hongo aspergillius.pdf

7/23/2019 hongo aspergillius.pdf

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EVALUAR LA APLICACIN DE ENZIMA PECTINASA AISLADA DEL HONGO

Aspergi llus nigerDURANTE EL PROCESO DE CLARIFICACION Y

FERMENTACION DEL MOSTO DE VINO DE UVA Vitis labruscaVARIEDAD

ISABELLA PARA LA OBTENCION DE VINO TINTO

NATALIA RINCON

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

BOGOTA D.C

2007


2/100

EVALUAR LA APLICACIN DE ENZIMA PECTINASA AISLADA DEL HONGO

Aspergi llus nigerDURANTE EL PROCESO DE CLARIFICACION Y

FERMENTACION DEL MOSTO DE VINO DE UVA Vitis labruscaVARIEDAD

ISABELLA PARA LA OBTENCION DE VINO TINTO

Trabajo de grado para optar el ttulo de

Ingeniera de Alimentos

NATALIA RINCON TORRES

Directora

LENA PRIETO

Ingeniera Qumica

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

BOGOTA D.C

2007


3/100

Ni la Universidad, ni el comit de

Proyecto de Grado, sern responsables

de las ideas expuestas por el

graduando


4/100

Nota de aceptacin

Presidente del Jurado

Jurado

Jurado

Bogot D.C. Mayo de 2007.


5/100

A Dios y la Virgen Mara por guiar mi camino a

cada instante y darme vida y salud para culminar

mis estudios.

A mis padres por su amor, entrega, apoyo y

sobre todo por su comprensin y paciencia.

A mi Hermana Catalina por ser tan especial e

incondicional.

A mi hijo Nicols por alegrar cada da de mi vida.

Al amor de mi vida por los momentos felices.

A mi mejor amiga Sandra por su amistad y

apoyo.

A todos mis compaeros de Guianza S.A. en

especial al Dr. Guillermo Atuesta, por su apoyo y

confianza.

A mi jefe Juan en Vehculos y Mercadeo por su

amistad y paciencia.


6/100

AGRADECIMIENTOS

La autora expresa sus agradecimientos a:

Dr. Camilo Rozo, Qumico PhD, por su inters en este trabajo de grado.

Lena Prieto, Ingeniera Qumica, por su asesora y amistad.

Patricia Jimnez de Borray, Qumica, por su apoyo y amistad durante toda la

carrera.

Jos A De Silvestre, Qumico Farmacutico, por su colaboracin, amistad e

inters en el proyecto.

Luz Myriam Moncada, Qumica, por su apoyo y asesora durante el desarrollo

del trabajo de grado.

Jaime Plazas A. Ingeniero de Alimentos, asesor comercial de COLDANZIMAS

LTDA. Por suministrar la muestra de enzima comercial para el desarrollo de la

experimentacin.

Dr . Juan Caldern Docente SENA por su asesora.

Juan Carlos Pineda, Qumico, y Luis Miguel Trivio, Tecnlogo en Alimentos,

por su amistad apoyo y confianza durante toda la carrera y en especial en el

desarrollo de este proyecto.

Freddy, Biblioteclogo, por su amistad y confianza durante toda la carrera.

A Universidad De La Salle, en especial a la Facultad de Ingeniera de Alimentos

por su apoyo durante toda la carrera, y permitir utilizar sus laboratorios y plantas

para el desarrollo de este proyecto.


7/100

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCION 12OBJETIVOS 14

1.MARCO TEORICO 15

1.1 HONGO Aspegillus Nger 151.2ENZIMAS PECTOLITICAS 171.2.1 Enzimas en la industria 191.2.2 Clarificacin de vinos con turbidez 201.3 UVA ISABELLA (TIPO Vitis labrusca) 211.3.1 Propiedades y caractersticas 221.4 PROCESO DE VINIFICACIN DEL VINO TINTO 25

2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL 282.1OBTENCION DE LA ENZIMA PECTINASA 282.1.1 Inoculacin del medio de cultivo 282.1.2 Fermentacin sumergida 282.1.3 Clarificacin del fermento 292.1.4 Purificacin del medio clarificado 302.1.5 Concentracin del medio purificado 302.2ACTIVIDAD ENZIMATICA 322.3 PROCESO DE ELABORACIN DEL MOSTO Y OBTENCIN

DEL VINO TINTO. 342.4 ANALISIS FISICOQUIMICOS 41

3. RESULTADOS Y ANALISIS DE LA EXPERIMENTACIN 483.1 OBTENCION DE LA ENZIMA PECTINASA 483.2 PROCESO DE ELABORACIN DEL MOSTO Y OBTENCIN

DEL VINO TINTO 483.2.1 Balance de materia 493.2.2 Balance de energa 54


8/100

3.3 ANALISIS FISICOQUIMICOS 553.3.1 Comportamiento del pH en el mosto 55

3.3.2 Comportamiento de slidos totales en el mosto 573.3.3 Comportamiento de extracto en el vino tinto 593.3.4 Comportamiento del ttulo Alcoholimetrico en el vino tinto 613.3.5 Comportamiento de Acidez Total en el mosto 643.3.6 Comportamiento de Acidez Voltil en el mosto 673.3.7 Comportamiento de Azcares totales y reductores 693.3.8 Clarificacin final 70

CONCLUSIONES 73

RECOMENDACIONES 75

BIBLIOGRAFIA 76

ANEXOS 78


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LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Clasificacin Botanica de la uva 22

Tabla 2 Composicin: referida a las cuatro partes orgnicas ms conocidas de la

uva 22

Tabla 3 Composicin qumica de la pulpa 23

Tabla 4 Composicin qumica del hollejo 23

Tabla 5 Composicin qumica de la semilla 24

Tabla 6 Composicin qumica del raspn 24

Tabla 7 Caractersticas fsicas de la uva Isabella 25


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LISTA DE CUADROS

Cuadro 1. Caractersticas fisicoqumicas de la enzima pectinasa aislada 33

Cuadro 2. Caractersticas enzimticas de la Enzima pectinasa aislada 33

Cuadro 3. Balance de materia desde recepcin hasta mosto pasteurizado 49

Cuadro 4. Balance de materia del ensayo 1 tratado con enzima pectinasa aislada

con baja concentracin 50


con mayor concentracin 51

Cuadro 6. Balance de materia del ensayo 3 tratado con enzima comercial. 52

Cuadro 7 Balance de materia del ensayo 4 sin tratamiento enzimtico. 53

Cuadro 8 Balance de Energa General del Proceso 54

Cuadro 9 Resultados del pH en los cuatro ensayos 56

Cuadro 10.Anlisis de varianza de la acidez pH con 95% de confiabilidad 56

Cuadro 11Resultado de los grados Brix en los cuatro ensayos 58

Cuadro 12Anlisis de varianza de Brix con 95% de confiabilidad 59

Cuadro 13 Resultados de extracto en los cuatro ensayos 60

Cuadro 14Anlisis de varianza de Extracto con 95% de confiabilidad 61

Cuadro 15Resultados del ttulo alcoholimtrico en los cuatro ensayos 63

Cuadro 16Anlisis del titulo alcoholimtrico con 95% de confiabilidad 64

Cuadro 17Resultados de la acidez total en los cuatro ensayos 65

Cuadro 18Anlisis de varianza de la acidez total con 95% de confiabilidad. 66

Cuadro 19Resultados de la acidez voltil en los cuatro ensayos 68

Cuadro 20Anlisis de varianza de la acidez voltil con 95% de confiabilidad 68


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LISTA DE FOTOS

Foto 1. Biorreactor Experimental 29

Foto 2. Medio de cultivo clarificado 29

Foto 3 y 4Liofilizacin de enzima pectinasa 31

Foto 5. Enzima en polvo 31

Foto 6. Recepcin de uva Isabella 34

Foto 7. Despalillado 35

Foto 8 -9 y 10. Macerado 36

Foto 11. Precalentamiento del mosto a 60 C. 37

Foto 12 Prensado manual del mosto 37

Foto 13. Llenado de frascos antes de la fermentacin 38

Foto 14. Acondicionamiento del mosto para adicin de Enzima 39

Foto 15. Adicin de levadura en presencia de calor para evitar contaminacin 39

Foto 16. Almacenamiento de los frascos en el laboratorio de Qumica 40

Foto 17. Preparacin de la muestra 41

Foto 18. Capsulas con extracto 42

Foto 19. Preparacin de la muestra a destilar 42

Foto 20. Destilador Marca 43

Foto 21Recuperacin del destilado 43

Foto 22. Lectura utilizando el aremetro de Gay lussac 44

Foto 23. Al realizar la titulacin se busca que la muestra llegue a un pH de 8.2 45

Foto 24. Lectura de pH utilizando el potencimetro marca BECKMAN 45

Foto 25. Solucin de felhing A, felhing B y azul de metileno 46

Foto 26. Titulacin en caliente de la solucin anterior para determinar el titulo felhing 46

Foto 27. Vino con enzima pectinasa aislada en menor concentracin 71

Foto 28. Vino con enzima pectinasa aislada en mayor concentracin 71

Foto 29. Vino con enzima comercial 72


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LISTA DE GRAFICOS

Grafica 1. Rendimiento en volumen de vino segn cada Ensayo 53

Grafica 2. Comportamiento del pH con respecto al tiempo en cada Ensayo. 55

Grafico 3. Comportamiento Brix con respecto al tiempo en cada ensayo 57

Grafico 4. Comportamiento de extracto en los diferentes ensayos 59

Grafico 5. Comportamiento del ttulo alcoholimetrico en los 4 ensayos. 62

Grafico 6. Comportamiento de Acidez Total en los cuatro e 65

Grafica 7. Grafica de comportamiento de Acidez Voltil 67

Grafica 8. Comportamiento de Azcares totales 69

Grafica 9. Comportamiento de Azcares reductores 70


13/100

INTRODUCCION

La Biotecnologa maneja organismos vivos o de sus partes para obtener diferentes

productos que se aplican en procesos industriales; como las enzimas que se

obtienen a partir de procesos biotecnolgicos para utilizarlas como aditivos en

alimentos procesados. Una de estas aplicaciones se realiza en la industria

vincola, donde se emplean las enzimas pectinasas durante la maceracin en

vinificacin de vinos tintos para facilitar la liberacin del contenido celular de labaya de uva y as, obtener un vino con ms color y rico en compuestos fenlicos.

Por consiguiente, se propuso aplicar y evaluar la enzima pectinasa obtenida en la

investigacin Produccin, purificacin y caracterizacin de la enzima pectinasa

aislada de Aspergillus nger, de la Universidad De La Salle, en clarificacin y

fermentacin del mosto de uva Vitis labruscavariedad Isabella, la cual es cultivada

en nuestro pas.

Para cumplir con el objetivo propuesto se realizaron cuatro ensayos principales: al

primer ensayo se adicion enzima aislada en una concentracin de 0,16gr/5l de

mosto, al segundo ensayo se le agreg enzima aislada en una concentracin de

0,26 gr/5l de mosto; estos dos ensayos se compararon con un tercer ensayo con

enzima comercial ULTRAZIM AFP en una concentracin de 0,4 ml /5l de mosto

y, un ltimo ensayo sin tratamiento enzimtico. Durante todo el proceso tanto de

clarificacin como de fermentacin se control por medio de anlisis

fisicoqumicos el contenido de slidos, pH, contenido alcohlico expresado Grados

Gay Lussac GL, Acidez Total, Acidez Voltil y contenido de Azcares Totales.

12


14/100

Finalmente, se obtuvo un vino tinto con las siguientes caractersticas

fisicoqumicas: pH entre 2.86 y 3.4; extracto entre 1 y 3 g/100 ml; GL finales entre

10.8 y 12.6; Acidez Total entre 22 y 24 g/l expresado en Acido tartrico; Acidez

voltil entre 0.0015 y 0.0040 g/l expresado en Acido Actico y un contenido de

Azucares totales finales entre 6 y 8%. valores que siempre estuvieron dentro de

los parmetros segn el DIARIO OFICIAL DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS.

Reglamento (CEE) N 2676 /90 de la Comisin de 17 de Septiembre de 1990 por

el que se determinan los mtodos de anlisis comunitarios aplicables en el sector

del vino y NTC 1740 BEBIDAS ALCOHOLICAS, VINOS LICOROSOS O GENEROSOS.

En conclusin, el uso de enzimas en enologa es importante porque se obtienen

vinos con un alto rendimiento final en volumen y con caractersticas organolpticas

que conducen a un producto de excelente calidad.

13


15/100

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la aplicacin de enzima pectinasa aislada del hongo Aspergillus niger

durante el proceso de clarificacin y fermentacindel mosto de uva Vitis labrusca

variedad Isabella para la obtencin de vino tinto.

Objetivos Especficos

Obtener la enzima pectinasa a partir de la fermentacin sumergida conAspergillus niger con las variables y el procedimiento definido en estudios

previos realizados en el Biorreactor del Laboratorio de Biotecnologa.1

Disear la experimentacin de la preparacin del mosto de vino tinto elaborado

con uva variedad Isabella tipo Vitis labrusca,en el Laboratorio de Qumica para

la aplicacin de la enzima pectinasa aislada la cual se comparar frente a una

enzima comercial.

Analizar el comportamiento de la enzima por medio de pruebas analticas

realizadas durante el proceso y al final del mismo segn las normas de la

AOAC Official Method930 VINOS.

Establecer las variables y las condiciones de la clarificacin y de la

fermentacin del mosto de vino tinto a partir de los balances de materia y

energa.

1 PRIETO,Lena y GREVECHOVA, Renata. Produccin, purificacin y caracterizacin de la enzima

pectinasa aislada de Aspergillus nger y Aspergillus foetidus. Investigacin Ingeniera de Alimentos

Universidad de la Salle.2006.

14


16/100

1. MARCO TEORICO

En este captulo se presentan las generalidades del hongo Aspergillus niger

productor de enzimas pectolticas, y se muestra el uso de esta enzima en la

industria en general; adems, se complementa el marco terico con informacin

de la uva Isabella, principal materia prima de este trabajo de grado para la

produccin de vinos tintos.

1.1 HONGOAspegi llus niger

A continuacin se describen las caractersticas de un hongo que tiene importancia

en la industria, principalmente de la alimentacin. El hongo Aspergillus niger

(figura 1) pertenece a la clase Deuteromicetoses decir que carecen de esporas

sexuales. Al orden Moniliales lo cual indica que presentan micelio claro y sin

coloracin o con un coloreado dbil. El gneroAspergilluses abundante. Muchos

de ellos son los responsables de ciertas alteraciones alimenticias y otros tiles en

la preparacin de algunos alimentos. Raper y Fennell han sealado la existencia

de 14 grupos y reconoces 132 especies pero solo describir al grupo nger2.

El grupo delAspergillus nger, que es la especie ms importante del mismo est

muy expandido, pudiendo ser de inters en los alimentos por sus diversasaplicaciones en la industria alimentaria.

2FRAZIER, W. Microbiologa de los alimentos. Acribia. Zaragoza. 1976, p 26-27.

15


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Figura 1. Microfotografia deAspergillusn niger. Aumentada unas 200 veces.

Las cabezuelas en las que se encuentran las esporas son grandes, muy apretadas

y globulares, de color negro, castao-negruzco o castao-prpura; los conidios

son rugosos, con bandas pigmentadas. Muchas variedades tienen esclerocios de

un color que va de ocre a a gris o negrusco.

Ciertas variedades seleccionadas se emplean industrialmente para la produccin

de cido ctrico, cidos glucnicos y diversas enzimas3

.

Los caracteres que distinguen a losAspergillusson:

Septados, de micelio ramificado, generalmente sin colorear; las partes

sumergidas son vegetativas y las areas, en su mayor parte frtiles.

Colonias a menudo presentando zonas circulares

El conidiforo o pedculo, septado o no, surge de una clula basal (figura 2),

que es una clula micelial especial, agrandada y rodeada de una gruesa

cubierta. El conidiforo, es la porcin distal, se hincha formando una vescula

que sirve de soporte a los esterigmas de los que se desprenden los conidios.

3Ibid p. 27

16


18/100

Figura 2. Diagrama de un hongoAspergillus

Esterigmas o filides sencillos o compuestos y coloreados o incoloros.

Conidias en cadenas de color generalmente verde, marrn o negro, tambin

pueden presentar otras coloraciones.

Algunas especies crecen bien a temperaturas de 37 C o superiores4.

1.2 ENZIMAS PECTOLITICAS

Se han descubierto varias enzimas que catalizan las diversas etapas de la

degradacin de la pectina: la pectina esterasa (PE) cataliza la eliminacin

hidroltica de los grupos metoxilo (saponificacin) de la molcula de pectina.

(Sinnimos: pectasa, pectinmetoxilasa, pectinmetilesterasa.) Esta enzima nosiempre se encuentra presente en las frutas ricas en pectina. Mientras que los

tomates y todas las frutas ctricas contienen PE en abundancia; no se ha

encontrado esta enzima en la remolacha o en las zanahorias, y se la encuentra

4Ibid p. 26

17


19/100

solamente en unas pocas variedades de manzanas. La mayora de los hongos

contienen apreciables cantidades de Pectina esterasa; hasta ahora no se ha

encontrado este tipo de pectina en las levaduras. La actividad ptima de la pectina

se produce a un pH 7.5 y su accin es muy especfica: requiere la presencia en el

sustrato de un grupo carboxilo libre junto al grupo metoxilo que va a ser

saponificado.

La poligalacturonasa (PG) cataliza la hidrlisis de la unin glucosdica entre las

unidades de cido galacturnico. Tambin recibe el nombre de pectinasa,

pectosaza, poligalacturonidasa, pectina despolimerasa.En aos recientes varios

investigadores han demostrado la existencia de varios tipos diferentes de enzimas

despolimerizadoras de pectina. Algunas provocan una veloz disminucin en laviscosidad de las soluciones de pectina sin un considerable aumento de los

grupos reductores. Estas enzimas licuantes atacan las molculas al azar,

rompindoles en cadenas ms cortas. Dado que el sitio del ataque se halla en el

seno de la cadena, estas reciben tambin el nombre de endo-PG.

Otros preparados de enzimas, PG sacarificantes o exo-PG, cortaran

preferentemente unidades terminales de cido galacturnico, aumentando la

concentracin de grupos reductores antes que haya una disminucin sustancial de

la viscosidad5.

Las pectinas despolimerasas pueden tambin diferir en su especificidad con

respecto al estado de metoxilacin alrededor del punto de ataque. Las

despolimerasas ms comunes de origen vegetal rompen las uniones glucosdicas

entre dos uniones no esterificadas. Su sustrato es el cido poligalacturnico, y la

denominacin de poligalacturonasa (PG) es la ms apropiada para este tipo de

enzima. La PG es inactiva con los polmeros completamente metoxilados. Sin

embargo en presencia de PE, que es capaz de desmetoxilar la pectina, la PG

puede romper todas las uniones de la cadena y producir cido galacturnico libre.

5Braverman, J.B.S. Bioqumica de los Alimentos. El Manual Moderno S.A. Mxico.1980.p 149-150

18


20/100

Por otro lado, un grupo de despolimerasas de origen fngico ataca

preferentemente a las pectinas con alto grado de motoxilacin. Estas enzimas

reciben el nombre de polimetilgalacturonasas. Phaff y Demain presentaron un

resumen de los distintos tipos de enzimas hidrolticas capaces de despolimerizar

pectinas, as como una sugerencia en cuanto a un sistema de nomenclatura. Los

autores tambin sealan que la endopoligalacturonasa de la levadura es una sola

enzima. Se ha demostrado la presencia de, al menos dos tipos de

poligalacturonasas en el tomate.

Casi todos los hongos contienen el espectro total de las enzimas pectolticas. Esto

puede observarse fcilmente en distintos fenmenos naturales, por ejemplo

cuando un tejido vegetal se desintegra totalmente y se deshace cuando lo atacanhongos; una fruta que recibe el ataque de Penicillium glaucum, terminar por

desintegrarse completamente, ya que la pectina que ha mantenido unidas a las

clulas del fruto habr sido convertida por las enzimas del hongo en cidos

pcticos que no tiene la capacidad de ligamento.

Un fenmeno similar puede observarse en la fermentacin de las hojas de tabaco

o de los granos de caf. La pectina transeliminasa (PTE) tambin cataliza la

despolimerizacin de la pectina. Sin embargo, a diferencia de la PG, la PTE no

hidroliza la unin glucosdica, sino que la elimina sin el agregado de una molcula

de agua6.

1.2.1 Enzimas en la industria. Las pectinasas obtenidas a partir de extractos

vegetales o de mohos se utilizan en las industrias alimenticias para la clarificacin

de jugos de frutas, vinos, vinagres jarabes y gelatinas que contienen sustancias

pcticas en suspensin. El tratamiento de los jugos de frutas con pectinasas evitasu gelificacin en la fase de concentracin. La adicin de pectinasas a frutas

maceradas (uvas por ejemplo) ayuda a la extraccin del jugo y da vinos de fcil

clarificacin. La desesterificacin parcial por medio de pectin esterasa para liberar

6Ibid. Pag 150-151

19


21/100

pectinas modificadas que sedimentan lentamente, se emplea en la manufactura de

gelatinas dulces de contenido azucarado elevado.7

1.2.2 Clarificacin de vinos con turbidez. Los fabricantes de jugos de fruta se

enfrentan a menudo con dos problemas. En primer lugar es importante clarificar,es decir, eliminar las partculas suspendidas de productos tales como el Vino y el

jugo de manzana clarificado. En segundo lugar hay casos en los que conviene

retener el aspecto turbio del producto y evitar esa separacin (jugos ctricos,

productos del tomate, algunas bebidas sin alcohol). Ambos problemas se vinculan

estrechamente a las sustancias pcticas y a las enzimas pectolticas.

Los jugos turbios consisten en una suspensin de partculas muy finas (a menudomenos de una micra de dimetro) en un medio transparente (suero). La

composicin qumica las propiedades fsicas tanto de la porcin de partculas

como del suero pueden variar considerablemente de una fruta a otra y cada

sistema debe de estudiarse separadamente.

Uno de los factores estabilizantes en los jugos turbios puede ser la carga

electrosttica de las partculas suspendidas. La turbidez del jugo de naranja se

encuentra cargada negativamente8.

El sitio de la carga negativa se cree que est localizado en los carboxilos libres de

la pectina presente en la superficie de las partculas (Mizrani y Berck). Deuel y sus

colaboradores aprovecharon el hecho de que tales coloides con carga negativa

forman complejos insolubles con otros poli electrolitos de signo contrario,

precipitando fcilmente. De acuerdo con esto, sugirieron el empleo de

polietilenamina para la clarificacin de los vinos y jugos turbios. El precipitado asformado pronto sedimentar, arrastrando consigo todo el material suspendido, as

como tambin los taninos, los cuales pueden ser adsorbidos sobre molculas de

gran tamao como stas.

7FRAZIER, W. Microbiologa de los alimentos. Acribia. Zaragoza. 1976, p. 416.8Ibd. p. 156.

20


22/100

Otro mtodo para lograr efectos similares consiste en el tratamiento de los lquidos

turbios con preparados comerciales de enzimas pectolticas, tales como el

pectinol. Estos preparados se obtienen generalmente a partir de hongos y

contienen PE y endo-PG. Sin embargo, cuando se requiere lo contrario, es decir

una turbidez estable, se torna entonces necesario evitar, en la medida de lo

posible, la desesterificacin de la pectina. Los jugos ctricos deben de tratarse

trmicamente tan pronto como sea posible luego de su extraccin a fin de inactivar

la PE y evitar la clarificacin. En el caso del jugo de tomate, las enzimas

pectolticas actan tan velozmente que se produce la destruccin de la estructura

coloidal, a menos de que la fruta sea calentada rpidamente antes o durante la

trituracin (rotura en caliente).

No se conoce el mecanismo de clarificacin utilizado por las enzimas pectolticas.

Resulta interesante notar que la PE por s sola es responsable de la clarificacin

de los jugos ctricos, ya que ste material no exhibe actividad de

poligalacturonasa 9.

1.3 UVA ISABELLA (TIPO Vitis labrusca)

El cultivo de la uva isabella tom fuerza en la dcada de los 50, y actualmente el

centro del Valle del Cauca cuenta con 500 hectreas, concentradas en los

municipios de Ginebra, el Cerrito y Guacar, el 75% de la produccin se destina al

mercado fresco y el 25% restante para la agroindustria.

El rea sembrada de uva isabella en el municipio de Ginebra es de 350 hectreas,

lo cual corresponde a un 70% del rea total (500 hectreas) existente en el centro

del Valle del Cauca. En esta rea participan 250 viticultores (pequeos y

medianos).

9Ibd. p. 157

21


23/100

A continuacin se presenta una breve descripcin del la uva variedad Isabel tipo

Vitis labrusca con las caractersticas y propiedades ms importantes.

1.3.1 Propiedades y caractersticas. Es una planta cuya clasificacin botnica

presenta los datos de las tablas 1 y 2.

Tabla 1. Clasificacin Botnica de la uva.

DIVISION NOMBRES

FAMILIA AMPELIDCEAS

GNERO VITIS

ORDEN RANIDAS

SUBCLASE DIAPTALAS

CLASE DICOLTILEDNEAS

TIPO ANGIOSPERMAS Y

FANERGAMAS

Fuente: DUARTE M., Alvaro Fundamentos de Enologa 1994.

Tabla 2. Composicin: Referida a las cuatro partes orgnicas ms conocidas.

SEGN GARCIA SEGN SEGN

DE SALMOS KEHIG VINKLER

% % %

PULPA 83 83,5 83,5

HOLLEJO 8 9,5 8,5

PEPITAS 4 3,5 4

RASPON 5 3,5 4

Fuente: NOGUERA PUJOL, Jos. Enotecnia Industrial.

La pulpa corresponde del 82 al 88 % del peso total del racimo; es de gran

importancia ya que despus del estrujado, en el proceso de vendimia se obtiene el

zumo.

22


24/100

A continuacin se presenta en la tabla 3, 4, 5 y 6 los datos ms importantes de la

composicin qumica de la pulpa, el hollejo, la semilla y el raspn.

Tabla 3. Composicin qumica de la pulpa

Fuente: NOGUERA PUJOL, Jos. Enotecnia Industrial

COMPONENTES %

Agua 78

Azcares 20

Acidos Orgnicos 1,5

Acidos libres 0,25

Minerales 0,2Aceites Esenciales

Sustancias Albuminoides 0,05

Sustancias Musilaginosas

Sustancias Amilaceas

100

Hollejo: Es de gran importancia durante el proceso vegetativo del fruto, ya que

sirve como protector.

Tabla 4. Composicin qumica del hollejo:

COMPONENTES %

Agua 64 a 78

Tanino 0,15 a 4,23

cidos Libres 1 a 1,30Minerales 1 a 2

Bitartrato de Potasio 0 a 1


23


25/100

Semillas o Pepitas: Su nmero en el grano de uva vara de 0 a 4. En el proceso de

vendimia es el material slido que presenta mayor contenido de tanino. De all la

importancia de separarla del mosto en el proceso de fermentacin para la

obtencin de vino ya que puede generar sabor astringente al producto final.

Tabla 5. Composicin qumica de la semilla.

COMPONENTES %

Agua 27 a 38

Grasas 4 a10

Taninos 0,30 a 6,80

Acidos Voltiles 0,50 a 1,0

Materia Resinosa 1,30 a 6,60

Minerales 1,30 a 2,00


Raspn: tambin recibe el nombre de escobajo, forma el racimo de uva y soporta

el fruto, desempea un papel importante como canal de alimentacin entre las

hojas y el fruto por una parte y entre las races y el fruto por otra.

Tabla 6. Composicin qumica del raspn.

COMPONENTES %

Agua 40 a 80

Taninos 1 a 3

cidos Libres 0,25 a 1,20

Materia Resinosa 0,70 a 1,80

Minerales 1 a 4

Cremor trtaro 0,4 a 1,25


24


26/100

Caractersticas de la uva: el laboratorio de investigacin sobre la qumica del

caf (LIQC) determin en el ao 1993 las caractersticas del tamao y peso de las

partes de la uva. A continuacin se presenta en la Tabla 7 una breve descripcin

de dichos estudios.10

Tabla 7. Caractersticas fsicas de la uva Isabella

VARIEDAD PARTES TAMAO PESO VOLUMEN DENSIDAD VISCOSIDAD TENSION

SUPERFICIAL

mm x

mm

g ml kg/m3 Centipoises Dinas/cm

Isabella 25 x 22 7,32 7,7 948,05 5,36 50,38

Fruto 15 X 11 6,5

Semilla 3,7 X 7,2 0,423

Raspn 2,1 X 1,4 1,56


1.4 PROCESO DE VINIFICACIN DEL VINO TINTO

En los vinos tintos, el mosto se hace fermentar en presencia de las partes slidas

de la uva, como el hollejo, la pulpa y las semillas. A continuacin se describe el

proceso a realizar para la obtencin de Vino tinto.

Estrujado: Es una operacin mecnica que consiste en romper el hollejo de los

granos de uva para que libere el mayor contenido de jugo. Esta operacin se

realiza mediante mquinas llamadas estrujadoras o pisadoras.

10 Datos referidos de QUINTERO SOLANO, Edward. Tesis Caracterizacin del zumo de uva (variedad

Isabella) tipo (vitis labrusca) cultivada en Colombia para la industria vincola.

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27/100

Derrasponado: Consiste en separar los granos de uva de la parte herbcea del

racimo, como es el raspn o escobajo ya que su presencia en el mosto no es

aconsejable.

Sulfatado: el sulfuroso acta como antioxidante, antisptico, fija la acidez,

disuelve la materia colorante, es un estimulante de las levaduras y hace una

funcin inhibidora contra las bacterias. Segn la forma de utilizacin del sulfuroso

depende la correcta conservacin del vino.

Fermentacin Maceracin: Para elaborar el vino tinto, el mosto se deja en

contacto con la pulpa, el hollejo y las pepitas o semilla. Aqu se realizan dos

procesos simultneos. La fermentacin, realizada por las levaduras, quetransformarn el azcar del mosto en el alcohol del vino, ms numerosos

componentes por un lado. Y por otro, el proceso de maceracin, en donde el jugo

de la uva o mosto, estar en contacto con las partes slidas del grano, como el

hollejo y la semilla, que le aportarn el color y los taninos del futuro vino. El tiempo

en que este fenmeno ocurra, depender del tipo de vino tinto que se desee

obtener.

Fermentacin Malolctica: entre los constituyentes de la uva, se encuentran

principalmente tres cidos orgnicos: el cido tartrico, el cido mlico y el cido

ctrico. Este ltimo desaparece rpidamente durante el proceso de fermentacin

alcohlica. El cido mlico es de suma importancia biolgica para el vino. En

primer lugar, durante la fermentacin alcohlica es transformado por las levaduras

y ciertas bacterias llamadas lcticas, en cido lctico. Pero terminada la

fermentacin alcohlica, estas bacterias que suceden a las levaduras alcohlicas

efectan lo que se conoce como segunda fermentacin o fermentacin

secundaria, en que el cido mlico es transformado en cido lctico. Este es de

constitucin suave y agradable. Mientras el cido tartrico, el ms estable de los

tres, pasa a formar el verdadero constituyente cido de los vinos.

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Trasiego: En los vinos nuevos se produce una clarificacin espontnea. Esto

implica que los sedimentos se depositan en le fondo de la vasija formando las

llamadas borras o sedimentos. No es aconsejable que los vinos estn mucho

tiempo sobre ellas, por lo que se realizan los trasiegos. Esta operacin consiste en

sacar los vinos que se encuentran sobre borras y pasarlos a una vasija

completamente limpia. En el pasaje se debe tener la precaucin de no arrastrar los

sedimentos.

Clarificacin: Operacin que consiste en agregar al vino una sustancia de

naturaleza coloidal puede ser de tipo vegetal o animal, stas sustancias arrastran

hacia el fondo de la vasija aquellos elementos en suspensin no deseados en el

vino.

Crianza: Los vinos tintos, pueden ser jvenes, cuyas caractersticas

sobresalientes, son la frescura y el frutado. Son los llamados vinos tintos jvenes.

Los grandes vinos tintos o clsicos, son aquellos que han sido sometidos a un

proceso de crianza, que consiste en estacionar los vinos, sobre todo en vasijas de

madera preferiblemente hechas a base de roble , donde, despus de la

fermentacin malolctica se presentan una serie de cambios fsico qumicos,

notablemente complejos, para llegar a lo que se conoce como envejecimiento o

aejamiento del vino, en donde ste se enriquece sobre todo en compuestos

aromticos los cuales dan el llamado buquet y a la vez estabilizan el color del

vino.

Embotellado: El proceso de crianza culmina con el embotellado, el cual se

efecta cuando el productor estima que la crianza del vino ha alcanzado su

perfeccin.11

11Fragmento tomado de la pagina www.lacavadebolotin.com.ar/elaboracion_vino_tinto.htm. Junio 15 de

2006.

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2. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

En este captulo se presenta la metodologa que se utiliz durante la evaluacin de

la enzima pectinasa aislada de Aspergillus nigery de una enzima comercial para

clarificacin de mosto de uva Isabella en la obtencin de vino tinto.

2.1 OBTENCION DE LA ENZIMA PECTINASA

Para la obtencin de la enzima pectinasa se realiz fermentacin sumergida y se

sigui el procedimiento12 establecido en la Universidad De La Salle. A

continuacin se presentan los pasos que se siguieron.

2.1.1 Inoculacin del medio de cultivo . El medio de cultivo experimental

empleado en el Laboratorio de Biotecnologa contena: pectina ctrica (2.0%),

salvado de trigo (1.0%), casena (1.0%), extracto de levadura (0.5%) y sales de

potasio y agua (resto del porcentaje); el cual se inocul con Aspergillus niger.resembrado con anterioridad a 30 C en la incubadora del laboratorio de Qumica

durante 96 horas. La inoculacin se realiz con una suspensin de conidias en

agua destilada con Tween-80 (0.01%).

2.1.2 Fermentacin sumergida. La fermentacin se realiz en un biorreactor

experimental construido con una cantina con capacidad de 10 L, la cual fue

sellada y se le adapt un motor facilitando la mezcla del medio durante la

fermentacin, y garantiz la obtencin de la enzima pectinasa.

12 PRIETO,Lena y GREVECHOVA, Renata. Produccin, purificacin y caracterizacin de la enzima

pectinasa aislada de Aspergillus nger y Aspergillus foetidus. Investigacin Ingeniera de AlimentosUniversidad de la Salle.2006.

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Se adaptaron al biorreactor experimental varias mangueras, por una de

ellas se permiti la salida de CO2en agua; y en otra manguera se tomaron

muestras del fermento para verificar valores de pH (Foto 1)13.

Foto 1. Biorreactor Experimental

2.1.3 Clarificacin del fermento. Para esta operacin se filtr el medio de

cultivo y despus se centrifug a 3000 revoluciones/min durante 20 min. En

la foto 2 se observa el medio de cultivo despus de ser centrifugado.

Foto 2. Medio de cultivo clarificado

13Beltran, Andrea et al. Idea original del grupo que desarrollo la tesis titulada Evaluacin de la Aplicacin

de la enzima pectinasa obtenida a partir deAsperguillus nger en el proceso de produccin de pulpa de Araz

(Eugenia stipitata sororia) concentrada al vaco.

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2.1.4 Purificacin del medio clarificado. Esta operacin se realiz segn la

metodologa de Grebechova y Prieto14. A continuacin se describe dicha

metodologa.

Se prepara una solucin madre de CaCl2H2O al 30%(P/V) y Na2HPO4.12H2O al

27% (P/V). Primero se adiciona lentamente a la solucin anterior, la solucin de cloruro de

calcio y luego la de fosfato cido de sodio, en cantidades suficientes paralograr una concentracin final del 5 % (P/V) del primero y 4.5% (P/V) delsegundo.

Se ajusta el pH en 4.5 con HCL 0.1 N Se agita por 1 hora a temperatura ambiente y por 2 horas en refrigeracin,

luego se deja en refrigeracin durante la noche. Se realiza separacin del gel fosfato de calcio centrifugando la solucin

anterior a 2000 revoluciones/min durante 15 min recuperando luego el lquidosobrenadante.

2.1.5 Concentracin del medio purificado . Se realiz sobre el lquido tratado

con fosfatos de calcio con la metodologa propuesta por Grebechova y Prieto15.

Se Mezcla un volumen de lquido purificado con fosfato de calcio con 3volmenes de etanol comercial al 96% lentamente, en fro (4C) (para ello secolocan los frascos que contengan la solucin en una cubeta con hielo paraque estn a la misma temperatura del etanol que se est adicionando).

Se agita completamente y luego se deja en reposo durante la noche a 4C. Se recupera el precipitado por centrifugacin a 2000 revoluciones/min durante

15 minutos. Este precipitado se seca adicionando pequeas cantidades de etanol.

Por ltimo se liofiliza el precipitado.

En las fotos 3 y 4 se observa el proceso de liofilizado de la enzima pectinasa en el

Liofilizador marca Labconco del Laboratorio de Biotecnologa, Sede Floresta. En la

foto 5 se muestra el producto obtenido en presentacin de polvo.

14El procedimiento fu estandarizado en la investigacin Produccin, purificacin y caracterizacin de la

enzima pectinasa aislada deAspergillus nger yAspergillus foetidus desarrollada por la Profesora Lena

Prieto Ing. Qumica y la Dra. Renata Grebechova Phd DSc.15Ibid

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Fotos 3 y 4Liofilizacin de enzima pectinasa

Foto 5. Enzima en polvo.

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2.2 ACTIVIDAD ENZIMATICA

Para determinar la actividad enzimtica de la enzima obtenida se realiz la pruebaexperimental de Gracheva descrita por Grebechova y Prieto16, la cual consiste en

medir la reduccin de viscosidad de la enzima pectinasa en un viscosmetro de

vidrio Cannon. Para la prueba se mezcl 100 ml de solucin de pectina al 2%, 2 ml

buffer acetato con pH 4.5 y 2 g de la enzima obtenida. Se incub a 35 C por 30

minutos y la enzima se inactiv en un bao a ebullicin por 5 minutos; se dejo

enfriar y se determin el tiempo de cada en el viscosmetro de vidrio.

El porcentaje de cambio de viscosidad se calcul de acuerdo con la ecuacin de

Roboz17:

V= (tc te) X 100

(tc-ta)

Donde:

tc = tiempo de control (pectina + agua, seg.)

te = Tiempo de prueba(+ enzima despus de pectolisis, .seg. )

ta = Tiempo de agua en segundos seg.

16 Ibid Ecuacin tomada de la investigacin Produccin, purificacin y caracterizacin de la enzima

pectinasa aislada de Aspergillus nger yAspergillus foetidus desarrollada por la Profesora Lena Prieto Ing.Qumica y la Dra. Renata Grebechova Phd DSc. pag 3517Ibid pag 35

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La enzima pectinasa aislada en el Laboratorio de Biotecnologa present las

caractersticas fisicoqumicas y enzimticas18que se presentan a continuacin en

los cuadros 1 y 2.

Cuadro 1. Caractersticas fisicoqumicas de la enzima pectinasa aislada

Propiedades Caractersticas

fisicoqumicas

Aspecto Polvo

Humedad % 12 a 13

Color Gris o Blanco

Sabor Caracterstico

Solubilidad en agua Buena

Conidias de hongos No existen

Cuadro 2. Caractersticas enzimticas de la enzima pectinasa aislada

Propiedades CaractersticasEnzimticas

Cantidad de preparadoenzimtico g/l

3.8

pH ptimo 4.5 5.5

Temperatura ptima C 30 40

Actividad de endo-PMGunidades/g

1927

Actividad de PE unidades /g 5.3

Actividad de PMGLunidades/g

0

18Datos presentados en la investigacin Produccin, purificacin y caracterizacin de la enzima pectinasa

aislada deAspergillus nger yAspergillus foetidus desarrollada por la Profesora Lena Prieto Ing. Qumica y

la Dra. Renata Grebechova Phd DSc.

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2.3 PROCESO DE ELABORACIN DEL MOSTO Y OBTENCIN DEL VINO

TINTO

Los pasos que se siguieron para la preparacin del mosto de uva Isabella y de su

fermentacin con enzima pectinasa obtenida y comercial, se describe a

continuacin.

Recepcin de materia prima. La uva utilizada se adquiri en CORABASTOS

(Cooperativa de Abastos) de Bogot donde se encontr distribuidores de uva

del Departamento del Valle del Cauca, marca LA VIA, y se compraron 5 cajas

con un contenido de 12,5 kg de uva cada una. En la foto 6 se presenta lacalidad de uva empleada.

Foto 6. Recepcin de uva Isabella.

Lavado: el lavado de la uva se realiz por inmersin en agua fra con jabn

biodegradable en una concentracin de 200 ppm en 12 litros de agua, para

retirar las impurezas como tierra u otras suciedades que se encontraron enla uva.

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Despalillado: Con esta operacin mecnica se retira el raspn para evitar

posteriores sabores herbceos. Esta operacin se hizo manualmente,

separando la uva del raspn o palillo para evitar el sabor astringente y

amargo debido a los taninos (componente del raspn). Ver foto 7.

Foto 7. Despalillado

Lavado (2): se realizo un nuevo lavado nicamente con agua para retirar

residuos de palillo que hayan quedado. Colocando la uva sin palillo sobre

canastas de plstico.

Macerado: Este proceso se llev a cabo manualmente, utilizando guantes

quirrgicos para evitar contaminacin por manipulacin. Consisti en

exprimir y a la vez estrujar la uva para obtener la mayor cantidad de jugo y

a la vez permitir que quedara expuesta la mayor parte de la uva para luego

aplicar la enzima y obtener un mejor producto. El producto que se obtuvo

en este proceso se denomina mosto y consta de uva pepitas y orujo.

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En las fotos 8-9 y 10 es posible apreciar las caractersticas de color que

presenta el mosto al ser macerado.

Foto 8-9-10.Macerado

Precalentamiento del mosto: El producto de este macerado, es decir el

mosto fue sometido a un calentamiento a una temperatura de 60C con el

fin de inhibir microorganismos, para sta operacin se utiliz la marmita (ver

foto 11) ubicada en la planta de frutas sede floresta. Este calentamiento

ayuda a mejorar tambin las caractersticas organolpticas del mosto sobre

todo en la fijacin de color. Despus de este calentamiento el mosto se deja

enfriar.19

19CALDERON,Juan. Docente Sena. Comunicacin personal Procedimiento sugerido. Octubre 26 de 2006.

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Foto 11.Precalentamiento del mosto a 60 C.

Prensado. En este proceso se separ el orujo y las pepitas utilizando un

colador de la siguiente manera: se coloc el mosto sobre un colador de plstico

y se hizo una fuerte presin sobre l con la mano (ver foto 12) (utilizando

guantes quirrgicos) o con un utensilio como una cuchara de madera. Es

importante que el mosto no entre en contacto con ningn metal ya que puede

daarse. De esta forma se obtuvo la mayor cantidad de pulpa separndola de

las pepitas y el orujo.

Foto. 12.Prensado manual del mosto.

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Llenado de Recipientes: El mosto obtenido se coloco en 15 frascos de

vidrio cada uno con una capacidad de 5 litros (ver foto 13). Los frascos

fueron previamente esterilizados en autoclave a 20 psi de Presin durante 5

min. A la tapa de cada uno de los frascos se les abri un pequeo orificio al

cual se conect una manguera de ltex (previamente esterilizada) para

facilitar la respiracin del frasco durante la fermentacin. Cada uno de los

frascos fue llenado equitativamente con la misma cantidad de mosto y

fueron marcados y separados en 4 grupos o ensayos.

Foto 13.Llenado de frascos antes de la fermentacin

Ad ic in de Enzima: para la adicin de enzima se acondicion el mosto en

cada uno de los frascos a la temperatura ptima a la cual cada una de las

enzimas empleadas tiene su mejor actividad. Es decir: Enzima Comercial

ULTRAZIM AFP a 45 C y Enzima aislada a 35 C segn fichas tcnicas

de cada una de las enzimas (Anexo A y B)20. La adicin a cada frasco se

realiz frente a calor de mechero para evitar contaminacin tanto de la

enzima como al frasco. Los frascos fueron acondicionados a las

temperaturas mencionadas anteriormente, en las incubadoras del

laboratorio de qumica (ver foto 14) y Biotecnologa para garantizar su

ptimo calentamiento.

20Datos referidos de las fichas tcnicas de la enzima Comercial y la Enzima aislada en el Laboratorio de

Biotecnologa .

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La enzima estuvo en contacto con el mosto por un periodo de 12 horas 21,

despus el mosto fue sometido a calentamiento a 65 C, temperatura a la cual

se inactiva la enzima.

Foto 14.Acondicionamiento del mosto para adicin de Enzima.

Ad ic in de Levadura: se utiliz levadura marca Uvaferm CK, segn la

concentracin sugerida en la ficha tcnica suministrada por la empresa

COLDANZIMAS LTDA (Anexo B). La adicin de levadura se realiz a cada

frasco cerca al mechero para evitar as contaminacin al momento de la

adicin, como se observa en la foto 15.

Foto 15.Adicin de levadura en presencia de calor para evitar contaminacin

21Dra. Renata Grevechova, Comunicacin personal Octubre 26 de 2006.

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Ad ic in de azcar:para la adicin de azcar se utiliz la siguiente frmula

la cual segn los grados alcohlicos deseados en el vino se obtiene un

aproximado de la cantidad de azcar necesaria sabiendo que 17 g de

azcar producen 1 de alcohol. La cantidad de azcar fue adicionada en

tres partes durante los 25 das que dur la fermentacin.

AZUCAR ( g.) = 17 g/l ( 1 G.L) l.

Fermentacin: El proceso de fermentacin se realiz en el laboratorio de

qumica a temperatura ambiente dicha temperatura estuvo entre 19 C y 21

C. Los frascos fueron almacenados en lokers de madera del laboratorio de

qumica como se observa en la foto 16 el tiempo de fermentacin fue de 36

das, tiempo en el cual el vino alcanz 12 GL (corregidos).

Foto 16. Almacenamiento de los frascos en el laboratorio de Qumica.

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2.4 ANALISIS FISICOQUIMICOS

A continuacin se describe el procedimiento utilizado para realizar los anlisis

fisicoqumicos durante el proceso de clarificacin y fermentacin del mosto para la

obtencin de vino tinto.

Preparacin de la muestra: se toman 150 ml de muestra en vasos de

precipitados de 400 ml filtrando con gasa para limpiar la muestra, como se

observa en la foto 17.

Foto 17.Preparacin de la muestra

Determinacin del extracto por mtodo directo: se tomaron 50 ml de

muestra de vino sin desgasificar en cpsulas de porcelana, previamente

taradas y pesadas. Las cpsulas fueron llevadas a estufa para evaporacin

a una temperatura de 100 C. cuando se haya evaporado totalmente la

muestra se retiran de la estufa (ver foto 18), se dejan enfriar y se pesan las

cpsulas nuevamente. Se calcula el extracto por diferencia de peso y se

expresa g/100ml.

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Foto 18.Capsulas con extracto

Determinacin del ttulo alcoholimtrico : se miden 100 ml de muestra en

un matraz aforado de 100 ml, se toma la temperatura de la muestra. Se

transvasa la muestra a un tubo de destilacin al cual se le ha agregado 10

ml de lechada de cal. Se lleva al destilador y se recoge el destilado en el

mismo matraz en el cual se midi la muestra inicialmente agregando 10ml

de agua destilada en la que se sumerge el tubo (prolongacin) del

refrigerante que lleva el destilado (el matraz se debe lavar previamente con

5ml de agua destilada 4 veces. En la foto 19 se observa la preparacin de

la muestra.

Foto 19. Preparacin de la muestra a destilar.

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El proceso de destilacin utilizando el destilador ubicado en el laboratorio de

qumica sede floresta y la recuperacin del destilado en el matraz aforado se

pueden observar en la foto 20 y 21.

Foto 20. Destilador Marca BUSHI.

Foto 21. Recuperacin del destilado

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El titulo alcoholimtrico se determin utilizando el alcoholmetro de Gay

Lussac, colocando el destilado en una probeta de 100 ml, se toma la

temperatura del destilado, se sumerge el aremetro de Gay Lussac y se

toma la lectura (ver foto 22). La lectura se realiz por triplicado.

Foto 22.Lectura utilizando el aremetro de Gay lussac.

Determinacin de acidez total: se tom una alcuota de 5 ml por ser color

vino tinto, se coloc la muestra en un beaker de 400 ml, se agregan 200 ml

de agua destilada, 4 gotas de fenoftaleina al 1 % en etanol y se titula con

hidrxido de sodio 0.01 N (0.1 N) hasta que el color rosa plido

permanezca. Debido al color vino tino de la muestra era complicado

determinar el color rosa por lo cual se determino por cambio en el pH de la

muestra hasta un pH, neutro all cambia a un color mas claro (ver foto 23).

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Foto 23.Al realizar la titulacin se busca que la muestra llegue a un pH cercano a 8.2.

Determinacin de acidez voltil por titulacin : se toma una alcuota de10 ml del destilado obtenido anteriormente, se coloca en un erlermeyer de

250 ml, se agrega n 50 ml de agua destilada, se adiciona 3 gotas de

fenoftaleina al 1% en etanol. Se titula con hidrxido de sodio 0.01 N (0.1 N)

hasta que el color rosa plido se mantenga por 30 segundos.

Determinacin de pH: se calibr el potencimetro con soluciones buffer pH

5 y 7, se tom una muestra de 20 ml y se coloc en un beaker de 50 ml. Se

realiza la lectura por duplicado como se observa el la foto 24.

Foto 24. Lectura de pH utilizando el potencimetro marca BECKMAN.

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Determinacin de azcares: para determinar el contenido de azcar se

debe preparar un titulo felhing, se prepara una solucin de glucosa al

1%. Se coloca la solucin en una bureta, y se titula con ella a una

solucin que contenga 10 ml felhing A, 10 ml felhing B y unas gotas de

azul de metileno (foto 25), esta solucin debe ser titulada en caliente

como se observa en la foto 30 hasta que vire el color azul a rojo ladrillo

(foto 26). Para determinar el titulo felhing se utiliz la siguiente ecuacin:

Ttulo felhing = Vol gastado de sol de glucosa X Peso glucosa

Vol Aforo glucosa

Foto 25. Solucin de felhing A, felhing B y azul de metileno.

Foto 26. Titulacin en caliente de la solucin anterior para determinar el titulo felhing.

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Para determinar azcares reductores y azcares totales se realiza el mismo

procedimiento utilizado para determinar el titulo felhing, reemplazando la solucin

de glucosa por: Para azucares reductores se toma 10 ml de muestra, aforar a 100

ml y titular con esta solucin. Para azucares totales se toma una muestra de 5 ml

se afora a 50 ml. Se toman 25 ml de esta solucin y se adicionan 5 ml de cido

clorhdrico, calentar a 50 C por 2 horas, enfriar, neutralizar con hidrxido de sodio

al 30 %, aforar a 50 ml y por ltimo titular con esta solucin en caliente. Para los

clculos finales se utilizaron las ecuaciones 1 y 222.

Ecuacin 1. Clculo de Azcares reductores

Azcares reductores% = titulo felhing x aforo reductores x 100Vol Reductores Alcuota mosto o vino

Ecuacin 2.Clculo de Azcares totales

Azcares reductores % = titulo felhing x aforo reductores x 100

Vol. Reductores Alcuota mosto o vino

Los resultados de los anlisis fisicoqumicos se analizarn de acuerdo a la

reglamentacin Espaola, ya que por tradicin es un pas vincola y tiene

parmetros estandarizados para cada tipo de vino. Adems se revis la norma

tcnica colombiana NTC 1740 BEBIDAS ALCOHOLICAS VINOS LICOROSOS O

GENEROSOScuyos valores son compatibles con la reglamentacin espaola.

22Metodologa AOAC 930 anlisis para vinos.

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3. RESULTADOS Y ANALISIS DE LA EXPERIMENTACIN

En este captulo se presentan los resultados de la metodologa experimental

descrita en el captulo 2. Los resultados del tratamiento enzimtico del mosto y de

la clarificacin del mismo se analizan por medio de pruebas fisicoqumicas con su

respectivo anlisis estadstico.

3.1 OBTENCION DE LA ENZIMA PECTINASA

Partiendo de 9 litros de medio de cultivo para la fermentacin sumergida seobtuvieron finalmente 42,37g de enzima pectinasa liofilizada siguiendo el

procedimiento descrito en numeral 2.1 para la obtencin de enzima segn la

metodologa Prieto Grebechova.

Por otro lado la enzima obtenida present actividad pectoltica de un 79.6 % segn

la ecuacin

V= (39, 65 s 10,10 s) X 100

(39, 65 s 2, 53 s)

V= 79.6%

Aplicando la ecuacin descrita en el captulo 2 numeral 2.2 el porcentaje de

cambio de viscosidad dio como resultado 79.6%, esto demostr que la enzima

pectinasa aislada poda aplicarse en el mosto de uva Isabella durante su

clarificacin, pues afectara su viscosidad y rendimiento.

3.2 PROCESO DE ELABORACIN DEL MOSTO Y OBTENCIN DEL VINO

TINTO

Durante la experimentacin con el mosto de la uva Isabella, se recopilaron los

pesos de las materias primas empleadas en cada uno de los pasos realizados.

Adems se analizaron los tipos de energa que intervinieron en el proceso.

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A continuacin se determinan los balances de materia y de energa del proceso de

obtencin del mosto de uva para la obtencin de vino tinto.

3.2.1 Balance de materia. Para conocer las cantidades tratadas en cada ensayo

experimental se aplica balance de materia; y con los resultados de este balance se

analiza el rendimiento del mosto clarificado con y sin tratamiento enzimtico.

En el cuadro 3 se resume el balance de materia de las primeras operaciones

realizadas con la uva Isabella desde su recepcin hasta el enfriamiento del mosto

pasteurizado, puesto que despus se dividi el mosto en cuatro ensayos, segn la

metodologa del numeral 2.3. Por otra parte, en el anexo C se encuentra eldiagrama de bloques de proceso con cantidades y los clculos del balance de

materia.

Cuadro 3. Balance de materia desde recepcin hasta mosto pasteurizado

OPERACIN MATERIALES CANTIDADES CANTIDADES

ENTRAN kg SALEN kg

PESAJE UVA 53,55 53,55

SELECCINUVA

SOBREMADURADA 0,05

LAVADO UVA 53,5 53,5

AGUA 30 30

DESPALILLADO UVA 53,5

PALILLO 0,65

MACERADO UVA 52,85

MOSTO 63

PASTEURIZACION MOSTO 63

MERMA 5.25

ENFRIAMIENTO MOSTO 57.75 57.75

Segn los resultados mostrados en el cuadro 3 se perdi de la uva Isabella que

ingres a la recepcin el 0,09% al retirar la uva que presentaba sobremaduracin

y el 1.2 % al retirar el palillo de la uva.

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Adems, se obtuvo 60 litros de mosto que equivale a 63 kg (el mosto present una

densidad de 1.050 kg/l) y de este solo se perdi el 8.3% debido a que se

concentr el mosto durante la pasteurizacin.

Despus de realizar los cuatro ensayos se realiz el balance de materia para

conocer el rendimiento de cada uno de ellos segn el tratamiento que se les aplic

(numeral 2.3). En los cuadros 4, 5, 6 y 7 se presentan los resultados del balance

de cada ensayo. En el anexo E se encuentran los clculos de estos balances de

materia.


con baja concentracinOPERACIN MATERIALES CANTIDADES CANTIDADES

ENTRAN kg SALEN kg

PRENSADO MOSTO 14,285

ESCOBAJO 1,14

CALENTAMIENTO MOSTO 13,145

Incubadora 13,145ADICION DE

ENZIMA MOSTO 13,145

AISLADA ENZIMA 0,00128

13,14628

CALENTAMIENTO MOSTO 13,14628Inactivacion

enzima Evaporacin 0,65

12,49628

ENFRIAMIENTO MOSTO 12,49628

12,49628ADICION DELEVADURA MOSTO 12,49628

LEVADURA 0,00444

12,50072ADICION DE

AZUCAR MOSTO 12,50072

AZUCAR 4,52

17,02072

FERMENTACION MOSTO 17,02072

VINO 17,6754

50


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Segn los resultados mostrados en el cuadro 4 el tratamiento o ensayo en el cual

se utiliz una concentracin baja (0.16 g) de enzima pectinasa aislada present un

rendimiento del 3.84 %, este resultado se obtuvo a partir de la siguiente ecuacin:

Rendimiento % = Vol Final Vino Vol inicial Mosto X 100

Vol inicial Mosto


con mayor concentracin


ENTRAN kg SALEN Kg

PRENSADO MOSTO 14,49ESCOBAJO 1,9

CALENTAMIENTO MOSTO 12,59Incubadora 12,59

ADICION DEENZIMA MOSTO 12,59AISLADA ENZIMA 0,00208

12,59208

CALENTAMIENTO MOSTO 12,59208Inactivacion enzima Evaporacin 0,65

11,94208



LEVADURA 0,00500411,947084

ADICION DEAZUCAR MOSTO 11,947084

AZUCAR 5,149717,096784

FERMENTACION MOSTO 17,096784VINO 18,0130

Segn los resultados presentados en el cuadro 5 el tratamiento en el cual se utiliz

una mayor concentracin (0.26 g) de enzima pectinasa aislada present un

rendimiento del 5,35 %.

51


53/100

Cuadro 6. Balance de materia del ensayo 3 tratado con enzima comercial.


ENTRAN kg SALEN kg

PRENSADO MOSTO 14,65

ESCOBAJO 1,39

CALENTAMIENTO MOSTO 13,26Encubadora 13,26ADICION DE

ENZIMA MOSTO 13,26AISLADA ENZIMA 0,00384

13,26384CALENTAMIENTO MOSTO 13,26384

Inactivacion enzima Evaporacion 0,6512,61384



LEVADURA 0,005048812,6188888

ADICION DE

AZUCAR MOSTO 12,6188888AZUCAR 5,1048

17,7236888FERMENTACION MOSTO 17,7236888

VINO 22,2829

Segn los resultados presentados en el cuadro 6 el tratamiento en el cual se utiliz

la enzima comercial present un rendimiento del 25,72 %. La enzima comercial

present una ventaja frente a la enzima pectinasa aislada, ya que la enzima

comercial tiene actividad celulasa la cual hace que despus de un buen maceradoacte rompiendo la pared celular de la fruta permitiendo as un mejor rendimiento

no solo a nivel de volumen final en vino sino en caractersticas organolpticas

como la fijacin de color.

52


54/100

Cuadro 7. Balance de materia del ensayo 4 sin tratamiento enzimtico.


ENTRAN kg SALEN kg

PRENSADO MOSTO 11,11ESCOBAJO 1,11

ADICION DELEVADURA MOSTO 10

LEVADURA 0,00301210,003012

ADICION DEAZUCAR MOSTO 10,003012

AZUCAR 3,109

13,112012

FERMENTACION MOSTO 13,112012VINO 13,3060

De los resultados del balance de materia del ensayo 4 se obtuvo un rendimiento

de 1,48%. En la Grafica 1 se observa claramente el rendimiento final de los 4

ensayos.

Grafica 1. Rendimiento en volumen de vino segn cada Ensayo

El ensayo en el cual se utiliz enzima pectinasa aislada de baja concentracin

present un bajo rendimiento comparada con el ensayo de mayor concentracin y

de enzima comercial, sin embargo fue mayor al compararlo con el tratamiento en

cual no se utiliz ninguna enzima.

0 5 10 15 20 25 30

Enzima aislada 0,16

Enzima aislada 0,26

Enzima Comercial

Sin Enzima

Ensayo

Rendimiento %

Rendimiento %

53


55/100

El ensayo en el cual se utiliz enzima pectinasa de mayor concentracin present

un mejor rendimiento frente al tratamiento enzimtico de menor concentracin y al

tratamiento sin enzima, sin embargo al compararla con la enzima comercial, la

enzima aislada tuvo un bajo rendimiento.

La enzima comercial present el mayor rendimiento de los cuatro ensayos

realizados presentando as la mejor actividad enzimtica, debido a que esta

enzima es una mezcla de enzima pectinasa y enzima celulasa.

3.2.2 Balance de energa. Durante la preparacin del mosto y sus diferentes

tratamientos para clarificarlo se emple energa trmica en las operaciones de

pasteurizacin del mosto; de acondicionamiento del mosto para el tratamientoenzimtico; de inactivacin de la enzima y de inactivacin de la levadura. Las

dems operaciones se realizaron con energa humana.

En el cuadro 8 se presentan los resultados del balance de energa de las

operaciones mencionadas y los clculos respectivos se muestran en el Anexo D.

Cuadro 8. Balance de Energa General del Proceso

OPERACIN ENSAYO ENERGIA ENERGIA ENERGIA CONSUMO

EMPLEADA UTILIZADA PERDIDA

PASTEURIZACION TODOS Termica-Qumica 97148,625 KJ 9714,8625KJ 3397.212 kg

ACONDICIONAMIENTO ENZIMA AISL 1 Termica-Electrica 8616.5475 KJ 0.1994 kWh

ENZIMA ENZIMA AISL 2 Termica-Electrica 10424,52 KJ 0,2413KWh

ENZIMA AISL 3 Termica-Electrica 10979,28 KJ 0.25415KWh

INACTIVACION ENZIMA AIS 1 Termica-Electrica 15199,2183 KJ 1519,92KJ 4,22KWh

ENZIMA ENZIMA AIS 2 Termica-Electrica 14625,5385 KJ 1462,55KJ 4,062KWh

ENZIMA COMERCIAL 3 Termica-Electrica 13029,5685 KJ 1302,95KJ 3,619KWh

INACTIVACION LEVADURA AIS 1 Termica-Electrica 24384,6 KJ 2438,46KJ 6,7735KWh

LEVADURA LEVADURA AIS 2 Termica-Electrica 24428,48 KJ 2442,84KJ 6,7856KWhLEVADURA COMER 3 Termica-Electrica 25412,424 KJ 2541,24KJ 7,059KWh

SIN ENZIMA Termica-Electrica 18094,56 KJ 1809,45KJ 5,26KWh

54


56/100

3.3ANALISIS FISICOQUIMICOS

3.3.1 Comportamiento del pH en el mosto y vino tinto.

El comportamiento del pH no present gran variacin con respecto a los diferentes

ensayos realizados y siempre estuvo dentro de los parmetros normales como se

puede observar en la Grafica 2. Segn la legislacin el vino debe presentar un pH

entre 2.7 y 3.823 este dato permiti verificar la estabilidad del vino de la

experimentacin. El vino elaborado present un pH inicial de 2.86 y al final de 3.4.

Grafica 2.Comportamiento del pH con respecto al tiempo en cada Ensayo.

01

23

4

1 12 27 35

Das

pH

Enzim a Ais

EnzimacomercialSin Enzima

Esta caracterstica se midi en los das 1, 12, 27 y 35 para conocer el desarrollo

del pH durante la fermentacin. En el cuadro 9 se presentan los resultados del pH

por triplicado para los das mencionados para los tres primeros ensayos y por

duplicado para el ensayo sin enzima debido a que la muestra no fue suficiente.

23DIARIO OFICIAL DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS. Reglamento (CEE) N 2676 /90 de la Comisin de

17 de Septiembre de 1990 por el que se determinan los mtodos de anlisis comunitarios aplicables en el

sector del vino, p. 121-122.

55


57/100

Cuadro 9. Resultados del pH en los cuatro ensayos

pH

Da Ensayo1 Ensayo2 Ensayo3 Ensayo42,86 2,91 2,88 2,932,94 2,92 2,88 2,91

1 2,93 2,93 2,93,63 3,62 3,59 3,61

3,62 3,63 3,6 3,612 3,63 3,61 3,58

3,01 2,96 2,93 2,972,99 2,98 2,94 2,97

27 3,01 2,96 2,933,44 3,44 3,42 3,4

3,44 3,44 3,42 3,435 3,44 3,44 3,42

Estos datos se analizan estadsticamente con arreglo aleatorizado por anlisis de

varianza (ANAVA) con diferentes repeticiones y un 95% de confiabilidad. Adems,

se formularon las siguientes hiptesis:

Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en el pH en los cuatro

ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y 26

Hiptesis alterna (H1): si hay diferencia significativa en el pH en los cuatro

ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y 26.

En el anexo E se muestra el ANAVA de los resultados de pH corridos en el

programa Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 10 se resume el

ANAVA de esta caracterstica.

Cuadro 10.Anlisis de varianza de la acidez pH con 95% de confiabilidad

ANAVA

Fuente de variacin Grados de libertad Suma de cuadrados Varianza F calculado F tabuladoTratamientos 4 - 1 = 3 0,25 0,08333Error 44 116667 0,26515

Total 48 - 1 = 47 11,9167 0,31 2,61

56


58/100

Segn los resultados del ANAVA se encontr un F calculado de 0,31 siendo

menor al F tabulado (2,61); por tanto, se acepta la hiptesis nula, lo que

demuestra que no hubo diferencia de pH entre los cuatro ensayos durante la

clarificacin y fermentacin del vino tinto a partir de uva Isabella, es decir, la

enzima pectinasa no afecta el comportamiento de esta caracterstica durante la

produccin del vino tinto.

3.3.2 Comportamiento de slidos totales en el vino tinto.

La medicin de slidos totales se realiz utilizando el refractmetro que contiene

las dos mediciones tanto en grados Brix como en ndice de refraccin. Como se

puede observar en la Grfica 3, el contenido de slidos totales no presentninguna variacin comparando los diferentes ensayos entre s, por el contrario los

cuatro ensayos presentaron casi el mismo comportamiento, lo cual indica que el

tratamiento enzimtico independientemente uno de otro no afecta el desarrollo de

la fermentacin. La mayor variacin se present al momento de adicionar el

azcar, luego fueron disminuyendo a medida que pas el tiempo de fermentacin

y el mosto se iba clarificando.

Grafica 3.Comportamiento Brix con respecto al tiempo en cada ensayo

0

10

20

30

1 6 12 26

Das

Brix

Enzima Ais

Enzima comercial

Sin Enzima

57


59/100

Esta caracterstica se midi en los das 1, 6, 12 y 26 para conocer el desarrollo del

comportamiento de los grados Brix durante la fermentacin. En el cuadro 11 se

presentan los resultados de los slidos totales por triplicado para los das

mencionados para los tres primero ensayos y por duplicado para el ultimo ensayo

sin enzima debido a que la muestra no fue suficiente.

Cuadro 11. Resultado de los grados Brix en los cuatro ensayos

BRIXDa Ensayo1 Ensayo2 Ensayo3 Ensayo4

12 12 13 1112 12 13 12

1 12 13 13

11 12 12 11

12 8 11 106 9 12 12

18,2 18 20 1818 18,2 20 18

12 18,2 18 205,33 4,83 5 45,16 4,75 5,03 4

26 4,91 5 5




Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en Brix en los cuatro


Hiptesis alterna (H1): si hay diferencia significativa en Brix en los cuatro


En el anexo F se muestra el ANAVA de los resultados de Brix corridos en elprograma Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 12 se resume el


58


60/100

Cuadro 12.Anlisis de varianza de Brix con 95% de confiabilidad

Fuente devariacin

Grados delibertad

Suma decuadrados Varianza

Fcalculado F tabulado

Tratamientos 4 - 1 = 3 0,00007 0,00002467Error 40 0,00166 0,00004154

Total 44 - 1 = 43 0,00174 0,59 2,84


menos al F tabulado (2,84); por tanto, se acepta la hiptesis nula, lo que

demuestra que no hubo diferencia en Brix entre los cuatro ensayos durante la

clarificacin y fermentacin del vino tinto a partir de uva Isabella, es decir, la

enzima pectinasa no afecta el comportamiento de esta caracterstica durante la

produccin del vino tinto.

3.3.3 Comportamiento de extracto en el vino t into .

Al comienzo de la fermentacin el mosto present un contenido de slidos

suspendidos entre un rango de 5,8 y 6 g/100 ml, durante el tiempo de

fermentacin stos slidos se sedimentaron, a medida que se clarificaba el mosto.

La mayor variacin se present durante los primeros 8 das, luego su

comportamiento fue constante y similar en los cuatro ensayos (Grfica 4).

Grafica 4.Comportamiento de extracto en los diferentes ensayos de vino tinto

Extracto

0

24

6

8

1 8 16 22

Das

g/10

0ml Enzima Ais

Enzima comercial

Sin Enzima

59


61/100

Esta caracterstica se midi en los das 1, 8, 16, 22 y 27 para conocer el

desarrollo de extracto durante la fermentacin. En el cuadro 13 se presentan los

resultados del comportamiento de extracto por triplicado para los tres primeros

ensayos en los das mencionados y por duplicado para el ultimo ensayo debido a

que la muestra no fue suficiente.

Cuadro 13. Resultados de extracto en los cuatro ensayos

EXTRACTO


1 6,05895 6,3322 6,16411,2881 1,6211 1,0801 1,3966

1,4713 1,6534 1,4189 1,41728 1,3797 1,63725 1,2495

1,2745 1,4514 1,5219 1,38191,39775 1,36815 1,5046 1,1418

16 1,2802 1,4243 1,31621,22 0,99 1,38 1,921,51 1,64 1,48 1,21

22 1,56 1,01 1,473,4248 2,7604 1,7268 1,61123,3738 2,7534 1,6791 1,6013

27 3,3993 2,7569 1,70295




Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en extracto en los cuatro

ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 8, 16, 22 y 27.

Hiptesis alterna (H1) si hay diferencia significativa en extracto en los cuatro

ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 8, 16, 22 y 27.En el anexo G se muestra el ANAVA de los resultados del extracto corridos en el

programa Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 14 se resume el


60


62/100

Cuadro 14.Anlisis de varianza de Extracto con 95% de confiabilidad

ANAVA

Fuente de variacin Grados de libertad Suma de cuadrados VarianzaF

calculadoF

tabuladoTratamientos 4 - 1 = 3 2,85 0,95Error 56 215,7337 3,85238

Total 60 - 1 = 59 218,583 0,25 2,76



demuestra que no hubo diferencia entre los cuatro ensayos durante la clarificacin

y fermentacin del vino tinto a partir de uva Isabella, es decir, la enzima pectinasa

no afecta el comportamiento de esta caracterstica durante la produccin del vinotinto.

3.3.4 Comportamiento del ttulo alcoholimetrico en el vino tinto.

Durante el tiempo de fermentacin se midi el ttulo alcoholimtrico en Grados

Gay Lussac (GL) segn la metodologa descrita en el numeral 2.4. El

comportamiento del grado alcohlico present una leve variacin entre los

tratamientos a los cuales les fue adicionada la enzima aislada en mayor

concentracin y enzima comercial comparados con el tratamiento que no tena

enzima, el que tena enzima en menor concentracin present un grado

alcohlico bajo, ya que este ltimo tard ms tiempo en alcanzar los grados

alcohlicos finales.

Al terminar la fermentacin el ensayo de menor concentracin enzimtica

presento 10,8 GL, el ensayo de mayor concentracin y el que tena enzima

comercial presentaron 12.6 GL mientras que el ensayo que no tena enzima

presento un grado alcohlico de 11.7 GL (Grfica 5).

61


63/100

Grafica 5. Comportamiento del ttulo alcoholimtrico con respecto al tiempo en los

4 ensayos.

Los grados alcohlicos fueron corregidos debido a la diferencia de temperaturas

del destilado al momento de realizar las lecturas y la referencia del alcoholmetro.

La correccin se realiz segn las tablas para correccin de ttulo alcoholimtrico

Steiner24.

T t u l o A l c o h o l i m t r i co

0

2

4

68

10

12

14

1 7 14 20 25

Das

GL

Enzima A is

Enzimacomerc ia lSin Enz ima

Esta caracterstica se midi en los das 1, 7, 14, 20 y 25 para conocer el desarrollo

de GL durante la fermentacin. En el cuadro 15 se presentan los resultados de

GL por triplicado para los tres primeros ensayos en los das mencionados,

excepto en el ensayo 4 que se realiz por duplicado porque la muestra no fue

suficiente.

24Steiner.C. Alcoholimetria, Preparacin de Alcoholes, Editorial Glem, Buenos Aires. Pag 117-118

62


64/100

Cuadro 15. Resultados del ttulo alcoholimtrico en los cuatro ensayos

TITULO ALCOHOLIMETRICO

Da Ensayo1 Ensayo2 Ensayo3 Ensayo4

0 0 0 00 0 0 01 0 0 0

3,6 3,6 3,6 3,63,6 3,6 3,6 3,6

7 3,6 3,6 3,68,7 8,83 9,56 5,839,03 9,63 9,16 8,7

14 8,7 9,3 9,1610,2 10,76 11,066 10,4310,2 10,2 11,13 10,13

20 10,2 11,66 11,06610,8 12,6 12,6 11,710,8 12,6 12,6 11,7

25 10.8 12,6 12,6




Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en el titulo alcoholimetrico

en los cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 7,14, 20 y 25.

Hiptesis alterna(H1): si hay diferencia significativa en el titulo alcoholimetrico

en los cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 7,

14, 20 y 25.

En el anexo H se muestra el ANAVA de los resultados del titulo alcoholimetrico

corridos en el programa Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 16 se

resume el ANAVA de esta caracterstica.

63


65/100

Cuadro 16.Anlisis del titulo alcoholimetrico con 95% de confiabilidad

ANAVA


calculadoF


Total 44 - 1 = 43 762,636 0,07 2,84


menor al F tabulado (2,84); por tanto, se acepta la hiptesis nula, lo que

demuestra que no hubo diferencia significativa de Grados alcohlicos GL entre

los cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin del vino tinto a partir de

uva Isabella, es decir, la enzima pectinasa no afecta el comportamiento de esta

caracterstica durante la produccin del vino tinto.

3.3.5 Comportamiento de Acidez Total en el mosto.

El comportamiento de la acidez total durante el tiempo de fermentacin fue

expresado en el contenido de cido tartrico y present un rango entre 22 y 24 g/l.

Los lmites legales para vino tinto tranquilo no debe ser inferior a 4.5 g/l segn el

reglamento CEE 557/94 de 14 de marzo de 1994.

El comportamiento de la acidez total fue similar en los ensayos con enzima

pectinasa aislada de mayor concentracin y enzima comercial como se observa en

la Grafica 6, sin embargo no present mayor variacin al compararlos con elensayo de menor concentracin y sin enzima.

64


66/100

Grafica 6. Comportamiento de Acidez Total en los cuatro ensayos.

Esta caracterstica se midi en los das 1, 9, 20 y 22 para conocer el desarrollo de

la acidez total durante la fermentacin. En el cuadro 17 se presentan los

resultados de de la acidez total por triplicado para los tres primeros ensayos en los

das mencionados, excepto en el ensayo 4 que se realiz por duplicado porque la

muestra no fue suficiente.

Ac idez Total

05

1015202530

1 9 20 22

Das

g/lac

ido

tart

rico Enzima Ais

EnzimacomercialSin Enzima

Cuadro 17. Resultados de la acidez total en los cuatro ensayos

ACIDEZ TOTAL


1 18,6 21,8 20,9

21,61 22,51 22,51 22,5122,21 21,91 22,51 22,36

9 21 21,61 22,2121,91 22,26 22,31 22,21

22,31 22,01 22,21 21,5120 21,1 20,75 22,81

21,4 22,51 26,01 23,1623,31 26,16 25,76 23,06

22 22,86 25,81 21,91

65


67/100




Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en la acidez total en los

cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y 26

Hiptesis alterna (H1): si hay diferencia significativa en la acidez total en los

cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y

26.

En el anexo I se muestra el ANAVA de los resultados de la acidez total corridos en

el programa Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 18 se resume el


Cuadro 18.Anlisis de varianza de la acidez total con 95% de confiabilidad.

ANAVA


calculadoF


Total 44 - 1 = 43 124,432 1,81 2,84



demuestra que no hubo diferencia de Acidez total entre los cuatro ensayos

durante la clarificacin y fermentacin del vino tinto a partir de uva Isabella, es

decir, la enzima pectinasa no afecta el comportamiento de esta caracterstica

durante la produccin del vino tinto.

66


68/100

3.3.6 Comportamiento de Acidez Voltil en el mosto.

El comportamiento de Acidez Voltil fue expresado en g/l de cido actico

presentando valores ms altos en el ensayo de enzima comercial y sin enzima

(0.0038 y 0.0040 g/l de acido actico respectivamente), en los ensayos de enzima

aislada de las dos concentraciones present valores menores (0.0015 y 0.0031 g/l

de cido actico) como se observa en la Grfica 7.

Segn el reglamento CE 14933/99 de 17/05/99 los limites legales de acidez voltil

para el vino tinto debe ser menor o igual a 1.2 g/l de acido actico. En los datos

anteriores a pesar de presentar variacin entre los ensayos todos los valores

obtenidos de acidez voltil cumplieron con la normativa.

Grafica 7.Grafica de comportamiento de Acidez Voltil

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

1 16 22 26Dasg/lacido

acetico

Enzima Ais

Enzima

comercialSin Enzima

ACIDEZ VOLATIL

Esta caracterstica se midi en los das 1, 16, 22 y 26 para conocer el desarrollo

de la acidez voltil durante la fermentacin. En el cuadro 19 se presentan los

resultados de de la acidez voltil por triplicado para los tres primeros ensayos en

los das mencionados, excepto en el ensayo 4 que se realiz por duplicado porque

la muestra no fue suficiente.

67


69/100

Cuadro 19. Resultados de la acidez voltil en los cuatro ensayos

ACIDEZ VOLATIL


1 0,0076 0,0085 0,00790,0083 0,0163 0,02 0,01920,0083 0,01731 0,0245 0,0214

16 0,0196 0,00182 0,023010,0014 0,002 0,0047 0,00320,0015 0,0003 0,0035 0,0046

22 0,0014 0,0048 0,0040,0014 0,0021 0,0044 0,00310,0015 0,003 0,0031 0,005

26 0,0014 0,0043 0,0039




Hiptesis nula (Ho): no hay diferencia significativa en la acidez voltil en los

cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y 26

Hiptesis alterna(H1): si hay diferencia significativa en la acidez voltil en los

cuatro ensayos durante la clarificacin y fermentacin en los das 1, 16, 22 y

26.

En el anexo J se muestra el ANAVA de los resultados de la acidez voltil corridos

en el programa Statistix versin 8.1. A continuacin en el cuadro 20 se resume el


Cuadro 20.Anlisis de varianza de la acidez voltil con 95% de confiabilidad

Fuente devariacin Grados delibertad Suma decuadrados Varianza Fcalculado F tabulado

Tratamientos 4 - 1 = 3 0,00007 0,00002467Error 40 0,00166 0,00004154Total 44 - 1 = 43 0,00174 0,59 2,84

68


70/100



demuestra que no hubo diferencia de Acidez Voltil entre los cuatro ensayos

durante la clarificacin y fermentacin del vino tinto a partir de uva Isabella, es

decir, la enzima pectinasa no afecta el comportamiento de esta caracterstica

durante la produccin del vino tinto.

3.3.7 Comportamiento de Azcares totales y reductores.

El contenido de azucares totales y reductores durante el proceso de fermentacin

fue decreciente como se puede observar en la grafica 8 y 9, debido a que durante

la primera parte de la fermentacin el mosto presenta una pequea cantidad deazucares reductores (sacarosa) y se adiciona una parte del azcar total para que

comience la fermentacin, estos azcares se convierten en alcohol por accin de

las levaduras, cerca al da 27 de fermentacin present un bajo contenido de

azcares, fue all donde se adicion la segunda parte del azcar. Segn el

reglamento CEE 997/81 del 26.01.81 para el tipo de vino seco el contenido de

azcar total debe ser menor o igual a 4 o menor o igual 9.el vino final present un

contenido de azcar total entre 6 y 8 % .

Grafica 8.Comportamiento de Azcares totales

0246

81012141618

7 14 27 35

Tiempo en dias

%a

zucaresTotales Enzima Ais

Enzima comercial

Sin Enzima

69


71/100

Grafica 9.Comportamiento de Azcares reductores

0

1

2

3

4

5

6

7

7 14 27 39

tiempo en das

%A

zucaresReduc

tore

Enzima Ais

Enzima comercial

Sin Enzima

Como se pudo observar en las dos graficas ninguno de los ensayos presento gran

variacin entre s con respecto al contenido de azucares totales y reductores, por

el contrario presentaron un comportamiento similar.

3.3.8 Clarif icacin final

Al terminar el proceso de fermentacin se deben hacer trasiegos que consisten en

trasvasar el vino a otro recipiente separando el vino de los slidos que quedan en

el fondo. A simple vista se pudo observar como fue ms difcil separar el vino de

de los fondos en los ensayos con enzima pectinasa aislada que con el ensayo

de la enzima comercial.

En la Foto 27 se muestra el frasco con el ensayo de enzima aislada en menor

concentracin, en la foto 28 el ensayo con enzima pectinasa aislada en mayor

concentracin y en la foto 29 el ensayo con enzima comercial, ntese la diferencia

en la intensidad de color.

70


72/100

Foto 27. Vino con enzima pectinasa aislada en menor concentracin

Foto 28. Vino con enzima pectinasa aislada en mayor concentracin

71


73/100

Foto 29.Vino con enzima comercial

72


74/100

CONCLUSIONES

En las primeras experimentaciones de obtencin de la enzima pectinasa aislada

no se obtuvo enzima con actividad enzimtica debido a que las pruebas

iniciales se realizaron en fermentadores experimentales que consistan en

frascos de vidrio que no tenan un sistema de mezclado constante.

El fermentador experimental hecho con la cantina y al cual se le acondicion un

motor pequeo permiti obtener una enzima aislada con actividad enzimtica

que present un cambio de viscosidad de 79% sobre una solucin de pectina al

2%.

En el procedimiento utilizado para la obtencin del mosto se realiz un

tratamiento trmico a 60 oC, lo cual permiti obtener un mosto con condiciones

organolpticas y fisicoqumicas ptimas para continuar con la aplicacin del

tratamiento enzimtico.

Los cuatro ensayos realizados permitieron obtener un vino tinto con las

siguientes caractersticas fisicoqumicas entre los siguientes rangos: pH entre

2.86 y 3.4; extracto entre 1 y 3 g/100 ml; GL finales entre 10.8 y 12.6; Acidez

Total entre 22 y 24 g/l expresado en Acido tartrico; Acidez voltil entre 0.0015

y 0.0040 g/l expresado en Acido Actico y un contenido de Azucares totales

finales entre 6 y 8%. valores que siempre estuvieron dentro de los parmetros

segn el DIARIO OFICIAL DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS. Reglamento

(CEE) N 2676 /90 de la Comisin de 17 de

hongo aspergillius.pdf

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