-
8/3/2019 hcre kltr - 1
1/15
16.04.2008
1
HCRE KLTR
Do. Dr. Hill zda
GVENL VE ETKNLABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
FZK ALTYAPI
Ayr bir oda
ClassII Biyogvenlik Kabini
Soutmal santrifj
Ters mikroskop
Pipet seti
Pipet yardmcs
Tezgah alt buzdolab ve derin dondurucu
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
2/15
16.04.2008
2
KLTR TPLER
Hcrelerin kkeni: Fetal veya erikin hayvan dokusu;Tmr dokusu; Primer hcre hatt ..
Bytlme usulleri: Sspansiyon; adherent; ankorajbaml veya bamsz
KLTR TPLEROrijin
Primer hcre kltrleri hayvan veya bitki dokusundan izole edilipkltre alnan hcrelerden oluur.
Devam hcre kltrleri daha hzl blnen, tmrijenitesi daha
yksektir. Transforme hcreler normal hcreden kanser hcrelerinin birok
zelliini tayan hale geen hcrelerdir.
Yksek younlukta rerler
Byme faktr ve seruma daha az ihtiya duyarlar.
Daha ziyade ankoraj bamszdrlar.
Sonsuz blnme kapasiteleri mevcuttur.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
3/15
16.04.2008
3
KLTR TPLER
Byme Tipi
Sspanse hcreler besiyerinde asl olarak byrler. Kltredildikleri kaba balanmadan yaayp oalma zelliinesahiptirler. Kan, dalak, kemik iliinden alnan hcreler geneldesspanse olarak byrler.
Yapk hcreler tek kat halinde kltr kabna balanarak byrler.Ektodermal veya endodermal embriyonik hcre katmanlar
genellikle bu ekilde byr. Buna fibroblastlar ve epitelyal hcrelerdahildir.
KLTR TPLERByme Tipi
Ankoraj baml hcreler hcre oalmas iin bir yzeye ihtiyaduyar.
Ankoraj bamsz hcreler kltr kabnn yzeyine zayf olaraktutunmulardr. Byme iin yzeye ihtiya duymazlar.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
4/15
16.04.2008
4
HCRELERN GZLEMLENMES
Besiyerinin rengi: Besiyerlerinin ounda pH indikatr bulunur.Sar ise asidite, mor gibi ise alkalilii iaret eder. Besiyerinin okbazik veya asidik olmas kontaminasyonu, fazla remi kltr,lm kltr, veya hatal C02 lm veya verimini iaret eder.
Besiyerinde bulutsu grnt kontaminasyonu veya fazla remikltr iaret eder.
Sspanse bir kltrde topaklanm hcreler ile yapk kltrdesoyulmu hcreler bir problemi iaret eder.
HCRELERN GZLEMLENMES
Flasktaki hcrelerinizi kabin iine almadan 40X objektif altndaters mikroskopta incelemeyi rutin haline getirin.
Yapk hcreler: yzeyde dzenlice yerlemi olurlar. Her tip hcreninkendine gre bir ekli vardr (yuvarlak, genimsi, karemsi, uzam).
Sspanse hcreler: Kre eklindedirler. Baz hcreler flaskn yzeyinehafife tutunmu olabilir.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
5/15
16.04.2008
5
HCRELERN ELDE EDL
Primer hcre hatlar veya kan hcreleri ile alan birlaboratuvarda alyorsanz mutlaka Hepatit B asyaptrmalsnz.
HCRELERN ELDE EDLPrimer Hcreler
Primer hcrelerin zor ve zahmetlidir. Bir hayvann ldrlpdissekte edildikten sonra hcrelerin izole edilip kltre alnmasngerektirir. Birok hcre tipinin primer kltrnde hcre says azdrve hcrelerin mr ksadr. Ancak gerek hcreye en yakn
model primer hcrelerdir. Primer hcreleri kendiniz retmeyekalkmadan nce:
Kendi labnzda veya blmnzde bu hcrelerle altn bildiiniz birmeslektanzdan rica edebilirsiniz. Hcrelerin hazrlanmasna yardmcolabilirsiniz. Bu hcrelerin hazrlanmas ok zahmetli olduu iin talebinizreddedilirse armayn.
Baka bir labdan isteyebilirsiniz ancak bu genellikle ortak almaprotokoln beraberinde getirecei iin byle bir yola girmeden ncepatronunuzla konuun.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
6/15
16.04.2008
6
HCRELERN ELDE EDL
Primer Hcreler
Primer hcreleri bir baka aratrc veya labdan alyor olsanz dahcrelerin elde edili prosedrn en az bir kez izleyin. Bir gnhcreleri kendiniz hazrlamanz gerektiinde hazrlkl olmuolursunuz. Ayrca verilen emee sayg gsterdiinizi de ifade etmiolursunuz.
Hastane ve tp faklteleri baz insan doku ve hcrelerini elde
etmek iin iyi bir kaynaktrlar.
HCRELERN ELDE EDLDevaml Hcreler
Eer bir hcre hatt iyi ve hzl blnyorsa hcrelerin eldesikolaydr ancak blnmesi problemli ise primer hcre hatlarndaolduu gibi zorluklarla karlalr.
Unutmayn ki devam hcre hatlar srekli kltr edilmeleri nedeniile fenotipik kayma yaarlar. Bu nedenle ayn hcre hatt iki farkllabda farkl karakteristikler gsteriyor olabilir.
Labdaki dier aratrmaclarla ayn hcre hattn kullanyorsanz biralma arkadanzdan bir tp donmu hcre isteyebilirsiniz.Donmu hcreleri yeni split olmu hcreye tercih edin zira pasajsays daha az olacaktr.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
7/15
16.04.2008
7
HCRELERN ELDE EDL
Devaml Hcreler
Devaml hcre hatlarn The European Collection of Cell Cultures(ECACC) veya American Type Culture Collection (ATCC)den satnalabilirsiniz. Bu kaynaklar insan ve hayvan hcrelerinin yansramikroorganizma, virus, DNA problar salayan zel kurululardr.Kltrlerin yaar durumda ve kontaminasyonsuz olmalargarantilidir. Aksi durumda hcreler yenileri ile cretsiz olarakdeitirilmektedir.
alacanz hcreleri elde etme araynda bu hcrelerle yaplmen iyi yaynlarn materyel-metod ksmlarn inceleyin. Buradakipasaj says, besiyeri benzeri ayrntlara dikkat edin.
Dondurulmu HcrelerinKltre Edilmesi
karyotik hcreler serumlu besiyeri ve dondurucu ajan (DMSO)varlnda dondurulup sv nitrojende (-196oC) saklanr.
Dondurulmu hcreler kuru buzda transfer edilir.
Dondurulmu hcrelerin hzlca zlp derhal kltre edilmesihcrelerin hayatiyetlerinin salanmas iin esastr
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
8/15
16.04.2008
8
Hcrelerin Bakm
Rutin
Beslenmeli: Taze besiyeri ile
Split Edilmeli (blnmeli): Kltr flask kapasitesi doldukahcreler split edilmeli.
Dondurulmal: Hcreleri depolamak arttr. retilen hcrelerin birksm sv nitrojende dondurulmaldr.
Hcrelerin BakmRutin
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
9/15
16.04.2008
9
Hcrelerin Bakm
Besleme ve Pasaj
Hcreler ne kadar hzl byyorlarsa o kadar sk beslenipblnmeleri gerekir.
Bir hcre aldnzda ilk renmeniz gerekenler:
Antibiyotik kullanlm m?
Hangi antibiyotik kullanlm?
Hangi besiyeri tercih edilmi?
Hcrelerin seruma ihtiyac var m?
Hcreleri ne kadar sklkla besleyip split etmem gerekecek?
Hcrelerin BakmAntibiyotik
Antibiyotik kullanm birok lab iin standart uygulama olmaklaberaber eer laykyla aseptik teknikler uygulanyorsa antibiyotieok da ihtiya olmaz.
Deerli veya kontaminasyona hassas hcrelerde tedbirli olupantibiyotii ihmal etmemekte fayda vardr.
Antibiyotikler toz halinde steril ielerde gelir. Steril su ilesulandrlrlar. Filtre sterilizasyona gerek yoktur.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
10/15
16.04.2008
10
Hcrelerin Bakm
Kltr Kaplar
Flask veya petri kaplar kullanlr.
Tek kullanmlk, polistrenden mamuldur ve radyasyon ile sterilizeedilmitir.
Yapk hcreler iin ilem grm plastik malzeme tercihedilmelidir (Polistren yzey amino gruplar ile kaplanm olabilir).
Plateler ise non-spesifik balanarak pozitif yzey oluturan birprotein ile (poly-D-lysine) kaplanm olabilir.
Kltr kaplar laboratuvar artlarnda da ilem grebilir.
Hcrelerin BakmBesiyeri
Hazr olarak satn alnr.
Raf mr dolmu olan besiyerlerini hcre ykamada kullanmak
mmkndr.
Besiyerleri birbirlerine benzer grnt olarak. Genellikle pHindikatr olarak hepsinde fenol krmzs bulunur.
Alacanz besiyerinin mikoplazma kontaminasyonuna kargarantili olmasna dikkat edin.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
11/15
16.04.2008
11
Hcrelerin Bakm
Besiyeri Fenol Krmzs
Limon sars < pH 6.5
Sar pH 6.5
Turuncu pH 7.0
Krmz pH 7.4
Pembe pH 7.6
Mor pH 7.8
Birok hcre pH 7.4te optimum reme gsterir.
Sarms asidik besiyeri: Fazla remi kltr
Bakteri kontaminasyonunu
Fazla CO2i iaret ediyor olabilir.
Morumsu bazik besiyeri: rememikltr
Kf kontaminasyonunu
Az CO2i iaret ediyor olabilir.
Hcrelerin BakmBesiyeri
Besiyeri kullanlmadan nce 37oCye stlmaldr. Su banyosununiinde (yaklak 10 dak). Besiyerinin iindeki baz bileenler(antibiyotik) uzun sre scakta beklemeye dayankl deildir.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
12/15
16.04.2008
12
Hcrelerin Bakm
Serum
Serum pahaldr. Her zaman blnp dondurularak saklanmaldr.Besiyerine kullanmadan nce eklenir. Erimi paralar tekrardondurulmadan buzdolabnda birka hafta saklanabilir.
Bilinmesi gerekenler:
Serumun yzdesi: %5-20
Serumun tipi: Standart olan dana serumudur. Fetal dana serumu da terciheden hcreler mevcuttur.
Is ile inaktive edilmi mi: Gerekiyorsa kendiniz donmu serumu erittiktensonra 65oCde 30 dak tutup paralara ayrp tekrar dondurarak prosedrtamamlayabilirsiniz.
Serumu nereden almalsnz: retimden retime fark gsterebilen birbileendir. Ucuza kamamalsnz.
Hcrelerin BakmHcrelerin Ayrlmas (split)
Hcrelerin reme hzna baldr.
Genellikle haftada iki kez yetecektir.
Hcreleri ayrmak iin ok beklemek (fazla remi kltr)
Yeteri kadar rememi hcreleri ayrmak
Taze besiyeri yerine eski besiyeri kullanarak hcreleri ayrmak skyaplan hatalar arasndadr.
Hcreleri split ederken flask/petri yzeyinden ayrmak gerekirbunun iin ekstraseller matriksi degrade eden Tripsin ve bubalanmada esas tekil eden Ca2+y bloke eden EDTAkullanlmaktadr.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
13/15
16.04.2008
13
Hcrelerin Bakm
Hcrelerin Dondurulmas
Hcreleri dondurmadan nce ATCCkataloundan kullandnz hcrenin dondurulma protokoln kontrol edin.
Laboratuvarda uygulanan prosedr arkadalarnzdan renin. Olas modifikasyonlar ATCCprotokol ile karlatrarak tespit edin.
Eer yeni bir hcre hatt ise hatt gelitiren lab ile irtibata gein veya literatre bakn.
Hcreler kryotplerde dondurulup sv nitrojen tanklarnda saklanr. Saklama iin kullanlan svnitrojen tanklarnn rakl sistemde olmas gerekir. Tpler bu tanklara kataloglanarak yerletirilmelidir.
Nitrojen tanklardaki sv nitrojen tankn zelliine bal bir hzda buharlar. Periyodik olarak nitrojenseviyesinin kontrol ve tamamlanmas gerekmektedir.
Sv nitrojen tanklar ile allrken mutlaka kryoeldivenler giyilmeli ve koruyucu gzlk taklmaldr.
Sv nitrojen buhar solunmamaldr. Elinizle oluan buhar datmamaya gayret edin.
Hcrelerin BakmKontaminasyon
Kontaminasyon bakteri, kf, mantar, mikoplazma veya baka hcrekltrlerinden kaynakl olabilir.
Makroskopik olarak
Bulutsu grnm
Besiyerinin renk deiimi
Koku: Flask kapa alp koklanmaz phesiz ancak ilerlemi kontaminasyoninkbatrn kaps alr almaz kendisini hissettirecektir.
Mikroskopik olarak
Dier organizmalarn varl bakteri veya kf gibi kendisini hemengsterecektir.
Hasar grm hcreler mikroskop altnda kolayca gzlenir.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
14/15
16.04.2008
14
Hcrelerin Bakm
Mikoplazma Kontaminasyonu
Mikoplazmalar 0.3um byklnde ok kk organizmalardr.ounlukla ters mikroskopta gzlenmezler. Hcre duvarlar yokturve bu nedenle antibiyotikten etkilenmezler. zel boyama yollar vetekniklerle varlklar tespit edilebilir. Enfeksiyon ar ise hcrehasar da enfeksiyonun varln gsterecektir.
Mikoplazma kontaminasyonunu engellemek iin kullanlanbesiyeri ve serumlarn mikoplazmasz olmas gerekir. Garantilirn kullann. Baka bir aratrmacdan hcre aldnzdamikoplazma testi yaplp yaplmadn sorun, en iyisi siz kendinizbu testi yapn.
Hcrelerin BakmMikoplazma Kontaminasyonu
Mikoplazma kontaminasyonun varl bir hcre yzey proteininekar onca uraya ramen neden antikor retilememi olmasnnnedeni olabilir.
Mikoplazma testi iin Floresan boyama
PCR
Eer kontaminasyon varsa
lgili hcreyi atn
Mikoplazma hcrenin biyolojisini bozar. Deneylerinizi ve sonularnzanlamsz klar.
Bir karantina hcre kltr odanzn olmas ve test edilmemi hcreleriyalnzca burada amanz mikoplazma kontaminasyonunun hcrelerinizeyaylmasn engelleyecektir.
-
8/3/2019 hcre kltr - 1
15/15
16.04.2008
Hcrelerin Bakm
Hcreden hcreye kontaminasyon
Hcrelerinizi gvenilir kaynaktan aln.
Ayn anda birden fazla hcre tipi ile almayn.
Asla ayn pipeti farkl hcreler iin kullanmayn.
Hcreye kullandnz bir pipetle asla besiyeri iesine girmeyin.
Hcrelerin BakmCO2 nkbatrleri
nkbatr iindeki tepsiyi steril distile su ile doldurmay unutmaynve her hafta bu suyu tazeleyin.
Her hafta raflar %70 EtOH ile silip her ay otoklavlayn.
nkbatr kapsn uzun sre ak brakmayn.
CO2 okumasnn doruluunu zaman zaman kontrol ettirin.
Is takibi iin ayrca bir termometreyi inkbatr iinde bulundurun.
