Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmen des Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besseren Durchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter das eingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, die Texterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichen Dateien mit Fehlern behaftet. Alle mehr als 700 Protokolle (Anfang 2007) können auf der Seite http://www.chids.de/veranstaltungen/uebungen_experimentalvortrag.html eingesehen und heruntergeladen werden. Zudem stehen auf der Seite www.chids.de weitere Versuche, Lernzirkel und Staatsexamensarbeiten bereit. Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007
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Hinweis Bei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll ... · Im Protein ist am ~-C-Atom die Carboxylgruppe einer Aminosäure mit der Aminogruppe am ~-C-Atom einer zweiten Aminosäure
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HinweisBei dieser Datei handelt es sich um ein Protokoll, das einen Vortrag im Rahmendes Chemielehramtsstudiums an der Uni Marburg referiert. Zur besserenDurchsuchbarkeit wurde zudem eine Texterkennung durchgeführt und hinter daseingescannte Bild gelegt, so dass Copy & Paste möglich ist – aber Vorsicht, dieTexterkennung wurde nicht korrigiert und ist gerade bei schlecht leserlichenDateien mit Fehlern behaftet.
Alle mehr als 700 Protokolle (Anfang 2007) können auf der Seitehttp://www.chids.de/veranstaltungen/uebungen_experimentalvortrag.htmleingesehen und heruntergeladen werden.Zudem stehen auf der Seite www.chids.de weitere Versuche, Lernzirkel undStaatsexamensarbeiten bereit.
Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007
-~
......,.__~/
Fachbereich eHE M I E der Fhilipps-Universität l':arburg
Protokoll zum 1. Experimentalvortrag vom 03.06.1980
Thema des Vortrags: PRO TEl N E
Rudolf Bochskanl
Feldweg 5
3550 Marburg/Cappel
Chemie in der Schule: www.chids.de
G 1 i e der u n g
1. Vorkommen
2. Bau und Struktur
a) Elementare Zusammensetzung
b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Primärstruktur
c) Räumliche Anordnung Sekundärstruktur
d) Molekülgröße und -gestalt Tertiärstruktur
J. Eigenschaften
a) Art und Struktur des Froteins
b) Art des Lösungsmittels
c) pH-Wert der Lösung
d) Veränderung der Tertiärstruktur
Literaturverzeichnis
Anhang
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1. Vor kom m e n
Die Materie der lebenden Welt besteht aus einer großen Vielfalt
organischer Verbindungen, von denen sehr viele makromolekularen
Charakter haben. Im pflanzlichen Bereich handelt es sich dabei
vorwiegend um Polysaccharide, im tierischen um Eiweiße oder
Proteine.
Der Name "Frotein", von BERZELIUS geprägt und zuerst in M(fL/D:f:RS' s
Lehrbuch (1840) gebraucht, ist abeeleitet vom eriech. protos
das Erste, Ursprüngliche. Diesen Namen tragen die Froteine zu
Recht, denn zahlreiche Lebensfunktionen sind anspezifische
Proteine gebunden; ja wir kennen kein Lecen ohne Froteine.
So ist jeder heterotrophe Organismus, sprich jedes Tier, zur
Aufnahme von Froteinen mit der Nahrung gezwungen, die er über
Assimilationsprozesse in körpereigene Proteine umbaut.
Als Beispiele proteinhaltiger Nahrungsmittel seien als pflanz
liches ~rodukt Sojamehl (40 % ~roteingehalt) und Hühnereiklar
(12 % Proteingehalt) als tierisches Frodukt vorgestellt, in
denen durch die sog. 'Xanthoproteinreaktion' die Anwesenheit
von ~roteinen nachgewiesen werden kann. - Der Name 'Xantho
proteinreaktion' enthält das grieche Wort 'xanthos' - gelb,
blond; es ist also mit einer Gelbfärbung des Reaktionsgemisches
zu rechnen:
Versuch 1: Xanthoproteinreaktion
2 ml einer proteinhaltigen Lösung werden in einern
HG mit 2 ml c on c , Hl'~CIJ versetzt. Dann wird das
Reaktionsgemisch lanesam gekocht, bis die zunächst
auftretende Fällung wieder verschwindet.
Nach dem Abktihlen gibt man vorsichtig conc. NaOH
hinzu. Im alkalischen Bereich schlägt die gelbe
Farbe nach orange um.
Der Chemismus dieser Reaktion wird aus methodischen Gründen
an anderer Stelle nachgeholt.
2. Bau und S t r u k t u r
a) Elementare Zusammensetzung
Wie oben bereits angesprochen, handelt es sich bei den Froteinen
um biologische Makromoleküle, denen L-Aminosäuren als Bausteine
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. \..-/
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zugrunde gelegt sind; man kennt heute 20 dieser Aminosäuren.
Die Verkntipfung der Aminosäuren zu einern Protein verläuft stets
geordnet, über die sog. Peptidbindung, zu Polyarninosäuren oder
Proteinen, falls diese aus mehr als 100 Aminosäuren bestehen,
wie man als Richtgröße festgelegt hat. Dabei erstreckt sich das
Spektrum der Molekulargewichte von froteinen von wenigen Tausend
bis zu mehreren Millionen. (Folie 1,.oben).
Trotz der Vielfalt der ~roteine (201 = 2,4x1018
Verknüpfungs
möglichkeiten der 20 Aminosäuren) ist ihre Zusammensetzung auf
lallend gleichförmig; sie vermag daher über die Eigenschaften
eines Froteins nicht viel auszusagen.
Proteine enthalten meist im selben Ausmaß: (Folie " unten).
Wie sofort auffällt, nimmt der Stickstoff, mit einem prozentualen
Anteil von 1;-18 %, eine wesentliche Stellung ein, wodurch sich
die Froteine von den anderen biologischen Makromolekülen wie
den Kohlenhydraten und den meisten Lipiden grundsätzlich unter
scheiden.
Neben diesen genannten Elementen enthalten viele Froteine noch
Spuren von: Pt Fe, Cu, Zn, 1'1n, Cl, Er, J.
b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Frimärstruktur
Um den Aufbau eines Froteins besser verstehen zu kannen, ist es
notwendig, sich genauer mit der Verknüpfung der Aminosäuren zu
einem Frotein auseinanderzusetzen: (Folie 2, oben).
Im Protein ist am ~-C-Atom die Carboxylgruppe einer Aminosäure
mit der Aminogruppe am ~-C-Atom einer zweiten Aminosäure durch
eine Peptidbindung - auch Amidbindung genal~t - kovalent ver
knüpft. Zwei Aminosäuren können formal unter Wasserabspalt~ng
zu einem Dipeptia kondensieren.
Das Gleichgewicht dieser Kondensation liegt bei Raumtemperatur
allerdings ganz auf der Seite der Edukte - die Feptidbindung ist
also endergonisch, da die Aminogruppe viel zu schwach nucleo
phil ist, um direkt mit der Carboxylgrup~e ein Amid zu liefern.
Bei der synthetischen Bildung von Feptiden und ~roteinen müssen
deshalb des reaktiven Gruppen zuerst "aktiviert", d v h , in eine
reaktionsfähigere Form gebracht werden, indem man z.B. die
Carboxylgruppe zunächst in eine Acylhalogenidgruppe überführt.
Durch fortgesetzte Kondensation bilden sich Tripeptide, Tetra
peptide und schließlich folypeptide, kettenförmige, aus Amino-
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- J -
säuren aufgebaute Makromoleküle. Dem auf diese Weise ent
standenen langgestreckten Molekül teilt man die Bezeichnung
Frimärstruktur zu: (Folie 3).
Zum besseren Verständnis dieses Sachverhaltes soll hierzu das
Modell einer Peptidkette, genauer, eines Fentapeptids, dienen,
das aus den Aminosäuren Cystein, Tyrosin, Glutaminsäure, Arginin
und Histidin aufgebaut ist. An diesem Peptidfaden kann man auf
grund der Feptidbildung zwei verschiedene freie Enden unter
scheiden: Einmal das Ende mit der freien Aminogruppe oder das
N-terminale Ende und andererseits das Ende mit der freien
Carboxylgruppe oder das C-terminale Emde. Auch am Modell wird
deutlich, daß die Aminosäure-Reste an der Feptidradenbildung
nicht beteiligt sind, sondern als voluminöse Reste seitlich
herausragen. Um möglichst große Abstände zwischen den Resten
zu erhalten, ist der reptidfaden jeweils am ~C-Atom gewinkelt
(1100
) ,
Da eine synthetische Peptidbildung über mehrere Reaktions
schritte verläuft und einen enormen Zeitaufwand erfordern würde,
soll auf einen Modellversuch zurtickgeriffen werden, der eben
falls eine Verknüpfung kleiner Bausteine zu einem Polymerisat
über Feptidbindungen zeigt:
Versuch 2: Darstellung von ~ylon 6,10 (Modellversuch)
Man füllt eine Lösung von 1,5 ml Sebacinsäuredi
chlorid im 50 ml CC1 4 in ein Becherglas. Darüber
schichtet man eine Lösung von 2,2 g Hexamethylen
diamin und 4 g ~a2coJ in 50 ml Aq. desto desto
Mit einer }inzette wird der sich bildende Grenz
flächenfilm in der Mitte der Oberfläche erfaßt und
als laufend sich bildender Faden aus dem Becherglas
abgezogen.
Der dabei ablaufende Kondensationsprozeß unter Freisetzung von
Hel ist auf Folie 2, unten dargestellt. Der Zusatz von Na 2CO Jbewirkt das Abfangen von Hel unter Freisetzung von CO2•
Der Nachweis, daß Froteine nun wirklich peptidarti~ verknüpft
sind, soll durch eine spezifische Nachweisreaktion für gebundene
Aminogruppen, der sog. Biuretprobe, erbracht werden:
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Versuch J: Biuretprobe: Na c hw e d s der Fept idbindung
Wenige ml verdürmter
a) Biuret-,
b) Eiklar-,
c) Glycinlösungen (= Glykokoll)
werden mit demselben Volumen 2 N NaOH und wenigen
Tropfen 0,1 %iger CuS04-Lösung versetzt. - Bei einem,. 2+ ( )Vberschuß an Cu -Ionen in jeder ~robe fällt Cu OH 2
in feinen, hellblauen Flocken aus.
Es bildet sich in den ~roben a) und b) sofort ein
intensiv violett gefärbter Komplex, während in Frobe
c) eine intensive Blaufärbung zu beobachten ist.
In allen drei Fällen beruht die Färbung auf einer
Komplexierung der Cu2+-Ionen.
Wie Folie 4 deutlich zeigt, bildet sich in den Froben a) und b)
der Biuretkomplex (violett), dagegen in Frobe c) der Arnino
glykokollkomplex (blau).
Verwendet man jedoch für die Biuretprobe eine Eiklarlösung, die
ca. JO Min. mit 2 N NaOH gekocht wurde, so fällt zunächst die
Braunfärbung der Lösung auf. Diese beruht auf der Anwesenheit
von Huminfarbstoff, einern C40-Molekül, das sich aus Zuckern Ce
bildet hat, die im Eiklar vorhanden sind. hach Zusatz von CuS04
Lösung müßte eich die Lösung blau gefärbt haben, die jedoch von
der Farbe des Huminfarbstofrs, trotz starker Verdünnung mit
Wasser, überdeckt wurde. Diese Reaktion ist dadruch zu erklären,
daß die Proteine im Eiklar hydrolytisch gespalten wurden, wodurch
die einzelnen Aminosäuren freieesetzt wurden.
Man kann also daraus schließen, daß sich die Spezifität der
Biuretprobe nur auf Peptidbindungen erstreckt, nicht aber auf
freie Aminosäuren.
Wie der letzte Versuch deutlich gezeigt hat, dürfte auch ex
perimentell die hohe Stabilität der kovalenten Feptidbindung
bewiesen sein, die erst nach längerem Kochen - hier: alkalische
Hydrolyse - gespalten wurde.
Diese Reaktion mach~man sich in der analytischen Biochemie zu
nutze; hier verfährt man in der Weise, daß man die Proteine
entweder durch Säure hydrolysiert oder durch Enzyme, was inso
fern von Vorteil ist, als hierbei keine Aminosäuren zerstört
werden.
Als Beispiel einer sauren Hydrolyse soll die Hydrolyse von Eiklar
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. \.-,/
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demonstriert werden:
Versuch 4: Saure Hydrolyse und Dünnschichtchromatographie von
Eiklar
10 g Hühnereiklar werden 24 h mit 40 ml 6 N HCI am
Rückflußkühler bei 110°C gekocht.
Am Rotationsverdarnpfer wird das Gemisch fast bis zur
Trockene eingedampft und anschließend zweimal mit
Wasser aufgenommen und der Vorgang wiederholt, um
die überschüssige Salzsäure zu vertreiben.
Dieses Hydrolysat wird chromatographisch untersucht:
Als Trägermaterial verwendet man DC-Flatten (20x20 cm)
Auf einer Ecke der ~latte, etwa 2 cm von den Rändern
entfernt, wird die Lösung des Eiweißhydrolysates mit
einer Mikropipette auIgetragen. Die Auftragung wird
7-8x wiederholt, jedoch erst dann, wenn der Fleck an
der Luft eingetrocknet ist.
Als Fließmittel verwendet man zwei verschiedene Ge-
mische:
1. F 1 i e ß mit tel: n - E u t an 0 1 : Eis e s s i g : }I20 = 4: 1 : 1
2. " Phenol: H20 = 4:1
Zur Entwicklung des Chromatogramms besprüht man mit
einer 0,1 %igen an Wasser gesättigten Lösung von
IJinhydrin in n-Butanol, der einiEe Tropfen Eisessig
zugesetzt wurden. Das Chromato€rarnm wird bei 105°C
im Trockenschrank getrocknet.
Die Reaktionsmechanismen der Hydrolyse entsprechen den Mech
anismen der Esterspaltung. Die Ninhydrinreaktion beruht auf
der Komplexierung der Aminstickstoffs der Aminosäuren.
Eine weitere Möglichkeit qualitativ zu überprüfen, welche
Aminosäuren am Aufbau eines Froteins beteiligt sind, liegt
darin, daß man spezifische Nachweisreaktionen der Arninosäure
Reste gefunden hat. Als ein Beispiel sei die spezifische Nach
weisreaktion auf den Aminosäure-Rest von Tryptophan demonstriert,
indem zwei verschiedene Froteine, nebst Tryptophan als Blind
probe, untersucht werden:
Versuch 5: Tryptophan-Nachweis nach HOfKINS & COLE
2 rnl verdünnter
a) Tryptophan-
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Versuch 5: (Fortsetzung)
b) Eiklar-
c) Gelatinelösungen
werden mit 1 ml Glyoxylsäurelösungen (10 %ig) ver
mischt. Anschließend wird das Stoffgemisch vor
sichtig mit cone. H2S04 unterschichtet.
Es bilden sich zwei Phasen, an deren Berührungs
fläche ein violetter Ring entsteht. Gewisse Verun
reinigungen können eine Verschiebung des Farbtons
nach Braunviolett hervorrufen.
Dieser violette Ring ist jedoch nur in den Froben a)
(Blindprobe) und b) zu beobachten. Frobe c) zeigt
keine Farbveränderung.
Hieraus läßt sich der Schluß ziehen, daß Tryptophan am Aufbau
der froteine im Hühnereiklar beteiligt ist, im Gegensatz zur
Gelatine.
Reaktionsmechanismus: Folie 5.
An dieser Stelle bietet sich die Erklärung der anfangs durch
geführten Xanthoproteinreaktion an, da diese ebenfalls auf dem
- Cys-M et-Gly -As p - Se r - Gly -Gly-Pro - Leu - Val -Cys -
-Cys-';!n- f;l y - Asp ' S', r -G l y -Gly - Pr o - Lf'u - H l s -oys -
-Cys - G1u- G1y-A s p-S e r ··Gly- Gly- Pro- Phc -Vd I -M~t-
- Cys -G l n-G l y- Asp- Se r -G l y-G l y- Pro-Leu-Va l-CY s -Pl ilsmin
Trypsin
Chymotry psin
El astas e
ThromL ln
est er asen , D ie H ydrolyse k ann als e in Ar ylt ransfcr an1;1'5l'h en we rden, b ei der e in Acyl-Rcst von ei ne r /I .m o-C ruppc [I 'r ot ea scn ) Olle re in er H y drc xy -C ru p pe ([ S ler.l ~ ell ) .1\1 ~Va s scr üb er t r .igc u wi rd . Ans te lle d e s int c rmr-d ia rc n 0 -", vl -S c rin -De riv atr- , ki i n nt' l1 r.,.j Fn zy m cn mit Cy~.k i l1 im aktiven Zr-ntrum in J na k 'l;er \\'l' i,e S'r\ cy l-Cyst c in - D c rivute den reakti o n sfähigen Zwi sch en z ust.md bilden (Schema 20) .
Schema 19 , Am inosä u rc-Scq uc u zcn um Jen Seri n-Rest im akti ven Zentrum vo n Se r in -Pro teas en
2.3 .1.1. ß cdl'ulll/lg einz elner Aminos .iuren {iir den Mecl1arlis-/IlItS der cll zymJ..-1l1111ysi erlell Reaktion
Die Bede ut u ng e inzelner Am in o säuren Für d a s akt iv e Zentrum undd .l ~ Z lI<" llI1l1lcw;rid d e r Amino sa u re n fü r J en Rca k t ionsmech anisrnusist a ru b est e-n 1>"i d en Hydrola sen untersu ch t. Seh r h ä ufig ist e in S er in-Res ] unter BilJung ei n es cov alen ten Ov Acvl-Derivates a m hyd rolyt isch en V o rg .l ng b et e il igt (S cherna 11\, S. 28 ) :' w :ih re n d e in H istid inR est und b ei e in igen En zy me n zu s.i tz lich ei n A s par ag in s .iu re-Rcs tdurch \ \'a s '> crst l lftbrii rken d ie rcaktion vf.ihigen Z w isch enzu st ände(tran s it ion !;ta ll' ) b ild en. D ie se En zy m e w e rd en al s Ser in -H ydrola sen(S e r in -Pro tc.r se n) bezeic h ne t . Zu ih ne n g ehö re n t: ß. TrYP::;I1, ClryTt! o /ry /, s ill , Ela~/t1 s e, T hrombin, {' ['ls m il1 , 5 111J tili:;;I1 , d ie alle in d erAminosau re-Seq ue n z um d ie sen akt iven Scrin-Re st g roße Überei n s t im m u n gen zei g e- n (Schema 19), so w ie d ie m e ist e n der Carbo xy -
, ? ·•.lt ./lr..t c.. ",, : , ~ .
Z u r B,··;(hrr·ihung der f un ktionen d es A kt iven Z e ntrum s kann es inm ch rr-rv S uhn'lI t re ll [su b vit c s) unterteilt we rd e n . M <l n untersch e id etd -,l ~ [l ! n lh n ;.; ~ :! ('nt rum (L inJi ng ,ik) d .rs nur für d ie Bin,Jung d es Su bstral cs a n .1 .\ 5 En zym verantwortl ich is t, so w ie da s k J L1]yt islhe Ze n tru m (Cll.1I)-' II< s itc }, cl , I S d in -kt a n '! ('r k .1 1al yti sc1wn R,' ., k tin n b e te iligl j .; l. D ie A m in o s.iurcn des k a ta ly t ischen Z entru m s können b e ieini ge-n En zymcn unt e r te il! werden in so lch e, d ie im Verl auf d ere n zym.rtis clu -n Reak tion ei ne co va lc ntc Bindung m it d em S u bs t r a tei ngl'hen , lind andere, die nur üb er nicht -covalente Bindung en a n derR ea kti on teilnehmen.
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Sd,c ma 20. fll l)' ll\ln rdlanismu5 o be r ei ne co va lc n te S\lb ~tral -rn 7.ym-Thio _(" l.-r b ind un g : Ubt'l't .lIIg sz u s t.lll J .In I ·.l l' .l in - k ~ t.ll y si cr l cn I'ro tco lysc
Bei ei ne r Gruppe w cite rcr H yJrolasen sind C a rboxy -Cr uppcn durchcova lcn tc Bindung en an J ('r Re.lkt io n beteil igt. Im Fa lle vo n Pro tea se n Irpten da b ei .IIs Zwi schenzus tä nJe gemisch te A n hyd r ide .1U f, d iein ei ne r FoIgere <1 kt io n h yd rolys io r j w erd en (SdH'm.l 21 , S . 3 1). Be isp iele da für sind die Car /JoxYT'ep lidllse und d .l ~ Pep sin , Im Falle desrc p~ i n s erfol);t jed o ch n icht nur eine an h yJriJart ige Bin d u ng derCollboxy -Kompnnen te , son dern an ei n e r zweite n Carboxy-G ruppew ird .ludI d ie A mi no-Kom pone n te a m id .irtig geb unde n (Sch ema 22,S . J2) . D u rch di e se räuml iche Fix ie run g der Ami no-Kompone n te wi rdd ie r ückl ä u fig e Reak tio n , die Bildung ei ner I' c'pliJ -BinJ lIn g , w escnt Ii." e rleich te r t. Dami t k önnen d ie be im Pepsin be ka nnten Transpep tid ie r u ng s-Reakr ionen erklä rt werden.
D e r Mech a nis m us der durch R iv ol/llc/cl/se k at al y s iert en S pa ltu ng vonNuclei n sa ure n verl äuft übe r ei nen cy cl ische n 2·,3'- f'ho~phor s ;i ure.evl cr (Sche m a 23, S . 3 3) . A n der Reak t ion sind zwe i H bt iJ in -ResteJ c ~ [ n zYllls bc tci lig t . ( D ie A rnin o sa u rr-n des ak tive n Ze n tru ms s indülu -r ei ne n wei ten Be reic h d er A mi nos.iu re-Sequcnz ver te ilt : Sc!H'l ua2-1. S . J .t. ) S pPL.Hische S u b s t r a te d es Ly so':Y/II s s ind I'olyscccha r id«, d iea lt er nie re n d d ie Z ucker- R e s te N -A cetyl -glu co sa m in u nd N -'\cet yl mu r ~ m in s :i ure e ntha lt e n (Sch ema 25.5.35). wobei eine gl ykos idischeBin d un g zwischen einem Muram in sau re - u nd ei nem C I U Co~,l lllin- Reslg e,pa lle n wird . Zur Sp.l lt u ng mu ß min .Ies tc n -, ei n He xa saccha r id vori iq ;en . I:.i n nur .IUS N-Accty l ··g ll1co~amin Resten be st eh en d es Trisacch a rid wi rd von de m En zy m n ur geb u nden, aber ni cht ge spalten(\..c1m p C't it iver Inh ib itor, s . S . 59 ). D ie Rönt gen slrukturan.ll yse d iesesk ri s t .rl livie rbarcn Kom plcxcs liefr-rt e wi , h tigl' Il in w C' bc über Ja s a kt ive Ze n t rum d e s Ly so zyms lind übe r d ie B i nJ u n~wcrhJltn i s sc arnS u h, t r.l!/ [ n zy rn -Ko m p le x. An d er S pa ltu ng der Uindllnp; w ir ken imk.lt.lly ti sch e n Zen trum C lu tamin s .iurc in I' o sif ion 35 und A sparag ins :iu re in Pos it ion 52 mit. Das Bindu ngSlell t ru m des Ly so zym s vertei lts i<!t iih t' r eine 1.1111;(' R iI1(', d ie an der :\ uE e!1';l ' ite de r T('rt i :ir ~tl uk t u rch, s Enzyms lie gt . An d er S ubs tr a tb in du ng si n d mindesten s 12 A m inosa u re- n be tcrlig ! (Schem a 25) ,