HPLC

5/25/2018 HPLC

1/18

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN HPLC)C R CTERISTIC S Y EQUIPOS UTILIZ DOS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE AGROINDUSTRIAS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

Pgina 1

1. CARACTERISTICAS Y EQUIPOS.1.1. Caractersticas ms importantes

Aplicaciones principales: Tcnica de separacin para los materiales menos

voltiles e inicos; anlisis cuantitativo de multicomponentes.

Fenmeno molecular: Reparto entre una solucin lquida y un substrato.

Ventajas en el anlisis cualitativo: Separa materiales para su examen por

medio de otras tcnicas.

Ventajas en el anlisis cuantitativo: Aplicacin amplia a los materiales menos

voltiles, anlisis de multicomponentes.

Muestra promedio deseable: 10 mg

Limitaciones del mtodo: Se tarda en desarrollar el mtodoLimitaciones para la muestra: Ninguna

2. Equipos.Detectores de absorbancia ultravioleta, de conductividad inica y de ndices de

refraccin.

Termostatos para control de la temperatura de la columna.

Detectores de absorcin ultravioleta, ndices de refraccin, fluorescencia,

conductividad, serie de diodos (UV) y espectrometra de masas.

Termostatos para control de la temperatura de la columna. Un inyector automtico de

muestras.

Ahora se va a tratar de los cuatro tipos bsicos de cromatografa en los que la fase

mvil es un lquido: (1) cromatografa de reparto; (2) cromatografa de adsorcin, o

lquido-slido; (3) cromatografa inica; y (4) cromatografa de exclusin por tamaos,

o en geles. Todo este captulo tiene relacin con las aplicaciones en columna de estos

cuatro importantes tipos de cromatografa.

En una primera etapa la cromatografa de lquidos se realizaba en columnas de vidrio

con dimetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas

realiz Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos caudales razonables, el

dimetro de las partculas de la fase estacionaria slida por lo general era de 150 a 200

m. Incluso as, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas dcimas de mililitro por

minuto. En consecuencia, los tiempos de separacin eran largos -a menudo de varias

5/25/2018 HPLC

2/18



Pgina 2

horas-. Los intentos para acelerar el procedimiento clsico mediante la aplicacin de

vaco, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba

un aumento de la altura de plato por encima del mnimo caracterstico que se observa en

las grficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia.

En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se

dieron cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna

disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino

hasta finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa adecuada para

producir y utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o 10 m. Esta

tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con las simples

columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para distinguir estosprocedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan con fines

preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de alta resolucin

(HPLC).

Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica de

separacin ms ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC

que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la

popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las

determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no

voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de

primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en

general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas,

cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas,

antibiticos esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias

inorgnicas.

La Figura 4.1 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la

cromatografa de lquidos tienden a ser complementarios por lo que a sus campos de

aplicacin se refiere. As, para solutos con masas moleculares superiores a 10 000, a

menudo se utiliza la cromatografa de exclusin, aunque ahora tambin es posible tratar

estos compuestos con cromatografa de reparto en fase inversa. Para especies inicas de

baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografa de intercambio inico.

5/25/2018 HPLC

3/18



Pgina 3

Los mtodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no inicas. Adems,

este procedimiento se utiliza muchas veces para la separacin de los integrantes de una

serie homloga. La cromatografa de adsorcin se elige con frecuencia para separar

compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifticos de los alcoholes alifticos.

Figura 4.1. Aplicaciones de la cromatografa de lquidos.

Por otro lado, la discusin sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a

la cromatografa de lquidos. A continuacin se ilustra el importante efecto del tamao

de partcula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que

a veces son de notable importancia en cromatografa de lquidos:

5/25/2018 HPLC

4/18



Pgina 4

Efectos del tamao de partcula del relleno. El coeficiente de transferencia de masa de

la fase mvil es funcin inversa del cuadrado del dimetro de las partculas que

constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC

debera mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamao de partcula. Por

ejemplo una reduccin del tamao de partcula de 45 a 6 m origina una disminucin

de diez o ms veces de la altura de plato.

Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografa de lquidos. En cromatografa

de lquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del

relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda

extracolumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de tubos como los que

se utilizan en los sistemas de inyeccin, en los detectores y en los tubos que conectanlos distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la diferente

velocidad de flujo que hay entre las capas de lquido adyacentes a las paredes del tubo y

las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve

con ms rapidez que la periferia. En cromatografa de gases la difusin compensa la

dispersin extracolumna. Sin embargo, la difusin en los lquidos es significativamente

menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente.

Cuando se utilizan columnas de pequeo dimetro, el ensanchamiento extracolumna

puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a

la reduccin del radio de los tubos del sistema externos a la columna.

Efecto del tamao de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra (g

de muestra/g de relleno) tambin afecta a la eficacia de la columna. Para las

aplicaciones con columnas de reparto y adsorcin, la eficacia decrece notablemente con

la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es

mucho ms pequeo.

3. Instrumentacin para cromatografa de lquidos.Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de

partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna

cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por

centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo

necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros

5/25/2018 HPLC

5/18



Pgina 5

tipos de cromatografa. La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentes

fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los

componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Figura 4.2. Esquema de un aparato de HPLC.

3.1.Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de losdisolventes.

Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de

acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente.

Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases

disueltos en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas en

los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema debombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los

disolventes o, como se muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusin que permiten

arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas

inerte de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas tambin contienen un

dispositivo para la filtracin del polvo y de las partculas slidas en suspensin de

5/25/2018 HPLC

6/18



Pgina 6

los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes

integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 4.2. Por

ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en

el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vaco a travs de un filtro de poro

muy pequeo. Este tratamiento elimina los gases adems de la materia en

suspensin.

Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se

denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se

aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos

(y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez

comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, aveces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los

instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos

que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara

de mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los

disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo. La Figura

4.3 ilustra la ventaja de una elucin con gradiente en la separacin de una mezcla

de cloro bencenos. La curva (b) corresponde a la elucin isocrtica con

metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elucin con gradiente, que se

inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la

concentracin de metanol un 8%/min. Obsrvese que la elucin con gradiente

acorta notablemente el tiempo de separacin sin sacrificar la resolucin de los

primeros picos. Ntese tambin que la elucin con gradiente produce unos efectos

similares a los producidos por la programacin de temperatura en cromatografa de

gases.

3.2.Sistemas de bombeo.Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la

generacin de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de

pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y

reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes resistentes a

la corrosin (juntas de acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse que las altas

5/25/2018 HPLC

7/18



Pgina 7

presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin,

debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un

componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que

esta prdida puede suponer un riesgo de incendio.

Figura 4.3. Mejora de la eficiencia de la separacin mediante la elucin con

gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1%

Permaphase ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol.

Detector: fotmetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60C, presin

80 kg/cm2. (a) elucin con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento

5/25/2018 HPLC

8/18



Pgina 8

de la proporcin de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) Elucin

isocrtica con metanol 50% / agua 50%.

3.2.1. Tipos de bombas.Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y

desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y

bombas neumticas o de presin constante.

Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los

sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una

pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de

vaivn de un pistn accionado por un motor. Dos vlvulas con cierre de

bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo deldisolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas

recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones,

las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como

ruido en la lnea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las

bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400

mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fcil

adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son

prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la

viscosidad del disolvente.

3.2.2. Amortiguadores de pulsos.Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones

de flujo. Un mtodo sencillo de amortiguacin contiene un fuelle flexible

o un gas compresible en la porcin superior cerrada de un tubo en T para

absorber parte de la energa de pulsacin. Cuando la bomba se rellena

esta energa se libera para ayudar a suavizar la pulsacin de presin. Los

amortiguadores electrnicos de pulsos proporcionan una carrera hacia

delante corta y rpida del pistn, y enseguida la carrera rpida de recarga

de la bomba. El pequeo impulso hacia delante amortigua el pulso de

flujo llevando disolvente a la presin del sistema.

5/25/2018 HPLC

9/18



Pgina 9

3.2.3. Control del caudal y sistemas de programacin.Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos

comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que

permiten medir el caudal mediante la determinacin de la cada de presin

a travs de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier

diferencia entre la seal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar

o disminuir la velocidad del motor de la bomba.

Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la

composicin del disolvente bien sea de una forma continua o bien deforma escalonada.

3.3.Sistemas de inyeccin de muestraA menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de

lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la

columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a

la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser

muy pequeos, de unas pocas dcimas de micro litro a tal vez 500 L. Adems, se

ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la

introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la

Figura 4.4. Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo

cromatogrfica y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos

de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la

muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas

dcimas por ciento.

Tambin existen vlvulas de inyeccin de micro muestras, con bucles con

volmenes de 0,5 a 5 L.

5/25/2018 HPLC

10/18


ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE AGROINDUSTRIAS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIASPgina10

Figura 4.4. Bucle de muestra para cromatografa de lquidos.

3.4.Columnas para cromatografa de lquidos.Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo

de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas

empaquetadas que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos

fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.

3.4.1. Columnas analticas.La mayora de las columnas para cromatografa de lquidos tienen una

longitud entre 5 y 30 cm. Por lo comn, las columnas son rectas y se pueden

alargar, si es necesario, acoplando dos o ms columnas. El dimetro interno

de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaos de las partculas

de los rellenos ms comunes son 3, 5 y 10 m.

Tal vez la columna ms frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud

y 4.6 mm de dimetro interno, y empaquetada con partculas de 5 m. Estas

columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.

Tambin, se han empezado a fabricar columnas de alta resolucin ms

rpidas, las cuales tienen menores dimensiones que las anteriormente

descritas. Estas columnas pueden tener dimetros internos que oscilan entre

1 y 4.6 mm y se rellenan con partculas de 3 o 5 m. A menudo su longitud

es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y

presentan la ventaja de la rapidez y del mnimo consumo de disolvente. La

5/25/2018 HPLC

11/18



ltima propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolventes

de alta pureza que se requieren en cromatografa de lquidos son muy caros.

3.4.2. Pre columnas.En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se

coloca delante una pre columna que elimina la materia en suspensin y los

contaminantes de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido,

la pre columna sirve para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as

minimizar las prdidas de sta en la columna analtica. La composicin del

relleno de la pre columna debe ser semejante al de la columna analtica; sin

embargo, el tamao de partcula es por lo comn mayor para minimizar la

cada de presin.3.4.3. Termostatos.

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura,

y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces

si se controla la temperatura de la columna en unas pocas dcimas de grado

centgrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayora de los

instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que

controlan la temperatura de la columna a las dcimas de grado, desde la

temperatura ambiente hasta 150 C. Para poder controlar con precisin la

temperatura, las columnas tambin se pueden colocar en camisas con agua

que provenga de un bao a temperatura constante.

3.4.4. Tipos de rellenos de la columna.En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos,

pelicular y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de

polmero, no porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a

40 m. En lasuperficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa

de slice, almina o de una resina de intercambio inico. Para algunas

aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase

estacionaria lquida que se mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se

pueden tratar qumicamente para obtener una capa superficial orgnica. Por

lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente en las pre

5/25/2018 HPLC

12/18



columnas y no en las columnas analticas. Los tpicos rellenos de partculas

porosas de cromatografa de lquidos estn formados por micropartculas

porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible

para un tamao determinado. Las partculas son de slice, almina o resinas

de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn. Las

partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos

inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas

mayores con dimetros muy uniformes.

Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas

orgnicas, que se unen qumica o fsicamente a la superficie.

3.4.5.

DetectoresA diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no

hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los

detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los

mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el

perfeccionamiento de los detectores.

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las

propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la

excepcin de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario

que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un

detector de HPLC debe tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el

ensanchamiento de banda.

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los

detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una

propiedad de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante

dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos.

Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden

a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV,

fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase mvil.

En la Tabla 4.1 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC

y algunas de sus propiedades ms importantes. Un informe de 1982 sobre

5/25/2018 HPLC

13/18



365 trabajos publicados en los que tena un papel importante la

cromatografa de lquidos, revel que el 71 % se utilizaban en la deteccin

de la absorcin UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el ndice de refraccin,

el 4,3% empleaba medidas electroqumicas y el 4,3% restante otras medidas.

3.4.5.1. Detectores de absorbanciaLa Figura 4.5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma

de Z para la medida de la absorbancia de los efluentes de una

columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de

banda extra columna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo

menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn

de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. Lautilizacin de cubetas de este tipo est restringida a presiones no

mayores de unos 50 kg/cm2.

Tabla 4.1. Caractersticas de los detectores de HPLC.

5/25/2018 HPLC

14/18



Figura 4.5. Celda de detector ultravioleta en HPLC.

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en

los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a

travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las

intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos

contrastados. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En

este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en

la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo

de la absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores

de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una

lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es

aislar la lnea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos

equipos tambin se pueden utilizar las lneas a 250, 313, 334 y 365

nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector

se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben a

alguna de estas longitudes de onda.

Algunos grupos funcionales orgnicos y diversas especies

inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms de

esas longitudes de onda.

5/25/2018 HPLC

15/18



Detectores de absorbancia ultravioleta con monocromadores. La

mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen

detectores que consisten en un espectrofotmetro de barrido con

ptica de red. Algunos se limitan a la radiacin ultravioleta;

mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la visible. Se

pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede

obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o

alternativamente, cuando los picos que eluyen estn suficientemente

separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico.

En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la

mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean losespectros completos con fines de identificacin, se puede parar el

flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el

barrido de la regin de longitud de onda que interesa.

Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes

son los instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes

ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de

un espectro completo en aproximadamente un segundo. De esta

forma, los datos espectrales para cada pico cromatogrfico se

pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la

columna. Una de las formas de presentacin de los datos

espectrales, que resulta til para la identificacin de las especies y

para elegir las condiciones de la determinacin cuantitativa,

consiste en un grfico tridimensional tal como el que se muestra en

la Figura 4.6. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos

de cinco segundos. La aparicin y desaparicin de cada uno de los

esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

5/25/2018 HPLC

16/18



Figura 4.6. Espectros de absorcin del efluente de una columna de HPLC tomados a

intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se

ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con barrido

de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro

semicirculares. El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de

detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada

de Fourier.

Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de

radiacin ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de

cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta

oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volmenes de 1.5 a 10 L. Los

instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden trabajar a una o

ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los

espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los

instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera

anloga a los instrumentos de series de diodos para las medidas de

absorbancia ultravioleta que se han descrito en la seccin anterior.

Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de

infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los

5/25/2018 HPLC

17/18



disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de

absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden

prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.

3.4.5.2. Detectores de fluorescenciaLos detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en

diseo a los fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de

ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector

fotoelctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de

excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de

excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin

fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores defluorescencia probablemente se basarn en el uso de fuentes de

lser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y

selectividad.

Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta

sensibilidad, que resulta ser ms de un orden de magnitud mayor

que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografa de lquidos

se ha aprovechado esta ventaja para la separacin y determinacin

de los componentes fluorescentes de las muestras.

3.4.5.3. Detectores de ndice de refraccinEstos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el

disolvente que en su camino hacia la columna pasa a travs de una

mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por la otra

mitad. Los dos compartimentos estn separados por una placa de

vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones

difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un

haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la

superficie fotosensible del detector provoca una variacin de la

seal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada,

proporciona el cromatograma.

5/25/2018 HPLC

18/18



Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que

responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores

universales anlogos a los detectores de llama en cromatografa de

gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo,

son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de

mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de

grado centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la

mayora de los otros detectores, y por lo general no se pueden

utilizar en la elucin con gradiente.

3.4.5.4. Detector de dispersin de luzRecientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detectorgeneral para la HPLC, el detector de dispersin de luz (ELSD). En

este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador

donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de

nitrgeno o aire. Las finas gotitas se llevan a travs de un tubo de

conduccin a temperatura controlada donde tiene lugar la

evaporacin de la fase mvil, lo que origina unas finas partculas de

analito. La nube de partculas de analito pasa a travs de un haz

lser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiacin

dispersada perpendicularmente al flujo.

Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su

respuesta resulta ser aproximadamente la misma para todos los

solutos no voltiles. Adems es notablemente ms sensible que el

detector de ndice de refraccin.

3.4.5.5. Detectores electroqumicosLos fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad

varios tipos de detectores electroqumicos. Estos dispositivos se

basan en cuatro mtodos electroanalticos que incluyen la

amperometra, la voltamperometra, la coulombimetra y la

conductimetra.

HPLC

Documents

cromatografa lquida

cromatografa de reparto

cromatografa inica

cromatografa de adsorcin

cromatografa de exclusin

tipos bsicos de cromatografa

cromatografa de lquidos

anlisis cualitativo