29.04.11 1 Title JUSTUS-LIEBIG UNIVERSITY GIESSEN MEDICAL FACULTY HLA – System, klinische Bedeutung Gregor Bein Zentrum für Transfusionsmedizin und Hämotherapie Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen HLA-System - Klinische Bedeutung 1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen Stammzelltransplantation (Krankheitsassoziationen) HLA-System und klinische Bedeutung 1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen Stammzelltransplantation
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HLA – System, klinische Bedeutung · 29.04.11 2 Antigen + APC + T Aktivierung, Proliferation Anergie, Suppression Ignoranz Adaptive Immunantworten Struktur HLA-Klasse I Molekül
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Title JUSTUS-LIEBIG
UNIVERSITY GIESSEN
MEDICAL FACULTY
HLA – System, klinische Bedeutung
Gregor Bein Zentrum für Transfusionsmedizin und Hämotherapie
Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH
Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin Justus-Liebig-Universität Gießen
HLA-System - Klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
(Krankheitsassoziationen)
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
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Antigen + APC T +
Aktivierung, Proliferation
Anergie, Suppression
Ignoranz
Adaptive Immunantworten
Struktur HLA-Klasse I Molekül
Struktur HLA-Klasse II Molekül
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Peptid-Präsentation durch HLA-Moleküle
HLA – Moleküle präsentieren Peptidantigene
Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse II: Exogene Peptide
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Antigen-Prozessierung und Präsentation MHC-Klasse I: Endogene Peptide
Erkennung von Peptidantigenen durch den T-Zell-Rezeptor
Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle
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Peptide binden über Anker-Aminosäuren an HLA-Moleküle
HLA – Moleküle: polymorphe AS-Positionen
Zusammenfassung: Antigenpräsentation
HLA-Klasse II – Moleküle – Exogene Peptide: Aufnahme von Antigenen zur
Initiierung einer adaptiven Immunantwort – Expression auf Antigen-präsentierenden Zellen – Präsentation an CD4+ T-Zellen (T Helfer Zellen)
HLA-Klasse I – Moleküle – Endogene Peptide: Anzeige intrazellulärer Infektion – Expression auf fast allen kernhaltigen Zellen
(nicht auf Erythrozyten) – Präsentation an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T Zellen)
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Shiina T Tissue Antigens 64:631 (2004)
Polymorphismus und Polygenie tragen zur Diversität der HLA-Moleküle eines Individuums bei
Haplotyp
HLA-Allele: Kodominante Expression
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HLA- A * 24: 02: 01: 02 L
Genort Breite Spezifität
(„Antigen“) Exonvariante
(stumm) Suffix*
Molekularbiologische Typisierung
Allel (Proteinvariante)
Intronvariante (stumm)
*Suffix: N Null allele L Low expression S Secreted, not on cell surface Q Questionable expression
- Doppelpunkt als Trennzeichen - Führende Nullen - Bis zu drei Stellen (e.g. A*02:101) - „w“ wir vom HLA-C-Genort entfernt: e.g. C*01:03
HLA-Nomenklatur 2010 (hla.alleles.org)
HLA alleles that encode for identical peptide binding domains (P groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II A*01:01P A*01:01:01:01/A*01:01:02/A*01:01:03/A*01:01:04/A*01:01:05/
HLA alleles that share identical nucleotide sequences for the exons encoding the peptide binding domains (G groups) (exon 2 and 3 for HLA class I and exon 2 for HLA class II
Antigenic variants e.g. HLA-A2 (2 digit resolution)
Allelic variants* e.g. HLA-A*0201 (Proteins)
HLA-A 28 1176
HLA-B 60 1641
HLA-C 10 808
HLA-DRB1 21 774
* www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ Release 3.4.0, 08 April 2011
Aber, - die Zahl der häufigen Allele (f > 1%) in einer gegebenen Population ist deutlich niedriger - Allele sind nicht zufällig miteinander kombiniert: konservierte Haplotypen e.g. HLA-A1, B8, DR3
HLA-System und klinische Bedeutung
1. Biologische Funktion der HLA-Moleküle 2. Nachweis von HLA-Antikörpern und Antigenen 3. Klinische Bedeutung in der Organtransplantation 4. Klinische Bedeutung in der allogenen
Stammzelltransplantation
Serologischer Nachweis von HLA-Antigenen und Antikörpern Mikro-Zytotoxizitätstest nach Terasaki
(Lymphozytotoxizitäts-Test, LCT-Test) – Isolierung von Lymphozyten
(Dichtegradientenzentrifugation, Beads) – Inkubation mit Antiseren (n ≥ 120 für Klasse I) – Inkubation mit Kaninchen-Komplement – Anfärbung der lysierten Zellen und Fixierung
ELISA Luminex
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HLA-Typisierung: Isolierung von PBMC durch Dichtegradienten-Zentrifugation
No association of kidney graft loss with human leukocyte antigen antibodies detected exclusively by sensitive luminex single-antigen testing: a collaborative transplant study report.
Süsal C et al., Transplantation (2011)
HLA-Typisierung Molekulargenetische Typisierung von HLA-Allelen
Molekulargenetische Verfahren
– PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotides)
– PCR-SSP (Sequence Specific Primers)
– Sequenzierung (Sequencing Based Typing, SBT)
HLA-Polymorphismus
HLA-X*01 ... ACGTGGTCATAATGCTTCCAGACA ... HLA-X*02 ... ----C------------------- ... HLA-X*03 ... -------A---------------- ... HLA-X*04 ... -----------------TT----- ... HLA-X*05 ... ----C--A---------------- ... HLA-X*06 ... ----C------------TT----- ... HLA-X*07 ... -------A---------TT----- ... HLA-X*08 ... ----C--A---------TT----- ... HLA-X*09 ... ------------------T----- ... - Hypervariable Regionen (HVR) - Public epitopes (fast keine allelspezifischen SNPs) - Genduplikation und –konversion (Gen?) - Polymorphismus in cis oder trans (Chromosom?)
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Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?
Molekulargenetische HLA-Typisierung: Polymorphismus in cis oder trans?
Wie lösen wir das cis/trans – Problem? – Familienuntersuchung (Segregation der Haplotypen) – Klonierung von PCR – Produkten – Klonierung von Chromosomen (Hybridoma-Technologie) – Trennung der Allele durch allelspezifische Sonden und
immunomagnetische Beads – Sequence Specific Priming (PCR-SSP)*