getirdi. Ayrıca iPSClerin kökenlendiği dokuya ait bazı problemler hala devam etmekteydi ve başarı bazı verileri hala barındırabileceği fikri (epigenetik

hükök

MAKALE

iPS Hücrelerin Epigenetiği

Ceyda Acılıoğlu

mayıs 201254

bellek) de ortaya atılmıştı. iPSCler de fESCler (fetüs şeye farklılaşabiliyor demektir, yani kök hücredir. embriyonik kök hücre) ve ntESCler(çekirdek trans- (bkz:2)ferli embriyonik kök hücre) gibi teratoma oluşturup 3 embriyonik germ tabakasına ait dokulara Sonra üretilen bu kök hücrelerin kemik(osteojenik) farklılaşabiliyordu. Ancak transkripsiyon faktöre ve kan(hematopatik) hücrelerine ne kadar verim-dayalı ve çekirdek transferine dayalı yeniden prog- lilikte dönüştüklerine baktılar. ntESC ve fESClerin ramlama özelikle DNA metilasyonuna bakıldığında iPSClerden daha fazla hematopatik koloni oluş-belirgin bir şekilde birbirinden ayrılmaktaydı. turduğunu; iPSCler karşılaştırıldığında ise kan kö-Araştırmacılar çeşitli pluripotent hücrelerin , iPSC- kenli B-iPSClerin ,F-iPSClerden daha fazla hema-ntESC-fESC ,farklılaşma potansiyellerini ve genomik topatik koloni oluşturduğunu(bkz:3) gözlem-metilasyonlarını karşılaştırdılar.Ve iPSClerin epi- lediler. Benzer şekilde F-iPSClerin B-iPSClere kıyasla genetik bellek denebilecek bir oluşum ile köken- daha kolay osteojenik koloni oluşturduğu,daha lendiği dokunun metilasyon özelliklerini kaybetme- fazla kalsiyum depoladığı(bkz:4) ve osteoblastik diklerine yönelik kanıtlar buldular. Deneylerine genleri daha fazla eksprese ettiği sonucuna başlamadan önce karşılaştıracakları hücrelerin ulaştılar.gerçekten kök hücre karakteri kazandıklarını ispatlamaları gerekti. Bunun için 2 yöntem kulla- Daha sonra farklı pluripotent hücrelerin farklı nılabilir: genetik DNA metilasyon özellikleri barındıra-

bileceği düşüncesiyle CHARM(geniş kapsamlı Ya immünohistokimya ile embriyonik bazı metilasyon analizi)analizini yaptılar.Bu analize göre proteinlerin üretildiği gösterilebilir(bkz:1) ya da fESClere en çok benzeyen ntESCler;en çok farklılık farenin üstüne ekerek teratoma oluşumu gösterenler ise F-iPSCler oldu(bkz:5).Sonra doku sağlanır;eğer 3 germ tabakasına ait doku varsa her kökeninin (kemik iliği ya da fibroblast) dokuya özgü

mayıs 2012 55

hükök makale

mayıs 201256

metillenme durumuna göre belirlenip belirlene- profilinin yeniden kurulabileceği anlaşıldı. Örneğin meyeceğini merak ettiler: Somatik hücre ve iPSC- kan farklılaşması yetersiz nöral progenitör kaynaklı lerdeki metillenmeleri inceleyerek F-iPSC küme- iPSCler (NP-iPSC) kana farklılaştırıldıktan sonra lerinin fibroblastlara yakın kemik iliğinden uzak ;B- yeniden programlandırılıp pluripotent hücre iPSClerin de kemik iliği hücreleriyle gruplandığını olduğunda kan oluşturma potansiyelinde belirgin gözlemlediler. Bundan yola çıkarak metillenme bir artış olduğunu saptadılar.profilinin iPSClerin kökenini gösterdiği sonucuna vardılar. Ayrıca bu 'iPSClerde epigenetik bellek' Ancak bu deneylerde karsılaştırılan pluripotent fenomenini destekleyen bir başka bulgudur. hücreler erken pasajlanmıştır. Devam eden seri

pasajlamalarla bu pluripotent hücre çeşitlerinin Sonra B-iPSC,F-iPSC ve ntESC lerdeki farklı metil- farklılaşma potansiyellerinin birbirine daha çok lenme profilinin birbirinden farklı yeniden pro- yaklaşacağını öne sürdüler. Kültür ortamında gramlamalara neden olabileceği varsayıldı ve bu devam eden pasajlama sonrası kandan, fibro-varsayım 2 bağımsız hesaplama analiziyle destek- blasttan ve kastan kökenlenen iPSClerde benzer lendi. Erişkin farenin farklı dokularından kökenlen- epigenetik bellek olduğunu saptayarak belleğin miş iPSCler karşılaştırıldığında kemik iliğinden yok edilebildiğini belgelemiş oldular.pluripotentliği üstün özellikte kök hücreler elde edildiyse de hiçbir iPSC ntESCye ya da fESCye Başka bir araştırma grubu da hücre kökeninin eşdeğer olamadı. iPSClerin moleküler ve fonksiyonel seyirlerinde

etkisini inceledi.Bu incelemeleri yaparken 2 Daha sonra sekonder ve tersiyer iPSClerde yapılan kimerik erişkin fareden alınan genetik olarak aynı deneyde farklılaşma eğilimi ve metillenme fakat kökeni bakımından farklı 4 hücreden üretilen

hükökmakale

hükök makale

iPSCleri kullandılar. Kuyruktan alınan fibroblast (TFF), dalaktan alınan B-hücresi,kemik iliği tü-revli granülosit(Gra) ve iskelet kası öncülü(SMP) hücrelerine yoğunlaştılar.(bkz:6)

İlk olarak iPSClerin kökenlendiği somatik hücre-nin gene ekspresyon seyrini gösterip göster-mediğine baktılar. Ve beklendiği üzere SMP-

deki farklardan kurtulup kurtulamayacağını ince-iPSClerin SMP belirteci olan itgB1 ve CxCr4'ü Gra-

lediler. Devam eden pasajlamanın epigenetik iPSClerden oldukça fazla;Gra-iPSClerin de granü-

farklardan kurtulmada öncü olduğunu saptadılar. losit belirteci olan lyzozim ve Gr-1'i SMP-iPSC'den

Benzer transkripsiyonel ve epigenetik seyri olan çok daha fazla eksprese ettiğini saptadılar(bkz:7-

kökenleri farklı iPSClerin farklılaşma potansiyelleri-8).Bundan yola çıkarak da iPSClerin kökenlendiği

nin de eşitlenip eşitlenemeyeceğini merak ettiler hücreye ait transkripsiyonel belleği kaybetmediği

ve deneyler sonucunda iPSClerin farklılaşma sonucuna ulaştılar.

potansiyellerindeki farklardan kurtulabilecekleri sonucuna vardılar.

Sonra bu gözlemledikleri gen ekspresyonu farklılık-larının epigenetik işaretlerdeki farklarla ilişkili olup

iPSClerle ilgili çalışmalar halen devam etmektedir olmadığını merak ettiler. Ve donör hücre çeşidinin

ve çok da uzun olmayan bir zaman sonra iPSClerin yalnızca iPSClerin transkripsiyonel seyrinde değil

çok fazla kullanılacağı öngörülmektedir.aynı zamanda metilasyon profilinde de etkili olduğunu saptadılar.(bkz:9)

Daha sonra bu 4 hücre çeşidinin iPSClerinin embri-yoid cisim, eritrosit ve makrofaj oluşturabilme özeliklerini incelediler ve hücrenin kökeninin iPSClerin farklılaşma potansiyelini koşullandıra-bileceği sonucuna vardılar.

Son olarak devam eden pasajlamayla, iPSClerin gen ekspresyonundaki ve farklılaşma potansiyellerin-

mayıs 2012 57

Optogenetiğin Çıkışı: m e t o d u n e n önemli özelliği

Nörobilimin karşılaştığı en büyük engel, tek bir olan; ışıkla bera-hücreyi aktive ederken diğerlerini değişmeden ber zar potansi-bırakabilmektir. Bilinen yöntemlerden elekt- yeli değişimidir. rotlar çok iyi lokalize olamaz ve diğer hücre Bu iki yolla sağla-gruplarını da uyarırken; ilaçlar genelde çok nabilir. İlk olarak yavaş etki göstererek hücresel olayların ani ışığa bağımlı bir madde beyine verilir, bu cevaplarının görülmesini engeller. Bu temel madde için nöronlarda genetiği değiştirilmiş sorunu çözmek için Francis Crick ışığın kontrol bir reseptör yaratılır. Alternatif olarak mikroor-mekanizması olarak kullanılmasını önerse de ganizmalarda bulunan ve ışığa karşı duyarlı araştırmacılar tarafından herhangi bir öneri microbial opsin molekülleri kullanılabilir. Buna geliştirilememiştir. 2002'de ışıkla uyarılan en önemli örnek channelrhodopsin-2 resep-alglerin ışıktan kaçtığı fark edilmiş, buna bir törüdür. Mavi ışıkla uyarıldığında depo-transmembran proteini olan channel- larizasyona neden olan bu reseptör türü rhodopsin-2'nin neden olduğu ileri sürülmüş- nöronun aktive olmasını sağlar. Ayrıca tür. Bu proteinin bulunması, araştırmacıların variantlarıyla tonik veya fazik uyarılar da hücrenin ışıkla yönetilmesi fikrini gerçekleş- oluşturabilir. Halorhodopsin reseptörü kulla-tirmesini sağlamıştır. nıldığında ise nöron sarı ışıkla hiperpolarize

olur. Bu şekilde nöronun inhibisyonu sağlanır. Optogenetiğin Özellikleri Ve Uygulaması: Yine variantlarıyla daha kalıcı hiperpolari-

zasyon elde edilebilir. Bazen zar potansiyeli Optogenetik metodun çalışmasında dört temel kontrolü membran reseptörleri yerine prensip bulunmaktadır. Bunlardan ilki intraselüler G-proteinleri ile de sağlanabilir.

Bir Method Olarak: Optogenetik

Optogenetik spesifik hücrelerin belirlenmiş fonksiyonlarını incelemek için genetik ve optik metotların birleştirilerek kullanılmasıdır. Nörobilim alanından çıkmasına rağmen optogenetik; belirli veya istenen bir olayın, belirli bir zamanda belirli ve sağlam hücre grupları üzerine etkinliği gibi çok daha geniş bir bilimsel amaca hizmet etmektedir. Ayrıca optogenetik metodu bu sayede bizim tek başına bir hücrede meydana gelen reaksiyonlara organizmanın verdiği tepkiyi görmemizi sağlaması açısından çok değerlidir. Daha şimdiden bir çok hastalığın tedavisinde ve bir çok fizyolojik olayın açıklanmasında tek nöronun aktivitesinin önemini gösteren optogenetik, bilim dünyasının en prestijli ödüllerinden biri olan “Nature Methods 2010” yılı ödülüne layık görülmüştür.

Tuna Üstünkaya

hükök

mayıs 2012 58

METOD

mayıs 2012 59

hükök metod

Örneğin kimerik bir protein olan metot sayesinde, elektriksel OptXR proteinleri G-protein artifakt nedeniyle elektriksel kaskadı kontrolünde, PhyB protei- stimulasyonu takiben okuna-ni ise GTPaz kontrolünde kullanı- mayan elektriksel kayıt, artifaktın larak nöronal modülasyona etkide yok olması sayesinde simultane bir bulunabilir. biçimde kaydedilebilir hale gelmiş-

tir. Bu simultane kayıt teknolojisi İkinci önemli nokta gerekli gen- verdiğimiz uyarının organlarda lerin transfer edilmesidir. Genler nasıl dönüştürüldüğünün yorum-transenfeksiyon yoluyla, viral lanmasında devir açabilecek transdüksiyon yoluyla veya trans- önemdedir.genic hayvan modelleri yaratılma-sıyla organizmaya aktarılabilir. İstenilirse Cre-Lox sistemi kullanı-larak gen aktarımının sadece belirli hücrelere REFERANSLARaktarılması sağlanır.

1. Deisseroth, Karl. "Optogenetics." Nature Methods 8 Üçüncü olarak ışığın hücreye aktarımı çok kritik bir (2011): 26-29.

rol oynar. In vitroda foton scanning mikroskoplarla 2. Pastrana, Erika. "Optogenetics: Controlling Cell sağlanan ışıklandırma, in vivo koşullarda genel Function with Light." Nature Methods 8 (2011): 24-25.olarak optik fiberlere bağlı ışık kaynaklarıyla veya

küçültülmüş LEDlerle sağlanmaktadır. Son 3. www.youtube.com Method of the Year 2010:

zamanlarda iki foton scanning mikroskobu ve Optogenetics.

temporal fokuslama ile hücrenin sadece küçük bir

segmenti aktive edilebildiği gibi, digital microaynalama gibi sistemle belirli bir alandaki nöronların tümü de aktive edilmeye başlanmıştır.

Dördüncü ve son prensip ışıkla meydana gelen ani olayların kaydedilmesidir. Genellikle bir elektrot aracılığıyla yapılırken, bazen florasan bazlı biyoreseptörlerle de yapılabilir.

Gelecek imkanlar:

Yukarıda da belirtildiği gibi bazı hücre kaskadlarının (G-protein yolağı, GTPaz'lar) ışık yoluyla değiştirilebilmesi; vücuttaki her hücrenin kontro-lünü ani bir şekilde, elektrikle uyarılabilirliğine bakılmaksızın sağlayabilecektir. Bu uygulamalar günümüzde nöronların yanı sıra, kas hücresi, kardiyak hücresi ve embriyonik kök hücreler üzerinde de kullanılmaya başlanmıştır. Bunun dışında channelrhodopsin'le alınan Ca glia hücrelerini uyarmakta kulla-nılmaya başlandığı gibi, Ca tarafından düzenlenen T-lenfosit-ler, insulin salgılayan B hücreleri gibi birçok hücrede de kullanıla-bilir. Optogenetik metodun hızlı ve spesifik olması fizyolojik sistemlerin input-output meka-nizmalarının anlaşılmasında bü-yük faydalar sağlamaktadır. Bu

ıl 1961, Paris'teki 2000 yılının sonlarına doğru, 9 bilim insanı, PU.1'in “Institut Pasteur”, GATA-1 ve eritroid farklılaşmasını GATA-1 faktörünün sonunda genlerin DNA'ya bağlanmasını fiziksel olarak engellediğini Ydüzenlenmesinde gösteren bir çalışma ortaya koyar. Bu makaleye ek

ki “O-peron” teorisine olarak 2009 yılında Thomas Graf ve Tariq Enver, ula-şacak bir çalışmaya hücrelerin miyeloidden eritropoide yeniden ev sahipliği yapar. Bilim programlanması sürecinde GATA-1 ile PU.1 trans-

dünyası daha DNA molekülünün yapısının farkına 8 kripsiyon faktörlerinin birbirlerini antagonistik bir yıl önce, 1953'te, varmışken François Jacob ve biçimde etkilediklerini yayımladıkları makaleyle öne Jacques Monod'un “Escherichia coli”nin laktozu sürerler. Lizogenik programlamayı çalıştıran nasıl sindirebildiği konusundaki incelemeleri, transkripsiyon faktörü aynı zamanda litik programı epigenetik ve hücrelerin yeniden programlanması baskılayarak bu ikisini dengeler. Bu durum elektrik çalışmalarının önünü açar. Escherichia coli için bu anahtarına benzetilebilir. Bir anahtarla elektriğin düzenleme “lac operon” olarak adlandırıl- geçişine ya izin verirsiniz ya da vermezsiniz; ancak maktayken, genel anlamda “operon” modeli her iki durumda da anahtar bulunduğu konumdan operatörlere ve repressörlere, cis ve trans birimler, memnundur. Hem litik hem de lizogenik durumda dayanır. Genlerin düzenlenmesi konusunda bazı gen ifadesinin tanımlanması böyle bir sistemin temel gerçekleri ortaya çıkarmak, sonrasında da varlığında dengelenmektedir. Bu benzerlikler, bizlere açıklamak açısından bu çalışma önemli bir basamağı bir bakteriofajın gelişmiş bir memeli hücresinin oluşturur. transdiferansiyasyonu sırasında kullanılan sistemin

mantığını kavramada ne kadar önemli olabileceğini 6 yıl sonra 1967 yılının içerisinde, Mark S. Ptashne, gözler önüne sermektedir. Ayrıca, denizkestaneleri diğer bir düzenleyici devrenin işleyişini ortaya üzerinde araştırma yaparak sonuçlarını 2010 yılında koyduğu çalışmasını bilim dünyasının bilgi birikimine literatüre sunan Erik Davidson, makalesinde eski sunar. “Bakteriofaj lambda”nın hem litik hem de çalışmaların sonuçlarıyla çelişen herhangi bir bulgu lizogenik özelliğinin bulunması şimdi şu soruyu akla belirtmez. Biz insanoğlu, gelişmişliğin ve karmaşanın getirir: “Bu iki özellik aynı anda ortaya çıkama- anlamlandırılması peşinde ne kadar koşarsak yacağından hangisi ne zaman ve nasıl baskın koşalım basitliğin ve temelin önemini göz ardı olabilir?” Bu sorunun kaderini DNA'nın bazı özel edemeyiz. Bu bilimsel gelişim de bu düşüncenin bölgelerine bağlanmaya çok yatkın bir repressör doğruluğunu kanıtlayan gerçeklerden sadece biri belirlemekte ve bu repressör, çevresel etkenlere değil mi? tepkisel bir tutum sergiler. Böylece, değişen çevre koşullarına uygun “adaptasyon”un nasıl elde edildiği Böylece, transdiferansiyasyon ve yeniden program-sorunu çözümlenebilir. Bu basit sistemin anlaşıl- lamanın geldiği bu nokta, hücrelerin kaderlerini ması, bilimsel gelişim süreci için önemli bir dönüm nelerin belirlediği konusunda bizi transkripsiyon noktası mıdır? Memelilerin hücre dizilerinin faktörleriyle düzenleyici döngüleri daha fazla transkripsiyon faktörleri doğrultusunda şartlanarak incelememiz gerektirdiği konusunda için yönlen-dönüşecekleri hücre türlerine farklılaşması sistemsel diriyor.bir anlayışla ele alındığında herhangi bir dönüm noktası değil midir? Bakteriofajlar gibi basit bir sistem, karmaşık sistemlerin birlikteliğini açıklayacak benzerliklere nasıl sahip olabilir ki? Bu konuda biraz daha ileri gidelim.

hüköktek sayfa

TRANSKRİPSİYON FAKTÖRLERİ

veDÜZENLEYİCİ

DÖNGÜLER Gökhan Uruk

mayıs 201260

Giriş lanışı olarak betimlemiştir. Bu yolculuğun sonunda hücre gelişimsel yollardan yuvarlanarak bir vadinin

Rejeneratif tıpın birincil amacı hasarlı ve hastalıklı sonundaki kararlı, “terminal diferansiyasyon” hücrelerin tamiri ve yenilenmesi için yeni hücreler evresine ulaşır. Eritrosit, keratinosit veya nöron gibi üretmektir. Bunu amaçlayan fikirler içinde en ilginci birçok hücre bu evreden sonra bölünme kabiliyetini ve yenilikçi olanı bir hücre çeşidini başka bir kaybeder. Sayılı örneği olan bölünebilen hücreler hücreye dönüştürme fikri. Örnek olarak, insan ise aynı şekilde terminal diferansiyasyon evre-vücudunda bol bulunan dermal fibroblast ve sindeki hücreler üretir. Yetişkin hücrelerin farklı adipositlerin elde edilip nöron, kardiyomyosit veya hücre tiplerine dönüşme kabiliyetleri (yani pankreatik β hücreleri gibi daha önemli hücrelere plastisiteleri) gözlemlenmiş olmasına karşın canlı dönüştürülmesi verilebilir. Bu immünolojik olarak organizmada fizyolojik ya da gelişimsel önemde eşleşen hücreler yeniden hastaya nakledilerek kayda değer oranda gerçekleşmemektedir.hastanın kendi hücrelerini geri alması sağlanabilir. Bu da adeta bir deri parçasının başka bir amaca Hücre Dönüşümünde Değişik Yaklaşımlaruygun hale getirilerek kalbe veya pankreasa yerleştirilmesine benzer. Buraya kadar olan bölümde normal gelişim ve

fizyolojik devamlılığı tartıştık. Fakat aynı zamanda, Yetişkin Hücrelerin Kararlılığı hücrelerin deneysel manipülasyonla terminal

diferansiye olmuş hücrelerin bile değişebileceğinin Yetişkin hücrelerin yeniden yapılmasındaki en önemine de vurgu yapmak gerekir. 1960larda büyük sorun, bu hücrelerin önemli derecede kararlı amfibiler üzerinde yapılan deneyler olgun bir olmalarıdır. Farklılaşmış hücrelerin evrelerini hücrenin kimliğinin tersine çevrilebileceğini muhafaza etmeleri yıllar alır, nadiren farklı bir gösterdi. Yetişkin hücreden alınan çekirdeğin evreye geçerler ve doğruyu söylemek gerekirse bu döllenmemiş yumurta hücresine aktarılması değişim kanseröz hücrelerin oluşumu dahil kötü sonucu farklılaşma tamamen tersine döndürüldü sonuçlar doğurabilir. Conrad H. Waddington, öncü ve yetişkin hücrenin çekirdeği tam bir canlıyı bir embryolog, hücrelerin plüripotent embryonik oluşturabilecek plüripotent evreye döndürüldü. Bu hücreden başlayıp, olgun ve diferansiye olmuş deney çok sayıda memeli türünde de uygulanarak aşamaya gelene kadar geçirdikleri yolculuğu bir başarıya ulaştı. Bu çalışmalar farklılaşmış hücreleri topun epigenetik bir arazideki vadilerden yuvar- plüripotent evreye döndüren yeniden program-

hükök

mayıs 2012 61

Extreme Makeover:Converting One Cell into Another

Yetişkin memeli hücrelerin yeniden programlanarak başka hücrelere dönüştürülmesi mümkün kılan çalışmalar geçtiğimiz yıllarda ortaya kondu. Yani yetişkin hücreler önce plüripotent kök hücreye, sonrasında ise farklılaşma yoluyla yeni hücre türlerine rejenere oluyorlar. Buna alternatif olarak yetişkin hücreler direkt olarak diğer yetişkin veya projenitör hücrelere dönüştürülebilir. Bu iki farklı yaklaşımı karşılaştırmaya ve rejeneratif tıp için önemlerini incelemeye çalışacağız.

Çağrı Küçükkayıkçı, Mehmet Yener Çalışkaner

Albert Einstein

DERLEME

lama (reprogramming) faktörlerinin araştırılmasına Transdiferansiyasyon uzun süredir yapılan araştır-öncülük etti. Yamanaka ve ekibinin yetişkin deri malara rağmen görece olarak az bilgiye sahip hücrelerini hücre kültüründe bazı transkripsiyon olunan bir konudur. Çünkü çevrilmek istenen faktörleri ekleyerek indüklenmiş plüripotent kök hücrelerdeki ana regülatör genlerin ortaya hücreye (iPSC) çevirmeleri Waddington'ın öne çıkarılmasının önemliliği, bu konudaki genel bir sürdüğü arazideki topların vadinin tepesine doğru strateji oluşturulmasını engellemektedir. Örnek ters yönde hareket edebileceğini, yani hücrelerin olarak; MyoD adlı iskelet kaslarının özelleşmesinde gelişim evrelerinde geri sarabileceğinin bir kritik bir transkripsiyon faktörü, kültür ortamındaki göstergesi oldu. Yeniden programlama hücrenin embryonik fibroblast, kondroblast ve retinal epitel gelişimi boyunca oluşan neredeyse bütün hücrelerini kasılan kas hücrelerine çevirebilmiştir. epigenetik izleri yok ediyor ve adeta hücrenin Benzer şekilde CEBP transkripsiyon faktörü hafızasını siliyor. Bu hücrelerin in vitro ortamda sayeesinde B-lenfositler makrofajlara transdiferan-elde edilmek istenen hücre tiplerine farklılaş- siye olabilmiştir. Başka bir çalışmada ise araştır-tırılması ve terapötik uygulamalarda kullanılması macılar Math1 transkripsiyon faktörünü kullanarak rejeneratif tıpta çok güçlü bir strateji haline geldi. işitme sorununa çözüm aramış, iç kulaktaki destek hücrelerini işitme kıllarına çevirmişlerdir. Pank-Plüripotent yeniden programlamaya ek olarak bu reastaki ekzokrin hücrelerin insülin salgılayabilen β konuya farklı yaklaşımlar da var. Yetişkin hücreler hücrelerine dönüştürülmesi transdiferansiyasyon-plüripotent evreye döndürülmeden direk olarak un rejeneratif tıpta ne kadar önemli olduğunun başka yetişkin veya projenitör hücrelere göstergesi olmuştur.dönüştürülebilir. Semenderlerin uzuv rejerenas-yonu sırasında yetişkin deri, kas ve kıkırdak Dediferansiyasyon ve transdiferansiyasyon hücreleri projenitör bir evreye dediferansiye (geri hücrelerin plüripotent evreye döndürülmesini farklılaşma) olur ve sonrasında yeni bir uzuv içermez ve böylece epigenetik izlerin çoğu oluşturacak şekilde rediferansiye olurlar. Tavuk- korunmuş olur. Ayrıca programlama sonucu oluşan larda ise hasar sonrasında iristeki pigmentli yetişkin ve projenitör hücreler direk olarak hücre hücreler transdiferansiyasyon adlı süreçle lens yenileme tedavilerinde kullanılabilir. hücrelerini oluşturur. Bu duruma benzer birçok örnek verilebilir. Cynidaria (sölentere) şubesindeki Yetişkin Hücre Serisi Yeniden Proramlaması için canlıların yaşam döngüsü polip, medusa ve ölüm Geniş Stratejişeklindedir. Bir sölentere olan Turritopsis nutricula ise medusa evresinden tekrar polip evresine Yeniden programlamaya geniş ve etkili bir strateji dediferansiye olabilmekte ve bu özelliği sayesinde belirleyebilmek için geren bilgi rejenerasyondan ölümsüz olmaktadır. Sigara dumanına maruz kalma geliyor; embriyonik genlerin aktivasyonu.sonucu solunum yolu epitelinin yassı epitele ya da gastro-özofageal reflü nedeniyle mide epitelinin Bu prensip kullanılarak yetişkin pankreatik ekzokrin yassı epitele dönüşmesi gibi insandaki bazı hücreler β hücrelerine dönüştürüldü. Her iki hücre fizyolojik metaplaziler de transdiferansiyasyona tipi de aynı embriyonik kökenden gelmesine rağ-örnek oluşturur. men çok farklı morfolojik ve fizyolojik özelliklere sa-

mayıs 201262

hükökderleme

mayıs 2012 63

hip. Ekzokrinden ya transdiferansiyasyon için kullanılacak transkripsiyon faktörleri (TFler) genomun taranması sonucunda elde edildi. Öncelikle pankreatik projenitör hücrelerde ifade edilen 30 TF elde edildi. Daha sonra knockout çalışmaları ile aday gen sayısı 9'a indirildi. İlerleyen çalışmalarla bir ekzokrin hücreyi hücresine dönüştürmek için gereken TF sayısı 3 olduğu görüldü.

Peki bu çalışma diğer hücre serilerine uygulanabilir mi? Gittikçe artan hücre tiplerine özgü TF bilgisi ve iyi düzenlenmiş protokollerle bu yaklaşımı bir çok hücreye uygulamak mümkün. Örnek vermek gerekirse glial hücrelerden motor nöronlar elde etmek mümkün. Bu yaklaşım sayesinde ALS (amyotrophic lateral sclerosis) gibi hastalıkları ya da omurilik hasarları gibi hasarları gibi hasarları tedavi etmek olası. Bir başka örnekte ise kalp kası hücrelerini fibroblastlardan ya da iskelet kası hücrelerinden elde ederek, kalp krizi sonrasında oluşan hasarların tedavi edilmesi var. Her iki hücre tipi de farklı yaklaşımlarla (projenitörlerden elde etmek ya da embriyonik kök hücrelerden elde etmek gibi) elde edilebilmekle birlikte, hangi yaklaşımın tedavilerde etkili olacağını zaman gösterecek.

Rapor edilen bazı hücresel "dönüşümler" çok güçlü transkripsiyon faktörlerinin çok yüksek düzeyde ektopik olarak ifade edilmesi ile sağlanmış durumda. Bu tarz bir yaklaşım sonucunda elde gelişimsel regulatör genler yeninden programlama edilen hücrelerde belirli genler ifade olmaya faktörleri olmak için iyi birer adaydır. En iyi adaylar zorlanmıştır ancak stabil bir dönüşüm elde knockout çalışmalarında delesyonları şiddetli edilememiştir. Gerçek bir reprogramlamada gerekli gelişimsel hatalara ya da belirli bir özelliğin Tflerin yalnızca geçici ifadesi söz konusudur ve elde tamamen kaybolmasına neden olan genlerdir. edilen hücreler stabil olmalıdır. Aksi takdirde elde Hücre serisi analizleri ile de hangi aday gen hangi edilen hüceler hibrid fenotip göstereceklerdir ki bu hücrede ve gelişimin hangi evresinde ifade edildiği da transdiferansiyasyonda istenen birşey değildir. bulunabilir. Bu iki yaklaşımın geçerli olmadığı

durumlarda gelişimde önemli rol oynadığı bilinen Prensipte, yetişkin bir hücrenin hücre soyu (cell gen ailleleri arasında adaylar aranabilir. Önemle lineage) reprogramlaması ile başka bir hücre tipine altının çizilmesi gereken bir nokta ise, aday Tfler dönüşmesi mümkündür. Farklı "son" hücre tiplerini aranırken tamamiyle başkalaşıma uğramış yetişkin elde etmek için kullanılacak yeniden programlama hücreler yerine gelişimin bir kaç basamak faktörlerini belirlemek için iki önemli soru aşağısındaki henüz tam başkalaşım geçirmemiş önümüzde durmaktadır. İlki, hangi genler testler hücrelere bakılmalıdır.için iyi birer adaydır? Ve ikincisi, testin in vivo olarak mı yoksa in vitro olarak mı yapılması gerek- Aday genler bir kez belirlendi mi in vivo ya da in mektedir? vitro testlere başlanabilir. İn vitro teslerin avantajı

bir çok TFnin paralel olarak test edilebilmesi iken, Her yeniden programlama deneyinin kendi içinde çoğu hücrenin kültür koşullarının çok iyi bilin-tasarlanması gerekmekle birlikte bazı genel yol memesi bir sorundur. İn vivo çalışmalarda ise göstericiler önerilebilir. Örneğin, elde edilmek yalnızca az sayıda TF ile çalışmak mümkündür ve istenen son hücre tipinde ifade edilen önemli sonuç elde etmek daha zordur.

β

β

hükök derleme

Nişin Rolü kullanılacak olan hücre popülasyonu, sonucu değiştirecektir. Farklı hücre tiplerinin gelişim

İn vivo hücresel dönüşümlerde nişin rolü hesaba sürecinde basamak basamak oluşmuş farklı katılmalıdır. Bir hücrenin yetişkin başkalaşmış epigenetik izleri vardır. Yakın ilişkili hücreler benzer durumu, kendi doğal çevresi içinde, nişinde, iken en izler taşırken, gelişimin çok erken evrelerinde stabil halindedir. Dışarıdan bir etki ile organ yolları ayrılmış hücre tipleri çok farklı epigenetik sistemindeki başka bir hücre tipine dönüşümde "makyaja" sahiptir. Bu epigenetik farklılık neden-nişin etkisi, in vivo çalışmalarda bir avantaj olabilir. iyle, başlangıç popülasyonunun son hücreye yakın

bir hücre tipinden seçilmesi sonuçları olumlu Yetişkin hücrelerle karşılaştırıldığında, projenitör- yönde etkileyebilir.lerin ya da kök hücrelerin bir niş için daha sıkı gereksinimleri olabilir. Ancak uygun kültür koşulları Bir başka kolaylaştırıcı strateji ise hücre bölün-varsa çalışmalar in vitroya taşınabilmektedir. Eğer mesinin uyarılması olabilir. Hücreler epigenetik çalışma doğrudan in vivo yapılacaksa, niş mutlaka yeniden programlamaya mitoz sırasında en yatkın uygun olmalıdır. Aksi takdirde, dönüşüm başarılı durumdadır. Yeniden programlama faktörlerinin olsa bile elde edilen projenitörler/kök hücreler hızlı mitoz sırasında, çekirdek zarfı kaybolmuşken bir şekilde apoptozise ya da farklılaşmaya verilmesi epigenetik yeniden programlamanın başlayabilirler. Belki de bu nedenle in vivo yeniden başarısını arttırabilir.programlama ile elde edilen projenitör/kök hücre ile ilgili az sayıda başarılı çalışma vardır. Yine de in Not edilmesi gereken durum ise şudur, şimdiye vivo stratejiler yetişkin projenitör/kök hücre kadar rapor edilen dönüşümlerin tamamı birbirine barındıran hematopoietic sitem, sinir sistemi, yakın hücre tipleri arasında gerçekleştirilmiştir. iskelet kası, deri gibi dokular için geçerli olabilir. Yukarıda bahsedilen kolaylaştırıcı stratejilere

rağmen birbirine uzak iki hücre tipinin birbirlerine Yetişkin Soy Yeniden Programlamasına Yardımcı tamamen dönüştürülüp dönüştürlemeyeceği tam Olabilecek Stratejiler olarak bilinmiyor.

Yeniden programlamadaki güncel örnekler yeniden Ana Yeniden Programlama Yaklaşımlarının programlama faktörlerinin ektopik ifadesine Karşılaştırılması dayanıyor. Bu faktörlerin ise var olan epigenetik programı silerek yerine bizim istedi-ğimiz yeni Pluripotent (iPSC) yeniden programlama ve hücre programıkoyması gerekiyor. Dönüşüme uğramasını soyu (Trans-, Dediferansiyasyon) arasında birkaç istediğimiz hücrenin orjinal epigenetik durumunu önemli fark bulunmaktadır. (Tablo 1) Örneğin stabilize eden faktörlerin delesyonunun yeniden pluripotent yeniden programlamada kullanılan bir programlama sürecini kolaylaştırdığına dair çok faktör şimdiden keşfedilmiş durumda ve bir çok kanıtlar var. Bu durumda ektopik ifade edilen farklı hücre tipinin kök hücreye geri dönüşünde bu yeniden programlama faktörlerinin yanı sıra, içsel faktörler işe yarıyor. Farklı olarak, transdiferan-bazı genlerin susturulmasının birlikte uygulandığı siyasyon faktörleri hücre tiplerine özgü ve bir çoğu stratejilerin daha başarılı olabileceğini gösteriyor. hala bulunmayı bekliyor. Yine de transdifreansiyas-Yalnızca epigenetik durumu sürdüren genlerin yon ile elde edilen hücreler projenitörler ya da susturulmasının yeniden programlamayı sağlaya- yetişkin hücreler olduklarından iPSC ya da bileceğini gösteren çalışmalar bile var. Hücrelerin ESClerden farklı olarak doğrudan klinik uygulama-farklı gelişimler durumlarını sürdürmesini sağlayan larda kullanılmaya daha uygun.faktörlerin belirlenmesi ve yeniden programlama sürecinde kullanılması oldukça iyi bir strateji olarak Transdiferansiyasyonun diğer bir avantajı ise görünse de, bu faktörlerin bir çoğu halen istenen hücrenin doğrudan in vivo olarak bilinmiyor. dönüşüme uğratılabilmesi. Bu in vivo rejenerasyon

ve tamir stratejilerini iPSC tabanlı yeniden Hücrenin kimliğini devam ettirmesini sağlayan programlama çalışmalarına uygulamak mümkün genlerin "kaybedilmesinden" başka yeniden değil. programlamayı kolaylaştıracak bir başka strateji de uygun hücre tipinin seçilmesi. Bazı hücre soyları, Hücre soyu yeniden programlamasının bir başka diğer hücre soylarına göre belirli hücre tiplerine ptoensiyel avantajı ise bir adım geri ya da bir adım dönüşmeye daha "yatkın". Kısaca başlangıçta yana atılması. Yani değiştirilmesi gereken epigene-

mayıs 201264

hükökderleme

mayıs 2012 65

tik izlerin sayısı iPSC yaklaşımına göre çok daha az. eksikliği yetişkin ve yetişkin olmayan hücrelerdeki iPSC yaklaşımında neredeyse bütün epigenetik yeniden programlama kapasitemizi sınırlandırıyor. işaretlerin kaldırılması gerekiyor; kısaca bütün Bu alanda edinilecek bilgiler ile yeniden program-makyaj silinmeli. lama çalışmalarına daha farklı ve ve etkili stratejiler

getirilebilir. Transdiferansiyasyon yaklaşımındaki sınırlama ise, şimdilik, yalnızca yakın hücre tipleri arasında Ayrıca transdiferansiyasyon çalışmalarının terapa-dönüşümün gerçekleştirilebilmiş olması. Bir birine tik etkisi hayvan çalışmaları ile gösterilmeye uzak akraba hücreler arasındaki dönüşümün nasıl başlanmıştır. Örneğin, iç kulaktaki destek hücre-sonuçlar vereceği hakkında kesin bilgiler mevcut lerinin kıl hücrelerine dönüştürülmesi ile sağır değil. iPSC yaklaşımı ile ise, teoride, bütün hücre hayvanlarda duyma sağlanabilmiştir. Transdiferan-tiplerini kullanarak istenen her hangi bir hücre siyasyonun önünde duran ve çözülmesi geren tipini elde etmek mümkün. önemli bir konu ise bu hayvan çalışmalarının insan

çalışmalarına dönüştürülebilmesidir. Örneğin yal-ESCler ve iPSCler kültür ortamında neredeyse nızca bazı TFler daha küçük ve güvenli moleküller sınırsız bölünme yeteneğine sahipler. Bu başlangıç ile değiştirlebilmektedir. Ya da tam anlamı ile materyali açısında elimizde geniş bir kaynağın ol- dönüşüme uğramamış hücrelerin malignant masını sağlamasına rağmen; her bölünmede değişler geçirmesi mümkündür. Yeniden program-oluşacak farklılaşmlar ve birikecek mutasyonlar ile lama faktörlerinin dikkatlice belirli dokulara stabil olmayan bir fenotip gösterebilirler ya da hedeflenmesi klnik uygulamalara geçilmesiden kültüre uyum sağlamış kök hücreler elde edebiliriz. önce yapılması gereken en önemli şeylerden Bu değişken fenotipe sahip hücreler kansere neden birisidir.olabilir ya da in vivo ortama uyum sağlayamayabilir. Transdiferansiyasyonda ise, hücreler birbirleri ile yakın ilişkili olduklarından daha az bölünme ile Referanslarsonuç elde edilebilir ve kanser şansı en aza indirilebilir. 1. Zhou Q., Melton D. A. "Extreme Makeover:

Converting One Cell into Another", Cell Stem Cell 3, 382-Transdiferansiyasyon İle İlgili Çözülmesi Gereken 388

Sorunlar

Hasta-spesifik tedavilerin geliştirilmesinde, hasta-dan alınan yetişkin hücrelerin yeniden program-lanması, embriyolardan alınan yetişkin olmayan hücrelerin kullanılmasından daha pratik bir yaklaşımdır. Ancak, terminal farklanmış yetişkin hücrelerdeki epigenetik kilitleri açıp yeniden ğrogramlamak, yetişkin olmayan hücrelerdekine göre daha zor olabilir. Bu düşünceyi hematopietik sistem hücreleri ile yapılan çalışmalar doğrula-maktadır. Sistemin embriyonik hücreleri ile yapılan yeniden programlama çalışmalarına dair çok sayıda veri bulunmakla birlikte yeişkin kan hücreleri ile yapılan başarılı çalışma sayısı oldukça azdır. Epigenetik programlama hakkındaki bilgilerimizin

hükök derleme

etişkin organizmalar çok çeşitli hücre ise epigenetik modifikasyonlar ile hayat boyu tiplerine sahiptir. Bu hücre tipleri, gelişim güvence altına alınır. Bu farklılaşma sürecini geriye Ysüreci boyunca kök hücrelerin farklılaşması döndürmek mümkün mü? Bu sorunun cevabı evet,

ile oluşur. Bu farklılaşma sürecinde, hücrelerin belirli transkripsiyon faktörlerini kullanarak hücre-kaderini belirleyen transkripsiyon faktörleri (TFler) lerin kaderini dramatik bir şekilde değiştirmek olur. İlk grup TFler hücreyi belirli bir yola sokar; 'sen mümkün. Benzer şekilde somatik hücre çekirde-bir kan hücresi olacaksın.' Daha sonra gelen TFlerin ğinin oosite transferi ya da pluripotent hücreler ile yaptığı iş ise 'sen lökosit olacaksın, sen de eritrosit farklılaşmış hücrelerin füzyonu sonucunda ol' demektir. TFler ile sağlanan bu hücre-tipine- hücrenin kaderini değiştirerek pluripotent duruma özgü (cell-type-specific) gen ifadesinin devamlılığı sokmak mümkün. Hücrenin kaderindeki bu

hükök

MAKALE

3 Faktör Ne Yapabilir?Cevap: Sinir Hücresi

Birkaç yıl öncesine kadar hücre farklılaşmasının güçlü ve geri dönüşümsüz bir süreç olduğu düşünülüyordu. Ancak Yamanaka'nın çalışmaları bunun aksini ispatlamayı başardı; fare ve insan fibroblastları 4 trankripsiyon faktörü kullanılarak pluripotent kök hücrelere yeniden programlandı. Bu çalışma akıllara şu soruyu getirdi; transkripsiyon faktörleri kullanılarak farklı hücre tipleri elde etmek de mümkün mü? Bu sorudan yola çıkan Wernig ve ekibi 19 aday gen ile işe başladılar. Amaçları fibroblasttan fonksiyonel sinir hücresi elde edebilmekti. Çalışmalarının sonunda 19 aday geni 3 gene indirmeyi ve fare ve insan fibroblastlarından indüklenmiş nöronlar (iN) elde etmeyi başardılar.

Mehmet Yener Çalışkaner

değişimin yalnızca farklılaşmış durumdan embriyonik duruma doğru olduğu düşünülebilir; ancak farklı çalışmalarla bir hücrenin başka bir hüc-reye doğrudan dönüşebileceği gösterilmiştir. Biz de bu yazıda spesifik TFler kullanılarak bir fibroblastın doğrudan bir sinir hücresine dönüştürülüp dönüştürülemeyeceği sorusunun yanıtını tatışaca-ğız.

Transkripsiyon Faktörlerini Bulmak: Bizi kim nörona götürebilir?

Bir hücreyi nörona dönüştürebilmek için muhte-melen birden fazla TF gerekliydi; bu nedenle 19 farklı genden oluşan bir havuz oluşturuldu. Nöral gelişimde önemli görevleri olan, nöral dokulara

Marius Wernig“Only those who attempt the absurd can achieve the impossible.”

Albert Einstein

mayıs 201266

özgü olan ya da epigenetik kontrolde görev alan bu rağmen mono- ya da bi-polar morfolojideydiler. 19 gen ile fare embriyonik fibroblastlarını (FEFler) 19F iN hücreleri ise kompleks morfoloji enfekte etmek üzere lenti virüsler hazırlandı. FEFler gösterebilmişlerdi; Ascl1 tek başına 19F havuzunun TauEGFP geni aktarılmış farelerden alındı. yaptığını yapacak güçte değildi. Ardından diğer 18 (TauEGFP geni, EGFP floresan proteinini kodlar. aday genin Ascl1 ile kombinasyonları test edilmeye Transgenik farelerimizde bu gen yalnızca sinir dokusunda ifade olacağı için ilerleyen basa-maklarda nöron oluşumunu test etmek için EGFP çok iyi bir araç.)

Fibroblastlar alınırken sinir dokusundan hücrelerin araya karışmaması için büyük bir dikkat gösterildi, bu dikkatin yanı sıra bazı testlerle (İmmüno-floresan, Polimeraz zincir reaksiyonu ve revers transkripsiyon 'RT-PZR') ortamda nöron olmadığı kesinleştirildi. Enfekte edilmemiş FEFler, nadir olarak Tuj1-pozitif (nöral marker), TauEGFP-negatif ve fibroblast benzeri morfoloji özellik gösteri-yorlardı; beklenildiği gibi. Bu durumun aksine 19F havuzu ile enfekte edilmiş hücreler 32 günün sonunda tipik nöron morfolojisi ile birlikte Tuj1-pozitif ve TauEGFP-pozitif (parlak floresan markerlar) gösteriyorlardı; iNlar oradaydı.

başlandı. Bu testlerin sonunda 5 genin (Brn2, Brn4, Daha sonra iN oluşturabilmek için için gerekli olan Myt1l, Zic1 ve Olig2) Ascl1 ile birlikte iN TF sayısını azaltmak için kolları sıvadılar. Sinir oluşturabildiği görüldü ve bu genlerin hiçbirinin tek hücrelerinin oluşumundaki bilinen önemleri başına iN oluşturmak için yeterli değildi. Brn2 ve nedeni ile öncelikle Ascl1 ve Neurod1 bireysel Brn4 arasındaki benzerlik nedeni ile Brn4 deney olarak test edildi. Sadece Ascl1 ile nefekte edilmiş dışında bırakıldı ve 5F havuzu oluşturuldu; Ascl1, hücreler Tuj-1 pozitif ve TauEGFP-pozitif olmalarına

hükök makale

mayıs 2012 67

Brn2, Myt1l, Zic1, Olig2. 5F havuzu ile enfekte hücreleri sinir hücrelerinin membran özelliklerine edildikten 12 gün sonra iN hücreleri karmaşık ve GABA reseptörlerine sahipti.morfoloji ile birlikte Tuj1-pozitif özellik gösterdiler. 5F havuzu, 19F kadar başarılı olmuştu ve hatta 19F'i iN hücrelerinin nörotransmitter profiline bakıldı-geçmişti! ğında ise glutamat'a ve GABA'ya cevap veren sinir

hücreleri gözlemlendi. Tirozin hidrolaz, kolin iN Hücreleri Fonksiyonel mi? asetiltransferaz ya da serotonin ifadesi görülmedi.

iN büyük kısmı periferin, periferik nöronlara özgü Çalışmadaki amaç fonksiyonel sinir hücreleri elde bir hücre iskeleti proteini, için negatifti. edebilmek olduğu için, iN hücrelerinin bu açıdan da test edilmesi gerekiyordu. Peki, fonksiyonel sinir Membran potansiyeli özelliklerinden ve nörotrans-hücrelerinin sahip olmaı gereken özellikler mitter profilinden sonra bir başka önemli soru nelerdir? Bir sinir hücresinin üç önemli özelliği fonksiyonel sinapsların oluşturulup oluşturula-vardır; mayacağıydı. İlk olarak iN ile önceden var olan sinir · Nöron-spesifik proteinler ağları arasında sinaps oluşup oluşamayacağı · Aksiyon potansiyeli oluşturabilme sorusuna cevap arandı. Bunun için 7 gün kültürde · Sinaps oluşturabilme geliştirilen neonatal kortikal nöronların üzerine

enfekte edilmesinin üzerinden 7 gün geçmiş iN'lar Bu üç özellikten ilki zaten test edilmişti, evet ekildi. Ekimden bir hafta sonra iN ile neonatal elimizdeki hücreler sinir hücreleriydi. Aksiyon kortikal nöronlar arasında kültürdeki kortikal potansiyeline gelince, 5F havuzu kullanılarak elde nöronlara özgü ritmik ve spontane aksiyon edilen iN hücrelerinin membran potensiyeli potansiyelleri gözlendi. Elektrik uyarımı ile egzite özellikleri patch-clamp tekniği ile enfekte edici ve inhibe edici postsinaptik akımların (EPSCler edildikten 8, 12 ve 20 gün sonra test edildi. Bu ve IPSCler) her ikiside gösterildi. EPSCler ve IPSCler testler sonucunda iN hücrelerinin aksiyon inhibitörler ile durdurulabiliyordu, bu da iNların

oluşturduğu sinapsların vücuttakiler ile aynı ya da benzer özellikte olduğunu gösterdi.

Sıradaki soru ise beklenildiği gibi; iN hücrelerinin kendi aralarında sinaps oluşturabilir mi? Bu

potansiyeli oluşturabildiği gözlendi (Fig. K). Bu sorunun cevabı ise enfekte edildikten 8 gün sonra aksiyon potansiyelleri tetrodotoxin ile, Na+ iyon primer astrosit kültürüne aktarılan FEF-kökenli 5F kanalı inhibitörü, durdurulabiliyordu. Eldeki bu iN hücreleri ile arandı. Astrositlerin ortamda bulgulara ek olarak zarda ligand-kapalı iyon bulunmasının nedeni sinaptogeneziste önemli bir kanallarının olup olmadığına bakıldı. Dışarıdan yerleri olmasıydı; astrosit kültürü önceden uygulanan GABA'ya (gamma-aminobütirik asit) ortamda sinir hücresi olmaması için dikkatle test cevap alındı ve bu cevap GABA inhibitörleri ile edildi ve saf astrosit kültürleri kullanıldı. iNlar inhibe edilebiliyordu. Sonuç olarak FEF-kökenli iN astrositlerin üstüne aktarıldıktan 12-17 gün sonra

elde edilen sonuçlar spontane postsinaptik akımları gösterdi. Ektraselüler uyarımlar sonucun-da ölçülen postsinaptik akımların büyük çoğunluğu EPSClerdi. Enteresan bir şekilde IPSCler gözlem-lenmedi. Sonuç olarak iN hücreleri kendi aralarında sinaps yapma yeteneğine sahiptiler ve oluşan sinapsların büyük bir kısmı EPSClerdi.

mayıs 201268

hükökmakale

FEFlerde Çalışıyor, Ya Postnatalda? bırakılarak 3lü gruplar denendi. Bu denemeler sonucunda en iyi sonuç BAM havuzu ile alındı.

Yukarıda açıklandığı gibi 5F havuzu embriyonik Enfeksiyon sırasında kullanılan toplam virüs sayısı fibroblastlar ile verimli ve hızlı bir şekilde çalışıyor. sabit tutulduğunda BAM havuzu ile elde edilen Postnatal hücrelerdeki durumu görebilmek için, sonuçlar, 5F havuzuna göre çok daha verimliydi. farelerden kuyruk-tipi fibroblastlar (KTFler) alındı.

Elde edilen sonuçlar bir ya da iki faktörün FEFlerden fonksiyonel iN hücrelerinin elde edilebileceği yönündeydi. Bu doğrultuda BAM havuzunun daha küçük alt grupları denendi. Elde edilen sonuçlara göre Ascl1 tek başına aksiyon potansiyeli oluşturabilen ve basit sinir-benzeri morfolojide hücrelerin oluşması için yeterliydi, buna fonksiyonel voltaj-kapılı kanal proteinleri de dahil. Ancak bu hücreler immature olup, kompleks sinir hücresi özelliklerini göstermekten uzaktı. BAM havuzu ile yapılan testlerde elde edilen sonuçlara göre kompleks morfoloji, olgun aksiyon

FEFler ile olan çalışmanın başında olduğu gibi potansiyeli ve diğer olgun sinir hücresi özellikleri bu öncelikle ortamda nöronların olup olmadığı kontrol iNlarda vardı. FEFlerin yanı sıra KTFler ile yapılan edildi ve çalışmaya başlandı. KTF iN hücrelerinde deneylerde benze olumlu sonuçları verdi. nöronal doku markerları enfekte edildikten 12 gün sonra gözlendi. 12 gün sonunda FEF iNlara benzer Sonuç olarak iNlar bir çok hastalıkta hastaya özgü olarak fizyolojik membran potansiyelleri, aksiyon tedaviler açısından çok önemli bir noktada duruyor. potansiyelleri ve voltaj-kapılı iyon kanallarının Gelecekteki araştırmalar ile diğer nörotransmitter ifadesi gösterildi. Yine iNlara benzer olarak ve postsinaptik akım profillerinin elde edilmesini glutamat ve GABA nörotransmitterleri görüle- sağlayacak başka 'havuzlar' da bulunacaktır ve bu bilirken, diğer nörotransmitterlere rastlanmadı. sayede tedavi edilecek bölgede ihtiyaç duyulan

iNlar üretilebilecektir. Şimdilik major tedaviler uzak KTFler ile yapılan sinaps deneyleri de olumlu görünse de gözdeki sinir tabakanın tedavi edilmesi sonuçlar verdi ve iN sonuçlarına benzer sonuçlar gibi minör tedaviler için artık sona yaklaşılıyor. elde edildi. Tedavi amaçlı kullanımın dışında sinir sistemi

hastalıklarının modellenmesinde, hücre plastisite 19F ile İşler Yürüyor, 5F Daha İyi, Daha Azı Ne araştırmalarında ve ilaç deneylerinde iNlar Yapar? kullanılarbilir.

5F havuzu ile alınan iyi sonuçların sonunda ortaya Referans;başka bir soru atıldı, peki ya daha az faktör aynı işi

ŸDirect conversion of fibroblasts to functional neurons yapabiliyorsa? Bu soruyu cevaplamak için 5 by defined factorsfaktörden her defasında 2 faktör dışarıda

mayıs 2012 69

hükök makale

aşta Yamanaka ve arkadaşlarının çalışmaları transkripsiyon faktörleri parantez içinde gösteril-ve bunu takip eden çalışmalar sonucu artık miştir. Bbelirli faktörlerle terminal diferansiyasyona

uğramış hücrelere yeniden pluripotensi kazandıra- Yakın bir zamanda Marro ve arkadaşları “BAM” ile bileceğimizi artık biliyoruz. Bu hücrelere indük- hepatositlerden(endoderm kökenli) de iN elde lenmiş pluripotent kök hücreler[induced pluri- etmeyi başardılar. Bu çalışma gösterdi ki fibro-potent stem cells(iPSCs)] diyorduk. Bunun ötesinde blastlar ile hepatositlerin dönüşüm zamanları Marius Wernig ve arkadaşlarının çalışmaları farklıdır. Hepatositler dönüşüme daha dirençlidir. sayesinde artık fibroblast gibi(hatta endodermal Ayrıca her ikisinde de donör hücreye özgü gen hücreler gibi) kökeni farklı hücrelerden, yine belirli ekspresyonların bittiği gözlendi. Bu da “BAM” faktörler ekleyerek, indüklenmiş nöronlar(iN) elde faktörlerinin sadece nöral programı indüklemeyip, edebileceğimizi de artık biliyoruz. Bu yazıda ayrıca donör programı da down-regüle ettiğini Marius Wernig' ten sonra bu konudaki araştırmaları gösterir.ve gelecekteki olası gelişmeleri inceleyeceğiz.

Klinik uygulamalar açısından bu faktörlerin insan Öncelikle fare fibroblastlarını indüklenmiş nöron- fibroblastlarında da aynı dönüşümü sağlayıp lara çevirmek için gerekli 19 farklı gen tespit edildi sağlamayacağı önem taşır. Yamanaka'nın 4 ve bu genlerin ürünü olan transkripsiyon faktörleri transkripsiyon faktörünü(Sox2, Klf4, Oct4 ve c-farklı kombinasyonlarda verilerek ilk önce en Myc) verdiğimizde hem insan hem fare fibro-önemli 5 transkripsiyon faktörü(Ascl1, Brn2, Olig2, blastları iPSC'ye dönüşür. Ancak BAM faktörlerini Zic1 ve Myt1l) belirlendi. Daha sonra bu sayı 3' e insan fibroblastlarına verildiğinde iN elde indirildi(Brn2, Ascl1, Myt1l). Bunlara kısaca “BAM” edilemediği görüldü. Pang ve arkadaşları BAM ile diyoruz(Şekil-1). Fibroblastların indüklenmiş birlikte 20 farklı transkripsiyon faktörü denediler ve nörona(iN) dönüşme verimliliğinin iPSC' ye sonuçta NeuroD1'in fonksiyonel nöron oluşturmak dönüşme verimliliğinden daha yüksek olduğu için gerekli olduğunu buldular. Bu nöronlar çeşitli bulunmuştur. nöronal belirteçleri eksprese ettiler ve aksiyon

potansiyeli oluşturma yeteneğine sahiptiler. Ancak Öte yandan bu ilk çalışmalar yeni bazı sorular ilk fonsiyonel sinapslar 5-6 hafta gibi uzun bir süre doğurmuştur. Fibroblastlardan iN elde ederken bir sonra oluştu. Ayrıca verimlilik olarak farelerdekin-ara nöral progenitör hücre basamağının olup den on kat az olduğu bulundu. Bu beklenen bir olmadığı gösterilememiştir. Ayrıca oluşan hücre- sonuçtur. Çünkü insan hücrelerinin plastisitesi lerin kökenlerine ait bir hafıza taşıyıp taşımadığı genel olarak daha düşüktür ve epigenetik engelleri henüz bilinmemektedir. İnsandaki uygulamaları ve daha yüksektir.klinik sonuçları da merak konusudur.Şekil-1: Fare ve insanda fibroblasttan ve hepatositlerden uyarıcı Ayrıca Qiang ve arkadaşları ilk baştaki 5 faktörü nöronlar, dopaminerjik nöronlar, motor nöronlar denediler ve birçok nöronal özelliği taşıyan ve nöronal progenitör hücreler(NPCs) elde edebili- hücreler elde ettiler PSEN geninde mutasyon taşı-yoruz. Farklı çalışmalarda kullanılan alternatif yan Ailesel Alzhemier Hastalığı(FAD) hastalarından

hükök

İndüklenmiş SinirHücreleri

Ömer Uludağ

mayıs 201270

DERLEME

elde edilen iN'lar bu hastalığa özgü özellikler taşı- (Lhx3, Hb9, Isl1 ve Ngn2) kullandılar. Elde edilen yordu. Bu iN'ların belirli hastalıklarda model olarak iMN'lar tavuk omuriliğine transplante edildiğinde kullanılabileceği fikrini doğrulayan bir gelişmeydi. ventral boynuza yerleştikleri gözlendi. Ayrıca G93A

mutasyonuna sahip Sod1 genine sahip glialar(ALS 2011'de iki farklı grup araştırmacı yeniden prog- hastalığının ailesel formunda görülür.) ile birlikte ramlamada miRNA'ların önemli birer ajan kültür yapıldığında iMN'ların hayatta kalımları olabileceğini göstediler. Hiçbir transkripsiyon fak- azaldı.törü eklemeden direk olarak miRNA'lar ile insan ve fare iPSC'leri elde ettiler. Yine 2011'de Yoo ve arka- 2011'de iki ayrı grup dopaminerjik iN'lar üzerine daşları insan fibroblastlarından miR-9/9* ve miR- çalıştılar. Pfisterer ve ekibi BAM ile birlikte Lmx1a ve 124 ile nöron benzeri morfolojiye sahip ve Foxa2 kullandılar ve tirozin hidroksilaz ile aromatik MAP2(bir pan-nöronal marker) eksprese eden hüc- aa. dekarboksilaz enzimlerini(katekolamin sentez reler elde ettiler. Ancak bu hücreler tam bir iN değil- yolağı enzimleri) eksprese eden ancak dopamin diler. Daha sonra ilaveten NeuroD2, Ascl1 ve Myt1l salmayan iN'lar elde ettiler. Caiazzo ve arkadaşları eklediklerinde daha yüksek dönüşüm verimliliğine ise Ascl1, Nurr1 ve Lmx1a kullandılar. Onların elde sahip iN'lar elde ettiler. Daha sonra Pang ve ettikleri iN'lar ayrıca dopamin de salıyordu. Ancak arkadaşları miRNA'ların Brn2'nin görevini üstlen- her iki çalışmada da hücreler orta beyin marker-diğini ve nöronal diferansiyasyonu engelleyen bir larını eksprese etmiyorlardı. Bu klinik uygulama için proteinin ekspresyonunu baskıladığını buldular. önemli bir sınırlamaydı. Bunun üzerine Kim ve

arkadaşları önce sadece Ascl1 ve Pitx3 kullanarak, Fibroblast ve hepatositlerden, sadece BAM daha sonra bunlara Nurr1, Lmx1a, Foxa2 ve En1 faktörlerini kullanarak elde edilen iN'lar uyarıcı, eklerek orta-beyin markerlarını eksprese eden yani glutamaterjik nöronlardır. Farklı transkripsiyon iN'lar elde ettiler. Ancak in-vivo deneylerde bu faktörleri ile farklı nöron tipleri elde edilip hücrelerin yeterince etkili olmadığını gözlemle-edilemeyeceği önemli bir soru haline geldi. diler. 2011'de Son ve arkadaşları fibroblastlardan motor nöron özelliklerine sahip iN elde ettiler. Bunun için Hücre-yenileme temelli klinik terapilerde çok BAM ile beraber 4 farklı transkripsiyon faktörü sayıda hücreye ihtiyaç duyulduğu için fibroblast-

Şekil-1: Fare ve insanda fibroblasttan ve hepatositlerden uyarıcı nöronlar, dopaminerjik nöronlar, motor nöronlar ve nöronal progenitör hücreler(NPCs) elde edebiliyoruz. Farklı çalışmalarda kullanılan alternatif transkripsiyon faktörleri parantez içinde gösterilmiştir.

mayıs 2012 71

hükök makale

olarak farklılaşır. Daha sonra aktif ve pasif membran özelliklerinin kazanılması, hiperpolarize dinlenme potansiyeli, kapasitansta artış ve iyon kanallarının artışına bağı dirençte azalma meydana gelir. Şekil-4: A; birkaç ince uzantısı olan Tuj1-pozitif fibroblast.

B; bir veya iki uzantılı olgunlaşmamış iN. C; Daha olgun iN'lar.Daha sonra ise fonksiyonel sinapsların oluşması gelir. Bunun için glia hücrelerinden

lardan direkt olarak iN yapmak yerine çoğalma salınan çeşitli faktörlere ihtiyaç vardır. Sinaps kapasitesi yüksek olan indüklenmiş nöronal öncül oluşumu morfolojik olarak, yüksek çözünürlüklü hücre[induced neuronal precursor cell(iNPC)] florasan mikroskoplar ile sinaptin, sinaptofizin, etmek daha çok istenen bir sonuçtur. Bunun için sinaptotagmin gibi çeşitli sinaptik proteinleri Kim ve arkadaşları 2011'de fibroblastlardan iPSC işaretleyerek incelenebilir. Ayrıca fonksiyonel oluşturacak klasik 4 faktörü eklediler. Ancak çok olarak incelemek için de elektrofizyoloji kullanıla-kısa süre beklettiler ve kültürü nöronal büyümeyi bilir. Bunun için postsinaptik reseptörlere agonist teşvik edici bir ortama aldılar. Bir süre sonra nö- verilerek, reseptör veya kanal bloker'ı varlığında ve ronal öncül hücreler birçok nöron tipi ve astrosite yokluğunda akım kaydedilir. Ayrıca spontan dönüştüler(Şekil-2). postsinaptik akımların(PSC) kaydedilmesi de

fonksiyonel inceleme için önemlidir(Şekil-5). Son Yeniden programlamada farklı aşamalarda hücre- gelişen özellik ise ise sinapslardaki kısa-dönem ler elde ettiğimiz için iN tanımının ve kriterlerinin plastik değişikliklerdi.belirlenmesi önemlidir. Tamamen programlanmış iN'lar nöronal morfolojiye sahip olmalı, nöron Sonuç olarak direk yeniden programlama ile elde spesifik gen ürünleri eksprese etmeli ve temel iki edilen iN'lar hastalık modellemelerinde ve hücre-fonksiyonel nöron özelliğine(aksiyon potansiyeli ve yenileme terapilerinde yeni ufuklar açmaktadır. sinaptik iletim) sahip olmalıdır. Bunlardan Ayrıca insan fibroblastlarından iN elde etme bazılarına sahip hücreler “kısmi programlanmış iN verimini arttırma, direk olarak nöronal öncül hücreleri” veya “olgunlaşmamış iN hücreleri” hücreler elde etme gibi yakın zamanda cevap olarak adlandırılabilir. bulmayı bekleyen pek çok yeni fikir doğurmuştur.

Başlangıçta bu uzantılar hem dendrit hem akson markerları taşırken daha sonradan bir uzantı akson

Şekil-2: Normal şartlarda dört Yamanaka faktörü iPSC oluşmasını sağlarlar(1). Ancak kısa süre bekletirsek kararsız pluripotent hücreler oluşur ve ortama göre nöronal öncüllere farklılaşabilirler(4). Direk yeniden programlama(3) BAM faktörleri ile olur. Gelecekteki çalışmalar (2) 'deki gibi direk programlamaya yönelik olacaktır.

Şekil-3 yeniden programlanmanın derecesine göre kazanılan özellikleri özetlemektedir. Buna göre ilk değişiklikler morfolojik değişikliklerdir(Şekil-4). Somadan uzantılar çıkar.

mayıs 201272

hükökmakale

hükök makale

Şekil-4: A; birkaç ince uzantısı olan Tuj1-pozitif fibroblast. B; bir veya iki uzantılı olgunlaşmamış iN. C; Daha olgun iN'lar.

Şekil-5: PSC'lerin voltaj-clamp ile kaydedilmesi sonucu yandaki kayıtlar elde edilmiş. Aynı kayıdın üst tarafta gürültüsü daha az alt tarafta ise daha fazla arka planda yapılmış halini görüyoruz. 1. bölgede(siyah) kümelenmiş spike'ları, 2. bölgede(kırmızı) ise ayrı spike'lar görüyoruz

mayıs 2012 73

ankreas hem ekzokrin hem endokrin salgıları olan bir organımızdır. Ekzokrin Bu hücreler arasında en fazla beta hücreleri ikinci Polarak sindirim enzimle-rinin bulunduğu olarak ise alfa hücreleri bulunur.

pankreas özsuyunu, endokrin olarak ise çeşitli hormonları salgılar. Embriyolojik olarak ekzokrin hücreler de Langer-

hans adacıkları da endoderm yaprağından köken Pankreasın histolojik özellikleri nelerdir? alan ön barsaktan gelişir, yani ortak bir kökenleri

vardır. Ayrıca ekzokrin hücreler birbir-lerinden Histolojik olarak 2 farklı parankimal dokudan ayrılıp in vitro olarak çoğaltıldıklarında endokrin oluşur; programların çalışmasını sağlayabiliyorlar.

1-Langerhans adacıkları-endokrin salgılar Pankreas hücrelerinin ortak embriyolojik orijini 2-Asinüsler-ekzokrin salgılar ekzokrin hücrelerin β hücrelere dönüşmesindeki

mekanizma açısından çok önemlidir. İşte bu şekilde Pankreasta kaç çeşit hücre grubu bulunur? non-stem cell'in farklı bir hücre çeşidine dönüş-

mesine transdiferansiasyon denir. Aslında bir çeşit 1-Ekzokrin hücreler(Amilaz) metaplazidir. Diğer bir ifadeyle farklılaşmış bir kök 2-Duktus hücreleri(CK19) hücrenin kendi farklılaşma yolunda değil de daha 3-Endokrin hücreler farklı bir yolakta farklılaşmasıdır.4-Vasküler hücreler(PECAM)5-Mezenkimal hücreler(Nestin ve Vimentin) Dediferansiasyon ise hücrelerin embriyoner

duruma gelmesi ve diferansiyel karakterlerini yitir-Peki Langerhans adacıklarında kaç çeşit hücre meleridir. Solucanlarda, amfibilerde ve aynı vardır ve hangi hormonları salgılarlar? zamanda bitkilerde görülür. Bazı otoriteler bunun

kansere neden olan bir gelişim sapması olduğunu 1-beta(β) hücreler insülin üretir. düşünmektedir. Öteki taratan ise evrimsel süreç 2-alfa(α) hücreler glukagon üretir. sonucu insanların kaybettiği bir immün cevap 3-delta hücreler somatostatin üretir. olduğu düşünülmektedir.4-PP hücreler pankratik polipeptid üretir.5-epsilon hücreler grelin üretir. Reprogramming(yeniden programlama) ise DNA

hükök

MAKALE

Yetişkin Pankreatik Ekzokrin Hücrelerinin In Vivo

Ortamda β Hücrelerine Yeniden Programlanması

Armağan Keskin

mayıs 201274

metilasyonu gibi epigenetik özelliklerin silinmesi ve maşık bağışıklık sistemi zayıf olan Rag1-/- yeniden düzenlenmesidir. suşundaki farelere verilmiştir. Bunun amacı immün

cevap ilişkili komplikasyonların engellenmesidir. Bu Bu iki kavramı birbirine bağlayan başka bir kavram 9 faktörden hangilerinin gerekli olduğunun anla-ise SCNT(somatic cell nuclear transfer)dir. SCNT ile şılması için sürekli içlerinden farklı bir tanesi çıkarı-yeniden programlama metafaz II safhasındaki larak deneyler yapılmıştır. Faktörler önce altıya olgun oositlerle yapılmaktadır. Oosit, SCNT sonrası (M6) daha sonra ise üçe(M3) düşürülmüştür. M3; olgun bir nükleusu embriyonik hale yani daha Ngn3, Pdx1 ve Mafa adlı faktörlerden oluşmaktadır. totipotent bir hale getiriyor. Ngn3 yerine NeuroD konduğunda kompleksin

etkisinin azaldığı gözlenmiştir.Yetişkin organizma hücreleri geri dönüşümsüz olduğu düşünülen sıralı farklılaşma basamakları Yeni insülin+ hücreler ilk olarak enjeksiyondan 3 sonucu oluşur. Son çalışmalar sayesinde insan kök gün sonra ortaya çıkmıştır. 10. günde ise endojen β hücresinin iPS-induced pluripotent stemcell β hücreler ile kıyaslanacak seviyeye geldiği gösteril-(uyarılmış kök hücreye) yeniden programlandığı miştir. 3 ay sonra bile az da olsa varlıkları gösteril-gösterilmiştir. Ayrıca bir hücre çeşidinin farklı- miştir. Ayrıca M3 kompleksinin spesifik olarak laşmamış bir hücreye çevrilmeden direkt olarak pankreas ekzokrin hücrelerini etkilediği ortaya başka bir hücre çeşidine dönüştürülmesinin de çıkmıştır. Çizgili kas ve fibroblast hücrelerinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Aslında vücu- insülin ekspresyonunu etkilemediği gösterilmiştir.dumuzda normal olarak zaten böyle bir mekaniz-manın olduğu da biliniyor.Olgun B lenfositlerin Pankreasta 5 çeşit ana hücre grubu bulunduğundan makrofajlara ve pro-B hücrelere dönüşmesi bunun bahsetmiştik. Enjekte edilen vürusların en çok en güzel örneğidir.Bunun yanında dermal hangi hücreleri etkilediğini anlamak için immüno-fibroblastların ve retinal epitel hücrelerinin kas histokimyaya başvurulmuştur. Bunun sonuncunda benzeri hücreleri dönüşebilmesi de buna örnektir. insülin+ hücrelerin %95'inin amilaz+ yani ekzokrin

hücre olduğu anlaşılmıştır.Bu gelişmeler sayesinde günümüzde birçok hastalığın tedavisi için artık genetik bilimi daha ön Normalde ekzokrin hücreler β hücrelerden daha plana çıktı. Dünya genelinde 346 milyon insanı büyüktür ve şekilleri kaldırım taşı şekline etkileyen diabetes mellitus hastalığı için de benzer.Ancak yeni oluşan β hücrelerin(induced β transdiferensiasyon ile çözüm önerileri aranmaya cells) normal endojen β hücreler ile aynı boyut ve başlandı. Bunlar içinde en önemlilerden bir tanesi şekilde oldukları gözlenmiştir. Ayrıca yeni oluşan β ekzokrin hücrelerin, insülini asıl sentezleyen hücrelerin adacık şeklinde değil de ekzokrin hücre-hücreler olan β hücrelere dönüştürülmesidir. Bu dönüştürme işlemi belli transkripsiyon faktörleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

β hücrelerde en az 20 farklı çeşit transkripsiyonun faktörünün eksprese edildiği gösterilmiştir. Tek tek mutasyona uğratılıp, değişikliklere bakılarak bunların içinden 9 tanesi yeniden programlama deneyleri için seçilmiştir. 9 farklı transkripsiyon faktörü pankreas hücrelerine adenoviral vektör-lerle verilmiştir. Adenovirus kullanılmasının avantajı seçici bir şekilde adacık hücrelerini değil de ekzokrin hücreleri enfekte etmesidir. Böylece Lan-gerhans adacıkları dışında oluşacak olan β hücreler (exta-islet insulin + cells) daha kolayca gösterilebilir.

Her bir transkripsiyon faktörü ile nGFP(nuclear green flourescent protein)'yi birlikte sentezleyen adenoviruslar izole edilip 9 adenovirus elde edilmiştir. Buna M9(mixture of 9) denmektedir. 9 tane transkripsiyon faktöründen oluşan bu kar-

mayıs 2012 75

hükök makale

hükökmakale

Sonuç olarak ekzokrin hücrelerin β hücrelere yeniden programlanması dediferensiasyon olma-dan gerçekleşmektedir. Belirli transkripsiyon faktörleri ile epigenetik değişiklikler yapılarak bu dönüşüm sağlanmaktadır.

β hücrelerin bir arada kümelenmesini sağlayan yeni fikirler ile glukoz/insülin cevapsızlığını ortadan kaldırmak mümkün görünüyor. Bu sayede diyabet tedavisi için yeni yollar açılmıştır ve gelecekte daha çok hastalığın tedavisi için genetik temelli yöntemler geliştirilmesi açısından büyük bir adım olmuştur.

ler arasına dağılmış şekilde bulundukları gözlen-miştir. Adacık içinde bulunan β hücreler arasında sinyaller vardır. Bu sinyaller sayesinde bazal insülin sekresyonu azaltılır, glukoz ilişkili insülin sekres-yonu artar. Β hücrelerin dağınık konumlanması bu bakımdan bizim için bir dezavantajdır.

Yeni insülin+ hücrelerin GLUT2, glukokinaz, prohormon konvertaz ve çoğu β hücre trans-kripsiyon faktörlerini sentezlemesi, ekzokrin hücre genlerini (CK19,amilaz) sentezlememesi ve glukagon, somatostatin değil de hormon olarak sadece insülün sentezlemesi β hücrelerine ne kadar fazla benzediğinin göstergesidir. Yani yeni insülin+ hücrelerin asıl fonksiyonu insülinin sentez-lenmesi ve salgılanmasıdır. Salınımı kolaylaştırmak için VEGF de sentezlediği gösterilmiştir. Böylece anjiyogenez uyarılmış olur ve sentezlenen hor-monun kana salınması kolaylaşır.

Bu hücrelerin insülün salgılayıp salgılamadığını test etmek için fareler STZ ile diyabetik hale geitirilmiştir ve ardından M3 kompleksi verilmiştir. Diyebet sebebiyle oluşan hipergliseminin düzel-mesinin ardından induced β hücrelerin in vivo ortamda da insülin üretip salgıladıkları doğrulan-mıştır.

Deneyin son kısmı ise uyarıcı TF lerin ne sıklıkta gerektiğini anlamak için yapılan testlerden oluşuyor. Bu testler sonuncunda endojen β hücrelerin Pdx1 ve Mafa'yı eksprese ettikleri ancak Ngn3'ü eksprese edemedikleri ortaya çıkmıştır.Yani ekzokrin hücreleri β hücrelere çevirmek için TF lerin geçici olarak verilmesinin yeterli olduğu görül-müştür.

mayıs 201276

nsan fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent Araştırmacılar ön çalışmalarına göre insan dermal kök hücresi (iPSC) oluşum mekanizması tam fibroblastları pluripotent yeniden programlama olarak çözülmüş değil. Ancak pluripotent özellik süresince ağırlıklı olarak OCT4 eksprese etmişlerdir. İsaptanmadığı halde öncül ve olgun hemato- Bu süreç içinde insan pan-hamatopoetik işaretçisi

poetik hücre oluşturabilen insan dermal fibro- CD45 de dahil olmak üzere hücre soyuna ait blastlarının bu yeteneklerini açıklamaya yönelik işaretçileri de eksprese edilmiştir. POU ailesinden yapılan çalışmalarda OCT4'ün (POU5F1 olarak da OCT1(POU2F1) ve OCT2POU2F2), OCT4'ün bilinir) ektopik ekspresyonu ortaya çıkarıldı. bağlandığına benzer bir DNA motifine bağlanır ve OCT4'ün ektopik ekspresyonu , özgül stokin lenfoid gelişiminde rol oynarlar. OCT4 ise hemato-tedavisi ile beraber pan-lökosit işareti CD45 poezde görev alır. Araştırmacılar bu çalışmaları ile ekspresyonunu sağlar. Bu tip hücreler daha sonra POU proteinlerinden OCT4'ün ektopik ekspresyo-granülosit, monosit, megakaryosit ve eritroid nuyla insan fibroblastlarından multipotent kan hücrelerini oluşturur. Araştırmalar pluripotent hücresi atasına direkt dönüşümü gösterip tanımla-özellik taşımadan gerçekleşen yetişkin hemato- mışlardır.poez programının aktive olmasıyla, pluripotent kök hücre gerektiren embriyonik hematopoez Fibroblastlardan CD45+ Hücrelerin Oluşumuprogramının aktive olmasının birbirinden farklı olduğunu düşüdürmüştür. Ayrıca yapılan çalışma- Pluripotentliğe doğru yeniden programlama lar insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinin teratom oluşturabilen stabil iPSC alt kümesi olan ve (iPSC) otolog hücre yerine koyma tedavilerindeki nadir görülen çeşitli hücrelerin de oluşturulduğu komplikasyonlardan uzak alternatifi olarak insan bir kaskat gerektirir. Bu öncül hücrelerin bir kısmı fibroblastlarının kullanılabileceği fikrini doğurmu-ştur.

İntersellüler ortam pluripotent durumun korun-masında ve pluripotent uyarılmanın tamamlan-masını sağlayacak yeniden programlama faktör-lerinin eksprese olmasında yetersiz kalır. Bu ara maddelerin koekspres genleri nöron, mezoderm gibi farklılaşmış yapılarla ilişkili ve bazı durumlarda muhtemelen fibroblastları özelleşmiş soylara farklanması için uyarmaktadır.Bu durum fibroblast-ların nöron, kardiyomiyosit ve makrofaj bezeri hücreler gibi tek tip hücrelere farklanması ile alakalı olabilir.

hükök

mayıs 2012 77

Dırect Conversıon Of Human Fıbroblast To Multilineage

Blood ProgenitorsCeren Yağmur Doğru

DERLEME

hükökderleme

hematopoetik hücrelere benzer morfoloji göste- uyarılabilen fibroblastlardan CD45+ hücelerinin rirler ve insan pan-hematopoetik işaretçisi olan oluşumu için OCT4'ün yeterli olduğunu göster-CD45 eksprese ederler(CD45+). Ancak aynı miştir.hücreler pluripotent işaretçisi olan Tra-1-60'tan yoksundurlar. Fibroblastlardan türemiş ve CD45+ CD45+ Hücrelere Dönüşüm iPSC Gerektirmezolarak adlandırılan bu hücreler NANOG ve SOX2'ü az miktarda bulundururken tercihen OCT4 CD45+ fibroblastların oluşumu süresince eksprese ederler. Bu durum fibroblastlardan pluripotentliğin korunması ve uyarılması için türemiş hücrelerin farklı hücre soylarına ait gerekli olduğu bilinen genlerin ekspresyonu morfolojilere sahip olabileceğini düşündürür. incelenmiş. OCT4 geninin artan aktivasyonu

dışında OCT4 geni transdüksiyonunun pluri-Araştırmacılar iki farklı fibroblast kaynağından potentlik genlerinin ekspresyonunda değişiklik (yetişkin ve yenidoğan) koloni oluşumunda ortaya çıkarmadığı görülmüş. Hatta POU OCT4'ün ve yalnız başlarınayken NANOG ve proteinleri ailesinden olan OCT1 ve OCT2 protein-SOX2'nin rollerini karşlaştırmıştır. Transdüksiyona leri de transdüksiyondan etkilenmemiştir. iPSC uğramış ve uğramamış fibroblastlar transdüksiyon- 'lerde pluripotent işareti olan SSEA3 ve Tra-1-60 dan sonraki 14 ve 21. günler arasında incelemiştir miktarı derece derece artarken sadece OCT4'ün (D14-D21) Transdüksiyona uğramamış veya ektopic ekspresyonunun olduğu hücrelerde bu SOX2veya NANOG transdüksiyonuna uğramış moleküllerin ikisi de gözlenmemiştir. Bunların hücrelerin aksine OCT4 ekspresyonu koloninin yanısıra tamamen yeniden programlanmış insan artmasını sağlamıştır. OCT4'ün ekspresyon miktarı iPSC'in aksine aynı miktarda, transdüksiyona iPSC'deki ekspresyon miktarına benzer çıkmıştır. uğramış FibsOCT4 ve uğramamış olan fibrobastlar OCT4 eksprese eden hücreler özellikle hemato- immün yetmezliği olan fareye enjekte adildiğinde poetik benzeri CD45+ hücreler oluşumunu teratom oluşumu gerçekleşmediği gibi ne artırmıştır. Üstelik CD45+ hücrelerde de OCT4 fiboblastlar ne de FibOCT4 hücreler ölümsüzleşme ekspresyonunda artış, fibroblastların spesifik olmamıştır. Ancak yaklaşık yedi geçiş sağlaya-genlerinin ekspresyonunda da azalma görülmüştür. bilmişler ve bu sırada MYC onkogeninde artış CD45+ hücrelere dönüşüm sırasında yaklaşık 1000 olmamıştır. Buradan çıkarılan sonuç ise pluripotent genin 4.günde aktivitesi artarken bir o kadar genin veya dönüşüme uğramış hücrelerin fenotipik ve de aktivasyonu azalmıştır. CD45+ fibroblastlarının fonksiyonel özelliklerini göstermeyen FibsOCT4

oluşumunu açıkayabilmek ve düzenleyabilmek için hücrelerinin hematopoetik hücre akıbeti gösteri-yapılan çalışmalarda erken hematopoez için gerekli yor olmalarıdır. uyarıcı büyüme faktörleri yerine FLT3 ligandı ve SCF kullanılmıştır. Bu maddeler OCT4 eksprese eden CD45+ FibsOCT4 Hücrelerin Hematopoetik Atalarıfibroblastlardan(FibOCT4) CD45+ kolonilerinin oluşma frekansını artırmıştır. Bu sırada kontrol Cd45+ FibsOCT4 hücrelerinin fonksiyonel olarak fibroblastlarında bir değişiklik kaydedilmemiştir. Bu hematopoetik kapasitelerini belirlemek için veri erken hematopoetik büyüme faktörleriyle yenidoğandan ve erişkinden CD45+ FibsOCT4

mayıs 201278

mayıs 2012 79

fiziksel olarak izole edilmiştir. İzole edilen hücreler karyosit hücre soyları kesinlikle ortak bir öncü insan hematopoetik ataların gelişimini ve yayıl- populasyondan beraber meydana geldiği ortaya masını desteklediği bilinen bir sitokin kokteyli ile çıkmıştır. CD45+ FibsOCT4 hücrelerinin EPO ile kültüre edilmiştir. İşlem sonucunda hücrelerdeki uyarılması megakaryotik soyların oluşumunu teşvik OCT4 ekspresyonu değişmemiş ve ilik-spesifik etmiştir. Bu megakaryotik soylar megakaryotik işareti CD33 ve CD13 tespit edilmiştir. Bir kısım (Mk)-CFU tahlillerinde Mk-spesifik antijenleri CD45+ FibsOCT4 ileriki aşamalarda fagositoz GPllb/llla(CD41;kırmızı-pembe koloniler) varlığı ile yeteneğine sahip makrofajlara olgunlaşmak üzere tespit edilmiştir. Ancak Epo tedavisi uygulanmamış M-CSF ve IL-4 ile uyarılabilen, CD14 eksprese eden CD45+ FibsOCT4 hücrelerde ve kontrol fibroblast-monosit içermiştir. larında megakaryotik ata oluşumu yoktur. Sonuç

olarak EPO, insan fibroblastlarından hematopoetik CD45+ Fibroblastların Eritroid Ve Megakaryotik hücre oluşum sürecinde megakaryotik hücre Potansiyelleri soylarının ortaya çıkmasını sağlamıştır ama bu

embriyonik programlar için geçerli değildir.CD45+ FibsOCT4 hücrelerinin eritroid hücreler dışında tüm iliksel hücrelere dönüşme imkanı Fibroblastlardan Oct4 Hematopoetik Programıolduğu saptanmıştır. OCT4 transdüksiyonu ile eritroblast işareti olan CD71 yaklaşık olarak %40 Firoblastların hematopoetik dönüşümünde sıklıkla eksprese edilmiştir. Erken eritroid OCT4'ün rolünü anlamak için CD45+ hücrelerin farklılaşmasını uyaran eritropoietin(EPO) Fibs- oluşum ve olgunlaşma sürecinde OCT4 varlığı, OCT4 kültür ortamına eklenmiştir. Fibroblastların ekspresyonu incelenmiştir. Süreç içinde metabolik CD71 ekspresyonunun 2 katına çıktığı, bu süre ve gelişimsel olayları içeren moleküler yolaklarda içinde glikoporin-A ve erişkin b-globin protein önemli değişiklikler kaydedilmiş ve fibroblast-ekspresyonunda artma olduğu gözlemlenmiştir. spesifik genlerin ekspresyonunda azalma görü-Ancak fibroblastlar ve insan PKH'den türemiş lürken (D0, D4 ve D21)OCT4 haricinde pluri-hematopoetik hücrelerde b-globin protein potentgen uyarımı olmamıştır. FibOCT4 hücreler saptanmamıştır. CD45+ FibsOCT4 EPO'nun hematopoetik gelişimle bağlantıl ı olarak

hematopoetik sitokin resptörlerinin,FLT3LG ve SCF reseptörlerinin transkripsiyon faktörleri ile beraber sırasıyla aktivasyonunu artırmıştır. Fibroblastlarda NANOG ve SOX2 gibi pluripotentlikile ilgili genler ve SCL/TAL1, RUNX1,GATA1, PU.1/SPII veya C/EBPa gibi hematopoetik-spesifik genler az miktarda tespit edilmiştir.OCT4 transüksiyonuna uğramış hücrelerde ise SCL,GATA1,RUNX1 ve C/EBPa miktarında artış görülmüş ancak ilkel kan gelişimini düzenlediği bilinen PU.1 ve MIXL1 regülasyonları farklılık göstermemişti. Brachury,GATA2 gibi pluripotent durumdan mezodermal gelişimle ilişkili genlerin fibroblastlarda ve CD45+ FibsOCT4 hücrelerde bulunmuyor olması, fibroblastların hematopoetik hücrelere özelleşmesi için

olmadığı ortamda b-globin protein tespit embriyonik-mezodermal dönüşümün gerçekleş-edilmemişken yalnızca b-globin proteinin mesinin zorunlu olmadığını gösterir. Sitokinle ekspresyonu olmuştur. iPSC'den türemiş tedavi edilmiş CD45+ FibsOCT4 hücrelerin hematopoetik hücrelerin aksine CD45+ FibsOCT4 moleküler analizlerinde 37. Günde OCT4 miktarı-hücrelerinden türemiş hematopoetik hücrelerde nın azaldığı RUNX1,SCL ve C/EBP a miktarının ve globin ekspresyonu olmamış ve fetal globinlerin hemoglobin-a, b ve d aynı kaldığı tespit edilmiş(Ek ekspresyonu da az olmuştur. EPO ile tedavi edilmiş fig.17c,Fig 5d).CD45+ FibsOCT4 hücreleri ilkel ve olgun eritrosit morfolojisi göstermiş ve eritroid oluşumunu OCT4 gibi OCT1 ve OCT2 de hematopoetik genleri sağlamıştır. düzenleyebilir. CD45+ hücreler oluşumu sırasında

sitokin azaltılmış ve OCT4 ekspresyonu artarken Araştırmaların sonuçlarına göre eritroid ve mega- OCT1 veOCT2 miktarı değişmeden kalmıştır. Bu da

hükök derleme

gösterir ki OCT ailesinin diğer üyeleri OCT4'ün OC1, OCT2 ve OCT4'ün ektopik ekspresyonunun hedefleri arasında yer almıyor. Ancak OCT1, OCT2 lenfoid hücre oluşturabileceği hala araştırılmakt-veOCT4 aynı oktamer (POU) bağlanma yapılarına adır.bağlanma potansiyeline sahip, dolayısıyla OCT4'ün OCT1 ve OCT2'nin hedef genlerini düzenleme Ayrıca fare fibroblastlarından kalple ilgili, nöral ve potansiyeli vardır. Bu sebepten OCT1, OCT2 veya makrofaj benzeri hücrelerin oluşmuşve yapılan OCT4'ün bağlandığı varsayılan, hematopoetik, nan- diğer çalışmalarda insan fibroblastlarından hematopoetik ve pluripotent genlerin promotor ve unipotentten çok multipotent hücrelerin oluşuyor enhancer genleri incelenmiştir. OCT4 varlığı ile olduğu görülmüştür. Bunlar oluşan multipotent RUNX1, GATA1, CD45 ve SCL gen ekspresyonundaki hücrelerin ilerde klinik teavilerde kullanılabilece-değişikler arasında bağlantı kurulmuştur. CD45+ ğini kanıtlamaktadır. Araştırmacılar yayılma hücrelerinin oluşumu sürecinde hematopoetik kapasitesi ve klinik uygulanabilirliği göz önüne hedeflerdeki OCT4 varlığının spesifikliğini alındığında kullandıkları tekniklerin klinik belirlemek için OCT1 ve OCT2'nin bağlandığı non- tedavilerde bu hücrelerin kullanılması için akılcı hematopoetik promotorlar incelenmiştir.OCT4, sebepler oluşturabileceğini ileri sürmüşlerdir.housekeeping genlerden GADD45A ve POLR2A promotorlarına bağlandığında bu genlerin ekspresyonu artarken mezodermal gelişimle ilişkili genlerden MYF5 VE NKX2.5 ekspresyonunda artış olmadığı görülmüştür. iPSC aksine CD45+ FibsOCT4 hücrelerinde OCT; NANOG, MYC ve TBX3 promotoruna bağlanmaz. Ayrıca OCT4 kendi promotoruna bağlanırken OCT2nin promotoruna bağlanmaz.Bu geçici gen ekspresyonlarından çıkarılan sonuç OCT4'ün ektopic ekspresyonun hematopoetik programı uyarması ile fibroblastların kan hücresine dönüşümünü sağlamasıdır.

Tartışma

Yapılan bu çalışmalar insan fibroblast hücrelerinin pluripotent duruma geçmeden ya da mezodermal yolaklar olmadan multipotent hematopoetik atalar oluşturabilme yeteneğini gösterir. Embriyonikten erişkin hemoglobin transkripsiyonuna dönüşüm sözü edilen dönüşümün de taslağını çizmiştir. İnsan PKH'den ayrılmış hematopoetik hürelerin aksine CD45+ fibroblastlarda sadece hematopoetik programın aktive olduğunu gösteren erişkin globin proteinleri kazandıkları görülmüştür.

OCT1 ve OCT2 erişkin lenfopoiezde görev alırken OCT4'ün hematopoetik-spesifik genlerin düzenleme bölgelerine bağlandığında hemato-poetik fenotipin ortaya çıkmasının ile alakalı olduğu belirtilmiştir. Ayrıca OCT4 varlığı fibroblast-ların ilik ve eritroid oluşturmasını sağlaöoş ancak lenfoid hücrelerin oluşumu tespit edilmemiştir.

mayıs 201280

hükökderleme

ünümüzde, kök mik iliğine yerleşik bir hücre, IL-2 ve GM-CSF resep-hücrelerin fark- törlerinin dışsal olarak uyarılmasıyla miyeloid soya lılaşmasının kon- yönlendirilebilir. Yani hücreler GM-CSF'ye maruz G

trolü üzerinde durulmaktadır. kaldıktan sonra lenfoid potansiyellerini kaybedip Bu amaçla kültür ortamına çeşitli granülosit ve makrofaj üretmeye başladılar. Böylece

büyüme faktörleri, sitokinler ve kimyasallar sitokin reseptörlerinin soy-öğretici (lineage-instructive) eklenmiş, farklı destek hücreleri kullanılmış ve gen etkisi keşfedilmiş oldu. Benzer şekilde C/EBP(alfa)(güçlü aktarımı ile farklılaşmanın yönlenmesi yönünde bir myeloid soy-öğretici transkripsiyon faktör) ve çalışmalar yapılmaktadır. Kök hücrelerin vücutta farklı C/EBP(beta)'nın zorunlu ifadesi farklılaşmış B hücre-hücrelere gelişebilmesi için büyüme faktörlerine ihtiyaç lerinin hızlı ve etkili bir şekilde kendini yeniden duyulmaktadır. Büyüme faktörleri kök hücrelerinin programlamasına yol açar.çoğalmasını tetikler. Stromal hücreler tarafından büyüme faktörleri salınır. Özelleşmiş hücrelerin büyüme gereksinimleri hakkında

detaylı bilgiye sahip olmadan, transdiferansiyasyonu Tanımlanmış ortamda yetiştirilen ilk fibroblast kültürleri indükleyen transkripsiyon faktörlerle ilgili deneylerin sığır serumu (EGF, PDGF, FGF gibi birçok büyüme faktörü gerçekleşmesi mümkün olmazdı. Çünkü in-vitro olarak içerir) ile desteklenme ihtiyacı duydu. Böylece birçok farklılaşmayı kontrol etmek için kültür ortamında destek özel hücre türlerinin ek doku ve büyüme faktörlerine hücreler ve sitokinlerden yararlanılmaktadır. Örneğin, C ihtiyacı olduğu anlaşıldı. / EBP(alfa) tarafından pre-B hücrelerinin makrofajlara dönüşümü için hem B hücreleri hem de makr ofajların Tespit edilen ilk büyüme faktörü olan Sinir Büyüme gelişimine uygun sitokinler ve stromal hücreler gerekir.Faktörü (NGF) Rita Levi-Montalcini ve Viktor Hamburger tarafından 1950'li yıllarda keşfedildi. Levi-Montalcini Sitokinler ayrıca, pluripotency için yeniden program-faktörü saflaştıran Stanley Cohen ile beraber 1986'da lamada önemli bir rol oynamıştır. Çünkü fare iPKH'ı, EKH Nobel Ödülünü paylaştı. Ayrıca 1950'de Viktor gibi LIF gerektirir. (İnsan kök hücresi için LIF kullanılmaz, Hamburger ve Rita Levi-Montalcini, hedef dokuların, FGF kullanılır). EKH'nin büyümesi ve pluripotency nöron sağ kalımını düzenlemede kritik bir rol oynadığını halinin sürdürülebilmesi için gerekli bir faktör olan LIF'in belirlediler. Koşullanan ortamdan bir tümör hücre keşfi, Oxford Üniversitesi ve Heidelberg Avrupa hattının kültürdeki civciv nöronlarının fazla büyümesini Moleküler Laboratuarında 1988 yılında yapıldı. LIF in tetiklediğini keşfettiler. Böylece özel hücre tiplerinin ortamdan kaldırılması kök hücreyi farklılaşmaya iter. vücut geliştirmek için spesifik nişlere ihtiyacı olduğu Daha sonra, Cambridge Üniversitesindeki(UK) Austin öğrenildi. Bu nişler çözünebilir faktörler ve spesifik Smith ve arkadaşları serumsuz ortamda LIF'in yerini reseptörleri aktifleştirerek sinyal yolağını harekete alabilen GSK3 ve fosforlanmış ERK inhibitörlerini geçiren birebir hücre-hücre etkileşimlerinden oluş- buldular. Bu koşullar EKHlerin kendini yenileyen maktadır. Sırasıyla sinyal yolaklarının tetiklen-mesinin durumda kalmasını sağlıyor. sonunda farklılaşma ve büyüme kontrolüyle ilgili genleri düzenleyen transkripsiyon faktörleri etkin hale geçer.

Rieger ve arkadaşları fizyolojik sitokinlerin, G-CSF ve M-CSF, hemato-poetik bir soy seçimini yönlendirebi leceğini gösterdiler.

Klonojenik yaygın bir lenfoid progenitör, özellikle lenfositlere (T, B ve doğal öldürücü hücre-ler) uyandırılacak bir ke-

Kök HücreBÜYÜME FAKTÖRLERİ

ve

STROMAL HÜCRELERFatma Yaman

EGF: Epidermal büyüme faktörü PDGF: Trombosit içeren büyüme faktörü FGF: Fibroblast büyüme faktörü G-CSF: Granülosit koloni stimule edici faktör M-CSF: Makrofaj koloni stimüle edici faktör GM-CSF: Granülosit-Makrofaj stimüle edici faktör IL-2: İnterlökin-2 C/EBP: CCAAT/Enhancer binding protein LIF: Lösemi inhibitör faktör ERK: Extracellular signal regulated kinase GSK-3: Glikojen sentetaz kinaz.

Rita Levi-Montalcini

mayıs 2012 81

tek sayfahükök

ök hücrenin en yaygın çalışmaların sürdüğü aday kabul gören tanımı; hücreler;hem kendini yeni-K

leme yeteneğine sahip İ skelet Kas Myo-hem de farklı olgun blastlarıhücre tiplerine fark-lanabilen bir hücre İskelet kas hücre olmasıdır. satellit hücreleri sa-

yesinde hasarlı du-Çeşitli kök hücre ve pro- rumlarda kendilerini genitör hücreler hücresel yenileme yeteneğine sa-kalp tedavisinde kullanıl- hiptir. Uygun hücresel uyarı ile maktadır. Bu hücrelerin bazıları iyi bu hücreler yeni hücreleri için öncüsü tanımlanmış farklı fenotipik özellikler içerir ve buna myotüplere farklanabilir.(1,2,3)göre isimlendirilir; bazıları da elde edilişine, in vitro kültürde davranış biçimi-ne, yüzey proteinleri gibi Hücresel tedavide kullanılacak myoblastlar iskelet özelliklerine bakılarak adlandırıl-mıştır. yetişkin kas biyopsileri izole edilebilir ve in vitro

kulanımına(Tablo3) çok uygun olması myo-Kardiyal hücre tedavisi myogenez ve anjiyogenez blastları kardiyak hücre nakli için bu hücreleri iyi prensiplerini içermektedir. Buna göre bazı aday bir aday haline getirmektedir. Önemli kalp hücreler myokardiyal rejenerasyon için indük- hastalıklarını tedavisine klinik uygulamaları vardır.lenebilir.(Tablo 1)

Bu hücrelerin çeşitli transdifferansyona girerek Günümüzde kardiyak hücre tedavisinde (myo- kalbe özel kontraktil proteinler sentezleyebildikleri kardiyal rejenerasyon) için hangi hücreler uygun gösterilmiş.(4-5)olduğu hala kesinlik kazanmamıştır. Tedavi için

Kök Hücreler veKardiyak Onarım

Oğuzhan Serin

DERLEME

mayıs 201282

hükök

hükök derleme

Mezenşimal kök hücrenin kardiyak ve diğer transplantasyonlarda geliştirilebilir uygun bir hedef olduğu gösterilmiştir.(11,18-21)

Mezenşimal kök hücre uygun biyokimyasal indüksiyonla adiposit, osteoblast ve myositlere farklanabilir.(22)

Mezenşimal hücre erişkin dokularından izole edilebilir, kemik iliği ve yağ hücresi bu izolasyon için iyi bir hedef olabilir.

Kesin olmayan paternlerine rağmen bu hücreler kardiyak rejenerasyon için birçok artı yöne sahiptir;

Kalp hücreleriyle aynı gelişim yoluna sahip Buna ek olarak Akut MI sonrası yapılan çalış-oldukları için transplantasyondan sonra da malarda bu hücrelerin transferlerinin sol ventrikül farklanmalarına devam edebilecekleri düşünülü-fonksiyonunu belirgin ölçüde artırdığı gösteri-yor.lmiş.(5,6,7) Fakat bu hücrelerin tüm kardiyak

fonksiyon geliştirimi için gerekli klinik faydayı Ayrıca bazı araştırmacıların da belirttiği gibi sağlayıp sağlamayacağı kesin değildir.

kardiyak rejenerasyon için sadece basit bir transfer ve doku yenilenmesi yeterli değildir. Bunun yanında Kemik İliği Kökenli Kök HücrelerMezenşim kökenli birçok hücrenin (damar hücreleri ve fibroblastlar vb) rejenerasyonu Hematopoitetic öncül hücre transplantasyonunda gereklidir.önemli olmalarının yanı sıra myositlere farklanma

yeteneklerine sahip oldukları 90'lı yıllardan beri Bir diğer olumlu yan ise; mezenşim bilinmektedir.(8-9)

hücrelerinin sahip oldukları immünmodulasyon kapasiteleri nedeniyle transplante hastalara Kemik iliğinde elde edilebilen 4 hücre soyu vardır;immünsupresyon gerekmeyebilir.(23)

Ÿ · Hematopoietik kök hücreBu yönleriyle hastalara yarar anlamında çok Ÿ · Mezenşim kök (10)önemlidirler. Nitekim transplante hastaların çoğu Ÿ · Multipotent erişkin kök hücre( 11, 12)hayatları boyunca immünsupresyonla yaşamak Ÿ · Progenitör endotel hücrler (13)zorunda olabiliyorlar.

Kemik iliği kökenli mezenşimal hücrenin 5-İnsan deneylerine geçmeden önce kemirgenlerde azacytidine ile yapılan kültürde kardiyomyositlere yapılan klinik yararlık deneylerin infakt bölgesi ve farklanabildiği göste-rimiş. (14-15-16)LV fonk siyonlarına yönelil olumlu sonuçlar alınmıştır.(24,25)Bu yöndeki bulgular araştırmacıları klinik

uygulamalar için cesaretlendirimiştir. Orlic'in Embriyolojik Kök Hücreçalışmasın farelerde %68 varan infakte myokard

duvarı rejenerasyonu görülmüştür.(17)İç blastosit (6 günlük) kitlesinde elde edilebilir ve tüm kök hücre tiplerine dönüşme yeteneğine Bu hücrelerin transferinde temel sorun fibrotik sahiptir. Fakat bu hücrelerle yapılan çalışmalar yaraya transferden sonra fibroblastlara farkla-immünolojik ve etik bariyerlere takılmaktadır 26 nabilecek olmalarıdır. Buna paralel olarak Akut MI ayrıca kontrol edilmesi zor olduğu için teratoma sonrası kemik iliği kökenli hücrelerin myokardiyal oluşturma riski de fazladır.rejenerasyonu sağlamadığını kanıtlayan çalışmalar

da mevcuttur.Embriyonik kök hücre kullanımının tartışıldığı günümüzde fibroblastlardan indüklenen pluri-Erişkin Mezenşim Hücreleripotent kök hücrenin kardiyak myositlerin genetik

mayıs 2012 83

sonrası fetal kardiyak hücre transplantasyonunda klinik fayda görülmüştür(29-31)

Bu hücreler normal paternlerinde zaten erişkin kardiyak myositlere farklaşacakları için çok önemli terapatik hedeflerdir. Buna ek olarak kardiyak hücre transplantasyonu için önemli birçok mekanizmaya sahiptir. Neovaskülarizasyonu tetik-leyen angiyogenik faktör salgıladıkları gösteril-miştir.(32)

Araştırmacıları bu hücrelerin iyi yaşamları, çoğalmaları ve erişkin kök hücrelere farklanmaları nedenliyle diğer kök hücrelere göre daha faydalı olacağı görüşünde birleşmişlerdir.

Embriyonik kök hücre tartışmalarının benzerleri fetal hücreler için de yaşanmaktadır. Bunlar da bu çalışmaların gelişimini oldukça kısıtlamaktadır.

Endotel Progenitör Hücreler

Hücre transplantasyonun geçerli olması için öncelikle preklinik deneylerde faydalarının görülmesi bu faydaların ürüne dönüştürülmesi çalışılması gerekir.

ve fenotipik özelliklerine uyum sağladıkları Anjiyogenez ve neovaskülarizasyonun hasarlı gösteren çalışmalar mevcuttur.(27) miyokard için önemli bir terapatik mekanizma

olduğu önceden beri bilinmektedir.Fetal Kardiyak Myoblast

Hücre transplantasyonundaki çalış-malar endotel Fare myokardiyumuna başarılı Fetal kardiyak progenitör hücrelerin kardiyak hücre tedavisinde myosit transplantasyonu daha önce belirtil- kullanabileceği gösterimiştir. Bu hücreler periferik miştir.(28) Ayrıca bazı hayvan deneylerinde Akut MI kandan, otolog arter ve venlerin intima

tabakalarından elde edilebilir ve otolog hücre donorü olarak başarılı bir şekilde kullanılabilir.(33-34)

Buna ek olarak endotel progenitör hücrelerin kardiyomyositlerin indükleme-siyle kalp hücrelerine transdiferansiye olabildikleri görülmüş.(35-36) Bu hücreler geniş kapiller ağlar sağlayabilir fakat yeterli conduit damarları indükleyemez.

Düz Kas Hücreleri

Bunlar damarlardan, vermiform appen-dixten ve uterustan elde edilebilir. Myokardiyal fonksiyonların iyileşmesi, fibrotik doku azalması gibi faydaları görülmüştür.(37)

mayıs 201284

hükökderleme

Klinik Yararlılık hücrelerden elde edilebilecek yeni, fonksiyonel, elektriksel olarak entegre kalp için preklinik

Erişkin myokardiyumu infarkt sonrası tamir için tecrübeler henüz çok yeterli değildir. Bu sebeple kendini yenileme yeteneğine sahip değildir. Tedavi yeni deneysel çalışmaların klinik çalışmalara yön için kullanılan hücresel kardiyomyoplasti infarkte verecek olması, transplantasyon için tüm mole-dokuların fibrozisi ve büyüklüğü azaltılır, iskemi küler mekanizmaları açıklayacak olması gerekir.sonrası zararlı mekanimaları engeller ve myo-kardiyal kontraktilte sağlar(Tablo 2). Şimdiye kadar yapılan çalışmalarda en dikkat çekici

mekanizmalar parakrin ve anjiyognez teorilerdir.

Kök hücre transplantasyonun anjiyogenik etkisinin donör hücrelerden kaynaklı değil asıl olarak ana myokardın parakrin etkisiyle açıklanmaktadır. Bu yüzdendir ki bu 2 dikkat çekici mekanizma tek bir açıklamada birleşmektedir. Bu parakrin etki myokardiyal koruma, neovascularizasyon, olası patolojikleri engelleme, kardiyak miyosit metabolizması geliştirme gibi özelliklere sahiptir.(41)

İnsan Deneyleri ve Doku Mühendisliği Çalışmaları

Günümüze kadar 100'ün üzerinde kardiyak trans-plantasyonla ilgili çalışmalar vardır. Akut MI sonrası

Uygulamalara Yönelik Yaklaşımlar kan ve kemik iliği bazlı transferleri içeren birçok insan deneyleri bulunmakta ve bu yönde meta

Son yıllarda yapılan myokardiyal kök hücre trans- analiz çalışmalar da mevcuttur.(42-44)plantasyon çalışmalardan sonra akut koroner olaydan sonra yapısal ve fonksiyonel getiri amaçlı Kalp hastalıklarının tedavisi için hücre trans-progenitör ve kök hücre transplantasyon çalış- plantasyonuna yönelik birçok yaklaşım bulun-maları hızlanmıştır. Hatta yaşlanmış kalplere maktadır. Bu önemli çalışmaların yanı yeni kalp yapılacak transferlerin fonksiyonel olarak fayda oluşturmaya yönelik doku mühendisliği çalışmaları getirebileceği düşünülmektedir. Fakat bu yöndeki da vardır.bulgular ve teorik tartışmalar henüz netlik kazanmamıştır. Yazının devamında bu yönde birçok atıf almış

önemli bir çalışmanın derlemesi yer almaktadır;Doğrudan enjeksiyon için genellikle koroner bypasslı açık cerrahi girişimler düşünülmektediri, Perfusion-decellularized matrix: using nature's fakat altenatif olarak minimal invazif torokoskopik platform to engineer a bioartificial heartenjeksiypn ve hatta daha az invazif olan transventriküler kateter bazlı enjeksiyon alternatif ABD'de yaklaşık 3.000 birey nakil için kalp bekliyor; bir seçenek olarak gözükmektedir. Tüm bu işlemler dünya çapında kalp yetmezliği olan 22 milyon kişi doğru uygulanması için elbette elektriksel haritalama gerekmektedir. buna yönelik olarak Biosense NOGA sistemi geliştirilmektedir.(38-40)

Hücre transplantasyonlarında enjekte edilen hücre konsantrasyonların çok dikkat edilmelidir aksi takdirde enjekte bölgenin/enjektatın vizkositesi ile sonuçlanabilir.

Mekanistik Açıklamalar ve Sınırlılıklar

Günümüze kadar yapılan çalışmalarda donör

mayıs 2012 85

hükök derleme

yaşıyor. Yılda 550,000 'e yakın yeni vaka teşhis Deneyin desellülerizasyonu aşaması sağlam edilmektedir. tamamlamak ve deneyin devamlılığını sağlamak

için en geçerli hücresizleştirme metodunu bulmak Kalp transplantasyonu, son dönem kalp yetmezliği için 140 kadavra kalbi üzerinde bu işlem uygunlandı için kesin tedavidir ancak donör organların kaynağı ve hücresizleştirme derecesini karşılaştırıldı.(Fig 1)sınırlıdır. Kalp nakli olan bireyler yaşam boyu immün baskın olarak yaşamakta, hipertansiyon, diyabet ve böbrek yetmezliğine maruz kalabil-mektedir.(45)

Biyoyapay kalp oluşturulması teorik olarak bu sorunları çözebilir.ve bu tür kalp dokusu girişimleri için çok çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır.(46)

Yapılan kontraktil myokard yapılarının hayvan deneylerinde ve gelişmiş ventrikül fonksiyonu sağlanmıştır (47, 48, 49) Biyoyapay kalp oluşturma; kalp mimarisi, uygun hücresel bileşenler ve pompa fonksiyonu sağlanması gerektirir.

Bu çalışmada, donör kalplere deterjanlar ile (koroner perfüzyon ile aktarılmış) desellülerize edilmiş. Üç boyutlu yapıyı korumak ve kalp inşası için kalp-damar iskelesi oluşturmak için, kadavra kalplerine koroner perfüzyonla doğrudan deterjan verilmiş, bu yöntemin daha uygun bir iskele oluşturmak için uygun olduğu gösterilmiştir.(50-54)

mayıs 201286

Fig. 1

hükökderleme

mayıs 2012 87

3 deterjanın kalp hücrelerinde çekirdek ve kontaktil Epikardiyal basal lamina altındaki epikardiyal element görüntülemelerine göre karşılaştırıldı. fiberlar kaybedilmemiştir.SDS(Fig 1c,f) kullanımı polietilen glikol(Fig 1a,d), Triton-X-100(Fig 1b,e) ve enzim bazlı yöntemlerden Fiber uyumu ve düzeni desellülerize aortik duvarı daha yararlı sonuçlar verimiştir. ve kapaklarında korunmuştur.(Fig 2c)

Desüllülerize Yapının Özellikleri(Fig2) Fakat zar sertlik ölçümlerinde kadavra ve desellülerize kalplerde fark görülmemiştir. Yalnızca

Kollajen 1 ve 3,laminin ve fibronektin desellülerize bu 2 grubunu fibrin gel kontrol grubuna göre farklar kalp matriksinde korunmuştur(Fig 2a ). 3 boyutlu ağ görülmüştür.(Fig.2f)yapısı ve myokardiyal ECM uyumu korunmuştur.

Kadavra ve desellülerize kalplerin görüntülemesi Kalan ventrikül ECM'sinde endotel ve düz kas (Fig 3a)hücreleri olmayan bazal membran sürekliliği sağlanmıştır. Klempli ve klempsiz aort perfüzyon görüntüleri(Fig

3b)

Fig. 2

hükök derleme

yapay kalpte 2 erişkin kalbin %2 ve 16 haftalık fetus kalbin % 25 eş-değeri kadar pompa fonksiyonu görülmüştür.

Klempli ve klempsiz aort perfüzyon görüntüleri (Fig 3b)

Koroner açıklıklar çap ve şekillerini korumuş. En-dotel hücreleri ve çekirdek bulunmamakta.(Fig 3d)

Bu işlemde ekstrasellüler yapı, kalbin kapaklarının, damarlarının ve odalarının anatomik yapısı korunmuş. Kardiyak hücre bileşimi taklit etmek için, kardiyak ve endotel hücreler nakledilmiş ve kalp inşası için uygun fizyolojik koşullar sağlan-mıştır.(55)

İncelemeler kalp fizyolojisini simule eden bir biyoreaktörde 28 gün sürdürülmüş. 4 günde makroskopik kasılmalar gözlendi. Fizyolojik yükü ve elektriksel stimülasyon altında geçen 8.günde,

mayıs 201288

Fig. 3

hükökderleme

mayıs 2012 89

12. Shake JG, Gruber PJ, Baumgartner WA, et al. Referanslar:Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional 1. Chiu RCJ. Therapeutic cardiac angiogenesis and effects. Ann Thorac Surg 2002;73:1919–25.myogenesis: the promises and challenges on a new

frontier. J Thorac Cardiovasc Surg 2001;122:851–2.13. Chachques JC, Duarte F, Herreros J, et al. Cellular myogenic and angiogenic therapy for patients with 2. Rajnoch C, Chachques JC, Berrebi A, Bruneval P, Benoit cardiac or l imb ischemia. Basic Appl Myol MO, Carpentier A. Cellular therapy reverses myocardial 2003;13:29–37.dysfunction. J Thorac Cardiovasc Surg 2001;121:871–8.

14. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A.I. (1994) Myogenic 3. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, et al. cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem Regenerating functional myocardium: improved cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18, performance after skeletal myoblast transplantation. 1417–1426.Nat Med 1998;4:929–33.

15. Makino, S., Fukuda, K., Miyoshi, S., et al (1999) 4. Pouzet, B., Vilquin, J.T., Hage´ge, A.A., et al (2000) Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal Intramyocardial transplantation of autologous cells in vitro. J. Clin. Invest. 103, 697–705.myoblasts: can tissue processing be optimized?

Circulation. 102, III210–III215.16. Bittira B, Kuang JQ, Al-Khaldi A, Shum-Tim D, Chiu RC. In vitro preprogramming of marrow stromal cells for 5. Robinson, S.W., Cho, P.W., Levitsky, H.I., et al (1996) myocardia l regenerat ion. Ann Thorac Surg Arterial delivery of genetically labelled skeletal 2002;74:1154–9.myoblasts to the murine heart: long-term survival and

phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell 17. Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., et al (2001) Bone Transplant. 5, 77–91.marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410, 701–705.6. Jain, M., DerSimonian, H., Brenner, D.A., et al (2001)

Cell therapy attenuates deleterious ventricular 18. Toma, C., Pittenger, M.F., Cahill, K.S., et al (2002) remodeling and improves cardiac performance after Human mesenchymal stem cells differentiate to a myocardial infarction. Circulation. 103, 1920 -1927.cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105, 93–98.7. Ghostine, S., Carrion, C., Souza, L.C., et al (2002) Long-

term efficacy of myoblast transplantation on regional 19. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., et al (1999) structure and function after myocardial infarction. Multilineage potential of adult human mesenchymal Circulation. 106,I131–I136.stem cells. Science. 284, 143–147.

8. Saito, T., Dennis, J.E., Lennon, D.P., et al (1995) 20.Sensebé L, Bourin P. Mesenchymal stem cells for Myogenic expression of mesenchymal stem cells within t h e r a p e u t i c p u r p o s e s . Tr a n s p l a n t a t i o n . myotubes of mdx mice in vitro and in vivo. Tissue Eng. 1, 2009;87:S49–S53.327–343.

21. Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci E, 9. Grigoridis, A.E., Heersche, J.N.M., Aubin, J.E. (1988) Stornaiuolo A, Cossu G, et al. Muscle regeneration by Differentiation of muscle, fat,cartilage,and bone from bone marrow-derived myogenic progenitors. Science.progenitor cells present in a bone-derived clonal cell 1998;279:1528–1530.population:effect of dexamethasone. J. Cell Biol. 106,

2139 –2151.22. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., et al (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal 10. Chedrawy EG, Wang JS, Nguyen DM, Shum-Tim D, stem cells. Science. 284, 143–147.Chiu RC. Incorporation and integration of implanted

myogenic23. Kode JA, Mukherjee S, Joglekar MV, Hardikar AA. Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in and stem cells into native myocardial fibers: anatomic immunomodulation and tissue regeneration. basis for functional improvements. J Thorac Cardiovasc Cytotherapy. 2009;11(4):377–391.Surg 2002;124:584–90.

24. Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J, Chedrawy E, 11. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, et al. Eliopoulos N, Chiu RC. Marrow stromal cells for cellular Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical adult marrow. Nature 2002;418:41–9.a d v a n t a g e s . J T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g . 2000;120:999–1005

hükök derleme

25. Nagaya N, Kangawa K, Itoh T, Iwase T, Murakami S, endothelial cells to trans-differentiate into cardiac Miyahara Y, Fujii T, Uematsu M,Ohgushi H, Yamagishi M, muscle: implications for myocardium regeneration. Proc Tokudome T, Mori H, Miyatake K, Kitamura S. Natl Acad Sci USA. 2001;98:10733–10738.Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated 36. Badorff C, Brandes RP, Popp R, Rupp S, Urbich C, cardiomyopathy. Circulation. 2005;112:1128 Aicher A, et al. Transdifferentiation of blood-derived –1135.marrow mesenchymal cells into CCl4-injured human adult endothelial progenitor cells into rats. J Hepatol. 2006;44:742–748. functionally active cardiomyocytes.Circulation.

2003;107:1024–1032.26. Min JY, Yang Y, Sullivan MF, et al. Long-term improvement of cardiac function in rats after infarction 37. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Merante F, Mickle DA. by transplantation of embryonic stem cells. J Thorac Smooth muscle cell transplantation into myocardial scar Cardiovasc Surg 2003;125:361–9.REVIEWS tissue improves heart function. J Mol Cell Cardiol

1999;31:513–22.27. Zwi L, Caspi O, Arbel G, Huber I, Gepstein A, Park IH, Gepstein L. Cardiomyocyte Differentiation of Human 38. Tse HF, Kwong YL, Chan JK, Lo G, Ho CL, Lau CP. Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation. 2009 Sep Angiogenes is in i schaemic myocardium by 28. [Epub ahead of print] intramyocardial autologous bone marrow mononuclear

cell implantation. Lancet.2003;361:47–49.28. Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal 39. Perin EC, Silva GV, Sarmento-Leite R, Sousa AL, cardiomyocytes and host myocardium. Science. Howell M, Muthupillai R, et al. Assessing myocardial 1994;264:98–101. viability and infarct transmurality with left ventricular

electromechanical mapping in patients with stable 29. Scorsin M, Marotte F, Sabri A, Le Dref O, Demirag M, coronary artery disease: validation by delayed-Samuel JL, et al. Can grafted cardiomyocytes colonize enhancement magnetic resonance imaging. Circulation. per i - infarct myocardia l areas? C i rcu lat ion. 2002;106:957–961.1996;94:II337–II340.

40. Wolf T, Gepstein L, Dror U, Hayam G, Shofti R, 30. Li RK, Jia ZQ, Weisel RD, Mickle DA, Zhang J, Zaretzky A, et al. cardial infarction. J Am Coll Mohabeer MK, et al. Cardiomyocyte transplantation Cardiol. 2001;37:1590–1597.improves heart function. Ann Thorac Surg. 1996;62:654–660.

41. Gnecchi M, Zhang Z, Ni A, Dzau VJ. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and

31. Etzion S, Battler A, Barbash IM, Cagnano E, Zarin P, therapy. Circ Res. 2008;103:1204–1219.Granot Y, et al. Influence of embryonic cardiomyocyte

transplantation on the progression of heart failure in a 42. Burt RK, Loh Y, Pearce W, et al. Clinical rat model of extensive myocardial infarction. J Mol Cell

Cardiol. 2001;33:1321–1330. applicationsof blood-derivedand marrow-derivedstemcells for nonmalignant diseases. JAMA

32. Van Meter CH Jr, Claycomb WC, Delcarpio JB, Smith 2008; 299:925–936.DM, deGruiter H, Smart F, et al. Myoblast transplantation in the porcine model: a potential 43. Abdel-Latif A, Bolli R, Tleyjeh IM, et al. Adult technique for myocardial repair.J Thorac Cardiovasc

bone marrow-derived cells for cardiac repair:a Surg. 1995;110:1442–1448.

systematic review and meta-analysis. Arch Int Med 2007; 167:989–997.33. Shintani S, Murohara T, Ikeda H, Ueno T, Honma T,

Katoh A, et al. Mobilization of Endothelial progenitor 44. Martin-Rendon, E, Brunskill, SJ, Hyde, CJ, cells in patients with acute myocardial infarction.

Circulation.2001;103:2776–2779. Stanworth, SJ, Mathur, A and Watt, SM. Autologous bone marrow stem cells to treat acute myocardial

34. Asahara T, Masuda H, Takahashi T, Kalka C, Pastore C, infarction: a systematic review.Eur Heart J 2008;29: Silver M, et al. Bone marrow origin of endothelial 1807–1818.progenitor ce l l s respons ib le for postnata l vasculogenesis in physiological and pathological

4 5 . K o b a s h i g a w a , J . A . & P a t e l , J . K . neovascularization. Circ Res. 1999;85:221–228.

Immunosuppression for heart transplantation: where are we now? Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. 35. Condorelli G, Borello U, De Angelis L, Latronico M, Med. 3, 203–212 (2006).Sirabella D, Coletta M, et al.Cardiomyocytes induce

mayıs 201290

hükökderleme

mayıs 2012 91

46. Eschenhagen, T. & Zimmermann, W.H. Engineering myocardial tissue. Circ. Res. 97,1220–1231 (2005).

47. Zimmermann, W.H. et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nat. Med. 12, 452–458 (2006).

48. Sekine, H., Shimizu, T., Kosaka, S., Kobayashi, E. & Okano, T. Cardiomyocyte bridging between hearts and bioengineered myocardial tissues with mesenchymal transition of mesothelial cells. J. Heart Lung Transplant. 25, 324–332 (2006).

49. Robinson, K.A. et al. Extracellular matrix scaffold for cardiac repair. Circulation 112,I135–I143 (2005).

50. Dellgren, G., Eriksson, M.J., Brodin, L.A. & Radegran, K. Eleven years' experience with the Biocor stentless aortic bioprosthesis: clinical and hemodynamic follow-up with long-term relative survival rate. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 22, 912–921(2002).

51. Rieder, E. et al. Decellularization protocols of porcine heart valves differ importantly in efficiency of cell removal and susceptibility of the matrix to recellularization with human vascular cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127, 399–405 (2004).

52. Ketchedjian, A. et al. Recellularization of decellularized allograft scaffolds in ovine great vessel reconstructions. Ann. Thorac. Surg. 79, 888–896 (2005).

53. Chen, R.N., Ho, H.O., Tsai, Y.T. & Sheu, M.T. Process development of an acellular dermal matrix (ADM) for b i o m e d i ca l a p p l i cat i o n s . B i o m ate r i a l s 2 5 , 2679–2686(2004).

54. Gilbert, T.W., Sellaro, T.L. & Badylak, S.F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 27, 3675–3683 (2006).

55. Gerecht-Nir, S. et al. Biophysical regulation during cardiac development and application to tissue engineering. Int. J. Dev. Biol. 50, 233–243 (2006).

hükök derleme

öron kaybına bağlı birçok hastalıkta, bu hücrelerde farklı olarak hasarlı nöronların geli-kaybı geri döndürecek veya nörolojik şimini sağlayacak bazı nörotropik faktörlerin Nişlevlerin iyileşmesini sağlayacak tam sentezlendiği kaydedilmiştir(10). Daha sonraki

anlamıyla etkili, nöral ağı tekrar canlandıracak, çalışmalar intravenöz enjekte edilen hemato-nöron hücrelerinin rejenerasyonunu sağlayacak bir poietik kök hücrelerin, santral sinir sisteminde tedavi yoktur. Bu anlamda remiyelinizasyonun biyoaktif molekül sentezleyecek ve doku onarımını sağlanmasının yanında hücre replasmanıyla veya sağlayacak sayıda reserve ulaştığını göstermiştir.endojen nöronları uyararak onları nörogeneze sürükleyerek hasarlı nöron dokuyu onarabilecek Mesenkimal kök hücreler(MSC) ve nöral öncü tedavilere ihtiyaç vardır. Yetişkin kök hücresi, hücreler (NPC) bu anlamda test edilmiş kök yukarıdaki ölçütler kapsamında plastisite kapasite- hücrelerdir. NPC'ler fetal beyin dokularından izole sinden dolayı en umut verici adaydır. edilip tedavi için önemli plastisiteye sahiptir; çünkü bu hücreler farklılaşmadan santral sinir Embriyonik kök hücrelerin(ESC) tersine, yetişkin ve sisteminin ektopik perivasküler nişlerinde uzun fetal dokulardan alınan çoğu kök hücre, alındığı süre canlı olarak kalabilir. Aynı zamanda bu dokunun özellikleriyle kısıtlı farklılaşma özelliğine hücreler, çevre nöral dokuyu uyarabilecek bazı sahiptir. Embriyonik kök hücrelerle yapılan ve faktörler üretebilir ve böylece burada proliferas-Multipl Skleroz(1), Parkinson hastalığı(2) ve diğer yonu ve yaşam süresini uzatabilir, santral sinir hastalıkların(3) tedavisini amaçlayan çalışmalarda sistemine infiltre olan immün hücrelerle etkileşime klinik anlamda pratikliğin yoksunluğu ve aynı girebilir. Ancak, NPC'lerin nöral hücrelere dönüşme zamanda bazı etiksel(4) problemlere bağlı sorunlar kapasitesi zayıftır, bu nedenle hücre replasmanını ortaya çıkmıştır. Uyarılmış kök hücrelerin kullanımı tam olarak sağlayamaz(11). NPC'lerin intravenöz (iPSC), bu anlamda yeni bir ufuk yaratmış ve veya intratekal infüzyonu otoimmün ensefalo-ESC'lerde ortaya çıkan bu problemleri ortadan miyelit, inme, medulla spinalis hasarlarında olumlu kaldırmıştır(5). Ancak, bu yöntem hala emekleme sonuçlar vermiştir. Ancak bu iyi sonuçlara rağmen, döneminde seyretmekte, uzun ve kısa vadede ne fetal nöral doku elde edilişinin zor olması, tür sonuçlar yaratacağı tam olarak bilinme- çoğaltılmasındaki teknik problemler ve MHC mektedir. Kordon kanından veya kemik iliğinden uyumlu olmayan konaklarda immün sistem elde edilmiş hematopoietik yetişkin kök hücreleri, baskılayıcı terapiye gerek duyulmasından dolayı multipl skleroz(6) ve amiyotropik lateral skleroz(7) tercih edilmeyen bir yöntemdir.gibi nörolojik hastalıklarda nöron kaybını onarmak ve immün baskılama sonrası immün sistemi Mesenkimal kök hücreler, mesodermal hücrelerin sıfırlamak(8) amaçlı kullanılmıştır. Ancak bu stromal öncülleri olarak neredeyse her bağ hücrelerle yapılan çalışmalarda sınırlı farklılaşma dokudan elde edilebilen –özellikle kemik iliği ve kapasitelerinden ve sadece ait oldukları dokuya adipoz doku- hücrelerdir. Kemik iliğinden izole dönüşebilmelerinden dolayı beyin engraftı edilen MSC'ler plastik yapı üzerinde adherent bir sonrasında nöral farklılaşma gözlenmemiştir(9), bu şekilde büyür, fibroblast benzeri morfolojiye sahip-

hükök

Multipl Skleroz ve Kök Hücre Tedavisi

Görkem Yavaş

DERLEME

mayıs 201292

hükök makale

tir ve koloni oluştururlar. Bu koloniler hematopoezi müştür. Bununla beraber infüzyon yapılan destekler, mesodermal kökendeki diğer hücrelere MSC'lerin uzun süre işlevsel kaldığı konusunda çok farklılaşır ve stromal markerları taşırlar. MSC'lerin kısıtlı bir veri vardır, büyük çoğunluğu invivo terapatik etkisi NPC'lere benzer; ancak daha az infüzyondan sonra NK hücreleri ve γδ T hücreleri immünojenik özellik taşır, böylece ksenojenik tarafından immünolojik olarak yıkıma uğrar. transplantasyonlar da yapılabilir (insan MSC'lerinin farelere transplantasyonu gibi) ve daha önemlisi Az sayıda hücrenin santral sistemine yerleşmesine insandan insana allojenik bir şekilde aktarımının rağmen, MSC'ler burada doku onarımını sağlar ve mümkün olması. Bu anlamda MSC'lerin kullanımı periferal immün tolerans mekanizmalarını pratik anlamda daha sık ve daha kullanışlıdır. uyararak otoimmün cevabı azaltır. Bu mekaniz-

malar dahilinde, santral sinir sisteminde MSC'ler Medulla spinalis hasarında lokal verilen kemik iliği parakrin yolla nöral dokunun korunmasını da türevli hücreler miyelin onarımı ile işlevsel olarak sağlar. Parakrin etki ile oligodendrosit öncülleri iyileşme göstermiştir. Başka bir çalışmada uyarılır, oligodendrogenez artar, nöral hücrelerin intravenöz enjekte edilen kemik iliği stromal apopitozu engellenir, nörotropik faktörler salınır, hücreleri inme sonrası bazı anti-apoptotik enflamasyona bağlı oluşan oksidatif stres azalır ve moleküller ve nörotropinlerle remiyelinizasyon, mikroglia hücrelerinin aktivitesi düzenlenerek endojen öncül hücrelerin proliferasyonunun koruyucu bir profil ortaya konur.uyarılması sağlanmış, hızlı bir iyileşme kaydedil-miştir. MG-132 ile oluşturulmuş Parkinson Sistemik infüzyon sonra MSC'ler lenf bezlerinde, modelinde, substansiyel MSC terapisi dopaminer- akciğerlerde –yoğun olarak bulunduğu yer- ve jik nöronların kaybını azaltmıştır. MSC'ler beyin hasarlı doku olan santral sinir sisteminde lokalize dokusuna az sayıda lokalize olur; ancak proliferas- olur (şekil 1). Bu nedenle temel anlamda iki farklı yon, göç ve endojen NPC'lerin farklılaşmasını mekanizmayla etki gösterir:sağladığı için bu az sayıdaki hücrenin etkisi daha büyük olur. Bu çalışmaların tümünde insan MSC'leri 1- İmmün sistemin periferal düzen-kullanılmıştır, bu çalışmalarda immün ret yanıtının lenmesioluşmadığı ya da yanıtın hücrelerin etkilerini 2- Nöral hücrelerin korunması gösterdikten sonra ortaya çıktığı görülmüştür.

Preklinik ÇalışmalarSantral sinir sistemindeki onarım mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir, ancak MSC'lerin bu MSC'lerle yapılan birçok çalışmadan önemli konuda büyük katkısı olduğu aşikârdır. Bu etkide sonuçlara ulaşabiliriz. İlk olarak, MSC'ler başarılı bir MSC'lerin bir diğer rolü olan immünregulasyon şekilde inme, medulla spinalis hasarında ve mekaniz-maları da etkili olduğu düşünülmektedir. otoimmün ensefalomiyelit gibi çok sayıda akut MSC'ler T ve B hücrelerini, dendritik hücreleri ve hastalıkta kullanılmıştır. Bu başarı, MSC'lerin doğal bağışıklık sisteminin bazı elemanlarını immün baskılayıcı karakterleriyle örtüşmekte ve etkileyerek otoimmün hastalıkların patogenezinde akut hastalıkların enflamasyon ve immün cevap pozitif yönde rol oynamaktadır. İntravenöz verilen mekanizmalarını inhibe etmektedir. İkincil olarak, MSC'ler otoimmün ensefalomiyelitli farelerde MSC'ler kronikleşen nörolojik hastalıkların sekonder lenfoid organlara lokalize olmuş, ve tedavisinde beklenenin tersine daha az etkili olmuş burada antijen miyelin oligodendrosit gliko- ve nörolojik işlevlerin düzelmesinde etkisi belirgin proteinine karşı periferal T hücre toleransını değildir. Nöral dokuya göçü, farklılaşma özelliği indüklemiş, böylece demiyelinizasyon sürecini yapılan çalışmalarla zayıf bulunmuştur; bunun engellemiş ve santral sinir sistemindeki T hücre ve nedeni temel olarak MSC'lerin kendini yenileme makrofaj infiltrasyonuna engel olmuştur. Ancak, bu özelliğinin az olması ve genellikle mesenkimal yararları infüzyon hastalık öncesi veya hastalığın en kökene farklılaşma eğiliminin olmasıdır. Üçüncül ağır geçtiği aşamalarda yapıldığında görülür, bunun olarak, MSC'ler intravenöz infüzyon sonrası yanında kronik progresif evrede MSC infüzyonunun akciğerde toplanır ve burada MHC uyumlu olmayan anlamlı bir farkı bulunamamıştır. Bu anlamda konaklarda büyük bir hızla yıkıma uğrar, bu da uzun MSC'ler otoimmün ensefalomiyelitte yararlı süreli santral sinir sistemi engraftını engeller. Bunca olmuştur, fakat histolojik boyama yapıldığında az engele rağmen, allojenik MSC'ler birçok nörolojik sayıda hücre santral sinir sistemine lokalize olduğu hastalığın hayvan modellerinde başarılı olmuştur. ve burada nöral fenotipe dönüşebildiği görül-

mayıs 2012 93

Şekil 1: (A)İntravenöz enjekte edilen MSC'ler(1) santral sinir sistemine ulaşır ve burada mikrogliaların proliferasyonunu azaltır(2), nöronları enflamasyondan, iskemiden ve oksidatif hasardan korur(3), oligodendrositleri uyararak remiyelinizasyonu tetikler(4), ve gliotik hasar dokunun oluşmasına neden olan astrositlerin proliferasyonunu inhibe eder(5). MSC'lerin lokal nöral öncül hücrelerle etkileşimi endojen nörogenezi sağlar(6). (B) İntravenöz enjeksiyon sonrası çoğu MSC akciğerlerde toplanır(7), ve burada regülatuar sitokinlerle enflamasyonun baskılanması saplanır –büyük ihtimal buradaki alveolar makrofajlarla etkileşimi ile- (8). (C) MSC'ler aynı zamanda lenf bezlerine göç eder ve B hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını engeller(9), T hücrelerinin proliferasyonunu baskılar(10), dendritik hücrelerinin olgunlaşmasını ve T hücrelerine antijen sunulmasını engeller(11). Şekil: Uccelli A, Laroni A, Freedman M. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurology, 2011; July, 649-56.

mayıs 201294

hükökmakale

Aynı zamanda MSC'lerin doğal bağışıklık sistemi hastalarında olumlu sonuç vermiştir(16, 17). tarafında hızlı bir şekilde yok edilmesi ve tekrarlanan infüzyonlarında ret cevabın oluşması, Multiple skleroz üzerinde yapılan MSC'ler ve kemik MSC'lerin etkilerini akut olarak gösterdiğinin ve iliği türevli hücre transplantasyonu faz 1 aşama-uzun süreli engraftlarının gerekli olmadığının larında güvenli bulunmuştur. İntravenöz ve intra-büyük bir kanıtıdır. Bu terapatik etki, hücre hücre tekal yapılan bu çalışmalarda anlamlı bir etki etkileşimleriyle, yüksek ihtimalle parakrin meka- gösterilmiştir. Ancak, kök hücre terapisinin pahalı, nizmalarla, çözümür faktörlerin çevreye salınımıyla zor ve etki derecesinin belirsiz olması daha büyük, alakalıdır. Bu nedenle, MSC terapileri nörolojik kontrollü klinik deneylere gerek olduğunu gösterir, hastalıkların akut fazında uygulanmalıdır. bunlardan sonra etkili bir tedavi yöntemi ve protokol belirlenmeli ve diğer biyolojik hastalıkların Birçok nörolojik hastalık için MSC terapi deneme- tedavisinde de denenmelidir. leri son zamanlarda başlamıştır, ancak etki verileri şu an için istenen düzeyde değildir. Yüzlerce hasta, Uzun Dönemde Etkileri ve Güvenilirliğiyüzlerce farklı nörolojik problemle kontrol edilmeyen şartlarda tedavi edilmeye çalışılmış, Multipl sklerozda kök hücre terapisi hala içinde hastalar sözgelişi medikal turizme yönlendirilmiştir. birçok soru işareti barındırmaktadır. Özellikle Bu çalışmalardan sadece birkaçı güvenli şartlarda kronik hastalıklarda –multiple skleroz gibi- sadece yapılmış ve önemli etkiler kaydedilmiştir (Şekil 2, bir enjeksiyonun yeterli olup olmadığı, uygun MSC tablo). Hurler sendromlu (mukopolisakkaridoz tip- dozunun ne kadar olduğu hala bilinmemektedir. IH) veya metakromatik lökodistropik hastalarda Hücre dozu hakkındaki veri hayvan modellerinden yapılan çalışmalarda hiçbir toksik etki kaydedil- insana aktarmadaki zorluktan dolayı tam memiş, belirgin bir klinik değişim olmamasına hesaplanamamakta, insandaki verilerin çoğu da rağmen sinir iletim hızlarında belirgin bir artış hemato-onkolojik hastalıklardan gelmemektedir ki gösterilmiştir(12). Yine bazı küçük çalışmalarda burada hücre miktarı 1x106 ile 5x106 arasında MSC'lerin serebral infarktta(13) gelişim kaydettiği, değişmektedir. MSC'lerin nöral dokuyu koruduğu kemik iliği kökenli MSC'lerin medulla spinalis ve nörogenezi hızlandırdığı, böylece hastaların hasarında önemli bir fark yarattığı(14, 15), işlevsel olarak iyileştiği MR görüntülemeyle substansiyel toksik etki olmaksızın gösterilmiştir. incelenmelidir. Çeşitli çalışmalarda santral sinir Benzer bir şekilde otolog MSC infüzyonu ALS sistemine lokalize olan MSC'ler gösterilmesine kar-

hükökmakale

Bazı nörolojik hastalıklarda MSC'ler ile klinik deneyler yapılmaktadır. Kaynak: Uccelli A, Laroni

A, Freedman M. Mesenchymal stem cells for the treatment of multiple sclerosis and other neurological diseases. Lancet Neurology, 2011; 10: 649-56.

mayıs 2012 95

şın bu lokalizasyonu arttıracak diğer tekniklerin de kılavuz yayınlayarak 2010 yılında ortak yargıya geliştirilmesi gerekmektedir. Çoğu nörolojik varmışlardır(18). Bu kılavuzda MSC'lerin etkilerinin hastalığın –multipl skleroz gibi- multifokal olduğu enflamatuar MS modellerinde MR görüntüleme düşünülürse intravenöz infüzyonun en iyi yöntem temelli gösterilmesi gerektiği belirtilmiştir. Bu olduğu preklinik verilerle kanıtlanmıştır. Ancak çalışmalar randomize, çift-kör, yarı-değişken fokal lezyonlar içeren diğer nörolojik hastalıklarda olmalı, otolog MSC'ler intravenöz olarak verilip MR –medulla spinalis hasarı gibi- lokal MSC trans- aktivitesi 6 ay sonra ölçülmelidir. Temel amaç, plantasyonu daha etkili olmuş ve buralardaki multipl skleroz hastalarında güvenilirlik ve intra-santral sinir sistemi engraftını arttırmıştır. venöz verilen hücrelerin aktivitesi öğrenmek,

kontrast bölgelerin büyüklüğünün konvensiyonel Transplant ilişkili akut yan etkiler, MS ve inme gibi 1-5 T MR görüntüleme ile 6 ay sonra belirlenmesi-nörolojik hastalıklarda kısa dönemde yok denecek dir. Diğer amaçlar ise MR ile hastaların işlevsel kadar azdır. Uzun dönem etkileri hakkında henüz bozukluklarının takibi, iyileşme ve yeniden oluşma kesin bir veri yoktur, çünkü sadece sayılı çalışma durumunun saptanması ve immünolojik markerlar MSC'lerin kronik hastalıklarda kullanımını hakkında bilgi sahibi olmaktır. araştırmıştır. MSC'lerin olası uzun süreli yan etkileri tümör hücre gelişmesini arttırması, bu hücrelerin Sonuçimmün sistem kontrolünden kaçmasına neden olması, tümör hücre göçünü arttırması, invazyonu İmmün cevaplara karşı geliştirilen birçok tedaviden arttırması ve hücre-hücre etkileşimiyle metastazı dolayı erken multipl sklerozda MSC terapisinin rolü etkinleştirmesi olabilir. Çok nadir olarak MSC'lerin küçüktür. Ancak, preklinik ve invitro çalışmalardan karsinojenik transformasyona uğraması da elde edilen verilere göre MSC terapisi gerçek nöron mümkündür. MSC'lerin veriliş yöntemine göre kaybını koruyucu etkiye sahiptir. Bu yüzden, MSC istenmeyen fenotiplere farklılaşması da bir diğer terapisi gelecek için büyük bir umut taşımakta, hem olası yan etkisi olabilir. klinik hem de radyololojik enflamasyonda büyük

gerileme kaydetmekte, nörogenezi parakrin yolla Bunca preklinik veriye rağmen bu tedavi yöntemi- uyararak doku onarımını sağlamaktadır. Preklinik nin uygulanabilmesi için hastalarda yeterli verilerin yeterli olmamasına rağmen, ALS ve güvenirliğe ve etkiye ulaşması gerekmektedir. Bu lökodistrofi gibi diğer nörolojik hastalıklarda anlamda bilim adamları ve klinisyenler MSC'lerin MSC'lerin nöron koruyucu rolü belirgin bir şekilde multipl sklerozda nasıl kullanılacağına dair bir gözler önüne serilmektedir.

mayıs 201296

hükökmakale

hükökmakale

Çalışma

Şekli MSC

kaynağı Veriliş Şekli

Tedavi

Edilen Hasta Sayısı

Hastaların Yaş

Aralığı Doz

Verilerin Biçimi

Sonuçlar Yorumlar

Multipl Skleroz

Mohyeddin et al

Faz 1, açık, güvenli Otolog İntratekal 10 22-40

Ortalama 8.73x106

hücre

Yan etkiler, etki derecesi

Güvenilirlik: iatrojenik

menenjit, baş ağrısı Etki:

değişmeyen(n=4) Kötüşen(n=5) iy ileşen(n=1)

EDSS MR: değişiklik

yok(n=7), artmış lezyon(n=2) ,

azalan lezyon(n=1)

Ortalama takip: 19 ay

Progresif multipl skleroz,

EDSS<6.0

Yamout et al

Faz 1, açık, güvenli Otolog İntratekal 7 34-56

32x106–100x106

arası hücre


Güvenilirlik: geçici

ensefalopati, en yüksek doz MSC

alan hastada nöbetler

Etki: k linik iyileşme(n=6) , kötüleşen MR

verileri

EDSS 4.0-7.5

Karussis et al

Faz 1-2, açık,

güvenli Otolog

10 hastada intratekal,

5 a intravenöz

15 25-65

İntratekal: Ortalama 63.2x106

hücre İntravenöz:

24.5x106 hücre

Yan etkiler, etki dereces i

Güvenilirlik: ateş(n=10),

başağrısı(n=10 ), aseptik

menenjit(n=1) Etki: EDSS’de

azalma

Aktif normal tedavile re cevap

vermeyen MS

Amiyotropik Lateral Skleroz

Mazzini et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog İntraspinal 9 21-75 57x106 hücre

Yan etki Geçici ağrı(n=4),

geçici duyu etkileşimleri(n=6)

…

Karussis et al

Faz 1-2, açık,

güvenli Otolog

10 hastada intratekal , 9 hastada intravenöz

19 25-65

İntratekal: 54.7x106

hücre İntravenöz:

23.4x106 hücre


Güvenilirlik: ateş( n=11),

başağrısı(n=5) , dispnea(n=1) Etki: nörolojik hastalıklarda 6

ayda bir değişim yok

…

Mazzini et al

Faz 1, açık, güvenli

Otolog İntraspinal 10 20-61 11.4x105

ile 120x106 hücre

Yan etkiler

Ağrı(n=7), lokalize duyu kaybı(n=5) ,

karıncalanma duyusu(n=1)

Sporadik hastalık

Serebral İskemi

Bang et al Faz 1-2,

randomize, kontrollü

Otolog İntravenöz

Aktif tedavi için 5 hasta,

kontrol grubunda 25

kişi

54-72 5x107

hücre, iki doz


Güvenilirlik: 1 yı lın ardından

ölüm, inme reküransı yok

Etki: 12 ayın ardından kontrol

grubunda daha fazla ventriküler dilatasyon, MSC

grubunda işlevsel iyi leşme

Orta serebral arter infarktları

Genetik Hastalıklar

Koc et al Faz 1-2, güvenl i,

etkili Allojenik İntravenöz

Hurler sendromlu 5

hasta, metakromatik lökodistropili

6 hasta

5-25 2x106 ile 10x106 hücre

Yan etki, sinir iletim

hızı değişikl ikleri ,

BMI

Güv enilirlik: 1. Derece

ateş(n=4), 2. Derece

filebit(n=1) Etki: MLD

hastalarında sinir iletim hızlarında artış( n=4), BMI değişiklik yok

Daha önceden hematopoietik

kök hücre transplantasyonu yapılmış hastalar

mayıs 2012 97

14. Pal R, Venkataramana NK, Bansal A, et al. Ex vivo-Referanslar:expanded autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord 1. Aharonowiz M, Einstein O, Fainstein N, Lassmann H, injury/paraplegia: a pilot clinical study. Cytotherapy Reubinoff B, Ben-Hur T. Neuroprotective effect of 2009; 11: 897-911transplanted human embryonic stem cell-derived

precursors in an animal model of multiple sclerosis 15. Ra JC, Shin IS, Kim SH, et al. Safety of intravenous infusion of human adipose tissue-derived mesenchymal 2. Ben-Hur T, Idelson M, Khaner H et al. Transplantation stem cells in animals and humans. Stem Cells Dev 2011; of human embryonic stem cell-derived neural p u b l i s h e d o n l i n e M a r c h 1 7 . progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian DOI:10.1089/scd.2010.0466.rats. Stem Cells, 2004; 22: 1246-55

16. Karussis D, Karageorgiou C, Vaknin-Dembinsky A, et 3. Joannides AJ, Chandran S. Human embryonic stem al. Safety and immunological effects of mesenchymal cells: an experimental and therapeutic resource for stem cell transplantation in patients with multiple neurological disease. J Neurol Sci 2008; 265: 84-88 sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis. Arch Neurol 2010; 67; 1187-944. Abbott A. Europe rules against stem-cell patents.

Nature 2011; 471: 28017. Mazzini L, Ferrero I, Luparello V, et al. Mesenchymal 5. Cundiff PE, Anderson SA. Impact of induced stem cell transplantation in amyotrophic lateral pluripotent stem cells on the study of central nervous sclerosis: a phase I clinical trial. Exp Neurol 2010; 223: system disease. Curr Opin Genet Dev, 2011; 21: 1-8229-37

6. Mancardi G, Saccardi R. Autologous haematopoietic 18. Freedman MS, Bar-Or A, Atkins HL, et al. The stem-cell transplantation in multiple sclerosis. Lancet therapeutic potential of mesenchymal stem cell Neurol 2008; 7: 626-36transplantation as a treatment for multiple sclerosis: consensus report of International MSCT Study Group. 7. Appel SH, Engelhardt JI, Henkel SJ, et al. Mult Scler 2010; 16: 503-10Hematopoietic stem cell transplantation in patients with

sporadic amyotropic lateral sclerosis. Neurology 2008; 71: 1326-34

8. Muraro PA, Douek DC, Packer A, et al. Thymic output generates a new and diverse TCR repertoire after autologous stem cell transplantation in multiple sclerosis patients. J Exp Med 2005; 201: 805-16

9. Massengale M, Wagers AJ, Vogel H, Weissman IL. Hematopoietic cells maintain hematopoietic fates upon entering the brain. J Exp Med 2005; 201: 1579-89

10. Chio A, Mora G, Bella VL, et al. Repeated courses of granulocyte colony-stimulating factor in amyotrophic lateral sclerosis: clinical and biological results from a prospective multicenter study. Muscle Nerve 2011; 43: 189-95

11. Martino G, Pluchino S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat Rev Neurosci 2006; 7: 395-406

12. Koc ON, Day J, Nieder M, Gerson SL, Lazarus HM, Kriwit W. Allogeneic mesenchymal stem cell infusion for treatmen of metachromatic leukodystrophy (MLD) and Hurler Syndrome (MPS-IH). Bone Marrow Transplant 2002; 30: 215-22

13. Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G. Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients. Ann Neurol 2005; 57: 874-82.

mayıs 201298

hükökmakale

cak ayında Akdeniz Üniversitesi'nde anlamda odaklanması ise 2 önemli makale gerçekleştirilen yüz ve organ nakillerinin sayesinde olmuş: bunlardan biri Nerem tarafından Oardından yeniden gündeme gelen doku 1991'de 'Hücre Mühendisliği' konusunda, diğeri ise

mühendisliği, kuşkusuz günümüz biyotıbbının en Langer ve Vacanti tarafından 1993'te 'Science' popüler alanı. Doku mühendisliğini böylesine öne dergisinde 'Doku Mühendisliği' başlığı altında çıkaran şey,ürettiği mühendislik harikası dokular yayınlanmış. Böylece temel bilimciler, malzeme sayesinde yakın gelecekte organ naklini tarihe mühendisleri, biyologlar ve klinisyenlerin ortak gömecek olması fikri. Organ nakli oldukça uzun ve çabasıyla bu alan günümüzde bütünüyle disiplinler sancılı bir süreçtir; uygun bağışçı bulunması,organı arası bir alan haline gelmiştir. Şu anda doğum vücuda kabul ettirebilmek adına kullanılan yan aşaması geride bırakılıp klinikte kullanılabilecek etkisi kaçınılmaz immün baskılayıcı ilaçlar vb. çeşitli ürünlerin üretilebileceği aşamaya gelin-birçok problemi beraberinde getirir. Bu noktada miştir. doku mühendisliğinin temel hedefi,hasar veya kayıp durumlarında kullanılmak üzere laboratuvar Peki, yapay organ üretimi için gerekli prosesler koşullarında organ/doku oluşumunu sağlamak. nelerdir? Bahsedilen organ ve doku yapılarının Üstelik hastaya göre tedavi odaklı olduğu için organ geliştirilmesi dört anahtar materyal kullanımına naklinde karşılaşılan sorunları mümkün olan en az bağlıdır: doku iskeleleri(tissue scaffolds), büyüme seviyeye düşürür. faktörleri, uygun ECM ve hücreler. 3 boyutlu doku

iskeleleri hücre üremesini doku ve organ Tarihçesine bakacak olursak;'Doku Mühendisliği' oluşturmak üzere yönlendirmek adına çeşitli terimi ilk olarak 1987'de California Üniver- biyomalzaemelerden üretilir. Ayrıca gerçek doku sitesi'nden Dr. Y. C. Fung tarafından NSF'nin bir mikroçevresindeki mekanik kuvvetlere benzer toplantısında dile getirilmiş. Konsepti ise ilk defa etkilerin sağlanabilmesi için çeşitli biyoreaktörler 1933'te şu deneyle tanıtılmış; fare tümör hücreleri kullanılır. Büyüme faktörleri hücre gelişimi polimer zarla örtülü halde tavuk embriyosunun çeşitlenmesi mekanizmalarında görev yapan doğal karın boşluğuna nakledildikten sonra görülmüş ki proteinlerdir, doku oluşumunda önemli rolleri bu hücreler pankreatik B hücreleri gibi insülin vardır. Vücudun farklı bölgelerinde hasarları tamir salgılayabilmiş. 1980 başlarında Burke'un yapay etmede farklı büyüme faktörleri görev almaktadır; deri üretmesi de günümüz klinik çalışmalarına ışık örneğin kemiklerde oluşan kırık tedavisinde kemik tutmuş. Fakat bilimsel çevrelerin bu konuya gerçek morfojenez proteinleri gerekmektedir. Hücreler

hükök

mayıs 2012 99

Doku Mühendisliği ve Hücre Bazlı Terapiler; Benchten

Kliniğe: Yedekleme, Onarım Ve Rejenerasyon Potansiyeli

DERLEME

Ayşe Zehra Karadere

sağlıklı yaşayabilmek için doğal ortamlarına ortadan kaldırılacaktır.benzeyen yapay bir matris içinde bulunma ihtiyacı hissederler. Doku mühendisliğindeki en önemli ejeneratif biyoloji ve bunun tıp uygula-konulardan birisi, gerekli yapay matrislerin ne maları biyolojik ilaçların etkin şekilde tedavi şekilde tasarlanması ve sentezlenmesi gerektiğidir. Redemediği hastalık ve yaralanmalarda Nanofibrasyon teknikleriyle ECM'yi en iyi biçimde terapatik tedavi sağlamada umut vaad eden taklit edebilecek doku iskeleleri geliştirilirken, araştırma alanları olarak hızla gelişiyor. Özellikle doğal ECM nin en temel yapıtaşı olan kollajen rejeneratif tıp alanında kaybedilen fonksiyonun iplikçikler temel alınır. Son ve belki de en önemli geri kazanılması adına hücre,doku ve organların olan aşama da uygun hücre kaynağı bulmaktır. Son gelişimine dair büyük çaplı araştırmalar yapıl-20 yıldır doku mühendisleri tüm hücre tiplerini makta. Konu üzerindeki genel düşünce; kaybedilen inceleyerek her bir ayrı doku oluşumu için en iyi fonksiyonun kazanımında dokular ve organların, hücreyi bulmaya çalışıyorlar. Bu noktada kök mekanik aletler ve kimyasal bileşiklerden çok daha hücreler kendilerini yenileyebilme ve uygun başarılı olacağı yönünde. Son zamanlarda otolog koşullarda her türlü hücreye dönüşebilme özellik- birincil hücre izolasyonları ve çeşitli kök hücre-leri ile en cazip hücre kaynağı olarak gösteriliyorlar. lerden üretilen hücre terapilerini içeren çeşitli

stratejiler de araştırılıyor. Bu küçük derlemede kök Tüm bu materyallerin kullanımı ise şu strateji ile hücre türlerinin klinik uygulamalarının, üstesinden gerçekleştirilir: öncelikle hastadan hücreler izole gelinmesi gereken problemlerin altını çizmeyi; dilir, bu hücreler kültürde çoğaltılır ve onlara uygun bilim ve teknolojinin gelişimine bağlı olarak biyomekanik çevre sağlayacak doku iskelelerine rejeneratif tıbbın rutin klinik alanı hâline gelmesini yerleştirilirler. Doku oluşumu tamamlandıktan sağlayacak yolları belirtmeyi hedefliyoruz.sonraysa nakil gerçekleştirilir. Bu proseslerde doku mühendislerinin karşılaştığı en büyük problem- Organ sistemleri içindeki farklılaşmış hücrelerin lerse; nakil sonrası dokunun yaşayabilmesi, normal kaybıyla sonuçlanan yaralanmaların yol açtığı fonksiyon gösterebilmesi ve çevredeki dokularla birçok hastalık ve fiziksel defeksiyon, organ entegre olmasıdır. Ayrıca çok yakın bir zamana sistemlerinin fonksiyonlarını yitirmelerine neden kadar gerçek boyutta organ sistemlerini oluş- olur. Örn; Parkinson hastalığı beynin 'substantia turmak üzere çalışmaları yalnızca 'makro ölçekte' nigra' bölgesindeki dopaminerjik nöronların gerçekleştirildi; fakat dokunun işlevsel birimlerini kaybına bağlı gelişir ve motor fonksiyon-larını oluşturmak için hücresel boyutun altında işlevsel hâle getiren distoni ve diskinezi ile nanoyapılar gereklidir. Bu yapıların üretimi içinse, sonuçlanır. Meniskal kopmalar ve omurilik özelllikle nanoteknoloji ve yenilikçi biyoreaktör hasarları da normal davranışları etkileyecek defekt-teknolojisine ihtiyaç vardır. lere yol açabilir. Dokulara normal fonksiyonunu geri

kazandıracak onarımı sağlamak adına hücre bazlı Günümüzde, bahsedilen bilimsel problemler terapiler bu hastalıkların tedavisi için büyük bir ötesinde göz ardı edemeyeceğimiz etiksel umut kaynağı. Burada tartışacağımız çeşitli hücre yaklaşımlar da vardır. Özellikle embriyonik kök tipleri ise şu şekilde tanımlanıyor: dokuya özgül hücre kullanımındaki kısıtlamalar birçok ülkede farklılaşmış hücreler (örn; kondrositler), kemik iliği hâlen tartışılmakta ve bu durum kısa vadede ya da nöral kök hücrelerden izole edilen progenitor değişecek gibi durmuyor. hücreler ve iç hücre kitlesinden türetilen embri-

yonik kök hücreler.Her şeye rağmen doku mühendisliği; özellikle tedavisi henüz mümkün olmayan felç ve kalp krizi Otolog Hücre Terapisigibi durumlarda en önemli tedavi yöntemi olarak görülmektedir. Yeni üretilecek yapay matrisler, Hasarlı dokunun onarımı için dokuya özgü biyoaktif moleküller ve hücrelerin kullanılmasıyla farklılaşmış otolog hücreler, bireyin kendisinden organ yetmezliği çeken hastaların kendi alındıktan sonra ex vivoda kültüre edilir, çoğaltılır organlarının üretimi yakın zamanda mümkün ve hücreler ikinci bir alana aktarılır. Otolog terapiye olacaktır. Hayat kalitesinin yükseltilmesi için bu tür immünolojik perspektiften baktığımızda, biyoteknoloji çalışmaları büyük önem taşımaktadır. hücrelerin bireyin kendisinden izole edilmesinin ne Umuyoruz ki, gelecekte özellikle kök hücre kadar ideal olduğunu fark ederiz. Bu, otolog terapi-araştırmalarından edineceğimiz bilgiler ve disiplinler arası işbirliğiyle etik ve teknik problemler

mayıs 2012100

hükökderleme

mayıs 2012 101

yi allojenik uygulamalardan üstün kılan en önemli olmaktadır.özelliklerden biridir.

Kadavra kaynaklı retinal pigment epitelyal hücreler Son zamanlarda klinik uygulamaların yanı sıra de ilginç birer allojenik hücre tipleridir. İmmün çeşitli klinik öncesi modeller keşfediliyor ve bunlar bariyeri sağlamak adına kapsüllüdürler ve Parkin-kıkırdak onarımı için kondrositleri, yanıklar için son tedavisinde kullanılmak üzere kültürlen-keratinositleri ya da dermal fibroblastları, miyokar- mişlerdir. Titan farmasötik, bu araştırmayı kliniğe diyal onarım için miyositleri, MSS lezyonlarındaki uygulamış ve bugünlerde pozitif sonuçlarla faz 2b miyelinlerin onarımı içinse Schwann hücre aşamasını yürütmektedirler. Ticari amaçlı geliştiril-transplantasyonunu içeriyor. Sayılanlar içinde en miş allojenik dokular, ticari otolog hücre terapileri gelişmiş iki tedavi, kıkırdak onarımı ve yanık ile benzer kısıtlamalara sahiptir. Ancak kapsül-tedavisidir. leme, doku işlemleri, tolerans geliştirilmesi ve

genetik modifikasyonlar sayesinde hasta popülas-Otolog kondrosit kültürlerinden kıkırdak damar yonu güvenli alıcılar hâline getirilebilecektir. defektlerinin onarımında yararlanılabileceği ilk kez bir tavşan dizinde gösterildi. Ardından, bu teknik Allojenik Kök Hücrelerkliniğe uygulandı ve Genzyme Biyocerrahi deste-ğiyle FDA onayını aldı. Genzyme Biyocerrahi ayrıca Allojenik kemik iliği transplantasyonu özellikle kan bir otolog keratinosit kültür prosedürü geliştirdi ve hastalıkları ve kanser tedavisinde klinikte sık bugünlerde 'Epicel' i yanık tedavisi için pazarlıyor. kullanılan bir tekniktir. Yeni klinik denemelerse

periferal kan kök hücrelerini kullanmaya odaklan-Otolog tedavide bireyin 'kendisinden' ifadesi her ne mıştır.kadar cezbedici olsa da; dokunun çıkarılması ve hücrelerin kültürde çoğaltılmasıyla ilişkili birtakım Fetüs ve yetişkin insan beyninden izole edilen nöral kısıtlamalar bulunmakta. Özellikle, yetişkin kök hücrelerin keşfi, nörolojik bozukluklar dokularının yeterli sayıda hücre üretmek adına (Parkinson gibi) ve omurilik hasarı tedavisinde çok kültürde çoğalma yeteneklerinin sınırlı olduğunu önemli gelişmelerdendir.biliyoruz. Bir diğer sınırlama ise, bu tip terapinin yalnızca çıkarılmaya dayanabilecek dokularda Yetişkin kök hücrelerinin düşünülenden çok işlevsel olmasıdır, medikal markette sadece iki plastisiteye sahip olmalarına rağmen sınırlı otolog hücre terapisinin FDA onayını almış olması farklılaşabilme kapasiteleri olduğu açıktır. Bu da bu gerçeği doğrular nitelikte. noktada embriyonik kök hücreler neredeyse tüm

hücre tiplerine dönüşebilmeleriyle çok daha kulla-Otolog progenitor hücrelere gelince, kaynak olarak nışlıdırlar.en sık kemik iliğine başvururuz; çünkü kemik iliğindeki mezenkimal kompartmanda birçok doku Şu anki hedef, ksenoplantasyon stratejilerine tipine dönüşebilecek kapasitede hücreler vardır. benzer olarak, yönlendirilmiş farklılaşmayla Son araştırmalar da gösteriliyor ki,bu hücreler istenen fenotipi elde edip, immün baskılayıcılar yalnızca kemik defektlerinde değil; kıkırdak, yokluğunda bunu nakletmektir.Bahsedilen iki miyokardiyum, karaciğer, omurilik hasarı ve sorunun da üstesinden gelmede en büyük diyabette çok olumlu sonuçlar vermiştir. Fakat avantajımız EKHlerin modifiye edilebilmesidir.henüz klinik uygulamalardan bahsetmek için erken.

KsenotransplantasyonAllojenik Dokular ve Hücre Dizileri

Güvenilir doku kaynağı bulmaya dair yapılan Günümüzde sikloporin, FK506 ve rapamisin gibi araştırmalarda son 20 yıldır öne çıkan bir alan var: immün baskılayıcı ilaç terapilerinin kullanımı ksenotransplantasyon(türler arası transplantas-allojenik doku transplantasyonunu klinik rutin yon).hâline getirmiştir. Dokuların rahatlıkla trans-plantasyonu, immün sistemin ataklarına karşı Bu alanda karşılaşılan en önemli bilimsel problem dirençli hâle gelmeyi ya da immünosistemin olaraksa patojen enfektivitesinin (ksenozoonosis) azaltılmasını gerektirmektedir. Otolog hücre yanısıra immünolojik engellerin üstesinden gelin-terapisinde olduğu gibi bu alanda da en yeni mesi gösterilir.gelişmeler kıkırdak ve deri yedeklemede

hükök derleme

mesi gösterilir. Transgenesis ve çekirdek transferi Referanslar:sayesinde türleri (genelde domuzları) genetik olarak modifiye edebilme olanağı doku/organ 1. Nerem RM, Cellular Engineering,Ann.Biomed üretimi ve transplantasyonda umut vâdetmektedir. Eng.19,1991

İlginçtir ki, diyabet ve nörolojik bozuklukların 2. Langer R,Vacanti JP, Tissue Eng.Science 260,1993tedavisi için domuzdan insana FDA onaylı birçok ksenoplantasyon klinik denemeleri vardır. 3. Topics in Tissue Engineering 2005, Volume 2. Eds.

N. Ashammakhi & R.L. Reis Ksenozoonosisin olası risklerinden korunmak adına içinde 160 insan transplant alıcının incelendiği retrospektif analizin de bulunduğu birçok araştırma yapılmaktadır.

Ksenoplantasyon çalışmaları, enfeksiyon risklerini aşmak ve güvenli transplantasyon yapmak adına hâlâ FDA denetiminde yürütülmektedir.

Gelecek

Kök hücre diferansiyasyonu, doku mühendisliği ve ksenotransplantasyon her biri kendi alanlarında çok yüzlü problemlerle yüz yüze gelmektedir. Bununla birlikte bilim ve biyoloji ötesinde karşılaşılan en büyük sorunlardan biri,yukarıda bahsedilen FDA onaylı ürünlerin geliştirilmesi. Klinik uygulamalarda teknolojinin ilerlemesine bağlı olarak, düzenleyici prosedürler de gün geçtikçe değişmektedir. Yaptıkları deneylerle bu alandan en kârlı çıkacak olanlarsa Genzyme Biyocerrahi, Organogenesis, Diacrin, Layton Biyobilimleri ve diğer doku mühendisliği firmaları olacaktır.

mayıs 2012102

hükökderleme

ONKOGENLER

mayıs 2012 103

Berşan Özcan

nsan vücudunun normal gelişimi sırasında; direkt olarak düzenleyen “proto-onkogenler” ve anlaşılması bir hayli güç olan genetik sistemler “tümör baskılayıcı genler”dir. hücre oluşumu, gelişimi ve ölümü arasındaki İdengeyi büyüme sinyallerine, büyümeyi Proto-onkogenler hücre büyümesi ve bölünme-

engelleyici sinyallere ve ölüm sinyallerine bağlı sinde rol oynayan, beklenildiği gibi büyüme olarak düzenlemektedir. Hücre döngüsünün faktörleri ve büyüme engelleyici faktörlere cevap normal ve istenilen şekilde ilerlemesi için bu verebilen, normal hücrelerde bulunan genlerdir. genetik sistemlerin doğru ve yeteri kadar çalışması Proto-onkogenler mutasyonun etkisiyle onkogen-çok önemlidir. Hücrede belirli genlerde ve lere dönüşerek çok fazla miktarda ifade edilirler ve dolayısıyla bu genlerin proteinlerinde ve böylece sınırsız hücre bölünmesine, kansere neden ekspresyonlarında görülen değişiklikler birçok olurlar. Geçenlerde okuduğum bir yazıda proto-patoloji gibi kanser oluşumu için de kilit onkogenleri sağlam olan hücreyi, gaz sistemi noktalarıdır. düzgün işleyen bir arabaya benzetmişlerdi ve bu

gerçekten çok hoşuma gitti: proto-onkogenler Kanser vakalarının çoğuna, hatta hepsine neden sağlamsa araba sadece gaza basıldığında ilerleye-olan hücredeki düzenin bozulması, sıklıkla tümör cektir fakat eğer proto-onkogenler mutasyonla gelişimini indükleyen kimyasallara, hormonlara ve onkogenlere dönüştüyse araba artık gaza basıl-bazen virüslere dayanır. Bunlar gibi hücrenin masa bile hızlanmaya devam edecektir. Sonuç, kaza genetiğini etkileyerek kanser oluşumu riskini olacaktır. arttıran bileşenlere karsinojen adı verilir. Kanser oluşumu (onkogenesis veya tümörigenesis), Onkogenler; düzensiz ve aşırı amplifikasyonlar aslında, genetik ve çevre arasındaki ilişkiye (örn, erb2 /neu onkogenlerinin oluşumu), bağımlıdır: Çoğu kanser, karsinojenlerle değişime translokasyon düzensizlikleri, nokta mutasyonları ugramış genler veya DNA replikasyonundaki ve (Örn, ras onkogenlerinin oluşumu) ve virüsler gibi onarımındaki hatalar nedeniyle ortaya çıkar. dış ve iç etkenler ile aktive olabilirler.

“Hücre döngüsünü düzenleyen genetik sistemler” Onkogen proteinleri hücrede birçok yolakta yer olarak ifade ettiğimiz başlığın altında 2 çok önemli almaktadırlar. Bu yolaklarda büyüme faktörü (örn, gen grubu bulunmaktadır. Bunlar hücre döngüsünü sis ve PDGF), büyüme faktörü reseptörü (Örn, erb B

ve EGF reseptörleri), sinyal iletim yolu elemanı (örn, Ras), nükleer transkripsiyon faktörü (örn, c-myc) gibi görevler üstlenebilirler.

Tümör baskılayıcı genler ise normalde hücre büyümesini ve proliferasyonunu engellerken, mutant olan tümör baskılayıcı genler inaktive olarak normal işlevlerini yerine getiremezler. Bunun sonucu da onkogenlerin hücreye etkisi ile aynı olur: sınırsız hücre bölünme ve büyümesi, kanser.

Kanser oluşumunda etkisi olan diğer gen grubu ise, üzerinde görülen mutasyon ile kanser oluşumunu indirekt olarak indükleyen genlerdir. Bunlara mutator genler denilmektedir. Mutator genler mutasyona uğradıkları zaman diğer genlere de Şekil 1

tek sayfahükök

hüköktek sayfa

bunların işleyiş mekanizmaları tam olarak tümör oluşumunu tetiklemesi Src transforming anlaşılamamıştır. Tipik olarak birden çok gende proteinlerinin tanımlanması, yıllar sonra anlaşıla-olan mutasyon, devamlı olarak bölünen ve bilecek kritik bir noktaydı. (Transforming gen ve hücrenin normal döngüsünden çıkmayı başara- proteinler, normal hücreleri tümör hücreleri oluş-bilen ve daha sık mutasyon geçiren hücreler oluş- turmaya yatkın hale getirirler.)turur.

RSV Üzerinde Yapılan Deneylerle İlk Onkogenlerin Bahsettiğimiz genetik düzenin bozulması hücrede, Keşfi (c-Src ve v-Src) Şekil 1'de şematik olarak görülen kanser hücre-lerine özgü hücre anomalilerinin oluşumuna neden Santrifüj yöntemiyle yoğunluk farkına göre olur. Bu anomalilerin hepsinin oluşumundan tek bir saflaştırılan RSV parçacıkları, bu virüslerin nükleik gen sorumlu değildir. Yukarıda sözünü ettiğimiz üç asitleri hakkında bir karara varılmasını sağladı. grup gen içerisinden birkaç genin mutasyona Böylece Crawford (1960) RSV'nin RNA genomu uğramış olması, yani mutasyonların birikmiş olması taşıdığını gösterdi. 1969'da Huebner ve Todaro, gerekir. RNA tümör virüslerinin genetik olarak aktarıla-

bileceği keşfine dayanarak, kanser için “onkogen hipotezi”ni öne sürdüler (Bu sürece kadar RNA Onkogenlerin Tarihçesi (Geçmişten Geleceğe)tümör virüsleri ile ilgili çeşitli çalışmalar olmuş ve çeşitli RNA tümör virüsleri ortaya çıkarılmıştı.). Aynı Rous Sarcoma Virüs'ün (RSV) Keşfizamanda hücre içerisinde kendilerini çoğaltarak ve diğer hücrelere de yayılarak tümör dokusu 1909'da Rockefeller Enstitüsü'nde (New York) oluşturan bu virüslerin transforming genler/”onko-çalışan Peyton Rous, Plymouth Rock ırkından bir genler” taşıdıklarını ortaya koydular (Huebner and tavuktaki büyük bir tümör vakasıyla işe başlamıştı. Todaro, 1969). Rous, bu kanser vakasının bu soyun diğer

bireylerine de geçebildiğini ve hatta bu soydan RSV virüsünün transformasyon için bir gen içermesi olmayan diğer tavuklara da bulaşabildiğini 1910 fikri o dönemde Mike Bishop ve Harold Varmus'u, yılında ispatladı ve bu tömüre “Chicken Tumor No. virüsün çoğalma döngüsünde işlevi olmayan 1” adını koydu. 1911 yılında ise bu kansere yol açan (Goldé, 1970; Martin, 1970; Toyoshima et al., 1970) ajanın hücre bulunmayan süzüntü ile de viral Src geni üzerinde düşünmeye teşvik etti. Mike taşınabildiğini (süzülmeye karşı koyabilen bir ajan) Bishop ve Harold Varmus bu genin yaşamın önceki kanıtladı. 1914 yılında da Murphy ve Rous bu yolla evrelerinde hücre genomundan alınmış olabile-geçen tümörlerin birbiriyle aynı özellikler ortaya ceğini de öne sürdüler. Bu fikri incelemek amacıyla çıkardıklarını görmüşlerdi. Bu sonuç, bu deney-Bishop-Varmus laboratuvarında çalışan Dominique lerden belki de 30-40 yıl sonra keşfedilecek olan Stehelin bu hipotezi inceledi ve viral Src (v-Src) gen-“virüslerin genetik özellik taşıdıkları” sonucu için o lerinin gerçekten de hücresel bir orijini (c-Src) oldu-zamanlarda görülememiş bir ipucuydu aslında.

ğunu keşfetti (Stehelin et al., Rous Sarcoma virüs birkaç on yıl 1976). Böylece tümör oluşturan boyunca kanser araştırmalarının retrovirüslerin neden genelde dışında tutuldu fakat yine de belli bir türe özgü olduğu da laboratuvarlara dağıtılan RSV soy-anlaşıldı. larından gelen bilgiler çoğaldıkça

ço-ğaldı. Rous'un seyahatleri Daha sonraları proto-onkogen boyunca RSV'nin (ileride böyle kavramı yeni bir gen türünü adlandırılacaktı) hep en güçlü tanımlamak için Huebner and varyantları seçilmişti. En sürpriz Todaro tarafından icat edildi! gelişme ise 1950'lerin sonunda bu Proto-onkogen kavramını, onko-virüsün, sanıldığının aksine gen kavramından ayırabilmek ve memelilerde de tümör oluştura-onkogenlerin öncülü olduklarını bilme yeteneğinin yenidoğan fare belirtebilmek için büyük uğraşlar ve sıçanlarda keşfedilmesiydi sonucu (!) icat ettiler (Ibaet al., (Svet-Moldavsky, 1957, 1958; 1984; Parker et al., 1984; Zilber and Kryukova, 1957, 1958; Shalloway et al., 1984). Schmidt-Ruppin 1959). RSV'nin

bazı varyantlarının memelilerde

mayıs 2012104

mayıs 2012 105

Transkripsiyon Faktörü Olarak Görev Yapan kan dokumuz gibi dokularda da kanserleşme Onkogenlerin Farklılaşmayı Bloke Edebilecek- görülebilmektedir. Burada kanserleşen doku lerinin Gösterilmesi farklılaşmış hücrelerin meydana getirdiği bir

tümörden değil, bu hücrelerin atalarının oluştur-Dominique Stehelin, Martine Roussel, Hartmut duğu tümörden meydana gelmektedir. Bu öncü Beug and Thomas Graf, avian leukemia virüs hücrelere progenitör hücreler denir. E26'nın ve AMV'nin (Avian Myeloblastosis Virus), fetal hematopoetik kök hücre oluşumunda gerekli Aynen bir dokunun içinde farklılaşmış hücreler ve olan bir transkripsiyon faktörüne karşılık gelen onların öncüllerinin bulunması gibi tümör doku-(Mucenski et al., 1991) v-Myb onkogen çeşidini larında da bölünmeyi kesmiş ve bölünmeye son içerdiğini gördüler (Roussel et al., 1979). İki tane v- hızıyla devam eden iki hücre tipi bulunur. Böyle Myb içeren virüsler seçici olarak myeloblastları tümör içerisinde de tümör dokusundaki diğer (granülositlerin ve makrofajların öncülü) kanser hücrelere oranla çok hızlı bölünme yeteneğine hücrelerine dönüştürürler (Beug et al., 1979). sahip olan hücrelere “tümör kök hücreleri” denir.Ayrıca daha önemli olarak, v-Myb aynı zamanda makrofajların myeloblastlara dediferesensiayonu-nu indükleyeceği gösterildi (Beug et al., 1987; Ness et al., 1987). Ancak transkripsiyon faktörleriyle indüklenen transdiferensiasyonun aksine, hücre fenotipini değişmiş pozisyonda tutmak için v-Myb'nin sürekli olarak ifade edilmesi gerekir, çünkü myeloblastlarda inaktive olduğu durumlarda bu hücreler fonksiyonel makrofajlara dönüşürler (Beug et al., 1984). Bu da onkogenlerin indüklemek yerine myeloid hücrelerinin farklılaşmasını seçici olarak bloke ettiğini gösterdi. Burada hücre farklılaşmasıyla ilgili v-Myb'nin davranışı çoğu kanserde onkogenlerin yaygın bir davranışı olarak görülmektedir.

Tümör Kök Hücreleri

Onkogenik mutasyonların kansere yol açabilmesi için bu mutasyonların bölünebilir hücrelerde olması ve dolayısıyla yeni bölünen hücrelere bu mutasyonların aktarılması gerekmektedir. Kas ve sinir dokuları gibi bölünmeyen dokularda meydana gelen onkogenik mutasyonların çoğunlukla kanser oluşturmamalarının nedeni de bölünmediklerin-den dolayı tümör oluşumuna yatkın olmayışların-dandır. Fakat, yine de eritrositlerimiz ve lökositleri-miz gibi çoğunlukla farklılaşmış hücrelerden oluşan

tek sayfahükök

DERLEMELER

Kanser kök hücresi nedir? hücrelerinin kök hücreleri anımsatan özelliklere sahip olması fikri yeni bir teori değil. Bu teori ilk

Özellikle son yıllarda birçok araştırmaya konu olan olarak 19. yüzyılda Rudolph Virchow ve Julius kanser kök hücreleri (KKH) tümör dokusu içinde Cohnheim tarafından kabul edilmiş. Virchow veya hematolojik kanserlerde bulunan ve normal 'embriyonal rest hypothesis' hipotezinde fetal kök hücre özelliğine sahip olan kanser hücreleridir. dokuyla kanser hücreleri arasındaki yenilenme ve Yani bu hücreler kanser hücrelerinin kendi farklılaşma özellikleri bakımından benzerliklerini kendilerini yenileme ve farklanma özelliği olan alt vurgulamıştır. Daha sonra Cohnheim ve Durante bu gruplarıdır. Bu özellikleriden dolayı tümör hipotezi mature organlardaki embryonik kalıntı-oluşturucu (tümörojenik) yapıdadırlar ve 'kanseri ların varlıklarını göstererek genişletmişler ve Beard başlatan hücre ' olarak da adlandırılmaktadırlar. kanserin aktifleşmiş germ hücrelerinden ya da İlaç ve radyasyon tedavisine dirençli olan bu plasental dokudan köken aldığı hipotezini hücrelerin tümör dokusu içinde ayrı bir popülasyon savunmuştur.olarak kaldıkları, yeni tümörler oluşturarak metastaza ve kanserin yenilenmesine sebep Tüm bu hipotezlerde kanserin kökeninin farklana-oldukları düşünülmektedir. Bu yüzden KHH spesifik bilmesi, yenilenebilmesi ve çoğalması bakımından tedavilerin geliştirilmesiyle özellikle metastatik gelişmekte olan embriyo hücrelerine benzeyen kanserlerden kurtulma şansının artacağı ümit hücrelerden oluşturduğu fikri gelişmiştir.Tümör edilmektedir. hücrelerinin diferansiye tümör oluşturucu özelliği

olan hücreler içerdiği ilk olarak 1961 yılında KHH'nin tarihçesi: kanıtlanmıştır. Southan ve Brunschwig hastalardan

alınan rekürent kanser hücrelerini kültür Kanser kök hücresiyle ilgili araştırmalar son yıllarda ortamında yetiştirip ototransplantasyon yöntemiy-oldukça artış göstermiş olmakla beraber kanser le farklı bölgelere aktardığında görülmüş ki yeni bir

tümör oluşturabilmek için en az bir milyon hücrenin enjekte edilmiş olması gerekiyor ve bu çalışmaların yaklaşık olarak da yüzde ellisi sonuç veriyor. Bu konuda daha sonra yapılan çalışmalar da benzer sonuçlar göstermiştir.Bu çalışmalar sonu-cunda tüm hücrelerin tümör oluşturucu özellikte olmadığı ve tümör oluşturan hücrelerin arasında bir hiyerarşinin mevcut olduğu öne sürülmüştür.

Kanser hücrelerinin hiyerarşisi ilk olarak lösemi hakkında Lapidot ve meslektaşları tarafından 1994 yılında kanıtlanmıştır. Akut myeloid lösemi hasta-larından izole edilen CD34+CD38- hücrelerinin nonobese/severe immun deficiency (NOD/SCID)

hükök

Kök Hücre, Kanser ve Kanser Kök Hücreleri

Damla Erimhan, Ülke Kocademir, Merve Cansu Kaya

mayıs 2012106

mayıs 2012 108

farelere enjekte edildiğinde tümör gelişimi olurken KKH'lerinin kök hücrelerden köken alması her daha çok farklanmış olan CD34+CD38+ hücreleri zaman gerekmeyebilir.Mature hücrelerin hücre çok fazla miktarlarda verilse bile tümör oluştur- füzyonu veya horizontal gen transferiyle geri madığı ve hatta CD34+CD38- hücrelerinin morfolo- diferensiyasyona veya transdiferansiyasyona jik açıdan hastadaki orijinal hastalığa benzediği uğramasıyla da oluşabilirler. Hem genetik hem de gösterilmiştir. epigenetik faktörler bu transformasyonda etkili

olabilir.Lösemi kök hücresi araştırmasında oldukça ilerlen-miş olmasına rağmen Al-Hajj , Clarke ve meslektaş- KKH'leri farklı maturasyon aşamalarından köken ları tarafından ilk olarak 2003 yılında meme kanser alıyor olabilirler. Bu hipotez hem beyin hem de kök hücreleri rapor edilene kadar solid tümör kök meme kanseri araştırmalarından elde edilen hücreleri çok fazla dikkat çekmiyordu. Bu çalışmada bilgilerle desteklenmiştir. Bu çalışmalarda Ince ve CD44+CD24- yüzey belirteci olan insan meme meslektaşları aynı genetik kökenden gelen insan kanseri örneklerinden izole edilen oldukça mammary (?) epiteli hücrelerinin ve birincil tümörojenik bir popülasyonun, NOD/SCID fareler- breast(?) epitel hücrelerinin transformasyonundan de tümör oluşturma kapasitesinin çok yüksek 2 farklı tümör elde etmiştir. Squamos hücre olduğu görülmüştür. CD44+CD24- olan bu hücre- karsinomasına benzeyen ve MEGM kültür lerin 100 tanesi bile tümör oluşturmaya yeterken ortamında transforme olmuş insan mamary epitel on binlerce CD44-CD24+ hücre oluşturamamıştır. hücrelerine kıyasla Wli olarak tanımlanan

serumsuz kültür ortamında transforme olmuş Daha sonra yine 2003 yılında Singh ve meslektaşları birincil breast epitel hücreleri breast adenokarsino-tarafından KKH'leri insan beyin tümörlerinde ,2007 maya çok daha fazla benzemekle birlikte tümör-yılında Ricci-Vitani ve meslektaşları tarafından ojenitesi ve metastatik yeteneği de daha fazladır. kolon kanserinde ve Li ve meslektaşları tarafından Aynı zamanda beyin tümörlerinin hem nöral öncül-pankreas kanserinde KKH'leri tanımlanmıştır. lerden hem de diferansiye hücrelerden oluştuğu Bunların dışında KKH'leri prostat,karaciğer,baş ve rapor edilmiştir. Buna rağmen ilginç bir şekilde boyun, akciğer ve deri gibi birçok kanserde de öncül hücrelerden köken alan tümörler astrosit-tanımlanmıştır. lerden köken alan tümörlere göre daha az malign

bulunmuştur.Ayrıca KKH'lerinin ilaçlara dirençliliği Dean, Fojo ve Bates tarafından 2005 yılında , radyoterapiye Tümör hücreleri farklı hücre türlerinden köken dirençliliği konusu Diehn ve Clarke tarafından 2007 aldığı için KKH'leri arasında bir hiyerarşiden söz yılında ,terapatik resistansı konusu Eyler ve Rich edilebilir. Bu yüzden spesifik tümör türlerinde tarafından 2008 yılında çalışılmıştır. 2007 yılında KKH'leri her zaman aynı yüzey belirteçlerine sahip Stingl ve Caldas tarafından yapılan 'Meme olmayabilirler. Son zamanlarda yapılan çalışmalar-kanserinin moleküler heterojenitesi ve KKH dan glioma kök hücrelerinin bir türünün CD133 hipotezi' 2008 yılında Li ve meslektaşları tarafından yüzey belirtecini eksprese etmemesi bu hipotezi yapılan 'Meme KKH'lerinin kemoterapiye intirinsik kanıtlar. Buradaki hiyerarşide hücresel heterojenite resistansı' çalışmaları da bu konuda yapılan birçok kastedilmiştir. Fakat buradaki heterojenite tümörü önemli çalışmanın sadece birkaçıdır. çevreleyen invaziv endotelial , hematopetik hücre

veya diğer kanser olmayan hücre anlamında KKH'lerinin kökeni : kullanılmamaktadır. Buradaki heterojenite daha

çok tümördeki kanser hücrelerinin farklılığı KKH'lerinin kökeni tam olarak bilinememekle anlamında kullanılmaktadır. Heterojenitenin birlikte hala bir araştırma konusudur. KKH'lerin nedeni farklılaşmış kanser hücrelerinin ya farklı kök normal kök hücrelerden veya çeşitli mutasyonlara hücrelerden kaynaklanmasından ve/veya farklı maruz kalan progenitör hücrelerden köken aldığı mutasyon profillerinin yansımasından kaynaklan-düşünülmektedir. Lösemi kök hücreleri ve beyin maktadır. Bu farklılıklarla hücrenin moleküler kanseri kök hücreleri normal kök hücrelerle benzer profillerinin belirlenebileceği ve böylece kanserin yüzey belirteçlerine sahiptirler. Ayrıca bazı KKH önlenmesi ve uygun tedavi stratejisinin geliştiril-türlerinin normal kök hücrelerdeki yenilenme (self- mesi için doğru hedefin seçilmesinin sağlanabile-renewal) yolaklarına (Notch , wnt , sonic hedgegog ceği düşünülmektedir.(Shh) gibi ) sahip olmaları KKH'lerinin kökeninin kök hücreler olduğunu düşündürmüştür. Ancak Kendi-kendini yenileme, farklılaşma ve kanser

hükök derleme

oluşumundaki sinyal ileti yolları: masına sadece farklı epitel hücrelerinde değil, aynı zamanda hematopoetik kök hücrelerde de katılır. .

Kanser kök hücreleri kanser hücrelerinden birçok Multiple myeloma , beyin ve meme kanserinde bakımdan farklıdır. Bu farklılık sadece KKH'lerinin tümör kök hücresi bölümleri elde edilmesinde oksijensiz çevreye, radyasyona ve standart önemli olduğu rapor edilen Shh sinyal ileti sistemi kemoterapi ilaçlarına karşı dirençli olmalarından de kendi-kendini yenileme mekanizmasının düzen-kaynaklanmaz. Aynı zamanda sinyal ileti yolları lenmesine katılmaktadır.bakımından da farklılık gösterirler. Özellikle normal kök hücrelerin yenilenmesini düzenleyen Notch Normalde kök hücrelerinin kendi-kendilerini ,Wnt ,Sonic hedgegog (Shh) gibi gelişimsel ileti yenilemesini düzenleyen sinyal ileti sistemleri, yollarının KKH'leri için önemli olduğu ileri sürülmüş sistemde aksilik olduğunda tümör oluşumuna ve birçok KKH'si için doğrulanmıştır. Bu ileti öncülük eder. Lösemi-öncü hücrelerinde PTEN yollarının yenilenme üzerindeki etkilerinin anlaşıl- geninin tümör baskılayıcı geninin kaybı miyelo-ması tümör oluşumunun anlaşılmasına yeni ışık proliferatif hastalığa öncülük eder. Ayrıca, PTEN açmıştır. Normal ve transforme olmuş kök hücre- kaybı hematopetik kök hücrelerin çoğalmasını lerin kendi-kendilerini yenileme mekanizmaları sağlamaktadır. Bununla birlikte, kendi-kendine benzer sinyal ileti sistemleri ile, fakat farklı şekilde yenilenmesinin baskılanması ise hematopoietik düzenlenmektedir. Lösemi ve hepatoseluler kök hücrelerinde azalmaya neden olmaktadır. Bu karsinoma kök hücreleri için önemli olduğu etki mTOR'un rapamycin ile baskılanmasıyla oluşur. gösterilen Wnt sinyal ileti sistemi, reseptörlerinin Rapamycin bir yandan lösemi-öncü hücrelerinin bağlanması ile aktif hale gelir, β-cateninin yıkılımı azalmasına neden olurken diğer yandan normal kompleksinden ayrılmasını sağlar ve nükleusa hematopoietik kök hücrelerin fonksiyonunu geçer ve burada Cyclin D1 ve C-MYC gibi genlerin yeniler. Kanser kök hücresi ile normal kök hücre tarnskipsiyonunu düzenleyerek kök hücrelerin arasındaki kendi-kendini yenilemenin mekanistik kendi-kendini yenilemesini ve farklılaşmasını farklılığı kanser tedavisinde kullanılabilir, böylece sağlar. Transgenik farelerde yapılan in vivo normal kök hücrelere zarar vermeden kanser kök çalışmalar, epidermal kök hücrelerde Wnt sinyal hücreleri hedef olarak kullanılabilir. Diğer bir örnek ileti sisteminin aktif hale gelmesiyle epitel hücre de, BCL- 2 onkogeninin ekspresyonuyla apoptozisin kökenli kanserlerin oluşumuna öncülük ettiğini engellenmesi in vivo olarak hemapoetik kök hücre göstermektedir. Wnt sinyal ileti sistemi, kök (HKH) sayısının artması ile sonuçlanır, bu da hücrelerin kendi-kendilerini yenilemesi mekaniz- HKH'lerin homeostasisin düzenlenmesinde hücre

mayıs 2012109

hükökderleme

mayıs 2012 110

ölümünün rol oynadığını göstermektedir. hücreleri ilk olarak hematopoietik sistemde tanımlanmıştır. SP fenotipinin oluşma mekanizması

KKH'lerinin izolasyonu : tam olarak anlaşılmamış olmasına rağmen bazı ABC(ATP-binding casette ) transportlarının (ABCG2

KKH'lerini tanımlamak için altın standart bu /BCRP , ABCB1/MDR ve ABCA3 gibi ) Hoechst 33342 hücrelerin tümörojenitesinin ve kendi kendini isimli floresan boyayı hücre dışına pompalamaları yenileme kabiliyetinin yüksek olmasıdır ve bu veya KKH'lerinin bu hücrelere göre pasifliğinin bu özellikler KKH'lerinin immün yetersizliği olan boyayı hücre içine almasını kısıtlaması SP feno-farelere transplante edilmesi sonucu anlaşılır. Son tipine neden olabilir. Hoeschst boyasının bu hücre-yıllarda KKH'lerini izole etmek veya zenginleştirmek lerde birikmemesi sebebiyle SP hücreleri flow sito-için 3 metod yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu 3 metri yöntemiyle izole edilebilir ve bu hücrelerin metot flow sitometrisi kullanarak yüzey belirteçleri lösemi , yumurtalık kanseri , tiroit kanseri , naso-ekspresyonu, yan popülasyon ve sfer kültür. Ancak faringeal karsinoma gibi birçok tümörde KKH'lerini KKH'lerini kesin olarak tanımlamak için evrensel bir zenginleştirdiği kanıtlanmıştır.metot yoktur. Her yöntemin kendi avantajları ve kısıtlamaları vardır. SP hücreleri KKH'lerini zenginleştirmek için yaygın

olarak kullanıldığı halde SP hücrelerinin kanser kök Yüzey belirteçleri: İlk olarak birçok kanser hücresi hücresi olduğunu iddia etme konusunda bazı yüzey belirteçlerine göre izole ediliyordu. Eğer endişeler vardır. SP analizi için kullanılan Hoeschst doğru yüzey belirteci kullanılırsa saf KKH popülas- 33342 boyası hücreler için toksik bir maddedir ve yonu elde edilebilmesi bakımından avantajlı olan SP hücreleri SP olmayan hücrelere göre daha az bu metot en çok kullanılan metottu fakat şu ana boya alırlar. Bu boyanın toksisitesi SP olmayan kadar bilinen yüzey belirteçleriyle ilgili potansiyel hücreleri daha çok etkilemesi bakımından bir kısıtlamalar veya problemler ortaya çıkmıştır. KKH sapmaya neden olabilir.için rapor edilen (meme, kolon veya pankreatik karsinomalar için CD44 veya CD24, glioblastoma, Ayrıca SP fenotipi kök hücrelere özgü olmayabilir, kolon veya prostat için CD133, melanoma için farklı sürelerde bu boyaya maruz kalan hücrelerin CD20) yüzey belirteçlerinin dağılımının in-situ geçici bir özelliğini belirtiyor olabilir. Bu yüzden immunohistokimyasal analizleri KKHlerin tümör boya konsantrasyonu ve boyama zamanı dışında da içindeki spesifik lokalizasyon paternlerini açığa birçok parametre SP fenotipinin etkiler. Bugüne çıkmasında başarısız olmuştur. Bu belirteçleri kadar SP kültürü için koşullar tanımlanmamıştır. Bu eksprese eden tümör hücreleri arasında tümöro- durum SP modelini kullanmayı oldukça zorlaştır-jeniteleri bakımından farklılık olmasına rağmen bu maktadır.farklılığın birçok açıklaması vardır. Örneğin bu farklılık farelerdeki farklı büyüme paternleri ve Sfer kültür (sphere culture): Bu yöntem ilk olarak farklı konak immun reaksiyonu dolayısıyla olmuş 1992'de nöral kök hücreleri kolonojenik olarak olabilir. Ayrıca transformasyon sırasında birçok genişletmek için geliştirilmiştir.Birincil nöral mutasyon birikimi olabilir. Bu yüzden normal doku hücrelerin içinde küçük bir popülasyon (<0.1%) çalışmalarında yaygın olarak kullanılan yüzey nörosfer denilen farklanmamış hücre grubunu belirteçleri kanser numunelerindeki biyolojik oluşturabilir. Nörosferlerin %4-20 sinin nöral kök revelansını yansıtmayabilir. Ayrıca izolasyonun ilk hücrelerden oluştuğu gösterilmiştir. Popülasyonun basamağındaki tümör biyopsisinden tek hücre kalanını farklanmanın farklı aşamalarındaki süspansiyonu elde ederken kullanılan proteolitik progenitör hücreler oluşturmaktadır.2003 yılında enzimlerin tümör hücrelerindeki bazı yüzey Dontu ve meslektaşı sfer kültür tekniğini meme antijenlerini de parçalamış olabileceği düşünül- kök/progenitör hücrelerini kültüre ekmek ve mektedir. Buna ek olarak normak kök hücrelerin zenginleştirme yöntemine başarıyla uygulamış-yüzey belirteçleri konusundaki bilgilerimiz de lardır. O zamandan beri sfer kültür tekniği beyin, kısıtlıdır. Kanser kök hücrelerini izole etmek için kolon, meme KKH'leri ve melanoma kök hücreleri günümüzde kullanılan yüzey belirteçleri KKHleri gibi birçok KKH çalışmalarında yaygın olarak için spesifik değildir, normal hücrelerde de eks- kullanılmaktadır. İnsan meme kanseri hastaların-prese edilirler. Bu konuda birçok tartışma halen dan alınan örneklerde bu yöntemin CD44+CD24- devam etmektedir. popülasyonunu %40'tan %98'e yükselttiği rapor

edilmiştir. Bu sfer hücreler parental hücrelere göre Yan Populasyon [Side population(SP)]: SP belirgin olarak daha fazla tümörojeniteye ve

hükök derleme

radyasyona karşı daha fazla dirence sahiptir. den farklı olarak KKH'leri ABC transporterlarını yüksek oranda exprese etmeleri (temel olarak

Sfer kültür tekniği yüzey belirteçlerine ve SP ABCG2/BCRP ve ABCB1/MDR1) , yüksek DNA tamir izolasyonuna dayanan diğer metotlara göre daha yeteneği , azaltılmış immünijeniteleri , kalıtsal anti-kullanışlı bir yöntem sağlar fakat bu yöntemin apoptosis özelliği ve pasiflikleri sebebiyle ilacı dezavantajı da sfer hücrelerinin heterojen olması hücre içine daha az aldıkları gibi tamir sistemleri ve ve sferdeki hücrelerin belli bir oranının yenilenme antiimmün mekanizmaları ile ilacın etkisini de en özelliği gösterip kök hücre popülasyonunu temsil aza indirirler ve böylece birçok geleneksel kemo-etmesidir.Ayrıca nöral kök hücre araştırmalarında terapiye karşı dirençli olurlar.da gösterildiği gibi sfer içindeki kök hücrelerin zenginleştirilmesi sfer boyutuna, pasaja, kültür KKH'lerini hedefleme:ortamı ve tekniğe göre değişebilir.

KKH'lerinin standart kemoterapiye dirençli olması KKH'leri ve tedaviye dirençlilik: sebebiyle sağ kalan KKH'leri yeni tümörler

oluşmasına ve metastaza neden olabilir. Bu yüzden Günümüzde kullanılan kanser kemoterapi ilaçları kanserin uzun vadede gerilemesi KKH'lerinin yok kontrolsüzce çoğalan kanser hücrelerini öldürerek edilmesini gerektirmektedir.yada inhibe ederek etkilerini gösterirler. Bu geleneksel yaklaşım tümör kitlesi içindeki minör bir KKH'lerinin elimine etmek için birçok yaklaşım popülasyon olan KKH'lerini görmezden gelmekte- planlanabilir.KKH'leri tercihli olarak önemli olan dir. Dahası diğer kanser hücrelerinden farklı olarak sinyal ileti yolları inhibe edilerek veya bu KKH'leri bazı kendine has özelliklere sahiptir. Bu hücrelerde öncelikli olarak aktif olan ABC özellikler genellikle bilinen çeşitli tedavilere karşı transporterlarını inhibe ederek hedeflenebilir. kalıtsal dirençliliğe sebep olmaktadır. Normal kanser hücreleri yerine KKH'leri üzerinde

geleneksel hücre temelli ilaç taraması bir başka KKH'lerinin klinik ilaçlara karşı olan dirençliliği umut vadeden yaklaşımdır.birçok farklı tümör tipinde gösterilmiştir. Akut myeloid lösemi (AML) kök hücreleri (CD44+CD38- Sinyal ileti yollarını hedefleme: Kanser hücreleri ve )hakkındaki çalışmalar. KKH'lerinin lösemi tedavi- KKH'lerinin sinyal ileti yollarındaki farklılıkKKH'leri sinde yaygın olarak kullanılan daunorubicin adlı için terapatik hedefler sağlayabilir. KKH'leri için ilaca CD44+CD38+ hücrelere göre daha dirençli önemli olan Notch,Wnt,Shh,NFKB,PI3K,PTEN gibi olduklarını göstermiştir. Kronik myeloid lösemi sinyal ileti yollarının elimine edilmesi mümkündür. (CML) kök hücreleri hakkındaki çalışmalar ise CML Bu yollara spesifik inhibitörler kullanılarak kritik kök hücrelerinin (CD44+CD38-) son yıllarda öneme sahip genlerin fazla eksprese edilmesi veya geliştirilen ve en başarılı hedef temelli ilaç olan baskılanması umut vadedicidir.Imatinib mesylate (Gleevec ) 'e dirençli olduğunu ileri sürmüştür.Buna benzer birçok KKH türünün ABC transporterlarının hedeflenmesi: KKH'leri [myeloma kök hücreleri (CD138-),beyin KKH'leri genellikle ABC transporterlarını fazla eksprese (CD133+) ve hepatocelular karsinoma (HCC) ederler. Bu durum toksik maddelere ve (CD133+), meme KKH'leri (CD44+CD24-) gibi ] oksijensizliğe karşı KKH'lerinin sahip olduğu kalıtsal standart kemoterapi ilaçlarına ve radyoterapiye koruyucu mekanizmasıdır ve KKH'lerinin ilaca dirençli oldukları rapor edilmiştir. dirençliliğinin en büyük nedenlerinden biri olarak

sayılmaktadır.SP fenotibinin verapamil, fumitre-KKH'lerinin standart kemoterapiye dirençliliği, morgin, C(FTC) ve reserpine gibi bazı ABC günümüzde kullanılan kanser tedavisine karşı olan transporter spesifik inhibitörler tarafından bloke çelişkili cevabının ve neden hayatta kaldığının edildiği gösterilmiştir.açıklaması olabilir. İmatinib'in KKH'lerini yok edememesinin ve CML'yi relaps olmadan tamamen ABC transporter ekspresyonunun inhibe edilmesi tedavi edememesinin en iyi açıklaması güncel ile en azından KKH'lerinin ilaç dirençliliği fenotipini kanser ilaçlarının sadece çoğalan kanser hücrelerini kısmen de olsa aksine çevirmesi mümkündür .Fakat hedef almasıdır. bu yaklaşımdaki birçok deneme başarısızlığa

uğramaktadır.KKH'lerinin ilaç dirençliliğini açıklayan birçok mekanizma mevcuttur. Normal kanser hücrelerin- KKH'lerinin tıp için önemi ve potansiyelleri:

mayıs 2012110

hükökderleme

mayıs 2012 111

Referanslar:

1- http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer_stem_cell

2- Tannishtha Reya, Sean J. Morrison, Michael F. Clarke& Irving L. Weissman. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001 Nov 1;414(6859):105-11.

3- Jiangbing Zhou,Ying Zhang.Cancer stem cells models mechanis im and implicat ions for improved treatment.Landes Bioscience.2008 May Cell Cycle 7:10,

Hasta tümör dokusundan izole edilen son derece 1360-1370lösemik veya tümörijenik KKH'lerinin in vivo ve ex vitro olarak farklılaşmış kanser hücre kitlesi 4- Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells.N oluşturduğu ve bunların lösemi veya tümör Engl J Med. 2006 Sep 21;355(12):1253-61.

oluşumundan sorumlu olduğunun gösterilmesi ile 5- Musaffe TUNA. MD Anderson Cancer Center, Cancer desteklenen KKH hipotezine göre kanser tümör Genetics, Houston, ABD. Solid tümörlerde ve dokusunda oluşan kök hücrelerden oluşur ve lösemilerde kanser kök hücreleri.Türk Onkoloji Dergisi 'kanseri başlatan hücre' olarak da adlandırılan bu 2009, Cilt 24, Sayı 1, Sayfa(lar) 042-047

kanser öncü hücrelerinin kanserin başlaması, ilerlemesi ve klasik tedavi şekillerine direnç

6- Brenton Thomas Tan1, Christopher Yongchul Park, göstermesinden sorumludurlar. Ayrıca birçok Laurie Elizabeth Ailles and Irving L Weissman. The cancer kanser hücresinin yeni bir tümör oluşturma stem cell hypothesis: a work in progress. Laboratory yeteneğine sahip olmadığı, sadece nadir olarak I n v e s t i g a t i o n ( 2 0 0 6 ) 8 6 , 1 2 0 3 – 1 2 0 7 . bulunan bu KKH'lerinin metastatik hastalıklara yol doi:10.1038/labinvest.3700488; published online 30

October 2006açtığı düşünülmektedir. Eğer öyleyse tedavinin amacı KKH populasyonunu tanımlamak ve

7- Michael F. Clarke, John E. Dick, Peter B. Dirks, Connie J. öldürmek olmalıdır. Kanser tedavisinin KKH'lerini Eaves, Catriona H.M. Jamieson, D. Leanne Jones, Jane elimine etmekte başarısız olmasının tümörün Visvader, Irving L. Weissman, and Geoffrey M. Wahl.

tekrar oluşmasına neden olduğu ise kanıtlanmış bir Cancer Stem Cells—Perspectives on Current Status and

gerçek ve bu gerçeğe dayanarak kitlenin tamamen Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem

yok edildiği ve kemoterapinin uygulandığı durum- Cells. Cancer Res October 1, 2006 66; 9339.larda kanserin tekrar etmesinin açıklaması KKH' lerinin tam olarak yok olmamasıdır denilebilir. Bu yüzden spesifik olarak KKH'lerini hedef alan stratejiler güncel tedavi yöntemlerine göre daha etkili olmakla birlikte kanserin yenilenmesi ve metastaz risklerini de azaltacağı düşünülmektedir.

hükök derleme

1 Kasım 1942 Pittsburgh(Pennsylvania) Ras ve yine ilk insan tümör supresör geni olan Rb' yi doğumlu Amerikalı bilimadamı Massach- bulmuştur.usetts Teknoloji Enstitüsü(MIT)'de biyoloji 1dalında 1964 yılında B.S, 1965 yılında M.A, 1970'lere kadar kanserin kaynağının virüsler

1969 yılında ise PhD ünvanlarını aldı.Temel olduğu düşünülüyordu.Bilimadamları bu düşüncel-araştırma alanı onkojenler ve insan kanserinin erini kanıtlamak için birçok deney ve araştırma genetik temeli olan Weinberg şu anda ise kanser yaptılarsa da virüsler ile kanser arasında bir hücre metastazlarıyla ilgili çalışmalarını sürdür- bağlantı kurulamadı.Bu durum kanser araştırma-mektedir.Ayrıca ünlü bilimadamı ilk insan onkojeni larının başka yönlere çevrilmesini sağladı ve

böylece günümüzde de bildiğimiz gibi kanserin asıl kaynağı olan 'onkojen'ler hakkında çalışmalar başlamış oldu.

1972-1973 yılları arasında Robert A. Weinberg MIT'nin Kanser Araştırma Merkezi'nde biyoloji bölümünde assistant prof. olarak çalışmalarını sürdürdü.1976 yılında ise MIT'de associate prof. oldu.

1970'lerin sonlarına gelindiğinde ise bir düzine onkojen tanımlanmasına rağmen kimse bu bu onkojenlerin virüsler tarafından aktif edilmeksizin kansere sebep olabileceklerini kanıtlayamadı. Sonunda Weinberg 1980 yılında bunu kanıtladı. Aktif bir kanserli insan hücresinden DNA alıp bunu normal fare hücresine transfer etti ve bu hücrelerin de kanserli hücre özellikleri gösterdiğini gözlem-ledi. Weinberg'in bir sonraki araştırması ise her kanser çeşidi için onkojen nitelikteki belirli genleri tanımlamak oldu.Weinberg ve arkadaşları 1981'de lösemi,kolon ve mesane kanseri için bu genleri belirlediler.Böylece karsinogenezin moleküler temeli kurulmuş oldu ve yine ilk kez spesifik onkojenler izole edilip karakterize edilmiş oldu.

1981'de mesane ve akciğer kanseri onkojenlerinin klonlanması sayesinde aslında, değişmiş olan bu genlerin normal hücrelerde de mevcut olduğunu

hükök

Robert Allan Weinberg Kimdir?

Robert Allan Weinberg

mayıs 2012112

hükökderleme

mayıs 2012 113

kanıtladı. Ancak bu genlerin bazı nedenlerle lerle birlikte 100 den fazla çeşitte kanser hücresi aktifleşene kadar pasif durumda oldukları veya az tanımlanırken bu kanser hücrelerinin ortak özellik-miktarda aktif olduğu görüldü. Teoriye göre; lerini tanımlamak çok zordu.Bu sebeple R. karsinojenler genleri etkileyerek onların nükleik Weinberg ve Douglar Hanahan(İsveç Deneysel asit zincirinde küçük değişikliklere sebep oluyor- Kanser Araştırma Enstitüsü) Ocak 2000'de Journal lardı ve bu durum bir şekilde hücrenin normal Cell'de yayımlanan ''The Hallmarks of Cancer'' regülatör mekanizmasını bozuyordu. Yine teoriye isimli bir peer review yazmışlardır ve bu yazı en sık göre kanserin gelişimi için 2 aşamalı bir süreç alıntı yapılmış peer view olmuştur. Weinberg ve mevcuttu; ilk olarak onkojenin oluşumu, ikinci Hanahan bu yazıda sağlıklı bir hücreden kanserli bir olarak ise belki de yıllar sonra maruz kalınılabilecek hücre oluşumundaki 6 ortak basamaktan bahset-herhangi bir karsinojen madde.Böylece bu iki mişlerdir. Bunlar şöyle sıralanmıştır;1-büyüme aşamalı sistem kanser insidansının artan yaşla sinyalinin hücrenin kendi kendine üretmesi 2-anti-paralellik göstermesi durumuna da bazı açıklama- growth sinyallere karşı duyarsızlık 3-doku invaz-lar sunabiliyordu. yonu ve metastazı 4-sınırsız replikasyon potensiyeli

5-sürekli olan angiogenesis 6-apoptosisten kaçın-1982'de Weinberg MIT'de biyoloji bölümünde ma. Mart 2011 de Weinberg ve Hannahan bu 6 profesör ünvanını aldı. Aynı yıl içerisinde kanser, hallmark' a 2 tane daha eklemiştir. Bunlar ise;1) AIDS, salgın ve kalıtımsal hastalıkları araştıran tümör geliştiren inflamasyon 2) gen instabilitesi ve Whitehead Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü 'nü mutasyonu (bu madde tek başına kansere sebep kurmuştur. Yine aynı yıl Discover dergisi tarafından olmayıp normal bir hücrenin kanserli bir hücreye yılın bilim adamı seçildi. 1983'te ise Warren dönüşümüne yardımcı oluyor) Triennal ödülünü ve Robert Koch ödülünü almıştır. 1985'te ise Amerikan Kanser Topluluğu tarafından Tüm bunların yanı sıra bir çok bilimsel kitap ve biyoloji dalında onursal profesör yapılmıştır. Bunu raporun yazarı olan Weinberg 2006 yılında da takip eden yıllar içerisinde de birçok uluslararası kanserin moleküler ve hücresel temelini anlattığı kuruluştan pek çok ödül almıştır. Bunlar içerisinde; ''The biology of Cancer''i yayımlamıştır.Robert A. 1997 yılında aldığı ABD'nin en önemli bilim ödülü Weinberg günümüzde MIT'de biyoloji dalında olan Ulusal Bilim Madalyası ve aynı yıl Japonya'da profesör olarak kanser çalışmalarına devam seçkin bir ödül olan Keio Medical Science ödülünü etmektedir.alması önemli bir yer tutmaktadır.2004'te ise tıp alanında Wolf ödülünü, bilimsel ve tekniksel araştırmalar alanında ise Asturias ödülünü kanser araştırmalarına öncülük eden beş kişiden biri olarak almıştır.Weinberg ''insan onkojenlerini tanımlayan öncülerden biri'' olarak kabul görül-müştür.

1999 yılında Weinberg ve meslektaşları ilk kez sağlıklı insan hücresinin genetik değişimle kanserli bir hücreye dönüşümünü başarmıştır. Bu çalışma-sından yola çıkarak Weinberg insan vücudundaki 4 geni kansere yol açan 'yapıcı blok' olarak belirle-miştir. Bunun yanı sıra 2004 yılında ise ''Twist'' adlı genin kanser metastazında kilit rol oynadığını tespit etmiştir. Normalde sadece embriyonik dönemde aktif olan bu genin metastaz yapan kanserli hücre-lerde de aktif durumda olduğunu gözlemlemiştir. Farelerle yaptığı deneylerde ise metastaz özelliğe sahip meme kanseri hücrelerini almış ve Twist genini inaktif hale getirip tekrar fareye verdiğinde bu kanser hücrelerinin metastaza neden olmadığını görmüştür.

20. yüzyılın sonuna gelindiğinde, genetik gelişme-

hükök derleme

pesifik olarak epitel kanser kök hücreleri yetenekleriyle gözlemlenmiştir.Aynı zamanda, (KKH) öldürecek ajanlar bulmak,bu hücre- KKH'sinden zengin kanser hücre popülasyonlarının Slerin tümör dokusu içinde çok nadir in vitroda da belirli özellikler sergilediği

bulunması ve kültür ortamında diğerhücrelere göre görülmüştür:stabil olmaması sebebiyle mümkün değildi.Bu çalışmada epitel KKH-spesifik toksisitesi olan 1- KKH's inden zengin popülasyonlar ajanları bulmaya yönelik bir yaklaşım tanımlan- ,''cellsurface marker'' profilleriyle izole edilebilirler. maktadır. (Örneğin,memeKKH'leri CD44-high/CD24-low

oranı yüksek hücrelerce zengindir.)Bu amaçla kimyasal tarama metodu uygulanarak 2- KKH'sinden zengin popülasyonlar, meme KKH'lerine karşı seçici toksisite gösteren süsfansiyon kültürlerinde tümör ''mammo-bileşikler keşfedilmiştir.Bir bileşiğin (salinomycin) spheres'' veya ''tumorspheres'' adı verilen küresel meme kanseri kemoterapisinde yaygın olarak koloniler oluşturur.kullanılan ilaç olan paclitaxel'e göre KKH oranını 100 kattan fazla azalttığı görülmüştür.Farelerin 3- KKH'sinden zengin popülasyonlar, salinomycin ile tedavisiyle,canlı ortamda meme kemoterapik ajanlara ve iyonize radyasyona karşı tümörü büyümesi inhibe olurken aynı zamanda artmış direnç gösterir.tümör hücrelerinin epitel hücrelere farklılan-masının uyarıldığı görülmüştür.Buna ek olarak; Prensip olarak ''automatedscreening'' teknoloji-salinomycin tedavisinin meme KKH genlerinin sinin kullanımı KKH-spesifik ajan tanımlanmasını ekspresyonununkaybedilmesini sağladığı,global kolaylaştırsa da,KKH'lerinin tümör içindeki oran-gen ekspresyon analizi (GGA) ile gösterilmiştir.Bu larının düşük olması,tümör kitlesine uygulanan çalışma,epitelyum KKH'leri için spesifik toksisiteye ''standart high-through put cell viability assay'' sahip ajanların tanımlanabildiğini göstermiştir. lerin, KKH-spesifik ajanları tespit etmesini

engellemiştir. KKH-spesifik ajanların tespit Giriş edilebilmesi, KKH popülasyonunun in vitroda

kararlı bir şekilde çoğalmasına ve miktarını Daha önce yapılan çalışmalarda,tümör içinde artırabilmesine bağlıdır. Ancak böyle bir popülasyo-bulunan bazı popülasyonların tümörün büyüme- nu elde etmek katı tümörlerin KKH'leri için halen sini ve kendini yenilemesini sağladığı tespit mümkün değildir.Örneğin,meme KKH'lerinin edilmiştir.Bu popülasyonlara KKH denmiştir. çoğaltılması in vitroda hızlı bir şekilde kaybedil-KKH'leri, kemo- ve radyoterapi dahil mevcut kanser miştir.tedavilerine karşı dirençlidirler.Bu da,birçok kanser terapisinin tümör hücrelerinin çoğunu öldürürken Normal ve neoplastik meme epitel hücrelerinin yeni tümör gelişimine neden olan KKH'lerini 'epithelial-mesenchymaltransition'' (EMT)'ye elimine edemediği için başarısızlıkla sonuçlandığını uyarılmasıyla kök hücre benzeri hücrelerin arttığı fikrini vermiştir.Kanser hücre popülasyonundaki görülmüştür. Normal de olsa kanserli de olsabir KKH'lerinin varlığı,in vivoda tümör oluşturabilme popülasyon EMT'ye uyarılırsa bu popülasyonun

hükök

Identification of Selective Inhibitors of Cancer Stem Cells by High-Throughput Screening

mayıs 2012114

hükökderleme

mayıs 2012 115

popülasyonu EMT'ye indüklenmiş ve CD44-high/CD24-low oranının arttığı gözlemlenmiştir (şekil 1-B). HMLER-shEcad (EMT uygulanmış tümör hücreleri) popülasyonunun,HMLER-shcntrol (normal tümör hücreleri) popülasyonuna göre ''tumorsphere'' oluşturma yeteneklerinin 100 kat fazla olduğu görülmüştür ( şekil 1-C). Aynı zamanda in vivoda tümör oluşturma yeteneğinin HMLER-shEcad popülasyonunda 100 kat daha fazla olduğu saptanmıştır.(şekil 1- D).Ayrıca bir başka deneyde,HMLER-shEcad popülasyonunun,kontrol grubuna oranla daha yavaş ürediği tespit edilmiştir (şekil 1-E).Tüm bu sonuçlar göstermektedir ki,EMT'ye indüklenen meme kanser hücresi populasyounda KKH oranı artmıştır.

kemoterapik ilaçlara olan direncinin arttığı deneylerle gözlenmiştir.Bu gözlemden, ''high 2-EMT'ye Uyarılan Normal ve Neoplastic through put screening'' metodu kullanılarak Hücrelerin İlaçlara Olan Direnci Artarepitelyum KKH-spesifik ajanların tanımlanmasında yararlanılmıştır. Tarama sonuçları ve sonrasında EMT ile elde edilen, KKH'inden zengin popülas-yapılan deney sonuçları,meme KKH'leri için güçlü yonun, biyolojik olarak da KKH gibi davranıp seçici toksisiteye sahip ajanların bulunması davranmadığını görmek için ilaçlara olan dirençleri mümkündür. karşılaştırıldı. Bunun için,yaygın kullanılan iki

kemoterapik ilaç(paclitaxel ve doxorubicin), Sonuçlar HMLER-shEcad ve HMLER-shcntrl popülasyonları

üzerinde denenmiştir. HMLER-shEcad hücrelerinin EMT: ''Epithelial-mesenchymaltransition''.Farklı HMLER-shcntrl hücrelerine göre bu ilaçlara karşı aracılar (shRNA veya twist) kullanılarak,epitele daha dirençli olduğu görülmüştür(şekil 1-F).Bu farklılaşmış hücrelerin mezenşime geri döndürül- direnç artışının nedeninin,neoplastik hücrelerin mesi sürecidir.Burada süreç,shRNA aracılığıyla sahip oldukları atipik özelliklerin bir avantajı olup gerçekleştiriliyor. olmadığını tespit etmek için aynı ilaçlar

HMLEshEcad ve HMLE-shcntrl grupları üzerinde shRNA:Önemli bir adhezyon proteini olan E- dedenenmiiş ve HMLE-shEcad hücrelerinin de cadherin'i kodlayan insan CDH1 genini inhibe eder. kontrol gruplarına göre ilaçlara daha dirençli

olduğu görülmüştür.Böylece direnç artışının HMLER:Neoplastik insan meme epitel hücresi. neoplastik hücrelerinin bir avantajı değil,EMT'nin

sonucu olduğu anlaşılmıştır.Ayrıca paclitaxel HMLE:İnsan meme epitel hücresi. uygulanan HMLE-shEcad popülasyonundaki hücre

sayısında,kontrol grubuna oranla 4 kat fazla artış HMLER-shEcad:EMT'ye uyarılmış HMLER.

HMLER-shcntrl:EMT'ye uyarılma-yan HMLER.

1.EMT'ye Uyarılan Meme Kanser Hücrelerinde KKH Sayısı Artmıştır

shEcad vektörü i le yapılan ça l ı şmalarda bu vektörün, hücrelerin mezenşimal morfoloji kazanmasını sağladığı ve hücreleri EMT'ye uyardığı görülmüştür.Bir sonraki adımda HMLER kanser

hükök derleme

artış gözlenmiştir (şekil 1-H). mış ve CD44-high/CD24-low oranı yüksek hücre popülasyonları üzerinde daha etkili olduğu

3-EMT-specific Toksisitesi Olan Bileşiklerin ''High- sonucuna varılmıştır.Bu yüzden,deneysel olarak Throughput'' Taramasıyla Tanımlanması oluşturulan EMT'ye uyarılmış popülasyonlar

yerine,doğal HMLER meme kanser hücrelerinin Yukarıda yapılan deneyler, HMLER-shEcad ve arasında bulunan KKH'ler üzerindeki spesifik HMLE-shEcad popülasyonlarının ilaçlara verdklerii etkileri araştırılmak istenmiştir.Öncelikle CD44-cevapların paralellik gösterdiğini kanıtlamıştır.O high/CD24-low antijenik fenotip incelenmesi halde HMLE-shEcad-spesifik özellik gösteren bir yapılmış ve görülmüştür ki salinomycin bu oranı ilaç bulunursa aynı etkiyi KKH'leri üzerinde vereceği kontrol grubuna göre 20 kat azaltmıştır.Paclitaxel de düşünülebilir fikriyle,içlerinde çeşitli ticari tedavisi ise bu oranı normalden 18 kat ajanlar ve doğal özlerin de bulunduğu 16.000 farklı arttırmıştır.Yani sonuç olarak salinomycin tedavisi bileşik,HMLE-shEcad ve HMLE-shcntrl grupları ,bu oranı paclitaxel'e göre 360 kat düşürüyor (şekil üzerindedenenmiştir. Bunların içinden; HMLE-sh 4-A,HMLER-1).İkinci bir deneyde,doğal olarak KKH Ecad yaşayabilirliğini azaltma, ulaşılabilirlik ve yüksek olan bir HMLER popülasyonu ve yine devamlı etki gösterme, özelliklerine bakılarak 4 salinomycin ve paclitaxel kullanılmıştır.Salinomycin ajan salinomycin, etoposide, abamectin,nigericin) tedavisi sonucunda popülasyonun CD44-high/ seçilmiştir.Nigericin,diğer ajanlara oranla daha CD24-low oranı kontrol grubuna göre 75 kat hafif etki göstermiştir (şekil 2-A).Bu ajanların aynı azalmıştır. Ayrıca salinomycin tedavisinde etkiyi HMLER-shEcad üzerinde de gösterip tümörsfer oluşumunun 10 kat azaldığı,paclitaxel göstermediği araştırılmak istenmiş ve sadece tedavisinde ise tümörsfer sayısının değişmediği salinomycin'in güçlü spesifik etkisini devam ancak tümörsfer büyüklüğünü arttırdığı gözlemlen-ettirdiği görülmüştür. miştir (şekil 4-B).Paclitaxel tedavisinin tümörsfer

sayısını arttırmama nedeninin,kullanılan popülas-4-Salinomycin KKH'leri Seçici Olarak Öldürür yonda zaten yüksek olan KKH oranının olduğu

düşünülmüş ve bunu araştırmak içinKKH oranının Salinomycin'in farklı özellikleri üzerine yoğunlaşıl- azaltıldığı bir popülasyon oluşturulmak iste-

mayıs 2012116

hükökderleme

mayıs 2012 117

artan duyarlılık göstermiştir.

5.Tümör oluşumu,Gelişimi ve Metastazında Salinomycin ve Paclitaxel'in Etkileri

1.Salinomycin ile tedavi edilen HMLER ve 4T1 kanser çizgilerinde tümör oluşturma yeteneği, paclitaxel tedavisi uygulanan hücre çizgileirne oranla 100 kat azalmıştır.2.Hem salinomycin hem paclitaxel tedavisi dokunulabilir tümör oluşumunu DMSO-kontrol grubuna göre 2 hafta kadar ertelemiştir.3.Salinomycin ile tedavi edilip in vivo'ya enjekte edilen tümörler incelendiğinde,kontrol grubuna oranla,apoptoz ve nekrozun arttığı görülmüştür.4.Normalde kontrol grubunda ekspresyonu nmiş. Buda,EMT'ye uyarılmış hücreler ile olmayan E-cadherin proteininin,salinomycin ile uyarılmamış kontrol grubunun karıştırılmasıyla tedavi edilen hücreler tarafından üretildiği sağlanmıştır (HMLER-Mx).Salinomycin'in HMLER-gözlemlenmiştir.Buradan da salinomycin'in Mxhücrelerinin CD44-high/CD24-low oranını, KKH'leri epitel hücrelerine farklılaşmaya götürdüğü kontrol hücrelerine oranla 4 kat azalttığı; sonucu çıkarılmıştır.paclitaxel'in ise 4 kat arttırdığı gözlemleniyor.Yani 5.Metastazdan sorumlu olduğu bilinen KKH'lerinin sal inomycin pacl itaxel 'den 16 kat daha sayısının azalmasının metastatik nodül oluşturma etkilidir.Benzeroranlar,HMLE-mx(''immortalized-kabiliyetini de azaltıp azaltmadığı araştırılmıştır.Bu nontumorogenic'' hücreler) ile de gözlemlenmiştir amaçla salinomyicn ile tedavi edilen 4T1 (şekil 4C).Salinomycin,HMLER-Mxtümörsfer hücreleri,benzer genetiğe sahip başka bir farenin sayısını da 13 kat azaltırken;paclitaxel'in 2 kat akciğerine enjekte edilmiştir.Kontrol grubuna arttırdığı ve ayrıca tümörsfer büyüklüğünü de oranla,salinomycin tedavisi metastaz oluşumunu 4 arttırdığı gözlemlenmiştir.Aynı deney HMLE-Mx kat azaltırken paclitaxel tedavisi metastazı 2 kat üzerinde yapılmıştır ve görülmüştür ki salinomycin arttırmıştır.tümörsfer sayısını 10 kattan fazla azaltmıştır.Buna

karşın paclitaxel,tümörsfer sayısını etkilememiştir Daha sonra deneğin akciğerleri vimentin ve E-(şekil4 D).''Monolayer'' kültür çoğalmasının cadherin için özel boyalarla boyanmıştır.Sonuçta sa l inomycin i le inhibe edi lememiş,yani salinomycin'in,doku hücrelerini bir arada tutan en salinomycin'in KKH öldürücü etkisinin,hücre önemli proteinlerden biri olan E-cadherin üretimini çoğalması üzerindeki genel inhibisyonu nedeniyle uyararak yeniden epitel hücreye farklılaşmayı olmadığı gösterilmiştir.sağladığı ve böylelikle metastazı engellediği görülmüştür.Paclitaxel'in ise vimentin (EMT için Daha sonra,bu ilaçların (salinomycin, paclitaxel, kullanılan bir marker) sentezini sağlayıp DMSO) ek olarak 2 meme kanseri hücresi cizgisinde mezenşimal farklılaşmayı uyardığı anlaşılmıştır.(fare meme kanser hücre çizgisi-4T1 ve insan

meme kanser hücre çizgisi-MLF7Ras) daha etkileri 6.Salinomycin Tedavisinden Sonra KKH'nde gözlenmek istenmiştir.Salinomycin'in DMSO-Görülen Genlerin Ekspresyonu Azalırkontrol grubuna oranla MCF7Ras hücreleri için 3

kat,4T1 hücreleri için 2 kat KKH sayısını azalttığı Salinomycin,uygulandığı popülasyonlarda yukarıda gözlemlenmiştir.Buna zıt olarak paclitaxel,bu sıralanan sonuçları vermeyi başarmıştır; ancak sayıları sırasıyla 3 ve 2 kat arttırmıştır.Hem 4T1 hem salinomycin ile tedavi edilmiş hücrelerin de MCF7Ras hücreleri için geçerli olarak salino-genetiklerinin, KKH ve normal epitel hücre mycin'in epitel farklılaşması fazla olan hücreler genetikleri ile benzerlikleri ve farklılıklarının lehine selektif;paclitaxel'in ise mezenşimal ve araştırılması ve tedavinin, hücre genetiği ''migratory'' fenotipteki hücreler lehine selektif üzerindeki etkisinin de gösterilmesi amaçlanmıştır. olduğu gözlemlenmiştir (şekil 4F).Başka bir Bu amaçla, KKH'lerinde aktif olan 3 gen seti deneyde ise paclitaxel ile tedavi edilen popülas-incelenmiştir.Sonuçta salinomycin tedavisinin yonun paclitaxel'e karşı direncinin arttığı kontrol grubuna oranla,KKH'lerinde aktif bulunan görülmüştür.Aynı popülaşyon,salinomycin'e karşı

hükök derleme

genlerin ekpresyonunu daha fazla azalttığını direk olarak primer kanser hücreleri (hastadan gösterilmiştir. alınan) üzerinde araştırma yapmak mümkün

olabilir;ancak bunun için iki zorluk aşılabilmelidir:Tartışma

1.Mevcut koşullarla,hastalardan alınan hücrelerin KKH'lerin çeşitli tedavilere direnç göstermesi,genel sadece %20'si immün sistemi baskılanmış farelere olarak apoptoza dirençli olduklarını ve KKH'yi hedef başarılı şekilde implante edilebilmektedir.alacak bir ilacın geliştirilemeyeceği fikrini 2.Farklı hastalardan alınan kanserli dokuların doğurmuştu.Ancak burada durumun böyle genetik ve histopatolojik açıdan farklılıkları, olmadığı,memeKKH'lere karşı spesifik ajanların dokuların aktarıldıkları hayvanlar üzerinde yapılan sistemik bir şekilde tespit edilmesinin mümkün deneylerde,ilaçların etkilerini karşılaştırmayı olduğu gösterilmiştir.Bu yaklaşım,diğer tip KKH'leri zorlaştırır.Bu da aynı kanser tipi için çok fazla için de uygulanabilir. hastadan örnek almayıgerektirir.

Yapılan deneylerde görüldüğü gibi salinomycin KKH'leri hedeflemenin önemi,kemo- ve radyote-,meme kanseri popülasyonunda,KKH'lere spesifik rapik tedavilere dirençli olması ve tümör oluşturma etki gösteriyor. Dahası salinomycin,kültür ortamın- yeteneğinin yüksek olmasından kaynaklanır. da yapılan deneylerde KKH'lerde görülen gen Burada ve daha önce yapılan deneylerde de setlerinin ekspresyonunu engelliyor.Ayrıca kültür görüldüğü gibi yaygın olarak kullanılan paclitaxel, hücrelerinde incelenen genler,iki ayrı hastadan KKH'lerin etkinliğini artırıcı etki gösterir.Yani alınan hücrelerin genleriyle de uyum gösteriyor.Bu paclitaxel tedavisi hastalığı tamamen söküp iki durum,kültür ortamında incelenen hücrelerin in atmaktan çok uzaktır,aksine geride çok daha aktif vivodakilerle benzer biyolojik özellikler gösterdiğini bir hücre topluluğu bırakır.Tüm bunlar,tedavinin ortaya koyuyor.Ayrıca KKH'lerinde bulunan ve uzun dönemde etkili olabilmesi için KKH'leri hedef salinomycin tedavisi ile ekspresyonu azalan genler alması gerektiğini gösterir.,anti-KKH terapilerine cevap verecek tümörlerin tanımlanmasında da biomarker olarak kullanıla- KKH'leri kadar agresif olmasalar da normal kanser bilir. hücreleri de zaten oluşmuş olan tümörün devam-

lılığını sağlayabilir.Bu nedenle sadece KKH'lerini Yapılan deneylerde,genetik olarak iyi tanımlanmış, hedef alan ilaç da tamamen iyileştirici olmayabilir. tümör oluşturmayan ''immortalized'' hücreler Çözüm olarak,her iki hücreyi de hedef alan ilaçların kullanılıyor. Böylece tarama sırasında herhangi bir geliştirilmesi veya ayrı spesifik etkiler gösteren bileşiğin,bilinmeyen bir genetik alterasyonu hedef ilaçların kombinasyonlarıyla tedavi düşünülebilir.alarak EMT'ye uyarılmıs hücreler üzerinde spesifik etki göstermesi ihtimali en aza indiriliyor.Tümör Ulaşılabilirliği nedeniyle,mevcut çalışmalar salino-oluşturmayan bu hücrelerle yapılan deneylerden mycin üzerine yoğunlaşmıştır.Ancak yapılan elde edilen bileşiklerin KKH'lerinde de aynı etkiyi deneylerde, ilk taramada alınan KKH-spesifik etki,-göstermeleri,EMT ve KKH arasındaki ilişkiyi deneylerin sadece %30'unda ikinci seferde de destekler niteliktedir.Ayrıca bu yaklaşım,antitümör alınabilmiştir. Bu da araştırmacılara, tarama terapi geliştirilmesinde yeni bir yol da açar.Bugüne kapsamının genişletilmesiyle yenibileşikler üze-dek kanser terapileri hep belirli bir genetik rinde yoğunlaşılabileceği fikrini veriyor.alterasyonu hedef almıştır.Burada ise kanser hücrelerinin farklılaşma evreleri üzerine yoğunla-şılmıştır. Böylece gelecekte,hem genetik alteras-yonlar hem de farklılaşma safhaları teşhis anında incelenerek,kişiye yönelik terapi ihtimali arttırıla-bilir.

Ayrıca Salinomycin'in etkisini potasyum kanalları üzerinden gösterdiği anlaşılmış olsa da net ilişki henüz bulunamamıştır.

İleride yapılacak olan önemli çalışmalar,burada elde edilen sonuçları daha da ileri taşıyabilir ve

mayıs 2012118

hükökderleme

mayıs 2012 119

SOMATİK HÜCRE

KLONLAMAFatma Deniz

fare de klonlandı(Wakayama 1998). Peki niçin Xenopustan vertabralılara sıçramak 30 yılımızı almıştı? Şu an görünen o ki çekirdek çıkarma

omatik hücre çekirdek lerin işleminde kullanılan resipiyon hücre tipleriyle den klonlamanın keşfi sitopl ilgiliydi. Önceki aşamalarda fare klonlamanın (Mc Sazmik belirteçlerin hücrenin program- Grath ve Solter 1984) başarısızlığı ise muhtemelen

lanmasına ne katkısı olacağının araştırılması interfazdaki hücrelerin nükleus içinde kalan sırasında ortaya çıktı. Bu hikaye 1918'de gelişimci nükleer faktörleriydi. Koyunda, farede ve diğer biologist Hans Spemann'ın Freiburg Üniver- memeli türlerde yapılan başarılı deneylerde sitesinde çalışırken totipotent zigotun çekirdeğini genellikle döllenmemiş Mayoz 2 aşamasındaki merak etmesiyle başladı. Şimdi bakınca inanılmaz nükleuslar ki bunlarda nükleer faktörler henüz kolay bir deney gibi. Spemann, 16 salamander stoplazma içindeydi; çünkü nükleer membran embriyosunu kullandı ve onların çekirdeklerini parçalanmıştı(Yayınlanma 2007,Egli). Gurdon ve bebek saçıyla sıkıştırarak hücrenin yan tarafında Wilmut'un deneyleri ise %1 veya daha az oranda kalacak şekilde ayırdı. Sonra, aynı yumurtadan başarılıydı (Wilmut 2007). Wakayama ve arkadaş-gelişen her bir yarım hücre nükleusu en son 4 ları yalnızca küme hücre çekirdeklerini kullandık-bölünmeye kadar totipotent durumda kaldığını ları zaman başarılı oldular (Wakayama 1998). Bir gösterdi.1938'de Spemann'ın farklılaşmış hücreler şüpheyle küçük miktarlarda kök hücre içeren için sorduğu nükleer transplantasyonu kullanabilir yetişkin hayvanlar üretmek için farklılaşmış hücre miyiz sorusunu fantastik bir deney olarak kullanmakta ısrar ettiler. Küme hücreler muhteme-tanımlanmasına rağmen Briggs ve King'in Rana len kök hücre benzeri hücrelerdir yoksa gerçekten pipienleri kullanarak nükleer transplantasyonu farklılaşmış hücreler tekrar programlanamaz. başarıyla gerçekleştirmesi 14 yıl aldı. Onlar, Konrad Hochedlinger ve Rudolf Jaenisch MİT'teki blastositlerin çekirdeklerinin balastositler elde fare blastositi ve yetişkin B ve T hücrelerinden edilebileceğini ancak potansiyel pluripotent-liğini alınan çekirdeği üretmekte başarılı oldular. Daha kaybetmiş ileri gastrula evresinde alınan göze çarpan; faredeki tüm dokuların içerdiği hücrelerin daha fazla özelleşmiş olduğunu buldu- immunoglobin veya T hücre reseptörü düzenlen-lar. Bu nedenle onlar yetişkin hücrenin çekirde- mesini düşündüler (Hochedlinger ve Jaenisch, ğinden ve gelişme sırasında genetik potansiyeli 2002). Diğer konu ise uzun süre çözünmemiş azalan hücrelerden klonlamanın imkansız olduğu kalan insan somatik hücreleri nükleer sonucuna vardılar. Sonra John Gurdon bu fikre transfer aracılığı ile tekrar program-karşı kendi bulgularını öne sürdü. Bu bulgularda, lanabilir. Bu yıla kadar, çekirdeksiz Xenopus leavisi model hayvan olarak kullanarak, yumurta hücresi içine somatik iribaşın bağırsak kültüründen alınan hücrelerin seri hücre çekirdeği transferi blas-nükleer transplantasyonundan sonra ana hayvanın tosit düzeyinde asla başarılı aynısını elde etti. (mature fertile animals) (Gurdon olmadı. Hücre genellikle 4 1958, Gurdon ve Wehlinger 1966). Ama sadece veya 8 hücreli aşamada farklı tipteki Xenopus hücrelerle, iribaşlar arasında tutulu kaldı. Ama New verim elde ediliyordu. (Gurdon ve Byme 2003). York Kök hücre kuru-Yani vertebralılar arasında klonlama 30 yıl aldı. Ian mundaki, Dieter Egli ve Wilmut ve Edinburg Üniversitesinden arkadaşları ekibi oosit çekirdeği deri çekirdeksiz oositi ve epitelyum hücre kültüründen hücresi çekirdeği trans-çekirdeği transplante ettiklerinde ünlü Dolly plantasyonundan sonra yaratıldı.(Wilmut 1997) Ve sadece bir yıl sonra ilk insan blastositini üret-

tek sayfa tek sayfahükök

menin mümkün olduğunu gösterdiler. Benzer ESC hücrelerini kullanarak blastosit aşamasının daha için, stabil 3n insan ESC dizilerinin somatik hücre üstünde yeniden düzenlenmenin mümkün nükleusları benze ESC'ler için yeniden program- olduğunu gösterir.lanabilir (Noggle 2011).Bu deneyler insan somatik

mayıs 2012120

hükök

1955

1958

1997

2002

Wilmut koyun hücre kültürünü klonlayarak Dolly'i yarattı.

King ve Briggs transplante edilen balastosit hücre çekirdeğinden iribaş üretti.

Gurdon iribaş çekirdeğinden yetikin

kurbağa üretti.

Hochedlinger ve Jaenisch yetişkin faredeki T ve L

lenfositlerden fare üretti.

tek sayfa

GELECEK???

ök hücreler, teorik olarak sonsuz bölünme Biz bile bile, kasten gelişmekte olan bir insanı bu ve birçok hücre türüne farklılaşabilme aşamada, bilimsel bilgilerimizi genişletmek veya Közelliklerine sahip hücrelerdir. Döllenmiş tıbbi fayda sağlamak için öldürme hakkına sahip

yumurta hücresinden birkaç bölünme ile elde miyiz? Embriyoya birbirinden farklı ahlaki statüler edilen hücreler totipotent nitelik taşır; sonrasında atfedilebilmektedir. Embriyonun oluşumundan yine bölünmeyle oluşan hücrelerin plastisitesi itibaren erişkin bir insan gibi saygı görmesi azalmaktadır. Totipotent hücrelerden pluripotent gerektiğini düşünenler için embriyo üzerinde kök hücreler oluşur. Bu tür hücreler plasenta hariç, hücre araştırması yapılması kabul edilemez bir vücudun herhangi bir tür hücresine dönüşebilir. uygulama olmaktadır. Diğer taraftan, anne Embriyonik kök hücrelerin elde edildiği blastosit, rahminde olmayan bir embriyonun artık büyüme pluripotent niteliktedir. Embriyonik kök hücrelerin ve erişkin bir kişi haline gelme potansiyelinin tedavi amaçlı kullanım açısından en iyi kaynak bulunmadığını ileri süren diğer bakış açısına göre, olabileceği düşünülmektedir. Ancak, insan em- embriyonik kök hücre araştırmaları en azından briyonik kök hücre çalışmaları, etik olarak tartış- kuramsal boyutta bir etik sorunu barındırma-maya açıktır; çünkü insan embriyolarının yok edil- maktadır. Farklı bir yöntem olan Tek blastomer mesini içerir. Şu an için ek sık gündeme getirilen biopsisi sırasında embriyo bir zarar görmemektedir. nokta, in vitro fertilizasyon süreçleri sonucunda Ancak erken dönem blastomerlerden geliştirilecek oluşan artık/fazlalık embriyoların kök hücre elde hESC dizileri totipotent olabilir. Bu durumda, ikinci etmek amacıyla kullanılıp kullanılamayacağı soru- bir embriyo geliştirebilirler ve bu da embriyonun sudur. Bu soruya olumlu yanıt verilmesi halinde ise ahlaki statüsüne ilişkin tüm etik tartışmaların sadece kök hücre araştırması amacıyla kullanılmak baştan başlaması anlamına gelir. Ayrıca günü-üzere embriyo üretiminin yaratabileceği etik müzde var olan bir çok embriyonik kök hücre (hESC) sorunlar gündeme gelmektedir. Bilim dünyasındaki dizisi embriyoların yok edilmesiyle üretilmiştir ve ortak kanı: İnsan embriyonik kök hücre çalışma- dünyada hala, dondurulmuş embriyoların %10'u larının çeşitli ciddi ve tedavi edilemeyen hastalıklar kök hücre üretiminde kullanılmaktadır. Bu için yeni tedavi yöntemleri geliştirilmesini sağlaya- gerçekler embriyonun ahlaki statüsü ve ve bileceğidir. Bu konudaki araştırmalarla ilgili dikkat yapılması kabul edilemez bir uygulama olmaktadır. çeken etik sorular: Diğer taraftan, anne rahminde olmayan bir

embriyonun artık büyüme ve erişkin bir kişi haline İnsan Embriyolarının Yok Edilmesi Ahlaki Açıdan gelme potansiyelinin bulunmadığını ileri süren Kabul Edilebilir Bir Durum mu? diğer bakış açısına göre, embriyonik kök hücre

araştırmaları en azından kuramsal boyutta bir etik İnsan embriyonik kök hücre dizileri, erken sorunu barındırmamaktadır. Farklı bir yöntem olan zamanda, blastosit evresinde iç hücre kütlesinin Tek blastomer biopsisi sırasında embriyo bir zarar fiziksel ve kimyasal yollarla ayrıştırılmasıyla elde görmemektedir. Ancak erken dönem blastomer-edilir. Embriyada yaklaşık 200 hücre vardır ve lerden geliştirilecek hESC dizileri totipotent olabilir. farklılaşmış dış-plasental madde içerir. İç hücre Bu durumda, ikinci bir embriyo geliştirebilirler ve kütlesi ise farklılaşmamış hücreler içerir ve bu bu da embriyonun ahlaki statüsüne ilişkin tüm etik hücreler pluripotenttir. İç hücre kitlesinin tartışmaların baştan başlaması anlamına gelir. ayrıştırılmasını gerektiren bu prosedür sonunda Ayrıca günümüzde var olan bir çok embriyonik kök embriyo ölür. İşte bu yüzden bu etik soru doğuyor: hücre (hESc) dizisi embriyoların yok edilmesiyle

hükök

mayıs 2012 121

MAKALE

KÖK HÜCRE ETİĞİElif Reyhan Güneş

hücre çalışmalarında kullanılabilecekken, yok edilmektedir. Peki zaten yok edilecek olan bu embriyolardan faydalanmak neden etik açıdan yanlış olarak görülüyor? Çünkü buna izin verilirse doğrudan bu amaç için embriyo üretileceği ve bunun hep devam edeceği düşünülüyor. Örneğin, çok az insan ölmek üzere olan bir çocuğun hayatını kurtarmak için ölmüş bir gencin organlarının kullanılmasına itiraz eder ve bu organ nakline izin verildi diye özellikle insanlar öldürülmez. Benzer şekilde kök hücre araştırmalarında da kontrol dahilinde, tüp bebek çalışmalarından arta kalan embriyoların kullanılmasına izin verilebilir.

üretilmiştir ve dünyada hala, dondurulmuş em-briyoların %10'u kök hücre üretiminde kullanıl- Klon Embriyo Üretmeli miyiz?maktadır. Bu gerçekler embriyonun ahlaki statüsü ve bu yok edişin etik yönüyle ilgili bu soruyu ''Human therapeutic cloning'' bilinçli olarak, gündemde tutmaktadır. somatik hücre çekirdek transferi ile embriyo

üretilen yöntemdir. Bu embriyolardan üretilen kök iPSC Çalışmaları Etik Soruları Ortadan Kaldırıyor hücre dizileri bağışıklık sisteminde bir tepkiye mu? neden olmaz çünkü annesinden alınan yumurtaya

(mitokondri aynı) bireyin vücut hücresinin 2007 yılında Yamanaka ve Thomson pluripotent çekirdeği yerleştirilir yani birebir özdeş bir embriyo kök hücre üretmek amacıyla gen transferi yapmayı elde edilmiş olur. Bu embriyo rahme yerleştirilirse o başardılar. İnsanlar bunun kök hücre çalışmaları kişinin klonu doğar (reproductive cloning); fakat hakkındaki etik tartışmaları bitireceğini düşündü. therapeutic cloning yöntemiyle kişiye özgü Ancak bilimsel açıdan,fareler üzerinde yapılan embriyonik kök hücre dizileri üretilmektedir. Bu deneyler sonucunda induced pluripotent kök hücrelere verilen özel büyüme faktörleri ile ihtiyaç hücrelerin yüksek tümör oluşum oranına sahip duyulan organ üretilir ve kişiye özgü olduğu için oldukları anlaşıldı. Ve bu hücrelerin transferinde vücutta bir reddetme söz konusu olmaz. Peki bu kullanılan retroviral vektörler kanser oluşumuyla yolla üretilen embriyo, insan embriyosu olarak mı bağlantılı. Bu problemler çözümlenene dek etik kabul edilir? Her ikisinin de insana dönüşme olarak insanda iPScell kullanımı yanlış olacaktır. potansiyeli var; ama sonuçta bu yöntemle döllen-

me olmaksızın üretildi. Ayrıca klon embriyolarda Yok Etmek Üzere Embriyo Üretebilir miyiz? görülen yüksek ölüm oranı da belirgin bir fark

yaratıyor. Klon embriyoya ahlaki açıdan biyolojik Erken dönemdeki embriyonun bir insana eşit embriyo ile eşit görürsek aynı etik sorularla olduğunu savunanlar bu amaçla embriyo üretilip karşılaşırız. yok edilmesine karşı çıkıyor. Onlar, bu çalışmaların insanı maddeselleştireceğini düşünüyor. Bu İnsan Embriyonik Kök Hücre Araştırmalarını tartışmalar şu soruyu akıllara getiriyor: Neden Ertelemeli Miyiz?çiftlerin bebek sahibi olmasına yardım eden tüp bebek çalışmaları etik açıdan doğru kabul edilirken, İnsan embriyolarının yok edilmesine karşı olanlar insan hayatını kurtarmak için bu işlemi yapmak en azından aynı faydaları sağlayacak yeni bir yanlış? yöntem (erişkin kök hücre dizisi vb.) geliştirilene

kadar bu araştırmaların ertelenmesi gerektiğini Önceden Üretilmiş hESC Dizilerinden Faydala- savunuyor. Erişkin kök hücre araştırmalarının nabilir miyiz? belirsizliği ise devam ediyor. Bilim insanları erişkin

kök hücrelerinin kullanışsız oluşundan şikayet Kök hücre dizisi üretiminde kullanılan embriyoların ediyor. Bu belirsizlik de ''embriyoları korumak ve çoğu tüp bebek çalışmalarından elde edilmektedir. saygı duymak konusundaki hassasiyet yüzünden Bu çalışmalarda yerleştirilecek embriyo sayısından çocuk ve yetişkin tedavileri ertelenmeli mi?'' çok daha fazlası üretilir geriye kalanlar donduru- sorusunu gündeme getiriyor. Birçok insan böyle bir larak saklanır veya yok edilir. Bu embriyolar kök ertelemenin olmaması gerektiğini, kök hücre

mayıs 2012122

hükökmakale

mayıs 2012 123

hükök makale

terapileri için çeşitli yolların bilimsel ve ahlaki açıdan açık tutulması gerektiğini düşünüyor.

Avrupa Birliği üyeleri embriyonun konumu nedeniyle konu ile ilgili farklı yaklaşımları içeren yasal düzenlemelere sahiptir. Polonya ve Slovak Cumhuriyeti embriyo üzerinde araştırma yapıl-masını yasaklarken; İngiltere kök hücre çalışmaları için insan embriyosu üretimine izin vermektedir.

Türk hukukunda embriyonik kök hücre çalışmaları konusunda herhangi bir düzenleme bulunma-maktadır. Ancak, Sağlık Bakanlığının 2005 tarihli “Embriyonik Kök Hücreler Genelgesinde” embriyo-nik kök hücre ile ilgili araştırmalrın durdurulması kararı yer almıştır. Bu bağlamda, konu ile ilgili çalışmalar sonuçlanana kadar embriyonik kök hücre çalışmaları durdurulmuştur.

Bahsettiğimiz etik sorulara ortak bir cevap verilmesi beklenemez fakat bilimsel gelişmeyi sağlayabilmek adına en azından üniversite laboratuarlarında özel izin ve kontrol dahilinde, ebeveynlerden de izin alınarak, tüp bebek çalış-malarından arta kalan embriyolar ile embriyonik kök hücre araştırmaları yapılabilir.

RÖPORTAJ

Bize kendinizi tanıtır mısınız?

İstanbul Üniversitesi Tıp Fakültesi (Çapa) mezunuyum. 1994-97 yılları arasında YÖK bursuyla Imperial College London'da Moleküler Biyoloji ve Genetik üzerine eğitim aldım. Sonra Türkiye'ye dönerek Kırıkkale Üniversitesi Tıbbi Biyoloji Genetik'i kurdum. 2010'da, oldukça geç bir dönemde de:D , doçentliğimi aldım. 2008 yılından beri de burda Hacettepe Üniversitesi'nde çalışıyorum.

Sizin ilgilendiğiniz konular neler? reaktivasyona da yol açabiliyor, bu hangi koşullarda gerçekleşiyor? Bütün dünyanın da üzerinde çalıştığı

Homeodomain transkripsiyon faktörlerinin kemik bir konu bu. Biz daha bunla ilgili projelere iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde nasıl bir başlamadık ama mezenkimal kök hücrelerin profili var? Mezenkimal kök hücreler kemik iliğinde immün modilasyon amaçlı kullanılmasıyla ilgili bir stromayı sağlayan mikroçevreye önemli katkısı olan proje verdik eğer çıkarsa bu da en önemli ikinci ilgi hücreler,hastalıklı bir durumda bu stroma nasıl alanımız olacak.değişiyor ve transplantasyon sonrasında da bu stromaya ne oluyor ? Çünkü transplantasyonda Bir de microRNAlar var, genomun kodlamayan kemik iliğini değiştiriyoruz ama hastanın stroması bölgelerinden üretilen, gen regulasyonunda aynı kalıyor, sağlıklı kemik iliği gelince acaba önemli kısa nükleotit dizileri diyebiliriz. Hastalık hastanın stromasında düzelme oluyor mu, oluyorsa durumlarında hangi miRNAlar farklılık gösteriyor, nasıl oluyor ve bunun hastalığın düzelmesine ne bunlar biomarker olarak kullanılabilir mi, tedaviye gibi bir katkısı var? Bu soruların yanıtlarını arıyoruz, aktarılabilir mi gibi soruların yanıtlarını arıyoruz. Bu şu anda sadece profilleme yapıyoruz, yıllara da üçüncü büyük çalışma alanımız olacak gibi yayılacak bir araştırma süreci bu. gözüküyor. Bu COST aksiyonunda projemizin bir

kısmı miRNAlarla ilgili zaten, önümüzdeki dönem Onun dışında benim özellikle yapmak istediğim şey çalışmalar başlayacak, onun için paramız var yani. mezenkimal kök hücrelerin genetik modifikas- Araştırma dediğiniz de bir anlamda para zaten, o yonlarıyla uğraşmak, şu an bunun altyapısını olmadan olmuyor.oluşturmakla uğraşıyorum. Genetiğini değiştirerek bu hücrelerin tedavide kullanılması .Bunların Mesela bir projeniz var, bunun için maddi desteği immün baskılayıcı etkileri var, bu bazı hastalıklarda nasıl sağlıyorsunuz, nerelere ne gibi gerekçelerle bir avantaj bazılarında dezavantaj olabiliyor. başvuruyorsunuz?Çevreye göre de değişiyor bu özellikleri, immün baskılayıcı olarak verdiğiniz bir şey sonra immün Ben hep Tübitak projesi yazdım. Çok iyi

hükök

Ayşen Günel ÖzcanRöportajı

Yusuf Yıldırım, Betül İçli

mayıs 2012124

mayıs 2012 125

hükök röportaj

tanımlanmış bir sorunuz olmalı, yoksa fikirler geri yurtdışında aldığım eğitimin %10'unu geri dönüyor. O soruyla ilgili ayrıntılı bir proje getirebildim diyebilirim hazırlamanız gerekiyor. Ben ilk Tübitak projesi yazarken şaşırmıştım, çok detaylandırmanız Yurtdışıyla anlaşmalı yapamıyor musunuz?gerekiyor , bir sonuçları koymadığımız kaldı demiştik. Şimdi biraz daha esnediler. Kullandığınız Yapabilirisiniz yayın olur ama o orda kalır, sizin malzemeleri vs ayrıntılı yazmanızı istiyorlar. akademik kariyerinizde hızlı yükselmenizi sağlar. Bütçenizi çıkartıyorsunuz, etik kurul gerekiyorsa Öğrencinizi de yollarsınız insan yetişmiş olur, ama etik kurul iznini almanız gerekiyor. Bazen projeler onun burda maddi olarak hayata geçmesi için reddediliyor, özgün değeri yüksek ama ya grubun burda yapmanız, burda onu oturtmanız gerekiyor tecrübesini sınırlı bulabiliyorlar ya da alt yapı ve tabi büyük bir mücadele vermeniz.yetersiz denebiliniyor. Siz de bir danışman ekliyorsunuz, cihazı olan bir laboratuvarla Çalışmalarınızı yazılımlar üzerinde yapabiliyor işbirliğine girip o şekilde halletmeye çalışıyorsunuz musunuz?ç ıkan problemleri. Çok iyi bir hipotezle başvurduysanız ordaki eleştirileri dikkate alarak MicroRNA datalarımız çıkınca, o programları yeniden deniyorsunuz ve sonunda kabul almış öğrenmeye başlıcaz öğrencilerimizle birlikte, oluyorsunuz. biyoinformatikten başlıcaz ama sistem biyolojisi

var mesela tamamen farklı bir konu. Sistem Bazen özgün değeri çok yüksek olmasına rağmen biyolojisinde deney yapıyorsunuz, o bilgileri literatürde hiç örnek olmadığı için red gelebiliyor. giriyorsunuz sisteme, ordan yeni hipotezler Bir şeyi ilk söylüyorsanız bu riskli bir iştir. Bir de çıkıyor,sonra tekrar deneye dönüyorsunuz, böyle ülkenin öncelikli alanlarına girmesine bakılıyor tabi. çalışıyor aslında.Bunu da yapmak isterim ama

benim yeterli altyap ım yok bu konuda. DPT genelde bir altyapı kurma amaçlı, daha büyük , Modellemeler için o alanda uzman birileri gelirse rektörlük destekli projeleri üstleniyor. Ben hiç onlarla çalışmak çok güzel olur tabi. DPT'ye proje yazmadım ayrıntılarını o kadar bilmiyorum. Pedi-stem nedir? Nelerle uğraşır? Siz nelerle

uğraşıyorsunuz?Yurtdışında aldığınız eğitimin burda size ne gibi faydaları oldu? Pedi-stem 2005 yılında Duygu Uçkan tarafından

DPT'ye verilmiş bir proje. Pedi kısmı pediatrik Siz dünyanın en önde gelen üniveristelerinden hastalıkların örnekleri olmasından kaynaklanıyor. birinde doktora yapıyorsunuz, onların soruları , Duygu Hanım pediatrik transplantasyonla uğraştığı endişeleri, bilimsel ilgileriyle yeni kurulan bir için kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreleri üniversitenin öncelikleri çok farklı oluyor. Siz geliştirmeye başlıyor. Bununla ilgili de böyle bir kendinizi oraya çektiğinizde de hayata döndüre- proje verip biyobankayı büyütmek, burdaki bilceğiniz şeyler çok sınırlı kalıyor. Böyle bir mezenkimal kök hücreleri iyi bir şekilde karakterize dezavantajı var tabi. Oysa bilimsel politikalar etmek, başka hücrelerle etkileşiminde neler oluyor çapında düşünülüp de, belli mükemmeliyet onları araştırmak, GMP koşullarında- yani hastaya merkezlerinde, büyük güdümlü projelerde verilecek özellikte- mezenkimal kök hücreleri çalışsaydık çok daha faydalı olurduk. Yine de fena üretmek gibi amaçlarını hayata geçirmeyi planlıyor. değildik, Hacettepe'de moleküler klonlama Türkiye akraba evlilikleri dolayısıyla nadir yapılmazken biz Kırıkkale'de yapıyorduk, burdan hastalıklar yönünden zengin bir ülke olduğundan onkoloji enstitüsünden doktora öğrencileri gelip bir çok önemli bir arşiv oluşuyor aslında burda kısmını orda yapıyorlardı sonra dönüp burada biyobankan ın geniş lemesiyle. Çoğunluğu devam ediyorlardı. Şimdi yapılıyor tabi onkolojide mezenkimal kök hücre olmakla bir l ikte de tıbbi biyolojide de. Orda da doktora öğrencisini hematopoetik kök hücre de oluyor ama o daha bulamıyorduk dediğim gibi yeni kurulunca sınırlı. Hollanda'dan doktorasını almış bir post-doct öncelikler farklı olabiliyor. Oradayken önce lisans var Fatima Artz Kaya(?), orda da Cell-PID projesinde programı oturttuk, tanı için bir laboratuvar kurduk aktif olarak çalışmış biri. Yakında o da sanırım bu kadar. Yine de şanslıydım diyorum, o dönemde öğretim görevlisi kadrosuna atanmış olur, o daha bunları anlayabilen yurtdışında çalışmış bir çok uğraşacak hematopoetik kök hücreyle. Ben dekanımız vardı da bunları hayata geçirebildik. Ben dediğim gibi 2008 yılında geldim. 2010 yılında

yazdığımız kök hücre bilimleri doktora programı multipotent olmasına rağmen, bunlar pluripotent. YÖK'ün onayından geçtikten sonra da işte bu sene Normalde vücütta pluripotent değillerken in vitro ilk öğrencilerimizi aldık. İlgi oldukça fazla, 8 tam koşullarda bu özelliğe sahip olduklarını görüyoruz. kayıtlı öğrencimiz ve dışarıdan birkaç özel Dünyada bununla ilgili çalışan gruplar çok öğrencimiz var. İlk dönem “kök hücre bilimlerinde sınırlı,buna rağmen ulaşılan sonuçlarda embriyonik temel mekanizmalar” dersini aştık, bu dönem de kök hücrelerden farklı olarak teratom oluştur-“doku organ kök hücreleri, kök hücre laboratuvar madığı saptanmış. Embriyoniklerin kliniğe yöntemleri” derslerini veriyoruz ağırlıklı olarak. geçmesindeki en büyük engelin teratom

oluşturması olduğunu biliyoruz ve belki de 2 tane Avrupa Birliği projesine dahilim: COST ve primordial kök hücreler buna bir çözüm Cell-PID (Advanced Cell-based Therapies for the getirebilcek diye düşünüyorum.treatment of Primary ImmunoDefiency)

IPS hücreleri de çok iyi ama onların da büyük Cell-PID immün yetmezlik hastalarına gen tedavisi problemleri var, genetic stabiliteleri , epigenetic protokollerinin geliştirileceği daha geniş çaplı bir değişiklikleri embriyoniklerle aynı değil. Ama proje. Cell-PID'in Türkiye ayağını Duygu Uçkan toksikoloji çalışamaları için çok önemli bunlar da. yürütüyor.Ancak gen iletim vektörlerinden IPSi biraz açıklamak gerekirse, fibroblastı lentiviral konstractlar Avrupa'daki partnerlar alıyorsunuz 4 tane geni veriyorsunuz ve epigenomu tarafından yapılıyor. geriye sarıyorsunuz, pluripotentlik sağlıyorsunuz.

Mezenkimaller kliniğe transfer açısından en uygun COST belli bir konuyla ilgili çalışan, dünyadaki ve olanlar Bazen tek başlarına, bazen genetic özellikle Avrupa'daki grupları biraraya getirmeyi modifikasyonla ya da bazen başka bir molekülle amaçlıyor. Amerika'dan gelen gruplar araştırma birlikte verdiğ inizde işe yar ıyor. Mesela sonuçlarını anlatıyorlar genelde. Avrupa'daki mezenkimal kök hücrelerin tumor oluşturma gruplar ise laboratuvarlar arasında gidip gelerek potansiyeli rağmen, tümör tedavisinde kullanılıyor. edindikleri bilgileri paylaşabilme imkanı Gönderdiğimiz kök hücreler direk yaralı dokuya buluyorlar.COST'un birçok aksiyonu var, biz de gittiği için bir intihar genini aktarıp dokuya onlardan birindeyiz: Sağlıkta ve hastalıklarda Hox yollayabiliyorsunuz . Tumor oluşturma riski de tail transkripsiyon faktörleri. Bunlar gelişim ortadan kaldırılırsa bence rejeneratif tıp açısından esnasındaki transkripsiyon faktörleri, vucud aksini çok önemli mezenkimal kök hücreler. Biz de bu belirleyen genler hoxlar. Tailler de hoxların alana yönelmeye çalışıyoruz. özgünlüğünü belirleyen genler. Bu genlerin evrimsel süreçte meyve sineğinden insana kadar Bu kök hücre çalışmalarına fizyopatolojinin çok iyi korunmuş olduğunu görüyoruz. O yüzden ayd ınlat ı lmas ı aç ıs ından da büyük görev model organizmalar üzerinden ilerliyor daha çok, düşüyor.Petridişte insanın kendi hastalık modelini zebra balığında, meyve sineğinde vs çalışan gruplar oluşturup hiç model organizmalara gitmeden var. Ne işe yaradığıyla ilgili de şu örneği verebilirim, çalışmalarınızı yapabiliyor hale geliyorsunuz.hoxlarla ilgili bir geni kapadığınızda bacak olacağı yerde anten olabiliyor ya da kanat olcağı yerde İlgilendiğiniz alanlarda beklentileriniz neler?bacak cıkabiliyor gibi. Yani gelişim sürecinde organların lokalizasyonunu belirleyen kısımlar Türkiye'de mi dünyada mı? Türkiye'de ilerleme çok bunlar, niye gözümüz başımızdanın cevabını yavaş. Türkiye'de yapılan çalışmalar hemen kliniğe arıyoruz biraz da. Gelişimden sonra da dokularda geçsin isteniyor. Temel bilimci olarak ne kadar ileri homeostasisin saglanmasında görev alıyor ama çok gidebiliriz kuşkularım var. Bunlar bireylerin tek da iyi bilinmiyor açıkçası bu aşamadan sonraki başına yapabileceği şeyler değil. Bilim politika-özellikler. Biz de “acaba hastalıklarda ne oluyor?” larına ihtiyacımız var. Tabii ki translational (kliniğe diye sorup bunu inceliyoruz. uygulanabilir) olması çok önemli ama bir şey

hemen kliniğe geçemiyor. Bir ilacın kullanılabilmesi Kök hücre ile ilgili ilginç bulduğunuz çalışmalar bile en az 10 yıllık çalışma gerektiriyor, o da dünya neler? Sizin beklentileriniz neler? Yakın ve uzun ölçeğinde ilaç firmalarıyla tabii. Akademide bu çok vadedeki planlarınızı bizimle paylaşır mısınız daha yavaş tabii. Yani çok boyutlu düşünmek ? gerekiyor. Bizde bilim politikaları üretebilen, buna Primordial germ hücrelerinin büyük ilgiyi üstünde kafa yoran insanların olmadığı düşüncesindeyim, toplayacağını düşünüyorum. Mezenkimaller bizde yok yani. Dünyada bilim bakanlıkları var ve bu

mayıs 2012126

hükökröportaj

mayıs 2012 127

bakanlıklarda çok yetkin insanlar var. Burada bilim yola çıkıyor ve bunun klinikle ne alakası var değil bakanlığı kurulsa bile ne kadar etkin çalışır o da soru mi? Ama sonra kliniğe ne kadar önemli katkı işareti. Bilim para yer. Siz toplum olarak günü sağlıyor. Onun için başlangıçtaki atılımı yaptıran kurtarmaya mı bakıyorsunuz geleceği mi temel araştırmalar çok önemli, temel araştırmalara kurtarmaya bakıyorsunuz? Günü kurtarmaya bakı- kaynak aktarmak çok önemli ama maalesef temel yorsanız şu anda olduğu gibi para harcamazsınız. araştırmalar hep para götüren yerler olarak Aynı şekilde Türkiye'deki akademisyenlerin de görüldüğü için çok yavaş ilerliyoruz.böyle düşünmesi lazım. Türkiye'deki sistemde bugünü kurtarmaya yönelik bir sistem. Uzun vadeli Dünya ölçeğinde beklentileriniz neler?yatırımlara kimsenin ne sabrı var ne de sistemden dolayı kimse girmek istiyor. Ama insanların uzun Dünya ölçeğinde gen tedavilerinin biraz daha hızlı vadeli planlarının olması lazım. Ben doktoramı ilerleyeceğini düşünüyorum. Bir dönem çok durdu yaparken hocamın yıllara yayılan projesi vardı. Ben çünkü ama gen tedavisini kök hücreden sadece orada vagondum, ben çıktım başka birileri ayıramıyorsun zaten modifiye ettiğiniz hücre geldi. Bu bir bayrak yarışıydı. Siz bırakıyorsunuz sonuçta hematopoietik kök hücre. Hücresel başka biri aynı projede devam ediyordu. Ve o proje tedaviler daha eski aslında. Son yıllarda bu atılımın belli bir yere gelince danışman tekrar hedefe yapılmasının sebebi de kültür ortamlarının daha iyi yönelik çalışma yapıyordu. Ama kendi yapacağı geliştirilmesi çünkü kök hücreleri petride işler için kollaborasyon kurmuyordu yani üretebilmek. Pluripotentliğin birçok şeye çare yapmayacağı işler için kollaborasyon kuruyordu. olması bekleniyor. Ama ondan da öte ben tissue Bize mesela Amerika'dan kimyasal geliyordu ama engineering le ilgili ilerlemeler bekliyorum. Bizim biz o kimyasalı deniyorduk, ama projeyle bağlantılı alanımız değil ama sonuçta orada da kullanılan, olarak. Yani gidip biz üretmiyorduk tabii ki. Hem doku mühendisliğinde de kullanılan hücreler. böyle kollaborasyona açık olmak gerekiyor ama Orada kullanılması da büyük katkılar sağlayacak. Türkiye'de bir bakıyorsunuz herkes aynı işi yapıyor. Mesela renkli printer ı doku mühendisleri Nas ı l kollaborasyon bu diyorsunuz. Yani düşünüyor, youtube'dan falan bulursanız seyredin, kollaborasyonların da çok iyi dengelendiğini mürekkep yerine belli oranlarda hücre püskürterek düşünmüyorum. Bilim kültürü yıllara yayılan bir doku yapıyorlar. Bu müthiş bir şey tabi, bu alanın şey. Avrupa bunu Ortaçağ'dan çıktıktan sonra çok ilerleyeceğini düşünüyorum. Özellikle trans-yapmaya başlamış. Bu bilim kültürünün oturması plantasyon açısından. 3 boyutlu doku kültüründen da bir süreç gerektiriyor. Dediğim gibi bilim böbrek yapmak, böbrek en karışık organlardan biri. politikalarıyla ve akademik camiada da günü Bu tabii mühendisliği de çok ilgilendiren bir şey. Tek kurtaracak değil ama ürün dediğimiz şey illa ki başına hiçbir şeysiniz bu yüzyılda. Çok farklı hastaya verilecek olması gerekmiyor. Bir yolağı birimlerin bir araya gelip ortak projelere imza tanımlamak da bir üründür. Anlatabiliyor muyum? atması gerekiyor, bizim beklentilerimiz o yönde. Hep ubiquitini örnek veririm, ubiquitinle Nobel Buna da desteklerin verilmesi beklentimiz. ödülünü alan kişi burada konuşma yapmıştı. İlk Dünyayla ne kadar çok entegre olursak dünyadaki yayın yaptığında c grubu bir dergide yayın yapıyor gelişmeleri buraya o kadar getirmek mümkün ve 10 yıl boyunca hiç atıf almıyor. Türkiye'de böyle olabilecek. Dünyada benim izleyebildiğim bunlar, bir şey olduğunu düşünsenize, akademik hayatınız bu alanlarda transplantasyon ve rejeneratif tıp gider. Sonra Nobel alıyor ama. Yani böyle hiç kimsenin söyleme-diği bir şeyi söylemeye kimin cesareti var yani. Ya da bir konuya atılmanın. Aynı şekilde telomer. Ubiquitin ve telomer şu anda kanser için çok önemli. Telomerazla uğraşanın da bakın hikayesine. Zaten C. Elegans'la çalışıyor. Burada C. Elegans la çalışmaya çalıştığınızda bu trans-lational mı diye önce önünüze bir şey çıkar ve tek merakı DNA'nın uçlarında ne var diye bir soruyla

hükök röportaj

açısından önümüzdeki yıllar çok önemli olacak gibi. sonra zaten GMP koşullarında üretilip, güvenli ise Bu yüzyıla biyoloji yüzyılı deniyor, geçen yüzyıl fizik hastaya verilecek. Cell PID'in amacı böyle. Yani yüzyılı deniyordu. oldukça büyük bir proje. Buradaki ayağı da zaten

direkt klinikle alakalı. Onun dışındakiler hep klinikte Yakın ve uzun vadedeki planlarınızı bizimle kullanmaya hedefli. Ama kliniğe urun üretmek paylaşır mısınız? anlamında değil de iyi bir şekilde hücreleri

tanımlamak ve fizyopatolojisini aydınlatmaya Yakın zamanda miRNA'lar var. Fanconi hastalığında. yönelik. Bulabilirsek tabii, biyomarker bulmak çok Onların kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök güzel olacak.hücrelerinden hox profilleme ve miRNA prodilleme yapıyoruz. Önümüzdeki yıl, birkaç yılımızı bunlar Türkiye'deki kök hücre çalışmalarını değerlendirir alacak. Onların doğrulanması. Buradan biomarker misiniz?çıkar mı? Biomarker bulmak tabii amacımız. Tabii bir de fizyopatolojiyi aydınlatmak amacımız. Türkiye'deki kök hücre çalışmalarından gittiğim Buradan modellemelere geçebiliriz. Çünkü zebra birkaç kongre kapsamında bahsedeyim. Genellikle balığının fanconi modeli var. Hatta bu zebra balığı mezenkimal kök hücre çalışılıyor, embriyonik kök yakın-uzun vade gibi oluyor. Mezenkimal kök hücrede işte kurallar nedeniyle, bir dönem hücrelerin immün modülasyonunu nasıl yaptığını çalışılmış bir ara yasaklandığı için bırakılmış. Ankara araştırmak ikinci yakın-uzun, orta vadeli diyeyim Üniversitesi'nde bir grup var, Murat Elçin'lerin planlarımız. Uzun vadede mutlaka ve mutlaka grubu. Histolojiden Akçan var galiba, Gata'da yine primordial germ hücrelerinin ve embryonik kök Ali Uğur Ural'ın bir laboratuvarı var. Onlar hücrelerle ilgili çalışma yapmak isterim. hematopoietik kök hücre ve mezenkimal çalışıyor-

lar sanırım. Ama orada tıbbı biyolojide doktora Buradaki çalışmaların kliniğe uygulamaları neler? öğrencisi var. Onlar şimdi embriyonik kök hücre

çalışmalarına başlıyorlar. Tabi fare embriyonik Şu anda kliniğe uygulama yok. Mezenkimal hücre hatları üzerinden onlar da bir takım hastalık hücrelerin temel karakterizasyonuyla ilgili modellerinde çalışmak istiyorlar. Yani fizyopato-çalışmalar bunlar. Ama bir biomarker bulursak, lojiyi aydınlatmaya yönelik çalışma olacak onlarınki kliniğe uygulama hedeflerimizi bu yönde de. Gata'daki o grup dışında embriyonik kök hücre koyuyoruz. Ya da genetik modifikasyonlarının çalışan başka bir grup var mı bilmiyorum. 9 Eylul'de güvenli olduğunu gösterirsek bu da kliniğe tedavi nöronal kök hücre grubu var, o dediğim arkadaşlar. amaçlı gidebilir. Verdiğimiz son projeyi söyleyeyim Onlar bayağı eskiden başladılar aslında yine ben: mezenkimal kök hücreleri bir immün gen farelerden, nöroloji üzerine bir tıbbi bİyoloji yapmış aktarıp onu kanserde kullanmaya yönelik. Çünkü tıbbı biyologdur. Eşi de nöroloji üzerine fizyoloji kanser immün sistemden kaçan hücreler. Siz onu yapmıştır. Nörofizyologdur. Oldukça iyi çalışmaları gönderdiğinizde ligandı var, siz reseptörü var onların. Manisa'da var İngiltere'den doktorasını gönderdiğinizde ya da tam tersi orada immün almış bir histolog arkadaş. İstanbul grubunu çok toleransı yok edecek bir şekilde gen aktarırsanız- bilmiyorum da İstanbul'da Ac ıbadem'de, çünkü mezenkimal tümöre gidecek- tümörü tedavi Trabzon'dan oraya geçmiş bir hocanın kurduğu -bir edebilirsiniz. Bu yoldan çıkarak bir proje yazdık eğer de Bilkent'ten bir hoca geçti- onlar bir grup kurdu kabul olursa. Bizimki sadece tümörü immün orda onu biliyorum . İTÜ'de, orada bir teknopark sisteme tanıtma amaçlı bir proje olacak. Mesela bu bünyesinde kök hücrelere yönelik bir şey kuruldu tip şeyler kliniğe gitmesi için bir bilgi birimi ama o da daha çok üretmeye yönelik sanırım. sağlayacak çalışmalar. Bu şekilde çalışmalarımız var. Trabzon'da var zaten biliyorsunuz. İlk orda başladı Bir de Cell PID aslında. Cell PID projesi direkt kliniğe zaten ama üretime yönelik o da yine yani üretim yönelik. Bu tip çalışmalar Avrupa'da yapılıyor. farklı bir olay tabi. Onu ilaç bazında düşünmek İmmun sistem defektlerine bağlı, kalıtsal hastalık- gerekiyor onu. Bir işte Akdeniz Üniversitesi gen lara yönelik gen tedavisi amaçlanıyor. Konstraktlar tedavi grubu var orada ama deneysel gen tedavi işte onların güvenli olup olmadığı. Bunların hepsi düzeyinde. Asıl şeyi unuttum Kocaeli var tabii ki Avrupa'daki başka gruplar tarafından -lentiviral Kocaeli aktif bir grup aslında. Onların baya bir vektörlere takılması bu konstraktların- Avrupa'daki projeleri var ama onlarda temel araştırma ülkelerde yapılıyor. Onlar buraya gelecek. Burda düzeyinde baya aktifler . Yani TÜBİTAK'ın var mı hasta örnekleri üzerinde bu gen tedavi kons- bilmiyorum yine. Kayseri bina yapıyor yani o daha traktları nasıl etki ediyor onlara bakacak. Ondan yeni. Kayseri var da sempozyumlarla filan ön plana

mayıs 2012128

hükökröportaj

mayıs 2012 129

sempozyumlarla filan ön plana cıktı ama çalışma anlamında ne yapılıyor bilmiyorum açıkçası. Onlar da bir DPT projesi mi aldılar bilmiyorum. Orası da iyi bir merkez olacak gibi duruyor. Aslında hücre biyolojisi çalışan ile moleküler biyoloji çalışanı bir araya getirdiğinizde mutlaka bir şeyler çıkar ortaya. Asıl mesela Bilkent'te Can Akçalı var. Daha cok hayvan modelleri üzerinde çalışıyor. O da mezenkimal kök hücre üzerinde çalışıyor. Mezenkimaller tabi translational, Türkiye'de destek bulmak daha kolay. Kliniğe daha yakın hücreler. Hem de üretimleri avantajlı. Kemik iliği önemli bir kaynak ama buradan ulaşamıyorsanız yağ dokudan da ulaşırsınız. Bu dokudan da üretmeniz mümkün. karakterleri de öyle çok değişmiyor gibi görünüyor. Fenotip olarak değişmiyor ama moleküler düzeye indikçe mutlaka farklılıklar çıkacaktır. Özellikle bu hox profilleri konusunda ben çıkacağını düşünüyorum; yani karından aldığınız bir yağ ile yüzden aldığınız bir yağ aynı değil aslında. Bizim o anlamda değil çalışmalarımız ama o da ilginç bir alan olabilir. Adipoz kaynaklı çalışmadığımız için o bağlamda değil ama adipoz dokuya geçersek de mutlaka o tip bir çalışma yapmak gerekir, yayınlarda da var zaten. Türkiye'de başka, Ege'de var mı bilmiyorum. Ben 9 Eylül'de bir konuşma yapmaya gittiğimde Ege'den bayağı bir katılım vardı. Onlar da sanırım küçük küçük gruplar halinde başlıyorlar. Ben İzmir Yüksek Teknoloji'den bir şeyler bekliyorum. Orda temiz oda filan da yapmışlar ama daha bir şeye başlamamışlardı. Daha çok deneysel ortam için temiz oda yapılmıştı. Kültür odası değil de ventilasyonu, üretim koşulları, hepafiltreleri olan bir temiz oda. Başka, doğuda var mı bilmiyorum . Boğaziçi'nin de mesela moleküler biyolojisi kuvvetli. Oranın doku mühendisliği, medikal mühendisliği de çok iyi. Ordan da çıkması beklenebilir ama şu anda ilgilenen grup yok ya da bizim bildiğimiz yok. Ama mezenkimal kök hücre, embriyonik kök hücre, iPS çalışan bildiğim yok. Bundan sonra kliniğe uzak da olsa iPS'e başlamamız lazım. Dediğim gibi hastalıkları petride çalışmak için çok önemli iPS'ler.

hükök röportaj

HÜKÖK Dergi Sayı: 1

Documents