Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização molecular e Biomarcadores Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre apresentada à Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto. Trabalho realizado por Maria Inês de Oliveira Alvelos. Orientador: Prof. Doutora Paula Soares.
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Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização … · MEN2 Neoplasias endócrinas múltiplas de tipo 2 (do inglês, Multiple endocrine neoplasia type 2 ) mg ... Esta endocrinopatia
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Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto
Hiperparatireoidismo Primário:
Caracterização molecular e Biomarcadores
Dissertação de Candidatura ao Grau de Mestre apresentada à Faculdade de
Engenharia da Universidade do Porto.
Trabalho realizado por Maria Inês de Oliveira Alvelos. Orientador: Prof. Doutora Paula Soares.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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Agradecimentos Gostaria de agradecer de uma forma muito especial a todas as pessoas, que me ajudaram e de alguma forma contribuíram para este trabalho: À Doutora Paula Soares (À Paulinha!!) o meu muito obrigada pelas oportunidades que me deu, e pela oportunidade de realizar este trabalho. Obrigada por todos os momentos críticos, orientação, disponibilidade, apoio, confiança e amizade que sempre me transmitiu. A todos os meus amigos e colegas de laboratório: Joana, Seca, João, Helena, Ricardo, Hugo, Patrícia, Jorge…obrigada pela partilha de experiências, pelo companheirismo, pelas sugestões. Seca, obrigada por me ajudares a entrar no mundo do coffalyzer!!!!! À Senrinha e Inês…tenho muitas saudades e este trabalho tem um bocadinho vosso. À minha Li e à minha Bá…por todos aqueles momentos tão únicos, e por tudo aquilo que faz com que a nossa amizade seja tão nossa. À Xana e à Ju…obrigada por partilharem comigo todos os momentos, por estarem sempre do meu lado, por todos aqueles cafezinhos de “10minutos”, pelo companheirismo, enfim...por tudo. Martinha, obrigada pelo grande apoio, carinho e amizade que tanta força me dão. Cátia, Zéze…Obrigada pelos bons momentos de descontração, que sabem tão bem !! À minha Ritinha e ao Bruno…obrigada por estarem sempre lá. Á minha Mãe, ao meu Pai e à minha Maninha …MUITO OBRIGADA por me apoiarem sempre e por estarem sempre comigo!! Obrigada por aturarem muitas(s) vezes aquele feitiozinho “particular” que as vezes se apodera e também por toda a força e incentivo!! Vocês são sem dúvida as melhores pessoas do MUNDO!! Obrigada também à minha PUNKAS…☺ Vítor…já ta☺ Obrigada… A todos os meus amigos, que sempre me apoiaram Inês Alvelos
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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Lista de abreviaturas, símbolos e convenções
A Resíduo de nucleótido contendo como base a adenina
ATP Adenosina Trifosfato (do inglês, Adenosine triphosphate)
bp (Número de) Pares de resíduos de nucleótidos (do inglês, base pairs)
C Resíduo de nucleótido contendo como base a citosina
CaSR Receptor sensível ao cálcio (do inglês, Calcium sensing receptor)
CDKN1B Inibidor de Cínases dependentes de ciclinas 1B (do inglês, Cyclin dependent Kinases inhibitor 1B)
CMT Carcinoma medular da tireóide
C-terminal Extremidade da cadeia polipeptídica cujo último resíduo de aminoácido apresenta livre a função ácido carboxílico
ddNTP Didesoxinucleótido
del Delecção (do inglês, deletion)
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, Deoxyribonucleic acid)
dNTP Trisfosfato de desoxinucleótido
EDTA Etilenodiaminatetracetato
FHH Hipercalcémia e hipocalciúria familiar (do inglês, Familial Hypocalciuria hypercalcemia)
FISH Fluorescent in situ hybridization
G Resíduo de nucleótido contendo como base a guanina
g Grama
g Unidade de campo gravítico (9,81 m.s -1), usada como unidade de força centrífuga.
HPTP Hiperparatireoidismo primário
HPT-JT Síndrome hereditária de hiperparatireoidismo e tumores nos maxilares (do inglês, Hyperparathyroidism – jaw tumor)
HRPT2 Hyperparathyroidism 2
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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inv Inversão (do ingles, inversion)
kb Kilobp (1000bp)
kDa kiloDalton (1kDa = 1000Da)
L Litro
LOH Perda de heterozigotia (do inglês, Loss of heterozygosity)
M Molar
MDE Mutation Detection Enhancment
MEN1 Neoplasias endócrinas múltiplas de tipo 1 (do inglês, Multiple endocrine neoplasia type 1)
MEN2 Neoplasias endócrinas múltiplas de tipo 2 (do inglês, Multiple endocrine neoplasia type 2)
8. Extracção de proteínas de tecidos incluídos em parafina 20
9. SDS-PAGE e Western blotting 21
9.1 SDS-PAGE 21
9.2 Western blotting 21
IV.RESULTADOS 22
1. Pesquisa de mutações na linhagem germinativa 22
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
ix
1.1 Análise molecular do gene MEN1 22
1.2 Análise molecular do gene RET 22
1.3 Análise molecular do gene CDKN1B 25
2. Pesquisa de mutações na linhagem somática 26
2.1 Análise moleculare do gene MEN1 26
2.2 Análise molecular do gene CDKN1B 32
2.3 Alterações na expressão da proteína Ciclina D1 32
2.4 Alterações na expressão da proteína p27 33
2.5 Detecção de alterações moleculares da proteína Ciclina D1 34
V. DISCUSSÃO 35
VI. CONCLUSÃO 47
VII BIBLIOGRAFIA 49
ANEXOS 55
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
1
I. INTRODUÇÃO GERAL
1. Sistema Endócrino
Uma das implicações da multicelularidade é que todas as partes de um
organismo comuniquem entre si de modo a que a homeostasia seja mantida. A
comunicação entre as diferentes regiões de um organismo é essencial para que haja uma
resposta adequada a alterações ambientais internas e externas. O sistema endócrino,
através da produção e libertação de hormonas é um elemento chave para o
estabelecimento e manutenção desta regulação (1).
1.1 Glândulas paratireóides
As glândulas paratireóides são glândulas endócrinas, logo, regulam a actividade
de outros órgãos através da produção de uma hormona, a hormona da paratireóide ou
paratormona (PTH), lançada directamente no sangue (2,3). As paratireóides estão
presentes em cada indivíduo normalmente em número de quatro, mas cerca de 13% dos
indivíduos possuem glândulas supranumerárias. Estas glândulas têm origem na
endoderme, tendo as glândulas superiores origem na quarta fenda branquial e as
inferiores na terceira fenda branquial (2).
As paratireóides estão localizadas simetricamente na zona do pescoço, na face
posterior da glândula tireóide. São órgãos de dimensões reduzidas, cerca de 6mm de
comprimento, 3 a 4mm de largura e 2mm de altura. Em indivíduos adultos, o peso de
cada glândula não deverá exceder 40mg. A nível histológico estas glândulas são
constituídas principalmente por dois tipos de células: as principais e as oxifílicas. É
também possível observar a presença de tecido adiposo, sendo o conteúdo em
adipócitos dependente da idade e constituição física de cada indivíduo (2,4).
Imagem. 1: Esquema ilustrativo da localização das glândulas paratireóides posteriormente à glândula tireóide.(http://64.143.176.9/library/healthguide/en-us/images/media/medical/hw/h5550931.jpg)
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
A técnica Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) é uma
técnica que tem como base o princípio da técnica de PCR e é usada na detecção de
anomalias genéticas como aneuploidia, delecções, e duplicações (49).
Esta técnica divide-se em quatro etapas: a desnaturação do DNA, a hibridação das
sondas, reacção de ligação e a reacção de PCR.
Durante o primeiro passo, o DNA é desnaturado para que, seguidamente ocorra
a hibridação das sondas. Cada sonda consiste numa sequência de oligonucleótidos
complementar da sequência alvo onde estão ligados um par de primers. As sondas vão
ligar-se às regiões alvo do DNA e apenas quando as duas sondas hibridizam em locais
adjacentes é que podem ser ligadas durante a reacção de ligação. Como apenas as
sondas que se encontram ligadas é que vão sofrer amplificação exponencial durante a
reacção de PCR, a quantidade de produto de ligação de uma determinada sonda é uma
medida do número de sequências alvo numa determinada amostra.
No final da reacção de MLPA, os produtos de amplificação são separados por
electroforese capilar usando o ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin – Elmer) e o
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19
software 310 GeneScan 3.1.2. transforma os sinais de fluorescência em
electroferogramas.
Os dados obtidos no 310 GeneScan são sujeitos a análise por um software
disponível na Internet- MRC Coffalyser MLPA-DAT.
O kit de MLPA usado neste trabalho foi o SALSA MLPA KIT P017-B1 MEN1
(MRC Holland, Amsterdam, the Netherlands) e todos os passos descritos anteriormente
foram efectuados segundo as instruções fornecidas pelo fabricante. Após o término da
reacção de MLPA, 1µL do produto final foi misturado com 0.6 µL de TAMRA 500
(Applied Biosystems) e 14.4 µL de formamida desionizada.
Como a análise dos resultados do MLPA se baseia em alteração da intensidade
de sinais de uma ou mais sondas, foram usadas três amostras de referências, como
recomendado pelo fabricante, provenientes de dadores se sangues.
Detecção de alterações na expressão proteica
7. Imunohistoquímica
A detecção por imunohistoquímica consiste na ligação de um anticorpo primário
não conjugado, ao seu antigénio (proteína em estudo) nas células do tecido. Na técnica
usa-se também um anticorpo secundário biotinilado, que se irá ligar ao anticorpo
primário. Seguidamente, a adição de um cromogéneo permite a visualização da proteína
em estudo (50). Os cortes de 2µm foram desparafinados e seguidamente hidratados. A
recuperação antigénica foi efectuada usando uma solução de citrato 2M pH6, a 100ºC
durante 30minutos. Uma vez que o método de detecção tira partido da acção da enzima
peroxidase, foi necessário realizar o bloqueio da peroxidase presente nos tecidos. Para o
bloqueio da peroxidase endógena usou-se uma solução de peróxido de hidrogénio a 3%
(v/v) em metanol. Para evitar ligações inespecíficas com imunoglobulinas endógenas foi
feito o bloqueio do tecido usando uma solução de bloqueio (Ultra V Block da Lab
Vision Corporation) durante 10 minutos Os anticorpos primários diluídos (ver Anexos:
Anexos II: Tabela 5) numa solução de diluição (Large Volume UltrAb Diluent da Lab
Vision Corporation) foram incubados nas secções durante um tempo determinado, em
função do anticorpo. Seguidamente, o anticorpo secundário biotinilado (Biotinylated
Goat Anti-Polivalent da Lab Vision Corporation) foi incubado com os cortes durante 10
minutos. Após este período de incubação, o complexo streptavidina – peroxidase
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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(Streptavidin Peroxidase da Lab Vision Corporation) foi adicionado e deixado a incubar
durante 10 minutos
Para finalizar, os cortes foram incubados com a solução de DAB, que consiste
no cromogéneo DAB (Diaminobenzidina) diluído no diluente de DAB (40 µL/mL)
(UltraVision Detection System da Lab Vision Corporation), durante 10 minutos Os
cortes foram lavados em água corrente, seguindo-se a coloração nuclear com
hematoxilina de Mayer.
As lâminas foram observadas ao microscópio e numa ampliação de 400x
realizou-se a contagem de células marcadas. Para a análise da expressão da Ciclina D1,
considerou-se sobre expressão desta proteína quando mais de 10% das células
apresentavam marcação nuclear. No caso da análise da expressão da proteína p27, os
casos que apresentaram mais de 5% dos núcleos marcados foram classificados como
positivos para a expressão da proteína.
8. Extracção de proteínas de tecidos incluídos em parafinas
A extracção de proteínas do material embebido em parafina tem como princípio
a reversão das ligações estabelecidas durante a fixação dos tecidos em formaldeído (51).
Para este fim, usamos o kit Qproteome FFPE Tissue (Qiagen) e as amostras
foram processadas segundo as instruções do fabricante, apenas com ligeiras alterações.
Foram efectuados três cortes de 10µm de cada amostra tumoral. Os cortes foram
desparafinados e hidratados em Clear Rite e etanol, respectivamente.
Seguidamente, apenas o tecido correspondente à região tumoral foi dissectado.
Após a dissecção destas áreas adicionou-se cerca de 100µL de Extraction Buffer
(o volume a adicionar varia com a quantidade de tecido disponível) e as amostras foram
incubadas a 100ºC durante 2 horas.
No final das 2 horas, as amostras foram colocadas durante 1 minuto a 4ºC,
seguindo-se uma centrifugação a 10 000g durante 15minutos O sobrenadante, que
contêm as proteínas extraídas foi retirado e armazenado a -20ºC.
Outro método utilizado para a extracção de proteínas de material parafinado foi
a utilização de uma solução de RIPA (Radioimunoprecipitation assay) buffer (25mM
Tris-HCl pH7,6; 150mM NaCl; NP40 1%; SDS 2%) no lugar no kit acima referido,
seguindo o mesmo protocolo.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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9. Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (SDS-
PAGE) e Western blotting
9.1 SDS-PAGE
O objectivo do SDS-PAGE é separar proteínas de acordo com o seu tamanho
(52). O extracto proteico a ser analisado é primeiro desnaturado com o detergente
aniónico SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) a 98ºC durante 5min, o que leva à perda da
estrutura tridimensional da proteína, ao mesmo tempo este detergente aniónico atribui
carga negativa às proteínas proporcionalmente à sua massa. Seguidamente, as proteínas
foram sujeitas a um processo electroforético em gel de acrilamida (BIO-RAD) a 12%
(v/v), durante o qual se separaram de acordo com o seu tamanho.
9.2 Western blotting
O Western blotting é uma técnica que permite a detecção de proteínas
específicas, através do uso de anticorpos (52). Após a separação das proteínas no gel de
acrilamida, realizou-se a sua transferência para uma membrana de nitrocelulose (GE
Healthcare), utilizando para isso um sistema de transferência (BIO-RAD). A eficiência
da transferência foi verificada através da coloração reversível com Ponceau S.
A membrana foi bloqueada com uma solução de leite em pó 5% (p/v) em PBS
1x Tween20 0,02% (v/v) (PBS-T) com o objectivo de minimizar as ligações
inespecíficas dos anticorpos.
Seguidamente, a membrana foi incubada com o anticorpo primário específico
para a proteína que se pretende detectar (ver Anexos: Anexos II: Tabela 6), durante um
período de tempo específico para cada anticorpo. As membranas são lavadas três vezes
durante 10 minutos após a remoção do anticorpo primário e em seguida realiza-se a
incubação com o anticorpo secundário, que se irá ligar ao anticorpo primário. Este
anticorpo secundário tem ligado a si a enzima peroxidase, que cataliza uma reacção de
quimioluminescência. A adição de uma solução de ECL (GE Healthcare) permite que
haja a emissão de luz. A luz emitida é proporcional à quantidade de proteína presente e
a excitação da película fotográfica (GE Healthcare), que é colocada sobre a membrana
permite visualizar a proteína de interesse.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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IV. Resultados
1. Pesquisa de mutações na linhagem germinativa.
1.1 Análise molecular do gene MEN1
Do gene MEN1 (OMIM 131100) foram analisados os exões do 2 ao 10.
A análise dos resultados obtidos por SSCP por sequenciação automática
permitiram detectar a presença de uma mutação germinativa, bem como a presença de
uma variante polimórfica.
A mutação germinativa consiste numa delecção de 4bp (ACAG) com início no
nucleótido 628 (exão 3). Prevê-se que esta mutação frameshift (c.628_631delACAG)
conduza à codificação de uma proteína truncada, por dar origem a um codão de
terminação prematuro, no codão 222.
Imagem 3:A- Padrão de SSCP obtido em gel de MDE 0,8% para exão 3 do gene, no qual se pode observar um padrão de migração diferente (seta). B - sequenciação de uma amostra com padrão de SSCP normal; C- Sequenciação da amostra com padrão de SSCP anormal revelou a presença de uma delecção de 4bp (ACAG).
A previsão da alteração a nível proteico foi feita utilizando software apropriado
ExPASy Proteomics Server (www.expasy.ch).
G G G C C A G A C A G T C A A T G C C G G T G T G G T C A A T G C C G G T G T G G C T G A
G G G C C A G A C A G T C A A T G C C G G T G T G G
A
B
C
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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Imagem 4: Esquema ilustrativo da alteração resultante da delecção de 4bp a partir do nucleótido 628. Esta mutação dá origem a uma proteína truncada, pois origina o aparecimento de um codão de terminação no codão 222. Wt: Wild type; Mut: Mutated.
A variante polimórfica observada consiste na transição de uma citosina para uma
timina (GAC �GAT) no codão 418 do gene. Esta variação representa uma alteração
sinónima, a D418D (rs2071313), visto que ambos os codões codificam para um ácido
aspártico.
Imagem 5: Resultados da sequenciação automática do exão 9 de gene MEN1. Ilustração das três variantes genotípicas para o polimorfismo D418D.
As frequências genotípicas referentes a esta variação polimórfica são: CC 0,30 ;
CT 0,57 e TT 0,13. Na população em estudo, esta variante está em equilibrio de Hardy-
Weinberg (p=0,294). As frequências genotípicas na população Portuguesa são: CC 0,29;
CT 0,51 e TT 0,20.
1.2 Análise molecular do gene RET
Do gene RET (OMIM 164761) foram analisados os exões 10, 11, 13, 14, 15 e 16
uma vez que é neste exões que estão localizados os hot spots mutacionais.
Os resultados foram negativos para mutações em toda a população em estudo.
Verificou-se a presença de variações polimórficas nos exões 11, 13 e 14.
G A C G A C T
G A T
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G G T
No exão 11 verificou-se a transição de uma guanina para uma adenina (GGT �
AGT) no codão 691. Prevê-se que esta alteração conduza à codificação de um resíduo
de serina (Ser/S) no lugar de uma glicina (Gly/G), G691S (rs1799939).
As frequências genotípicas encontradas são: GG 0,80; GA 0,17 e AA 0,03. As
frequências descritas para a população Europeia são: GG de 0,652; GA 0,304 e AA
0,043. A variante polimórfica em estudo está em equilibrio de Hardy-Weinberg
(p=0,326).
Imagem 6: Resultados da sequenciação automática para o exão 11. Os electroferogramas ilustram as três variantes genotípicas para do polimorfismo G691S.
No exão 13 verificou-se a transição de uma timina para uma guanina (CTT �
CTG) no codão 769. A modificação da base azotada conduz a uma alteração sinónima,
ou seja, ambos os codões codificam para uma leucina (Leu/L), L769L (rs1800861).
As frequências genotípicas encontradas são: TT 0,40; TG 0,57 e GG 0,03 e a população
está em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p=0,201). As frequências genotípicas descritas
para esta variante polimórfica, na população Europeia são: 0, 614 TT; 0,343 TG e 0,043
GG (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=RET).
Imagem 7: Resultados da sequenciação automática do exão 13 do gene RET. Os electroferogramas ilustram as três variantes genotípicas do polimorfismo L769L.
C T G
G G T A
A G T
C T T C T T G
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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No exão 14 verificou-se a transição de uma citosina para uma timina (AGC �
AGT) no codão 836, S836S (rs1800862).Esta alteração nucleotídica conduz a uma
alteração sinónima, pois ambos os codões codificam um resíduo de serina (Ser/S) .
As frequências genotípicas presentes na população em estudo são CC 0,90 , CT
0,10 e TT 0,00. Este polimorfismo está em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p=1,00).
As frequências genotípicas na população Portuguesa são: 0,96 CC, 0,04 CT e
0,00 TT.
Imagem 8: Resultados obtidos por sequenciação automática para o polimorfismo S836S do gene RET, ilustrando as duas variantes genotípicas encontradas na população em estudo.
1.3 Análise molecular do gene CDKN1B.
A análise do gene CDKN1B foi feita por sequenciação directa dos seus dois exões.
Não se verificou a presença de mutações, apenas uma alteração polimórfica no exão 1.
A alteração presente no exão 1 consiste na transição de uma timina para uma guanina
(GTC�GGC) no codão 109. Esta alteração nucleotídica promove a substituição de um
resíduo de valina (Val/V) por um resíduo de glicina (Gly/G), V109G (rs2066827).
As frequências genotípicas encontradas na população em estudo são: TT 0,80; TG 0,17
e GG 0,03. Esta variante polimórfica está em equilibrio de Hardy-Weinberg (p=0,326).
As frequências genotípicas descritas para a população Europeia são: TT 0,610; GT
0,373 e GG 0,017.
Imagem 9: Resultados obtidos por sequenciação do exão 1 do gene CDKN1B. As imagens ilustram as três variantes genotípicas encontradas na população em estudo.
A G C A G C T
G T C G T C G
G G C
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Tabela 1: Tabela resumo das alterações germinativas nos genes MEN1, RET e CDKN1B (n=30).
Gene
& Exão
Nucleótido/ Codão
Alteração genética &
Substituição aminoacídica
Tipo de alteração genética
Frequências
genotípicas
Equilibrio Hardy
Weinberg
MEN1 Exão 3
628/210 c. 628_631delACAG Mutação frameshift
0,03 NA
MEN1 Exão 9
1254/418 GAC�GAT D418D
Polimorfismo sinónimo
CC = 0,30 CT = 0,57 TT = 0,13
p=0,293
RET Exão 11
2081/691 GGT�AGT G691S
Polimorfismo não-sinónimo
GG = 0,80 GA = 0,17 AA = 0,03
p=0,326
RET Exão 13
2307/769 CTT�CTG L769L
Polimorfismo sinónimo
TT = 0,40 TG = 0,57 GG = 0,03
p=0,201
RET Exão 14
2693/836 AGC�AGT S836S
Polimorfismo sinónimo
CC = 0,90 CT = 0,10
p=1,000
CDKN1B
Exão 1
326/109 GTC�GGC V109G
Polimorfismo não-sinónimo
TT = 0,80 TG = 0,17 GG = 0,03
p=0,326
Nota:Os polimorfismos e as mutações estão numerados em relação ao cDNA, onde o nucleótido +1 corresponde ao A do ATG do codão de iniciação.
NA : Não Avaliado.
2. Pesquisa de alterações na linhagem somática
2.1 Alterações moleculares no gene MEN1
Os resultados da análise de alterações somáticas estão restritos a 25 dos 30
indivíduos estudados anteriormente, devido à impossibilidade de obter material
histológico em 5 casos.
A análise por SSCP e a sequenciação dos exões 2 a 10 do gene MEN1 levou à
identificação de duas mutações somáticas no exão 2, uma delas ainda não descrita na
literatura.
Uma das mutações é uma delecção de 49bp, com início no nucleótido 115,
codão 39 (c.115_163del49bp). Prevê-se que esta mutação frameshift origine uma
proteína truncada pelo aparecimento de um codão de terminação (codão Stop)
prematuro, no codão 102.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
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T C C C T A
T C C C T A
Imagem 10: As imagens ilustram a delecção de 49bp com início no nucleótido 115 (exão 2). A- Padrão de SSCP correspondente à mutação (seta). Os electroferogramas revelam em B a sequência normal e em C a existência de uma deleção, que ocorre entre os nucleotideos 115 e 163.
Imagem 11: Esta imagem ilustra as alterações resultantes da delecção de 49bp no exão 2 do gene MEN1 a nível proteico. Prevê-se que esta mutação origine uma proteína truncada, devido ao aparecimento de um codão de terminação prematuro no codão 102. (A leitura da sequência reinicia no codão 55 após a delecção). Wt: Wild type; Mut: Mutated.
Uma vez que esta alteração foi encontrada em hemizigotia, suspeitou-se que o
outro alelo (o alelo normal) teria sido delectado, ou seja, estaríamos na presença de
perda de heterozigotia (LOH).
Para verificar esta hipótese foi utilizada a técnica de MLPA que permite
verificar eventuais perdas de material cromossómico na região ocupada pelo gene
MEN1, na região 11q13.
Assim, comparando a amostra que apresenta a delecção com os casos controlo
(sem alteração) verifica-se a presença de diferenças entre os electroferogramas (ver
imagem 12). A comparação entre o resultado obtido na linhagem somática (DNA
C
B
A
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tumoral) e o correspondente da linhagem germinativa (DNA de sangue periférico do
doente), aponta para a ocorrência de dois eventos genéticos na linhagem somática
(delecção de 49bp verificada por sequenciação e LOH) (ver imagem 12 c)).
Os resultados do MLPA foram analisados pelo programa Coffalyser MLPA data
analysis software, que fornece informação relativamente às porções do gene que foram
perdidas.
Imagem 12: Esta imagem ilustra os resultados de MLPA obtidos para o caso que evidencia a delecção de 49bp em hemizigotia. a) Controlo negativo do MLPA (caso com sequência normal); b) Electroferograma correspondente à análise do DNA da linhagem germinativa por MLPA do caso com a delecção somática de 49bp; c) Electroferograma correspondente à análise da linhagem somática do caso portador da delecção de 49bp. As regiões que sofreram delecção estão apontadas com uma seta e os números indicam os exões delectados ( ).
A outra mutação encontrada neste gene é uma delecção de 4bp (GTCT) com
início no nucleótido 249 (c.249_252delGTCT), prevê-se que esta mutação conduza ao
aparecimento de uma proteína truncada, pois origina um codão de terminação
prematuro, no codão 117.
Linhagem somática
Delecção 49bp
c)
7200
5400
3600
1800
0
b)
7200
5400
3600
1800
0
7200
5400
3600
1800
0
DNA linhagem germinativa
DNA controlo Sequência normal
DNA linhagem somática
2
3 4
a)
b)
c)
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Imagem 13: A-Padrão de SSCP relativo à delecção de 4bp (GTCT) (seta) no codão 83 no exão 2, B- electroferograma da sequência normal; C- electroferograma da sequência com delecção de 4 bp.
O software ExPASy Proteomics Server (www.expasy.ch) permitiu, mais uma
vez, prever qual o efeito a nível proteico desta mutação, sendo de esperar o
aparecimento de um codão de terminação prematuro, na posição 117.
Imagem 14: Esta imagem ilustra os efeitos da delecção de 4bp a partir do nucleótido 249. Esta delecção de 4bp dá origem ao aparecimento de um codão stop prematuro, originando uma proteína truncada.
A análise somática (n=25) do polimorfismo D418D (rs2071313) no gene MEN1
permitiu verificar as seguintes frequências genotípicas CC 0,37; CT 0,41 e TT 0,22.
A comparação entre os resultados obtidos na linhagem germinativa e somática
permitiram verificar que quatro indivíduos heterozigóticos na linhagem germinativa
(CT), apresentaram um perfil hemizigóticos (T ou C) na linhagem somática, o que é
sugestivo de perda de heterozigotia (LOH).
A C C T G T C T A T G A T C G C C G C C C T C T A T G C C C G
A C C T G T C T A T G A T C G C C G C C C T C T A T
A T G A T C G C C G C C C T C T A T G C C C
A
B
C
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
30
Destes quatro indivíduos genotipicamente CT, três apresentaram apenas o alelo
T e o restante apenas o alelo C na linhagem somática.
Estes resultados foram posteriormente confirmados por MLPA (Imagem 15).
Verificou-se em 3 destes casos perda de material genético correspondente ao exão 9. O
restante caso caso mostrou perda de vários exões incluindo o exão 9.
Imagem 15: Esta imagem representa os resultados obtidos por MLPA para os casos que revelaram LOH para o polimorfismo D418D no gene MEN1. (As setas apontam para as regiões detectadas pela técnica como estando perdidas).
Os restantes casos foram também sujeitos a análise por MLPA, uma vez que
poderiam ter sofrido perda de material cromossómico, não tendo sido esta evidenciada
pela sequenciação, o que poderá ocorrer nos casos homozigóticos para a variante
9
9
9
8
4
6 5
9
DNA controlo Sequência normal
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
31
D418D, bem como para casos que apresentem delecções fora da região desta variante
polimórfica. Deste modo, foi possível verificar a existência de delecções em mais 5
casos.
Imagem 16: Esta imagem apresenta três exemplos dos resultados obtidos por MLPA em casos em que a análise do polimorfismo D418D se revelou não informativa para a evidência de LOH. (As setas apontam para as regiões detectadas pela técnica como estando perdidas).
9
9
9
8
8
6 10
6 4
DNA controlo Sequência normal
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
32
2.2 Alterações moleculares no gene CDKN1B.
Foi feita a pesquisa de alterações somáticas no gene CDKN1B também por
sequenciação, dos exões constituintes deste gene (exão 1 e 2).
Não se verificou a presença de qualquer alteração genética, excepto a presença
da variante polimórfica V109G.
As frequências genotípicas são as mesmas que as encontradas na linhagem
germinativa.
Tabela 2: Tabela resumo das alterações somáticas (n=25).
Gene &
Exão
Nucleótido/ Codão
Alteração genética
Tipo de alteração genética
Frequências
MEN1
Exão 2
115/39 c. 115_163del49bp Mutação
frameshift
0,04
MEN1
Exão 2
249/83 c. 249_252delGTCT Mutação
frameshift
0,04
MEN1
LOH
0,40
Nota:os polimorfismos e as mutações estão numerados em relação ao cDNA, onde o nucleótido +1 corresponde ao A do ATG do codão de iniciação.
2.3 Alterações na expressão da proteína Ciclina D1.
O estudo por imunohistoquímica da proteína Ciclina D1 revelou sobre expressão
desta proteína em 4 dos 25 (16,0%) casos estudados, usando um cut-off positivo de
10%.
Os restantes casos foram considerados negativos.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
33
Imagem 17: Exemplos dos resultados de imunohistoquímica obtidos para a Ciclina D1. A – caso classificado como positivo para a expressão da Ciclina D1, em que 33,3% dos núcleos das células tumorais se encontravam marcados; B e D - representam casos negativos para a expressão da proteína; C – representa um caso positivo, mas com uma percentagem de 19,7% de núcleos marcados (setas). (Ampliação de 400x). Tabela 3: Tabela resumo dos resultados obtidos na imunohistoquímica para a Ciclina D1.
2.4. Alterações na expressão da proteína p27.
Dos 25 casos em estudo, todos (100%) revelaram expressão nuclear da proteína p27 e
destes 25 casos, 9 (36%) evidenciavam também expressão citoplasmática da proteína.
Negativos Positivos
Nº de casos n (%) 21 (84,0%) 4 (16,0%)
% de células
marcadas
0 -5% 20 - 35%
400x 400x
400x
400x
400x
400x
A
D C
B
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
34
37kDa
25kDa
37kDa
25kDa
50 kDa
37kDa
50 kDa
37kDa
Imagem 18: Exemplos de resultados de imunohistoquímica obtidos para a proteína p27. A – caso classificado como positivo para a marcação nuclear; B – caso classificado como positivo para a marcação nuclear e citoplasmática. (Ampliação de 400x).
3. Detecção de alterações moleculares da proteína Ciclina D1.
Partindo dos 4 casos que revelam sobre expressão da proteína Ciclina D1,
realizou-se a extracção de proteínas do material tumoral incluído em parafina, com o
objectivo de comparar o peso molecular da proteína nativa com o peso molecular da
proteína sobre expressa.
Imagem 19: Imagens de imunohistoquímica ilustrativas dos quatro casos com sobre expressão da proteína Ciclina D1.
Após a análise por Western blot verificamos a presença da proteína Ciclina D1 de peso
molecular igual ao da proteína nativa (wt), 34kDa.
Imagem 20: Western blot para a Ciclina D1, nos casos que revelaram sobre expressão.
A B
400x
400x 400x
400x
400x 400x
C1 C2 C3 C4
wt C1 C2 C3 C4
Ciclina D1 (34kDa) Actina (43kDa)
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
35
V. DISCUSSÃO
O hiperparatireoidismo primário (HPTP) é a principal causa de hipercalcemia,
podendo ocorrer na sua forma esporádica ou associada a síndromes tumorais
hereditários. Nas formas familiares são conhecidos os genes responsáveis pelo
respectivo fenótipo, mas os mecanismos moleculares envolvidos na forma esporádica da
patologia permanecem pouco conhecidos (23).
A população incluída neste estudo foi constituída por 30 doentes com HPTP
aparentemente esporádico, seleccionados de uma base de dados com 80 doentes
seguidos no Hospital Pedro Hispano.
Na primeira fase do presente trabalho foi feito o rastreio de três formas
familiares de HPTP de forma a excluir a origem familiar dos casos de HPTP em estudo:
a síndrome MEN1, a MEN2A e a síndrome MEN1-like syndrome. Outros síndromes
com manifestação familiar de HPTP como, FHH, NSHPT e HPT-JT não foram
incluídos no estudo já que a história familiar e avaliação clínica não apontavam para a
presença de nenhuma destas outras formas.
Na série estudada, foi feita a pesquisa de alterações genéticas de toda a região
codificante do gene MEN1, ou seja do exão 2 ao 10, tendo-se verificado a presença de
uma mutação germinativa num dos doentes.
A mutação germinativa encontrada corresponde a uma delecção de 4bp (ACAG)
com início no nucleótido 628 (c.628_631delACAG). Esta mutação está presente em
heterozigotia e é uma mutação frameshift uma vez que altera a grelha de leitura da
sequência nucleotídica, originando uma codão de terminação prematuro no codão 222.
A nível proteico deverá resultar na codificação de uma proteína truncada, ou seja, não
funcional. Cerca de 75% das mutações descritas no MEN1 resultam numa proteína
Menina truncada, levando a perda de função (53,54).
A presença desta mutação indica que este indivíduo é portador de uma forma
familiar de HPTP, a síndrome MEN1, e não de uma forma esporádica. A mutação
(c.628_631delACAG) encontrada neste indivíduo já se encontra descrita na literatura
em famílias com síndrome MEN1, sendo a sua frequência de 2,5% (29, 53).
Apesar de pouco provável, não podemos excluir de todo a existência de outras
alterações germinativas na série em estudo. Em 10 e 20% das famílias com fenótipo
clínico de síndrome MEN1, não são detectadas mutações germinativas neste gene (55).
A não detecção de alterações nas sequências exónicas poderá dever-se à localização de
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
36
mutações em regiões reguladoras ou regiões não traduzidas do gene. A patologia
observada poderá ainda resultar de grandes delecções germinativas no gene MEN1, não
detectáveis por sequênciação directa, como já foi observado em famílias portuguesas
(56), ou então, de alterações moleculares noutros genes ainda não identificados.
O diagnóstico de MEN1 num doente, tem implicações importantes, uma vez que
os parentes em primeiro grau têm um risco de 50% de herdar o alelo mutado, e
desenvolver a doença devido à sua elevada penetrância.
Se, por um lado, a identificação de uma alteração genética germinativa pode
auxiliar na detecção e tratamento precoce de algumas patologias associadas, por outro
lado, o rastreio clínico e bioquímico de tumores endócrinos pode ser suspenso em
familiares não portadores da mutação no gene MEN1 (57). Por este motivo, realizamos
o teste genético a um descendente deste indivíduo, que se veio a revelar positivo
(resultados não apresentados).
Diversos estudos permitem afirmar a não existência de correlação genótipo -
fenótipo consistente para os casos de MEN1. Verificou-se que gémeos monozigóticos
com mutação no MEN1 podem apresentar fenótipos diferentes e que famílias com
manifestações clínicas muito semelhantes não possuem o mesmo tipo de mutações (58).
Isto sugere que poderá verificar-se alteração de expressão de uma determinada mutação
dependendo do fundo genético do indivíduo, por exemplo através da acção de genes
modificadores (genes que afectam a expressão fenotípica de outro gene) (59).
No gene MEN1 observamos ainda a presença de uma variante polimórfica (GAC
�GAT) no codão 418 e que consiste numa variação sinónima (D418D).
Pela consulta de bases de dados (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verificamos
tratar-se de uma variante polimórfica já descrita, presente em mais de 1% da população.
As frequências por nós obtidas não variam significativamente das observadas na
população controlo estudada por outros autores (60).
A variante D418D está descrita na literatura como um polimorfismo muito
frequente na população, sem qualquer efeito na função da proteína (61). Alguns autores
referem que esta variante polimórfica poderá ser um potencial marcador de HPTP
esporádico (60), mas na nossa série não encontramos uma relação estatísticamente
significativa entre a presença deste polimorfismo e HPTP.
Uma outra síndrome familiar onde o HPTP é um componente é, como já foi
referido, a síndrome MEN2, concretamente a variante MEN2A. Mutações activantes no
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
37
gene RET estão directamente relacionadas com o desenvolvimento desta síndrome. A
síndrome MEN2A é a forma mais comum de MEN2 e caracteriza-se pela presença de
carcinoma medular da tireóide (CMT), feocromocitoma e/ou tumores paratireoideus.
Em indivíduos com MEN2A a frequência de CMT é de 90%, de feocromocitoma 40-
50%, e tumores paratireoideus 10-20%. O CMT é geralmente a primeira manifestação
de MEN2A (62).
Ao contrário do que se verifica na síndrome MEN1, na síndrome MEN2
verifica-se a existência de uma correlação genótipo-fenótipo. Isto significa que há uma
associação clara entre as mutações no gene RET (genótipo), a idade de aparecimento da
patologia, a agressividade, e a presença de outras neoplasias, como o feocromocitoma e
hiperparatireoidismo primário (fenótipo) (63). Apesar de se poder verificar alguma
sobreposição entre as mutações e o subtipo de MEN2, 85% dos indivíduos com
MEN2A tem mutação no codão 634 (exão11). Mutações nos codões 609, 611, 618 e
620 estão presentes nos restantes 10 a 15% dos casos. O HPTP está associado a
mutações no codão 634, e em particular com a mutação C634R (64,65).
Apesar de o HPTP ser um componente raro da síndrome, o CMT encontra-se
associado a HPTP em 15 a 25% dos casos de MEN2A (66).
A população em estudo não revelou a presença de mutações germinativas no
gene RET, o que fortalece a hipótese de estarmos na presença de casos de HPTP
esporádicos.
A análise deste gene evidenciou, no entanto, a presença de variantes
polimórficas no exão 11 (G691S), 13 (L769L), e 14 (S836S).
O polimorfismo G691S (rs1799939), localizado no exão 11 está presente na
população em estudo em frequências genotípicas semelhantes às descritas para a
população Europeia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Trata-se de um polimorfismo não
sinónimo ou seja uma variação alélica de um gene que, por definição, não altera a
funcionalidade da proteína codificada, apesar de originar alterações na sequência
aminoacídica (67). Esta alteração está bem descrita em estudos de MEN2,
principalmente em casos de CMT (67,68) tendo alguns autores verificado uma maior
frequência deste polimorfismo, G619S, em indivíduos com CMT do que na população
controlo (23.3% vs. 12.5%). Estes mesmos autores referem que, apesar deste
polimorfismo estar presente na população “normal”, a sua elevada frequência em
indivíduos com CMT sugere que esta variante genética poderá ter um papel na
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
38
patogénese, bem como na predisposição para o desenvolvimento de CMT esporádico. O
polimorfismo G691S determina uma substituição aminoacídica, o que poderia conferir
ao receptor uma estrutura conformacional e electroquímica diferente, levando a uma
actividade funcional diferente. Por outro lado a frequência com que ele é encontrado em
indivíduos saudáveis torna difícil demonstrar a relação entre o polimorfismo e o
desenvolvimento de CMT (69). Este aspecto permanece pouco esclarecido (67).
No exão 13 verificou-se a existência de um polimorfismo no codão 769
(rs1800861) que dá origem a uma mutação silenciosa, não há troca de aminoácido
(L769L). Este polimorfismo está presente na população em estudo com as frequências
genotípicas indicadas na tabela 1 (secção III: Resultados). Diversos estudos tentaram
verificar a existência de relação entre esta variante polimórfica e o risco de desenvolver
CMT.
Winch e colaboradores descreveram que este polimorfismo ocorria
principalmente em indivíduos com CMT esporádico diagnosticado em idades precoces
(36%<30 anos vs 15%>30 anos) (70). Estes autores sugerem que este polimorfismo
poderá ter um papel modulador na apresentação fenotípica do CMT, em indivíduos com
predisposição (71). Em contraste, Elisei e colaboradores não encontraram diferenças
estatisticamente significativas entre as frequências alélicas de indíviduos com CMT e
indivíduos normais (67).
Por fim, o polimorfismo no exão 14, codão 836 (rs1800862) dá origem também
a uma variação sinónima, em que o resíduo de serina é mantido. Tal como os
polimorfismos anteriormente referidos, as frequências genotípicas podem ser
consultadas na tabela 1 (secção III: Resultados). De novo, alguns estudos referem uma
maior frequência deste polimorfismo em indivíduos com CMT do que em indivíduos
controlo (72,73). Contudo, torna-se difícil explicar como é que uma variante que não
leva a alteração aminoacídica origina activação oncogénica de um gene.
Apesar de o polimorfismo não afectar a capacidade de ligação DNA – proteína,
a estabilidade da transcrição ou o splicing do RNA, há autores que propõem que a
presença do polimorfismo pode causar instabilidade na sequência nucleótidica que está
a jusante do exão 15, dando origem a uma mutação a nível somático (72). Em 1999,
Gimm e seus colaboradores verificaram a importância da variante S836S do exão 14 e
chamaram a atenção para a maior frequência desta variante em indíviduos com CMT
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
39
esporádico provenientes da Alemanha e Estados Unidos da América, comparativamente
aos controlos da mesma área geográfica (9% vs 3.6%; p=0,03). A hipótese por eles
postulada era que a variante S836S levaria à criação ou facilitação de um local de
splicing, que daria origem a uma nova proteína (72).
Nenhum destes polimorfismos do gene RET foi associado com o risco de doença
da paratireóide e os nossos resultados não são conclusivos dado o limitado número de
casos estudados.
O estudo do gene CDKN1B neste trabalho deve-se, como já foi referido, ao
trabalho publicado por Pellegata e colaboradores em 2006 (25). Neste trabalho, os
autores referem a presença de uma mutação germinativa nonsense no codão 76
(c.G692A) do gene CDKN1B num indivíduo fenotipicamente MEN1 (apresenta
acromegalia devido a tumor na pituitária e hiperparatireoidismo primário), mas que
revelava ausência de mutações no gene MEN1. Estes mesmos autores verificaram a
existência de uma síndrome de neoplasia endócrina múltipla em ratinho (MENX), em
que o gene responsável é o CDKN1B (25).
Também Georgitsi e colaboradores verificaram a presença de uma mutação
germinativa no CDKN1B num indíviduo fenotipicamente MEN1, sem mutação no gene
MEN1. A mutação descrita por estes autores corresponde a uma duplicação de 19bp no
exão 1.
A nível proteico, esta duplicação origina uma proteína truncada, devido ao
aparecimento de um codão de terminação prematuro. A proteína resultante tem menos
69 aminoácidos que a proteína nativa (74).
Com base nestes achados, foi proposta a designação de um novo tipo de neoplasia
endócrina múltipla, MEN4, sendo esta nova síndrome ainda um pouco controversa
devido ao pequeno número de casos identificados.
Tendo isto em conta, foi feita a pesquisa de mutações no gene CDKN1B na série
em estudo. Verificamos a ausência de mutações, mas a presença de uma variante
polimórfica no codão 109, V109G. Este polimorfismo está em equilibrio de Hardy-
Weinberg e as frequências genotípicas estão descritas na tabela 1 (secção III:
Resultados). Neste gene estão descritos vinte e um polimorfismos, destes vinte e um,
onze têm uma frequência baixa (< 5%) e os restantes nove ocorrem na região não
codificante do gene. Apenas este polimorfismo no codão 109 origina substituição de
aminoácido (41). Kibel e colaboradores verificaram a associação entre homens com
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
40
genótipo TT e o risco aumentado de desenvolver carcinoma da próstata (odds
Protzner I, Kapusta L, Franssen E, Pritchard KI, Slingerland JM. Decreased levels of the
cell-cycle inhibitor p27Kip1 protein: prognostic implications in primary breast cancer.
Nature Medicine 3, 227-230 (1997).
92. Loda M, C.B., Tam SW, Lavin P, Fiorentino M, Draetta GF, Jessup JM, Pagano M.
Increased proteasome-dependent degradation of the cyclin-dependent kinase
inhibitor p27 in aggressive colorectal carcinomas. Nature Medicine 3, 231-234 (1997).
93. John P. Bilezikian, R.M., Michael A. Levine. The Parathyroids: Basic and Clinical
Concepts., (Academic Press, California, 2001).
94. Lim TH, T.S., Lim P, Lim AS. The incidence and patterns of BCR/ABL rearrangements in
chronic myeloid leukaemia (CML) using fluorescence in situ hybridisation (FISH). Ann
Acad Med Singapore 34, 533-538 (2005).
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
55
ANEXOS
Anexo I
Imagem 1: Imagem ilustrativa do Consentimento Informado.
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
56
Anexo II
Tabela 1: Descrição dos pares de primers usados para a amplificação das regiões alvo do gene
RET.
Exão Temperatura de
emparelhamento (ºC)
Tamanho do produto
de PCR (bp)
Sequência dos primers (5´�3´)
10 65ºC 165 F: AGGCTGAGTGGGCTACGTCT
R: GTTGAGACCTCTGTGGGGCT
11 65ºC 273 F: TGGCGGTGCCAAGCCTCACA
R: AGGGCAGGGGATCTTCCCTG
13 65ºC 118 F: TTTGCAACCTGCTCTGTGCT
R: TCACCCTGCAGCTGGCCTTA
14 65ºC 258 F: TGGAAGACCCAAGCTGCCTGA
R: TGGCTGGGTGCAGACCCATAT
15 65ºC 168 F: ATGGCCTGACGACTCGTGCT
R: ATGGTGCACCTGGATCCCT
16 60ºC 155 F: AGGGATAGGGCCTGGCCTT
R: TAACCTCCACCCCAAGAG
Tabela 2: Descrição dos pares de primers usados para a amplificação das regiões alvo de gene
CDKN1B.
Exão Temperatura de
emparelhamento (ºC)
Tamanho do
produto PCR (bp)
Sequência de primers(5´�3´)
1 62ºC 515 F: TTGTTTTTTTGAGAGTGCGAGAGA
R: ACATTCTATGGTTGGGAAAGGGT
2 62ºC 223 F: AACTTCTGCCAGCCATTGTTTTTT
R: AGTAAGATCAGGTATCGTGAGGT
Tabela 3: Descrição dos pares de primers usados para a amplificação das regiões alvo do gene MEN1
Exão Temperatura de
emparelhamento (ºC)
Tamanho do
produto PCR (bp)
Sequência dos primers (5´�3´)
2.1 60ºC 223 F: GGGCGGGTGGAACCTTAG
R: AAGGAAAGGAGCACCAGGTC
2.2 60ºC 182 F: CCCAGAAGACGCTGTTCC
R: GCTGGGCTGGAAGGTGAG
2.3 60ºC 196 F: GTGGAGCATTTTCTGGCTGT
R: CTCGAGGATAGAGGGACAGG
2.4 60ºC 226 F: TGGCCGACCTGTCTATCATC
R: CCACCTACTGGGCTCCAAC
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
57
3.1 60ºC 167 F: CCTTTCCCCATGTTAAAGCA
R: ACACTACCCAGGCATGATCC
3.2 60ºC 191 F: GTCTCCGGGATGTCCACCT
R: TACAGTATGAAGGGGACAAGG
4.1 60ºC 152 F: ATTCCCTGAAGCAGGCACAG
R: GTCAATGGAAGGGTTGATGG
4.2 60ºC 159 F: ATCATACATGCGCTGTGACC
R: CAAGTCAAGTCTGGCCTAGC
5 60ºC 102 F: CCTGTTCCGTGGCTCATAAC
R: CTGGCCACTTCCCTCTACTG
6 60ºC 167 F: GGTGGCAGCCTGAATTATGA
R: CAGCCACTGTTAGGGTCTCC
7.1 60ºC 116 F: AGGATCCTCTGCCTCACCTC
R: ACATTGCGGTTGCGACAGT
7.2 60ºC 151 F: ACATTGCGGTTGCGACAGT
R: ACAGGCTGCAGGCCCTAGTA
8.1 60ºC 192 F: GATGGTGAGACCCCTTCAGA
R: CCTTTCACCTGGCTTTGCT
8.2 55ºC 156 F: GACGAGGAGATCTACAAGGAGTT
R: GTGGGAGGCTGGACACAG
9.1 60ºC 155 F: CCCTCTGCTAAGGGGTGAGT
R: GACTGCCCTCCTCCCATT
9.2 60ºC 157 F: ACCTGCTGCGATTCTACGAC
R: ACCACCTGTAGTGCCCAGAC
10.1 55ºC 158 F: CCTTGCTCTCACCTTGCTCT
R: GCTCCTCTGGCTTGGACTC
10.2 55ºC 178 F: CGCATAGTGAGCCGAGAGG
R: GGGGTCCTGACACTGCAC
10.3 60ºC 177 F: AGAAGCCAGCACTGGACAAG
R: TCTGGAAAGTGAGCACTGGA
10.4 60ºC 150 F: CAGCACCCACAGCATCAC
R: TCATCTGCACTTGCGACTGT
10.5 55ºC 158 F: GTGGCCACCAAGATCAACTC
R: GGTCCGAAGTCCCCAGTAGT
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
58
Tabela 4: Condições de SSCP usadas no estudo dos genes RET e MEN1.
Concentração do gel
de MDE (%(v/v))
Temperatura de
corrida
Gene RET
(exões)
Gene MEN1
(exões)
0,8%
20ºC
10
13
14
2.1 – 10.5
8ºC -
0,6%
20ºC 15
16
8ºC 11
Tabela 5: Listagem dos anticorpos usados em imunohistoquímica
Anticorpo Diluição Tempo de incubação
Anti-Ciclina D1
(Neomarkers (SP4))
1:100 30 minutos
Anti-p27
(Santa Cruz)
1:250 O.N.
Tabela 6: Listagem de anticorpos primários usados em Western blot.
Anticorpo primário Diluição Período de
incubação
Hospedeiro Peso molecular
(kDa)
Anti - Ciclina D1
(Neomarkers (SP4))
1:500 O. N. Coelho 34
Anti-Actina
(Santa Cruz)
1:2000 1 hora Cabra 44
Hiperparatireoidismo Primário: Caracterização Molecular e Biomarcadores
59
Imagem 2: Estas imagens ilustram o exemplo de uma electroforese capilar de uma amostra de DNA controlo analisada com o kit SALSA MLPA P017-B1 MEN1 lot 0109, e a respectiva tabela que indica a correspondência entre os tamanhos (nt) e os respectivos exões (adaptado de http://www.mrc-holland.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=tz2fAPIAupKyMjaDF\E\t9bmuxqlhe/Lgqfk8Hkjuss|&ProductOID=2ECCR/VCBSs|