HPLC2

Erciyes Üniversitesi

HPLC High Performance

Liquid Chromatography


HPLC 1. BölümHPLC’nin teorisi ve kullanım sahasıKullanılan modüller ve işlevleriAyırma tekniklerinin sınıflandırılması


Kromatografi bir ayırma tekniğidir.

Diğer ayırma teknikleri: Ekstraksiyon, Filtrasyon, Destilasyon, Santrifüj etme, vb..

Kromatografide ana amaç, hedef bileşiği bulunduğu ortamdaki diğer tüm bileşiklerden ayırarak belirlemek ve miktarını ölçmektir.

KROMATOGRAFİ NEDİR?


ChromatoChromatograph Petroleum ether

CaCOCaCO33

ChlorophyllsChlorophylls ColorColor

Rus Botanikçi M.S. Tswett. 1903



KROMATOGRAFİ TÜRLERİ

Thin-Layer Chromatography (TLC)

Column Chromatography

Gas Chromatography (GC)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Supercritical Fluid Chromatography (SFC)

Capillary Electrophoresis (CE)



sabit faz

mobil faz




Hareketli Faz (Mobile Phase)Sıvı veya Gas

Sabit Faz (Stationary Phase)solid partikül veya ince bir sıvı film ile kaplanmış solid partikül


Ayırma kolonda gerçekleşir.

dolgu materyali, 3-5um

kolon

Ayrılma, farklı bileşiklerin, kolon dolgu ya da kaplama materyali ile farklı etkileşiminin sonucudur.

bileşik A

bileşik B

dolgu materyali


karışım





HPLC’nin KULLANIM SAHASI


Gıda analizleri Çevre analizleri Biokimyasal analizler İlaç formülasyonları Polimerler

Bir çözücüde çözünebilen tüm maddeler

HPLC’nin KULLANIM SAHASI


HPLC’nin AVANTAJLARI

Eş zamanlı analiz Doğruluk Yüksek hassasiyet (ppm - ppb) Küçük enjeksiyon hacmi (1- 1000µl) Geniş uygulama sahası Zor olmayan analiz koşulları Çok iyi tekrarlanabilirlik


HPLC Sistemi Akış Diyagramı

pompainjektör kolon

detektör

bilgi işlemci

mobil faz


ISOCRATIC SYSTEM

LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM

HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM

HPLC SİSTEM TÜRLERİ


ISOCRATIC SYSTEM

Tek pompa, tek solvent Solvent, karışım olabilir

Akış şeması

pompainjektör kolon

detektör

bilgi işlemci

mobil faz


yetersiz ayırımyetersiz ayırım

ODS kolon

Sistemin yetersizliğiMeOH / H2O = 6 / 4

uzun analiz süresiuzun analiz süresi

MeOH / H2O = 8 / 2

ISOCRATIC SYSTEM

GRADIENT SYSTEM

Ayırma yeteneği95%

30%

MeO

H ko

nsan

trasy

onu

Zaman


1 pompa max. 4 farklı mobil faz karışım pompadan önce

düşük basınçgradient valf

pompainjektör

kolon

M1

dedektör

bilgi işlemci

M2 M3 M4

LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM Akış şeması


2 yada 3 pompa 2 ya da 3 farklı mobil faz karışım pompadan sonra

HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM

bilgi işlemci

injektörkolon dedektör

pompa

pompa

pompa

mixerM1

M2

M3

Akış şeması

İsimlendirmenin kökeni

mixer

düşük basınç gradient ünitesi

Degasser

HIGH / LOW PRESSURE


motor

plungerplunger seal

Check valve

pump head

10-100uL

HPLC SİSTEM MODÜLLERİ

POMPA Çalışma prensibi


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Pompa Tipleri

Çift pistonlu paralel pompalar

Çift pistonlu seri pompalar

Tek pistonlu pompalar


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Pompa Tipleri


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Basınç dalgalanması


kolon

LOAD INJECTpompa pompa kolon

loop

HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Oto-Enjektör


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Manual-Enjektör


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Manual Enjektör



Ön işlem yapma yeteneği

Soğutma olanağı Kendi üzerinden

kumanda edilebilme olanağı

Küçük enjeksiyon hacmi için çok iyi tekrarlanabilirlik

Düşük cross contamination

Oto-Enjektör


HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Kolon Fırını

Hava sirkülasyonlu Blok ısıtıcılı Düşük sıcaklık

dalgalanması Manual enjektör, mixer

ve dedektör hücresi monte etme olanağı

Sızıntı sensörü Kendi üzerinden

kumanda edilebilme olanağı



DetektörHassasiyet

Düşük gürültü seviyesi

Detektör hücresi seçenekleri ve özellikleri

Kendi üzerinden kumanda edilebilme olanağı


HPLC ’de AYIRMA TEKNİKLERİ

Normal Phase NPReverse Phase RPReverse Phase Ion Pairing IP Ion Exchange ICSize Exclution SEC ( GPC /

GFC ) Chiral Separation


heksan / diklorometanheksan / diklorometan

NORMAL FAZ

İlk Geliştirilen Teknik CaCOCaCO3 / Petrol eteriPetrol eteri

Genel Tanımı:kolonkolon :: polarpolarmobil fazmobil faz : : apolarapolar


NORMAL FAZ KOLONLARI Silica gel Cyano Amino Diol Nitro


SilikaSi

Si-Si-CH2CH2CH2 CN-Si-CH2CH2CH2 NH2-Si-CH2CH2CH2 OCH(OH)-CH2(OH)

Kaplanmış Silika

NORMAL FAZ KOLONLARI

Erciyes ÜniversitesiSilica gel (polar)

apolar

NORMAL FAZ ETKİLEŞİMİ Hidrojen bağı (hidrofilik etkileşim)


HİDROJEN BAĞI Bileşiğin yapısında bulunan

COOH, -NH2, -OH, -CN vb. polar guruplar

Hidrojen bağının kuvvetini artırır

CH, -CH2 guruplarının sayısı ve dallanma

Hidrojen bağının kuvvetini azaltır


OH

HO

SiOH

SiOH

kuvvetli

zayıf

HİDROJEN BAĞI


NORMAL FAZDA ALIKONMA Solvent : Hexane

1 : Dioctyl phthalate

2 : Dibutyl phthalate

3 : Diethyl phthalate

4 : Dimethyl phthalate


su / metanol / asetonitrilsu / metanol / asetonitril

TERS FAZ (REVERS PHASE) En çok kullanılan teknik Genel Tanımı:

kolonkolon :: apolarapolarmobil fazmobil faz : : polarpolar


TERS FAZ KOLONLARI C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) Phenyl TMS Cyano


Si• apolar özellik

TERS FAZ KOLONLARI


apolarapolar

polarpolar Hidrofobik etkileşimHidrofobik etkileşimTERS FAZ ETKİLEŞİMİ


HİDROFOBİK ETKİLEŞİM

Bileşiğin yapında bulunan

Karbon zincirinin uzunluğu ve aromatik guruplar Hidrofobik etki kuvvetini artırırHidrofobik etki kuvvetini artırır

COOH, -NH2, -OH, vb. polar guruplar Hidrofobik etki kuvvetini azaltırHidrofobik etki kuvvetini azaltır


OH

OH

C18 (ODS)

kuvvetli

zayıf

TERS FAZDA ALIKONMA


TERS FAZDA ALIKONMA Solvent : MeOH+Su

1 : p-Hydoxymethylbenzoate

2 : p-Hydoxyethylbenzoate

3 : p-Hydoxypropylbenzoate

4 : p-Hydoxybutylbenzoate


C18 (ODS)

kuvvetli

C8

Bileşik

Bileşik

Bileşik

C4

orta

zayıf

SABİT FAZIN ETKİSİ


ODS C8 TMSODS C8 TMS

SABİT FAZIN ETKİSİ

1. Methyl benzoate

2. Ethyl benzoate3. n-Propyl

benzoate4. n- Butyl

benzoate


TERS FAZ-İYON ÇİFTİ


İYON ÇİFTİ REAKTİFLERİ

Anyonik bileşiklerTetra-n-butilamonumhidroksid (TBA)

Katyonik BileşiklerBütan (C4) - Dekan (C10)sülfonik asit sodyum tuzu


İYON DEĞİŞTİRİCİ KOLONLARKatyon değiştirici kolonlar

–Kuvvetli katyon değiştirici (SCX)

–Zayıf katyon değiştirici (WCX)

Anyon değiştirici kalonlar

-Kuvvetli anyon değiştirici (SAX) -Zayıf anyon değiştirici (WAX)


N+

RR

RAnyon

SO3- Katyon

+

++++

++

+

++++

+

İYON KROMATOGRAFİDE ETKİLEŞİM İyonların çekim kuvveti


Size Exclusion Chromatography – SEC-Size Exclusion Chromatography – SEC-

Gel Permeation Chromatography (GPC) Polimerlerin analizi, molekül ağırlığı ölçümü

Gel Filtration Chromatography (GFC) Proteinlerin ayrımı


SEC’de ETKİLEŞİM Fiziksel etkileşimFiziksel etkileşim


GPCKolon

Fiziksel etkileşimFiziksel etkileşimM

olek

üler

ağ

ırlık

Zaman

Exclusion Limit

Permeation Limit

SEC’de ETKİLEŞİM


C*

H

COOHCOOHNH2

RR HOOCHOOC*C

NH2

RR

Hayn

a

(L) form (D) form

Optik izomerler: Işığı çevirme yönlerinin farklılığın dışında, tüm fiziksel ve kimyasal özellikleri aynı

*Chiral Center

CHIRAL SEPARATION


(R)(R)

(L)

(D)

kuvvetli etkileşim

zayıf etkileşim

Optik izomer ayrımında etkileşim

CHIRAL SEPARATION


Enjeksiyon tekniğiDetektör tipleri ve çalışma

mekanizmalarıSonuçların doğrulanması ve

güvenirliğin sağlanması

HPLC 3. Bölüm


çözücü:Methanol

20 mL kafein

cözücü:Ethanol

20 mL kafein

ENJEKSİYON TEKNİĞİ

Çözücü etkisi Standart ve örneğin çözücüsü mobil

fazdan daha kuvvetli olmamalıdır

Erciyes ÜniversitesiZayıf solvent Kuvvetli solvent

Çözücü etkisi

ENJEKSİYON TEKNİĞİ


DEDEKTÖRLERUltraviolet / Visible detector (UV/VIS) Photodiode Array detector (PDA) Fluorescence detector (RF) Conductivity detector (CDD) Refractive Index detector (RID) Electrochemical detector (ECD) Mass detector (MS) Evaporative Light Scattering detector

(EL)


Ein Eout

ACl= - log (Eout / Ein)

l

C : concentration

Lambert-Beer yasası

(A : absorbance)

CellCell

UV DEDEKTÖRAbsorbans ölçümü


UV DEDEKTÖR Çalışma prensibi


UV DEDEKTÖR Gürültü seviyesi (Noise level)

4 2

2 1

A=-log(2/4)=0.3A=-log(2/4)=0.3

A=-log(1/2)=0.3A=-log(1/2)=0.3

A1=-log(2/(4+0.1))=0.311A2=-log(2/(4-0.1))=0.290dA=A1-A2=0.021

A1=-log(1/(2+0.1))=0.322A2=-log(1/(2-0.1))=0.278dA=A1-A2=0.044

dA=0.021AUdA=0.021AU

dA=0.044AUdA=0.044AU


UV DEDEKTÖR UV dedektörün olanakları

İki ayrı dalga boyunda çalışabilmek Oran kromotogramı alabilmek Dalga boyunu zamana karşı

programlayabilmek Spektrum taraması yapabilmek D2 / W lamba seçeneği Değişik çalışma türleri için hücre

seçenekleri


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR

Çalışma prensibi


Sample Cell

512 Elements Photodiode Array

Grating

D2 / W lampher element ayrı bir dalga boyunu ölçer

PHOTODIODE ARRAY DETECTOR

Çalışma prensibi


Zaman

Dalgab

oyu

Abso

rban

s

kromatogramSpektrum

PHOTODIODE ARRAY DETECTOR 3 Boyutlu veri


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR 3 Boyutlu görüntü ve üstten

görünüş


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik profili ve oran kromatogramı


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik saflığı ve spektrumu


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik saflığı


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Slit width (Sensitivity x Resolution)


PHOTODIODE ARRAY DETECTOR PDA’nın sağladığı olanaklar

İstenilen dalga boyu aralığında çalışabilmek Analiz sonrası istenilen çok sayıda dalga boyunda

ölçüm yapabilmek Oran kromatogramı alabilmek istenilen her pikin spektrumunu görebilmek Benzerlik kıyaslaması yapabilmek Pikin saflığını tayin edebilmek D2 ve W lambayı aynı anda kullanabilmek


+ hn1

hn2+

*

A

A*

A

hn1 hn2

Excitation Wavelength

Emission Wavelength

FluorescenceFluorescence

*

FLORESANS DEDEKTÖR Floresans oluşumu


FLORESANS DEDEKTÖR Çalışma prensibi


Sıcaklık kontrolü

REFRACTİVE INDEX DETECTOR Çalışma prensibi


MASS DETECTOR Çalışma prensibi

++++++ +++++ +++++ +++ ++++ +++

+ + + ++++

++

Vacuum

Skimmer lens

Mass analyser

Rotary pump TMP1 TMP2Rotary pump TMP1 TMP2


MASS DETECTOR Diquat’ın mass spektrumu


Sıklıkla ortaya çıkan Sıklıkla ortaya çıkan sorunlar, muhtemel sorunlar, muhtemel nedenleri ve çözümlerinedenleri ve çözümleri

HPLC 4. Bölüm


EddyEddy

diffusiondiffusion

AkışınAkışın

dengesizliğidengesizliği

BAND GENİŞLEMESİDoğal Neden:

Mobil faz akışının kolon içinde dengesiz akışı


BAND GENİŞLEMESİ Genel önlemler

Daha dar ve küçük partiküllü kolon Viskozitesi daha düşük mobil faz

Kolon fırını sıcaklığını yükseltmek Yeterli ayrımı sağlamak koşulu alıkonma

süresini azaltmak akışı hızını artırmak, kısa kolon

Poroz yüzeyi daha küçük dolgu maddeli kolonlar

Küçük enjeksiyon hacmi Enjeksiyon hacmine uygun loop ve cell Daha dar bağlantı tubing’leri Silica bazlı kolon


BAND GENİŞLEMESİ Muhtemel nedenleri ve çözümleri

Bazı piklerde genişleme varsa bir önceki enjeksiyondan kalmadır

Tüm piklerde genişleme varsa kolon etkinliğini kaybetmiş demektir. (Kolonda yaygın kirlenme, ölü hacmin büyümesi,silanol gurplarının artması)kolonu kuvvetli bir çözücü ile yıkayınEnd-cappingkolonu değiştirin


Tailing faktörü T= W0,05 / 2f Olumlu koşullarda 0,9 > T >1,2 T<1,5 kabullenilir değerdir

FRONTİNG / TAİLİNG

ff

ww0,050,05

0,05h0,05h

tailingtailing frontigfrontig


Muhtemel nedenleri ve çözümleri Mobil fazın çok kuvvetli olması

k’<2 olmayacak kadar kuvvetli solventi azaltın Örnek solventinin kuvvetli olması

Örneği mobil fazda çözün Kolon kapasitesinden fazla yükleme

1/10 seyrelterek enjeksiyonyapın Safsızlık

Detektörün veri alma sıklığını artırınBaşka bir dalga boyunda kontrol edin

FRONTING / TAILING


Muhtemel nedenleri ve çözümleri Kolon içinde silanol guruplarının çokluğu

End cappigMobil faza trietanolamin ilave etmekİyonlaşmayı azaltacak pH değerine sahip tampon

Kolon başında boşluk oluşmasıBoşluğu doldurun

Silica içindeki ağır metal safsızlıklarYüksek saflıkta silica bazlı kolonMobil faza EDTA ilave etmek

FRONTİNG / TAİLİNG


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK İkincil alıkonma etkisi

Kaplanmış silca kolonlarda silanol guruplarının varlığı normaldir

C18

C18

C18

C18

silica coreOH

OH

Silanol group


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK End capping

C18

C18

C18

silica coreOH

OH

C18

C18

C18

silica core(CH3)3Si-Cl

-HCl

C18C18

O-TMS

O-TMS


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUKİkincil alıkonma etkisi

Ağır metal kalıntıları

C18

C18

C18

silica coreO-TMS

O-TMSM+

M+

C18

O

O

Normal silica ağır metal kalıntısı içerir

Ağır metal içermeyen yüksek saflıkta silica’dan yapılmış kolonlar terçih edilmelidir


Muhtemel nedenleri ve çözümleri Bağlantılarda boşluk

Enjektör ve detektör arasındaki tüm bağlantıları kontrol et

Kolon başında veya içinde boşluk Kolonu tamir et ya da değiştir

PİKLERİN ÇATALLANMASI

tüm pikler çatallıtüm pikler çatallı

kolon içindeki kolon içindeki boşlun tamiri çok boşlun tamiri çok zordurzordur


Muhtemel nedenleri ve çözümleri Bir önceki enjeksiyondan kalma

Kendinden sonra gelen piklerden daha geniş olur Kolondaki kirlilik

Kolonu mobil fazdan daha kuvvetli bir çözücü ile yıkayın

Manuel enjektörde kirlilikSadece solvent enjekte edildiğinde de ortaya çıkar

Gradient çalışmada mobil fazlardan birinde bulunan safsızlık

Enjeksiyon yapmadan verilen START sonunda görülürKirli mobil fazı belirleyin ve değiştirin

HAYALET PİKLER (Ghost peaks)


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Kolon kirliliği

Daha önce yapılan analizlerde benzer mobil faz kullanıldığında kolonda tutulan maddeler

Kolonu kuvvetli bir çözücü ile yıkamakmobil faz:MeOH/su (30:70)mobil faz:MeOH/su (30:70)

THF ile yıkandıktan sonraTHF ile yıkandıktan sonra


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Kolon sonunda tuzaklanmış buble

Kolondan düşük akışla isopropil alkol geçirin Kolonu dik kullanmayı tercih edin


PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Tampon gücü zayıf

İyonlaşma engellenemiyor


BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline ani,sivri iniş çıkışlar

Detektörden buble geçişi veya tuzaklanmasıMobil fazı degas edinDedektör hücresini yıkayın Resistör coil ilavesi ( basıncı kontrol

ettikten sonra)


BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da dalgalanma veya kayma

Pompada basınç dalgalanması Pompa başındaki hava kabarcığını uzaklaştırın

Kolonda kirlilik Kolonun temizlenmesini bekleyin

Mobil faz kirli Mobil fazı değiştirin


BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da aşırı gürültü (noise)

Dedektör hücresi veya lensler kirli Hücreyi yıkayın

Lamba enerjisi düşük Lamba ömrünü ve enerjisini kontrol edin

Mobil fazda uygun olmayan solvent (cut off point) Mobil fazı değiştirin


BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da aşırı gürültü (noise)

Degas edilmemiş mobil faz

Degas edilmişDegas edilmiş

Havaya doymuşHavaya doymuş

0,32 Au0,32 Au

Mobil faz: MeOH, UV-210 nmMobil faz: MeOH, UV-210 nm


ALIKONMA ZAMANI DEĞİŞİMİ Buharlaşma nedeniyle mobil fazın

yapısındaki değişim Taze mobil faz kullanın, He degas

kullanmayın, mobil fazın ağzını sıkıca kapatın

Tampon gücü zayıf Tamponun konsantrasyonu artırın veya

değiştirin Kolon kirli

Kolonu kuvvetli çözücü ile yıkayın Sıcaklık dalgalanması

Kolon fırını kullanın


Muhtemel nedenleri Fritlerin tıkanması Akış hattında tıkanma Oto enjektörde tıkanma Kolonda tıkanma Sıcaklık azalması

BASINÇ YÜKSELMESİ


BASINÇ YÜKSELMESİ Alınabilecek önlemler

Mobil fazı ve örnek çözeltisini süzmek0,45 veya daha da iyisi 0,20 u

Tamponla çalışmalardan hemen sonra tüm sistemi su ile yıkamak

Taze mobil faz kullanmak Kolonu en az %50 organik çözücü ile

bekletmek Mobil faza %0,01 Sodyum azid ilave

etmek


Kolonun temizlenmesi

Kolon girişindeki frit’i çıkarın ve ulrasonik banyaoda isopropil alkolle temizleyin

Kolonu ters bağlayıp yıkama solventi ile düşük akışla uzun süre yıkayın

BASINÇ YÜKSELMESİ


BASINÇ DÜŞMESİ Muhtemel nedenleri

Kolon öncesi hatlarda sızıntı Emme filtresinde tıkanıklık Pomba başında buble Pompa contasında sızıntı Yanlış mobil faz Kolon deformasyonu

Akış miktarını kontrol edinAkış miktarını kontrol edin


Emme filtresinin temizlenmesi

HNO3suEDTANH3Organik solvent

BASINÇ DÜŞMESİ


KOLON’un FİZİKSEL DEFORMASYONU

Kolonu ani şok etkilere maruz bırakmayın Mekanik darbelerden sakının Pompa çalışırken valfi açmayın, ani

basınç yükselme ve düşmelerinden sakının

8 9

4 5 6

1 2 3

･

7

0

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx xxxx

000 0 000 0

LC-10AD :::::::


KOLON’un KİMYASAL DEFORMASYONU

Kolona ait kullanma talimatını mutlaka okuyun Silika bazlı kolonlar

pH aralığı 2-8 Basınç genellikle 250 kg Organik solvent limitsiz

Polimer bazlı kolonlarpH aralığı çok geniş Basınç genellikle 50 - 150 kg Organik solvent limitli

HPLC2

Documents

hplcnin kullanim

photodiode

ters faz

band genlemes

erciyes niversitesi

bilgi ilemci

kromatograf

kolon