1 Högupplösande masspektrometri för screening av internetdroger Dr. Martin Josefsson Docent, Forskningskemist Avdelningen för rättsgenetik och rättskemi Rättsmedicinalverket Linköping Avdelningen för fysik och mätteknik (IFM) Linköpings Universitet Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324 Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324 TOF-MS karaktäristik • hög MS-upplösning (resolving power) >10,000 up to 50,000 (100,000) • hög massnoggrannhet (accuracy) < 1 ppm (<0.5 ppm) • hög känslighet (ESI) lägre pg-området ner till fg (injicerat) • stort dynamiskt mätområde 5 magnituder! (för nya instrument)) inom 50-3000 m/z (≥20 spektra/sekund) • snabb datainsamling (acquisition) 1-4 GHz (ett krav för hög massnoggrannhet) genererar stora datamängder/analys, 100 Mb -1 Gb/analys • hybridinstrument tandem-MS, Q-TOF (möjligt att generera MS-spektra) Kan användas för såväl… riktad screening targeted som förutsättningslös non-targeted analys av data 1 ppm 0.0003 amu (0.3 mDa) 263.1885 29 (tramadol)
15
Embed
Högupplösande masspektrometri för screening av internetdroger Josefsson_Internetdroger.pdf · protein fällning (PPT) med 500 µl 0.075 % myrsyra i MeCN:EtOH 90/10 v/v centrifugera,
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
1
Högupplösande masspektrometriför screening av internetdroger
Dr. Martin JosefssonDocent, ForskningskemistAvdelningen för rättsgenetik och rättskemiRättsmedicinalverket LinköpingAvdelningen för fysik och mätteknik (IFM)Linköpings Universitet
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
TOF-MS karaktäristik• hög MS-upplösning (resolving power)
>10,000 up to 50,000 (100,000)
• hög massnoggrannhet (accuracy)< 1 ppm (<0.5 ppm)
• hög känslighet (ESI)lägre pg-området ner till fg (injicerat)
• stort dynamiskt mätområde5 magnituder! (för nya instrument))inom 50-3000 m/z (≥20 spektra/sekund)
• snabb datainsamling (acquisition)1-4 GHz (ett krav för hög massnoggrannhet)genererar stora datamängder/analys, 100 Mb -1 Gb/analys
• hybridinstrumenttandem-MS, Q-TOF (möjligt att generera MS-spektra)
Kan användas för såväl…
riktad screeningtargetedsom förutsättningslösnon-targetedanalys av data
1 ppm ó 0.0003 amu (0.3 mDa)
263.188529 (tramadol)
2
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
QTOF-MS instrumenteringhybridinstrument
Time of Flight(TOF)
Ion Funnel (Agilent)StepWave (Waters) Quadrupole (Q)
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Massnoggrannhet vs. antal isobareraccuracy
Quadrupol MS (Q)
Time of Flight MS (TOF)
analyt formel nominell masstramadol C16 H25 N O2 263,4N-desmethyl-venlafaxin C16 H25 N O2 263,4O-desmethyl-venlafaxin C16 H25 N O2 263,4melperon C16 H22 F N O 263,4nortriptylin C19 H21 N 263,4
analyt forme l exakt ma ssatramadol C16 H25 N O2 263.188529N-desmethyl-venlafaxin C16 H25 N O2 263.188529O-desmethyl-venlafaxin C16 H25 N O2 263.188529melperon C16 H22 F N O 263.168542nortriptylin C19 H21 N 263.167399 2243 träffar!
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Databehandling, TOF-MS
alla massor mäts och all data sparas – retrospektiv analys möjligt!
genererar hög bakgrundsingnal – ger mycket brus!
filtrering av data med hjälp av algoritmer• Identifiera kromatografiska toppar
– identifiera alla joner som länkar– inkludera addukter som; Na+ or K+
– inkludera isotoper ([M+H]+, [M+H+1]+,…– inkludera olika laddningsfördelning– identifiera eventuella dimerer– generera ett analytspecifikt spektra
• Summerar alla signaler till ett värde (Feature)• Helt automatiserad data processning
4
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Databas / Bibliotekexakt massa / spektra
PCDL = Personal ComposedDatabase / Library
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Find By Formula (FBF)
Compound information from formula or database
XIC drawn from information
Formula matchingparameters
Spectral performance calculated
Spectra extracted from integrated peak
total score (pos i.d.)max = 100
• retention time• accurate mass• isotopic pattern
5
Auto MS/MS data-dependent acquisition
Precursors (MS)max precursors per cycle, 2 co-eluted compounds can be identifiedactive exclusion
– excluded after 1 spectrum average of several spectra on each peak– released after 0.05 min
Spectra matching (MS/MS)reversed: library vs. sample gives most often the highest scoresforward: sample vs. library often bad scores in urine analyses
Library spectra at 10, 20 and 40 eV
fixed collision energy (CE) screening for analogues/homologes (T5)
CE based on MW from formula screening for more different chemical identities (T6/T8)
individual CE settings when target lists are used (T7)
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Auto MS/MSMDPV (bath salt)
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Särskild förfrågan (urin)steroider GC-MS (full scan, SIM) X ej vidare för verifikation!
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Instrumentering
• Agilent 6540/6550, Jet-Stream ESIgenerella parameter inställningar!kapillär 3500 V, fragmentor 125 VMS-mode med 20 ppm detektionsfönser, auto MS/MS-mode m/z 50-1000, 1.5 spektra/sekundprofil och centroiddata vid 2 GHz (utökat dynamiskt område)
• Agilent 1290 UHPLClång kolonn för maximal upplösing! HSS T3, 150x2.1, 1.8 µm (Waters) Linjär gradientkromatografi inom 12 min(A) 0.05% FA i 10 mM NH4FA, (B) 0.05% FA i Acetonitril0.5 ml/min vid 60°C, 2 µl injicerat
• MassHunter Acq, Qual and Quantegna databaser/bibliotek (PCDL = personal composed database/library)>600 föreningar med tillgång till certifierat eller väldokumenterat referensmaterial (t ex beslag)
7
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
• urin - 0.5 ml med eller utan hydrol med β-glucuronidase (E.coli) extraktion genom utsaltning (SALLE) med 500 µl MeCN och 250 µl 10 M NH4Accentrifugera, överför 100 µl MeCN, injicera 2 µl.
interna standarder för standard metoder (amfetamin-D8, diazepam-D5, mianserin-D3)för syntetiska cannabinoider (tillgängliga deutererade analoger)
UHPLC - gradientkromatografi
Blankt blodprov (överst). Autentiskt blodprov från obduktion (nederst). Interna standarder markerade med svarta pilar (amphetamine-D8, mianserine-D3, diazepam-D5).
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
HSS T3, 150x2.1, 1.8 µm
(A) 10 mM NH4FA + 0.05% FA (B) actetonitril + 0.05% FA
Linjär gradient1-95% B inom 10 minuter
Kromatografin är en kompromiss!
GHBTHC
8
Strategier för TOF-/QTOF-MS analys
• single state TOF-MS (6540/6550)används för screening som följs av verifikationsanalys LC-MS/MS, GC-MS eller GC-NPD för verifikation och kvantifiering
högt genomflöde av prover!
• data-dependent MS/MS acquisition QTOF-MS (6540)används för screening där ingen kvantifiering krävsscreening och verifikation av internetdroger
tillförlitliga identifieringar!
• QTOF-MS med mer känsligt instrument (6550/iFunnel)- data-dependent MS/MS med inklusionslista (prefered list)- prekusorer + fragment; All Ions (Agilent), MSe (Waters), bbCID (Bruker)screening och verifikation av internetdroger i låga koncentration (syntetiska cannabinoider i blod)
tillförlitliga identifieringar vid låga koncentrationer!
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Syntetiska cannabinoider
JWH-018JWH = John W. Huffman
• research chemical (RC)• designade droger / internetdroger
(”spice”, K2)
flera olika klasser naftoylindoler (JWH-018)tetrametylcyxlopropylindoler (XLR-11)adamantoylindoler (AKB-48)
mångaanaloger
genererar flera metaboliterhydroxylering, karboxylering
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
2.9%5.0%6.4%+50%
5.8%9.0%19.7%-50%
20105
2.9%5.0%6.4%+50%
5.8%9.0%19.7%-50%
20105
0,00
0,010,02
0,030,04
0,050,06
0,070,08
0 5 10 15 20 25 30
ng/mL
abs
0,00
0,010,02
0,030,04
0,050,06
0,070,08
0 5 10 15 20 25 30
ng/mL
abs
MAM-2201 pentansyra52% korsreaktivitet
MAM-2201 4-OH pentyl36% korsreaktivitet
JWH-122 4-OH & 5-OH pentyl40 resp. 39% korsreaktivitet
Ingen korsreaktivitet förUR-144 pentansyraUR-144 4-OH & 5-OH pentyl
Analyserat med Advia 1850
forts…
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Tröskelvärde; HEIA 5 ng/ml, LC-QTOF 2 ng/ml
utvalda prover (3 månader, n=87)
än god överensstämmelse mellan metoderna
men UR-144 detekterades ej med HEIA
80 positiva fynd i 38 fall med LC-QTOF
JWH-122 5-OH-pentyl, JWH-018 5-OH-pentyl
Strategies for the analysis of synthetic cannabinoids in urine. A comparison between an immuno assay and an LC-QTOF method Kronstrand R, Birath-Karlsson C, Brinkhagen L, Roman M, Josefsson M. Anal. Bioanal. Chem. 2014 epub-
FP
FN
339+
540-
+-
339+
540-
+-
LC-Q-TOF
HEIA
12
Rutinscreening för syntetiska cannabinoider i urin
stor efterfrågan > 250 prover per vecka - problem med kontamination av instrumentet
Steg 1• Mindre injektionsvolym, 2µl (vs 5) och höjda tröskelvärden, 5ng (vs 2)Steg 2• Utveckla ny snabbare screening metod (T9).
ett mer känslig instrument (6550), 0.5 µl injicerat (jfr 5 µl ursprunligen)snabbare kromatografi, from 17 to 6 minuterTOF-MS-analyser
• Bara de positiva fynden analyseras och verifieras med hjälp av den ursprungliga metoden (T5)
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
• enkel provberedning (SALLE för urin, PPT för blod)• auto MS/MS (AT 6540) – endast kvalitativ analys• eget bibliotek, PCDL (för närvarande ca 120 substanser)• tröskelvärde: urin 50-500 ng/ml, blod 20-100 ng/g (analytberoende)
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
*flera fynd, vid riktad frågeställning analyserat med 3Q LC-MS/MS
15
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Sammanfattning
• LC-TOF-MS kan på ett snabbt och rationellt sätt användas för screening av ett stort antal prover på en relativt kort tid, men en uppföljande verifikationsanalys av positiva fynd är nödvändig.
• LC-QTOF-MS kan användas för screening och verifikation vid ett och samma analystillfälle men är ofta mer tidskrävande både gällande analys och utvärdering av data.
• Med TOF-MS metoder kan man uppnå den flexibilitet som krävs vid analys av internetdroger där omsättningen är stor för de substanser som metoderna bör täcka. De är möjligt att retrospektivt analysera data från tidigare analyserade prover och att utföra förutsättningslös (ej riktad) analys av data.
Martin Josefsson, Agilent Forensic Solution Summit, Mannheim Germany 140226
Martin Josefsson, Equalis användarmöte, Knivsta 140324
Ansvariga medarbetare RMV
Markus Roman (QTOF specialist, blodmetoderna)
Linda Brinkhagen (syntetiska cannabinoider i urin)