Page 1
T.C.
ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ
TIP FAKÜLTESĠ
ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI
ANABĠLĠM DALI
NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI
HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT
MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ
ÜZERĠNE ETKĠSĠ
Dr. Erdal TAġKIN
NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ
TEZ DANIġMANI
Prof. Dr. Mehmet SATAR
ADANA–2010
Page 2
T.C.
ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ
TIP FAKÜLTESĠ
ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI
ANABĠLĠM DALI
NEONATOLOJĠ BĠLĠM DALI
HĠPOKSĠK ĠSKEMĠK ENSEFALOPATĠ OLUġTURULAN RAT
MODELĠNDE ĠNDOMETAZĠNĠN NÖRONAL APOPĠTOZ
ÜZERĠNE ETKĠSĠ
Dr. Erdal TAġKIN
NEONATOLOJĠ YANDAL UZMANLIK TEZĠ
TEZ DANIġMANI
Prof. Dr. Mehmet SATAR
ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ
ARAġTIRMA FONU
TARAFINDAN DESTEKLENMĠġTĠR.
PROJE NO: TF-2006/LTP-32
ADANA-2010
Page 3
I
TEġEKKÜR
Neonatolojii yan dal eğitimim süresince yardımlarını ve deneyimlerini esirgemeyen değerli hocam ve
tez danıĢmanım Prof. Dr. Mehmet SATAR‟a ve birlikte çalıĢmaktan zevk duyduğum Prof. Dr. Nejat NARLI‟ya,
Doç. Dr. Hacer YAPICIOĞLU YILDIZDAġ‟a, tezime yardımlarından dolayı Patoloji Ananbilim Dalı‟ndan
Prof. Dr. Suzan ZORLUDEMĠR‟e, arkadaĢlarım Uzm. Kenan ÖZCAN‟a, Uzm. Dr. Ferda ÖZLÜ‟ye ve
Yenidoğan Kliniği çalıĢanlarına teĢekkür ederim.
Ayrıca yan dal ihtisasım süresince desteğini esirgemeyen eĢim Berrin TAġKIN‟a, sevgili çocuklarım
Zeynep TAġKIN ve Beril TAġKIN‟a teĢekkür ederim.
Page 4
II
ĠÇĠNDEKĠLER
TEġEKKÜR II
ĠÇĠNDEKĠLER III
TABLO LĠSTESĠ V
ġEKĠL LĠSTESĠ VI
KISALTMA LĠSTESĠ VII
ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER VIII
ABSTRACT- KEYWORDS IX
1. GĠRĠġ 1
2. GENEL BĠLGĠLER 2
2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati 2
2.1.1.Tanım 2
2.1.2. Ġnsidans 2
2.1.3. Asfiksi Tipleri 3
2.1.3.1. Kronik Kısmi Asfiksi 3
2.1.3.2. Akut Tama Yakın Asfiksi 5
2.1.4. Patoloji 6
2.1.4.1.Selektif Nöronal Nekroz 8
2.1.4.2. Status Marmoratus 8
2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar 8
2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi 8
2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt 9
2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı 9
2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi 10
2.1.5.1. Hipoksemi 12
2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi 12
2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 13
2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü 13
2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz 14
2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması 14
2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi 17
2.1.5.3.5. Serbest radikaller 19
2.1.5.3.6. Sitokinler 20
2.1.5.3.8. Apopitoz 20
2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler 23
2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak 24
2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak 25
2.1.5.3.8.4. Kapspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu 25
2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu 25
2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriĢimler 26
2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması 26
2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu 27
2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileĢtirilmesi 27
2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi 29
2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu 29
2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi 30
2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler 31
Page 5
III
2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi 31
2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri 31
2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri 32
2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması 33
2.2.1.5. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması 33
2.2.2. Fosfolipaz A2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar 34
2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı 35
2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı 36
3. GEREÇ ve YÖNTEM 38
3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag® Peroxidase Uygulanması 40
3.2. Histopatolojik değerlendirme 42
3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme 42
4. BULGULAR 43
5. TARTIġMA 48
6. SONUÇLAR 52
7. KAYNAKLAR 53
8. ÖZGEÇMĠġ 62
Page 6
IV
TABLO LĠSTESĠ
Tablo no Sayfa no
Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 3
Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 4
Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı 7
Tablo 4. HĠE‟li yenidoğanda nöropatolojik özellikler 7
Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iĢlevsel farklılıklar 23
Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 24
Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriĢimler 28
Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon
ve sitokinler 30
Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı 43
Tablo 10. Gruplara göre apoptotik hücre dağılımı 44
Page 7
V
ġEKĠL LĠSTESĠ
ġekil no Sayfa no
ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıĢ 11
ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve
astrosit içerisindeki döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları 15
ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı 18
ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluĢumu 19
ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 45
ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluĢturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif
boyanan apoptotik hücreler 45
ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta
TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46
ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen
grupta daha az sayıda TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 46
ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan
grupta belirgin olarak azalan TUNEL pozitif boyanan apoptotik hücreler 47
Page 8
VI
KISALTMALAR
ADP Adenozin difosfat
AMPA Alfa-amino-3.hidroksi-5.metil-4.izoksazol propionik asit
ATP Adenozin trifosfat
BOS Beyin omurilik sıvısı
Ca2+
Kalsiyum
COX Siklooksijenaz
DNA Deoksiribonükleik asit
EDRF Endotelden derive edilen gevĢetici faktör
eNOS Endoteliyal nitrik oksit sentaz
FAD Flavin adenin dinükleotit
GH Growth hormon
HĠE Hipoksik iskemik ensefalopati
IGF-1 Ġnsülin like growth faktör-1
ĠL-1 Ġnterlökin-1 beta
ĠL-6 Ġnterlökin-6
iNOS Ġndüklenen nitrik oksit sentaz
KA Kainat
MSS Merkezi sinir sistemi
NAD Nikotin adenin dinükleotit
NADP Nikotin adenin dinükleotit fosfat
NMDA N-Metil-D-Aspartat
nNOS Nöronal nitrik oksit sentaz
NO Nitrik oksit
NOS Nitrik oksit sentaz
O2 Oksijen
PG Prostaglandin
PVL Periventriküler lökomalazi
PVHĠ Periventriküler hemorajik infarkt
QA Kuiskalat A
TGFB Transforming growth faktör B
TNF- Tümör nekrozis faktör alfa
Page 9
VII
ÖZET
Amaç: Siklooksijenaz yolağı ve prostaglandinler hipoksik-iskemik beyin hasarı patogenezinde ve gecikmiĢ
beyin hasarı mekanizmasında önemli rol oynar. Bu çalıĢmada hipoksik iskemik rat modelinde farklı dozlardaki
nonselektif siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin nöronal apopitoz üzerine etkisi araĢtırıldı.
Gereç ve Yöntem: Levine-Rice metoduna göre hipoksik iskemi oluĢturulan yedi günlük ratlar beĢ gruba ayrıldı.
Grup I (n: 15) ratlara serum fizyolojik verildi, arter ligasyonu ve hipoksi yapılmadı. Grup II (n: 15) ratlara
hipoksik-iskemiden sonra serum fizyolojik verildi. Grup III (n: 15) ratlara hiposik-iskemiden önce tek doz 2
mg/kg indometazin verildi. Grup IV (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 2 mg/kg
indometazin verildi. Grup V (n: 15) ratlara hipoksik-iskemiden sonra 12 saat arayla üç doz 4 mg/kg indometazin
verildi. Ratlar hipoksik-iskemiden 72 saat sonra dekapite edildi ve beyin hemisfer dokuları TUNEL yöntemi ile
değerlendirildi.
Bulgular: Hipoksik-iskemi öncesi ve sonrası verilen indometazin tedavisi hipoksik-iskemi sonrası serum
fizyolojik verilen grup ile karĢılaĢtırıldığında rat beynindeki apopitotik hücre sayısını önemli ölçüde azalttı
(p<0,001).
Sonuç: Bu sonuçlara göre indometazin tedavileri hipoksik iskemik beyin hasarı tedavisinde iyi bir seçenek
olabilir.
Anahtar kelimeler: Hipoksik-iskemi, beyin zedelenmesi, apopitozis, indometazin
Page 10
VIII
THE EFFECTS OF INDOMETHACIN ON NEURONAL APOPTOSIS IN NEWBORN RATS WITH
HYPOXIC-ISCHEMIC BRAIN INJURY
ABSTRACT
Purpose: Cyclooxygenase pathway and prostaglandins plays an important role in the pathogenesis and delayed
mechanisms of hypoxic-ischemic brain injury. The aim of this study was to investigate the effect of different
doses of indomethacin, a nonselective cyclooxygenase inhibitor, on neuronal apoptosis in rats with hypoxic-
ischemic brain injury.
Material and Methods: Seven-day-old rat pups with the Rice model of hypoxic-ischemic cerebral injury were
randomly divided into five groups. Group I (n: 15) pups were given physiologic saline, but neither ligation nor
hypoxia were performed. Group II (n: 15) pups were treated with physiologic saline after hypoxic-ischemia.
Group III (n: 15) pups were treated with indomethacin at a dose of 2 mg/kg per before hypoxic ischemia. Group
IV (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin at a dose of 2 mg/kg every 12 h after hypoxic-
ischemia. Group V (n: 15) pups were treated with three doses of indomethacin, at a dose of 4 mg/kg every 12 h
after hypoxic ischemia. After 72 hours, the rats were decapitated and each brain hemispheres tissues were
evaluated by using the TUNEL staining method.
Results: Indomethacin treatment either before or after hypoxia, results in a significant reduction in the numbers
of apoptotic cells in rat brains when it is compared with group treated with physiologic saline after hypoxic-
ischemia (p<0,001).
Conclusion: These results demonstrated that indomethacin administration either before or after hypoxic-
ischemia reduce neuronal apoptosis, and we propose that indomethacin may be a good option for the therapy of
hypoxic-ischemic brain injury.
Key Words: Hypoxic ischemia, brain injury, apoptosis, indomethacin
Page 11
1
I. GĠRĠġ ve AMAÇ
Hipoksik Ġskemik Ensefalopati (HĠE) yenidoğan mortalitesine ve uzun dönemde
gözlenen serebral palsi, mental retardasyon ve epilepsi gibi morbiditeye neden olabilen
yenidoğanın önemli sorunlarından biridir.1,2
HĠE‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen süre olan ve terapotik pencere‟
olarak adlandırılan bu kritik dönemde oluĢan hücre ölümüne neden olan moleküler
olaylar kaskadının sonlandırılarak, programlanmıĢ hücre ölümü olarak bilinen nöronal
apopitozun önlenmesi HĠE‟nin tedavisinde güncel yaklaĢımların temelini
oluĢturmaktadır.3
AraĢidonik asit ve prostaglandinlerin (PG) HĠE etiyopatogenezinde önemli
rolleri olduğu bilinmektedir.4-6
Hipoksi-iskemi sonrasında intrasellüler kalsiyum
konsantrasyonunun artmasıyla fosfolipaz A2‟nin aktive olduğu, membran
fosfolipidlerinin yıkılmasıyla hücrede araĢidonik asid biriktiği, siklooksijenaz ve
lipooksigenaz enzimlerinin aktivasyonuyla prostoglandinler, tromboksan A2 ve
lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikallerinin açığa çıktığı bilinmektedir.2
Serbest
radikalllerin hücrelere veya makromoleküllere doğrudan zarar verebildiği gibi
proapopitotik genleri tetiklediği ve kaspaz-3 aktivasyonunu içeren ve hücreyi apopitoza
götüren hücre içi olaylar kaskadını uyardığı ileri sürülmüĢtür.3
Ġndometazin gibi PG üretiminin baskılanmasına yol açan bir siklooksijenaz
(COX) enzim inhibitörünün reperfüzyon-reoksijenasyon döneminden sonra
verilmesinin, postiskemik infarkt alanını küçültüğü hem de nöronal hasarı azalttığı
gösterilmiĢitir.7,8
Bu çalıĢmada nonselektif bir siklooksijenaz inhibitörü olan indometazinin
HĠE‟de nöroprotektif etki sağlayabileceği hipotezi öne sürülmüĢtür. Bu amaçla HĠE
oluĢturulan 7 günlük ratların beyin dokusunda TUNEL yöntemi kullanılarak farklı
dozlardaki indometazinin nöronal apopitozis üzerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır.
Page 12
2
II. GENEL BĠLGĠLER
2.1. Perinatal Asfiksi ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati
2.1.1. Tanım
Neonatoloji alanındaki ilerlemelere rağmen hipoksi ve asfiksi özellikle az
geliĢmiĢ ülkelerde sorun olmaya devam etmektedir. Perinatal hipoksi-iskemide kan ve
dokulardaki oksijen (O2) konsantrasyonu, pH değiĢiklikleri ve glikoz gibi metabolize
edilebilen substratların konsantrasyonlarındaki değiĢikliklere bağlı olarak geliĢen bir
takım olayların tanımına ihtiyaç vardır. Hipoksi (anoksi), bir veya birkaç organda
oksijenin kısmi veya tam yokluğudur. Hipoksemi ise kanda oksijen konsantrasyonunun
azalmasıdır. Asfiksi plasental veya pulmoner gaz değiĢiminin kesilmesi sonucu
hipoksemi ve hiperkapninin kombinasyonu sonucu oluĢan durumdur. Perinatal asfiksi
tanımı hemen her yerde farklı anlamlarda kullanılmaktadır. Asfiksinin kelime anlamı
"nabızsızlık" olup; ancak genel olarak perinatal asfiksi, doku zedelenmesine yol açacak
kadar dokuya oksijen verilmesinin bozulması (hipoksi-iskemi) sonucu hipoksemi ve
hiperkapninin birlikte olmasını tarifler. Ġskemi ise bir organdaki kan akımının azalması
veya kesilmesidir. Bu durumda sadece O2 değil, diğer substratlar da dokuya eriĢemez.
Fetus veya yenidoğandaki iskemi genellikle sistemik hipoksi-asidoz sonucunda
meydana gelir. Ayrıca kardiyovasküler fonksiyonun deprese olduğu durumlarda veya
okluzif vasküler hastalıklarda da iskemi oluĢabilir. Perinatal hipoksi-iskemiye maruz
kalan yenidoğan bebeklerde en önemli hasar santral sinir sisteminde olmak üzere buna
ek olarak bir veya birden fazla organ tutulumu olur.1,9,10
Yenidoğanda hipoksi-iskemi, çoğunlukla hipoksik iskemik ensefalopati (HĠE)
Ģeklinde bulgu verir ve yenidoğan bebeğin tüm hayatını etkileyebilen en önemli
sorunlardan biridir.1
2.1. 2. Ġnsidans
Hipoksik iskemik ensefalopatinin tanımlanmasındaki farklılıklar nedeniyle
gerçek insidansını belirlemek güçtür. Antepartum ve intrapartum fetal monitorizasyon
yöntemlerindeki geliĢmelere rağmen doğumu takiben geliĢen sistemik asfiksi insidansı
term bebeklerde halen 1000 canlı doğumda 2 ile 4 arasındadır.11
GeliĢmekte olan
ülkelerde bu oranın 1000 canlı doğumda 9 ile 18 gibi daha yüksek oranlara ulaĢtığı
Page 13
3
bildirilmektedir. Asfiktik doğan bebeklerin % 15-20‟si yenidoğan döneminde
kaybedilmektedir. YaĢayanların % 25‟inde mental retardasyonun da eĢlik edebildiği
serebral palsi, öğrenme güçlüğü veya epilepsi gibi kalıcı nörolojik hasarlar
geliĢmektedir.11
Bu problemin önemi, serebral hipoksi iskemi riski altındaki fetus ve
yenidoğana uygun yaklaĢımı zorunlu hale getirmiĢtir.
2.1.3. Asfiksi tipleri
Perinatal asfiksi "kronik kısmi" veya "akut tam" asfiksi Ģeklinde iki ayrı tablo
halinde ortaya çıkmaktadır. Bu iki durum birbirinden klinik ve patolojik özellikler ile ayırt
edilebilir (Tablo 1).12
Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri12
Kronik – Kısmi Akut - Tam
Riskli durumlar Ablasyo plasenta, plasental
hipoperfüzyon, uterusta
hipertonisite
Ablasyo plasenta
Uterus rüptürü
Kordun tam obstrüksiyonu
Annenin kardiyo-respiratuvar
arresti
Asfiksi oluĢması için geçen süre 1–3 saat < 10 dk
Serebral kan akımında yeniden
düzenleme
OluĢmuĢ Yetersiz
Klinik bulguların çıkıĢı için sessiz
dönem (6 – 48 saat)
Var Yok
Beyin Ödemi Var Yok
Konvülziyonlar Var Var/Yok
Beyin sapı bulguları Yok Var
2.1.3.1. Kronik kısmi asfiksi
Hayvanlar üzerinde yapılan çalıĢmalarda maternal plasental hipoperfüzyon,
uterus hipertonisitesi, ablasyo plasenta, umblikal kord obstrüksiyonu ve fetal
hipoperfüzyon gibi nedenlerle oluĢan plasental perfüzyon bozukluklarında, olay bir saat
veya daha uzun sürmüĢse fetusta progresif hipoksemi ve asidoz geliĢtiği gösterilmiĢtir.
Bu durumu kompanse etmek için vücuttaki kan akımı yeniden düzenlenmekte, kan
Page 14
4
akımı vital olmayan organlardan (böbrekler, gastrointestinal sistem, karaciğer, kas ve
deri), vital organlara (kalp, beyin ve adrenaller) yönlendirilmekte ve beyine giden kan
akımı belirgin Ģekilde artmaktadır. Bu uyum sırasında serebral perfüzyon oldukça iyi
korunmaktadır. Ancak fetal hipoksemi bir süre daha devam ederse, böyle bir
kompansasyon ile sağlanan serebral perfüzyon yetersiz kalır ve santral sinir sistemine
giden kan akımında yeni bir düzenleme ortaya çıkar.1
Serebral hemisferlerde kan akımında azalma olurken, bazal metabolizmanın en
fazla olduğu talamus, beyin sapı ve serebelluma daha fazla kan gönderilmeye çalıĢılır
(intraserebral Ģant). Bu durumda serebral hemisferler, özellikle perfüzyonun en uç
noktaları olan parasagittal korteks ve bunun altındaki beyaz cevher hipoksemiden
etkilenmeye baĢlar; küçük infarktlar veya lokal konvülziyon odakları geliĢir, olay daha
da ilerlerse bütün serebral hemisferleri etkileyen infarkt alanları ortaya çıkar. 1,13
Yenidoğan bebeklerde ortaya çıkan klinik bulgular kan akımındaki bu
değiĢikliklere bağlı olmakta, birçok organda hipoksik-iskemik zedelenme görülmektedir
(Tablo 2). Olguların üçte ikisinde beynin yanı sıra en az iki organ da etkilenmiĢtir.
Tablo 2. Hipoksik iskemik ensefalopatide etkilenen organlar 1
Kardiyovasküler sistem
Miyokard iskemisi
Kalp yetmezliği
Solunum sistemi
Respiratuvar distres sendromu (RDS)
Apne
Pulmoner kanama
Pulmoner hipertansiyon
Santral sinir sistemi
Serebral ödem
Konvülziyonlar
Ġntrakraniyal kanama
Hipoksik-iskemik ensefalopati
Sıvı-elektrolit dengesi
Akut böbrek yetmezliği
Uygunsuz ADH Salgılanması
Metabolik
Hipotermi
Hipoglisemi
Hipokalsemi
Hiponatremi
Hiperpotasemi
Kanamalar
Dissemine intravasküler koagulasyon
Adrenal kanama
Gastrointestinal sistem
Nekrotizan enterokolit
Hematemez, melena
Page 15
5
Nörolojik bulgular, hipoksik-iskemik zedelenmenin derecesine, süresine ve
dağılımına bağlıdır. Bebek doğumdan hemen sonra beyin zedelenmesi ve metabolik
asidoz nedeni ile depresedir. Hipotoni, letarji ve konvülziyonlar görülebilir. Hipotoni
çok ağır olabilir. Ancak dakikalar veya saatler içinde bebeğin aktivitesi ve tonusunda
artma olur, spontan ve uyarılarla tremorlar görülebilir. Konvülziyonlar genellikle 6-12
saat sonra ortaya çıkar, hemen her zaman hayatın ilk günü içinde görülür.
Konvülziyonların sıklığı giderek artar ve genellikle baĢlangıçta tedaviye dirençlidir. 2-5
gün sonra konvülziyonlar azalır veya tamamen ortadan kalkar ve ilaçla kontrol edilebilir
duruma gelir. Ağır zedelenme olan vakalarda Ģiddetli beyin ödemi bulguları vardır.
Kafa içi basınç artıĢı bulguları (fontanelde bombeleĢme, suturalarda açılma gibi)
genellikle 24 saat sonra baĢlar, 48. saatte en Ģiddetli düzeye eriĢir. Bu hastalarda
yeniden hipotoni geliĢir, bebeğin hareketleri azalır veya ortadan kalkar. Beyin sapı
disfonksiyonu bulguları (sabit pupiller ve apne gibi) vardır.1,15
Serebral hemisferlerdeki infarkt yaygınsa, özellikle beyin ödemi bulguları varsa,
lateral ventriküller kompresedir, serebral beyaz cevher ekojenitesinde difüz artma olur,
serebral gri cevher (korteks ve bazal ganglionlar) ile beyaz cevher arasındaki görünüm
farklılığı ortadan kalkar. Bir iki hafta sonra hemisferlerdeki nekroz alanları belirginleĢir
ve sonunda multikistik ensefalomalazi veya serebral hemisferlerin total obliterasyonu
olur; talamus, beyin sapı ve serebellum daha iyi korunmuĢtur.1,15
2.1.3.2. Akut tama yakın asfiksi
Bu durumda olay akuttur, hipoksemi ani ve Ģiddetlidir. Olay hızlı geliĢtiğinden
organlar arası ve beyin içindeki kan dolanımının yeniden düzenlenmesi yetersizdir.
Buna bağlı olarak hipoksik-iskemik zedelenme bulguları, metabolik aktivitenin fazla,
enerji depolarının az olduğu yerlerde daha fazla görülür. Talamus ve beyin sapı
nükleusları belirgin derecede etkilenirken, serebral hemisferler daha iyi korunmuĢtur,
beyin ödemi görülmez. Parsiyel asfiksidekinin tersine nörolojik bulguların (konvülziyon
ve beyin ödemi) ortaya çıkması için nisbeten sessiz geçen dönem görülmez. Hayvanlar
üzerinde yapılan çalıĢmalarda, olay on dakikadan kısa sürerse, beyin zedelenmesi
bulgularının tamamen düzeldiği gösterilmiĢtir. 10-25 dakika kadar sürdüğünde talamus
ve beyin sapı nükleuslarında ağır zedelenme görülür. 25 dakikadan uzun süren
Page 16
6
durumlarda ise ağır kardiyak zedelenme de olduğu için geriye dönüĢümsüz vasküler
kollaps geliĢir.1
Ġnsanlarda tama yakın asfıksi çok seyrektir. Ancak tam ablasyo plasenta, akut
tam kord obstrüksiyonu, uterus rüptürü, maternal kardiyorespiratuvar arrest gibi
durumlarda görülebilir. Bazı vakalarda ise hiç bir neden bulunamaz. Bununla birlikte bu
vakaların bir çoğunda daha önceden baĢlamıĢ kısmi asfıksi bulguları da vardır. Ağır
derecede etkilenmiĢ bebekler doğduklarında deprese ve bradikardiktir, resüsitasyon
gerekir. Spontan solunumları uzun süre yoktur. Konvülziyonlar ve uzun süren stupor
görülür. Beyin ödemine bağlı kafa içi basınç artıĢı bulguları yoktur. Beyin sapı
disfonksiyonu bulguları 24 saat kadar sonra ortaya çıkar. Sabit pupiller, okulosefalik
refleks yokluğu (orta-beyin, pons zedelenmesi), kornea refleksi yokluğu (pons
zedelenmesi), öğürme refleksinin kaybı, dilde fasikülasyonlar (medulla spinalis
zedelenmesi) görülebilir. Bu bulgular bebeğin uyanık durumlarında biraz düzelme
gösterse bile genellikle kalıcıdır. Öğürme refleksinin azalması nedeni ile beslenme ve
yutma bozuklukları görülür, nazofarenkste biriken sekresyonlar sorun olur ve bu
nedenle bebeğin entübe edilmesi gerekebilir. Beyin-dıĢı organlardaki zedelenme
bulguları daha hafiftir.1
2.1.4. Patoloji
Hipoksi-iskemi ardından geliĢen serebral hasarın patolojik görünümü üniform
özellikte değildir. OluĢan beyin hasarının lokalizasyonu, yaygınlığı ve Ģiddeti Ģu
faktörlere bağlıdır:
1. Asfiksiye neden olan olayın Ģiddeti (total veya parsiyel),
2. Etiyolojik faktörün zamanı ve süresi (akut veya kronik)
3. Beynin geliĢimsel olgunluğu (prematüre veya term)
4. Beyinde bölgesel duyarlı bölümler [vasküler faktörler ve N-metil D-
aspartat (NMDA) reseptörlerinin dağılımı].1,26
Beyin zedelenmesinin ne zaman olduğu ile ilgili yapılmıĢ çalıĢmalar az olmakla
birlikte histolojik incelemelerle lezyonun yaĢı konusunda bilgi edinilebilir (Tablo 3).1
Page 17
7
Tablo 3. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı
Bulgu Gün
Reaktif astrositozis 0.5 - 4
Mikroglial proliferasyon 0.3-3
Nöronal karyoreksis 0.5-2
Makrofaj infiltrasyonu 4-6
Kapiller endotelyel reduplikasyon 5
Fibriller gliosis 6
Kist oluĢumu 10-42
HĠE‟de patolojik görünüm, serebral matürasyon ve dolayısıyla gestasyon yaĢı ile
farklılık göstermesi nedeniyle ayrı ayrı tartıĢılmaktadır (Tablo 4).10
Term bebekte
gözlenen hipoksik-iskemik beyin hasarında; selektif nöron nekrozu, parasagittal
zedelenme ve fokal iskemik beyin nekrozu görülür. Bunların arasında esas olan selektif
nöron nekrozudur. Prematür bebekte görülen oligodendroglial /beyaz cevher hasarı term
bebekte de görülmekle birlikte nöron hasarı daha baskındır.10
Hipoksik iskemik
ensefalopati esas olarak term bebeklerde geliĢtiği için burada daha çok nöron nekrozuna
neden olan patolojik biyokimyasal olaylardan bahsedilecektir.
Tablo 4. HĠE’li yenidoğanda nöropatolojik özellikler10
Matür yenidoğan Selektif nöronal nekroz
Bazal ganglia ve talamusun status
marmoratusu
Parasagital serebral hasar
Fokal ve multifokal iskemik serebral
nekroz
Prematüre yenidoğan Selektif nöronal nekroz
Periventriküler lökomalazi
Fokal ve multifokal iskemik serebral
nekroz
Periventriküler hemorajik infarkt
Page 18
8
Hipoksik iskemik ensefalopati‟de geliĢebilen baĢlıca serebral lezyonlar: 1)
Selektif nöronal nekroz 2) Bazal ganglion ve talamusta status marmoratus Ģeklinde
lezyon 3) Parasagital serebral hasar 4) Periventriküler lökomalazi (PVL) 5)
Periventriküler-Ġntraventriküler kanama (PV-ĠVK) 6) Fokal ve multifokal iskemik beyin
lezyonlarıdır.1
2.1.4.1.Selektif nöronal nekroz
Miyadında doğan bebeklerde H-Ġ hasarın sık rastlanan bir tipi olan selektif
nöronal nekroz sıklıkla serebral korteks, talamus, beyin sapı ve spinal kordun ön boynuz
hücrelerini içerir. Bu tip hasara en yatkın bölge serebral korteks tabakaları ve
hipokampus bölgesidir. Lezyonlu bölgede sitoplazmik eozinofili ve nükleer kırılmalar
dikkati çeker. Kronik nöropatolojik değiĢiklikler, nöronal kayıp, astrositozis ve
multikistik ensefalomalazi ile sonuçlanır.26
2.1.4.2. Status Marmoratus
Hayvan modellerinde bu tip lezyon daha çok akut, tama yakın asfikside görülür.
Bazal ganglionlar ve talamusta nöronal kayıp, gliozis ve anormal miyelinizasyon ile bu
bölgeler mermerimsi bir görünüm alır.1,16
2.1.4.3. Parasagital Serebral Hasar
Daha çok serebral korteks ve subkortikal beyaz cevheri tutan bir lezyon tipidir.
Hasar genellikle bilateral ve simetriktir, lezyonlardan çoğunlukla hemoraji değil,
infarktlar sorumludur. BaĢlıca anterior, posterior ve median serebral arterlerin sulama
alanlarında yaygın nöron kaybı olur.16
2.1.4.4. Periventriküler Lökomalazi
Periventriküler lökomalazi (PVL) özellikle lateral ventriküllerin dorsal ve
laterallerinde serebral beyaz cevherin hipoksik-iskemik nekrozu Ģeklinde tanımlanır.
Serebral arteriyel anatomik farklılıklar nedeni ile ortaya çıkan tablo, bebeğin gestasyon
yaĢına göre değiĢir. Daha çok prematüre bebeklerde gözlenir ve oluĢan hasar,
koagülasyon nekrozu ve periventriküler beyaz maddenin infarktı ile sonuçlanır. Çok
Page 19
9
düĢük doğum ağırlıklı (<1500 gr) bebeklerin % 25-40‟ında PVL görülür. Ön, orta ve
arka serebral arterlerin meningeal dallarındaki zengin interarteriel anastomozlara bağlı
olarak serebral korteks rölatif olarak korunur. Hastaların yaklaĢık % 25'inde
periventriküler infarkt alanlarında hemoraji görülür ve genellikle ağır intraventriküler
hemoraji ile birliktedir.1,16
Oligodendrosit hasarı geliĢen prematür bebeklerde 32 haftalık olduklarında
beklenen hızlı miyelinizasyon safhası olmaz ve miyelinizasyon artıĢına bağlı beyaz cevher
artıĢı görülmez. Buna bağlı olarak rölatif ventriküler dilatasyon geliĢir ki bu duruma
sıklıkla „ex vacuo‟ veya atrofik ventrikülomegali denir.1
2.1.4.5. Periventriküler Hemorajik Ġnfarkt
Periventriküler hemorajik infarkt (PVHI), prematürelerde sıklıkla ciddi IVH ile
birlikte ortaya çıkar. Genellikle bilateraldir. Daha çok venöz orijinlidir. Venöz infarkt
medüller ve terminal venlerin geniĢ subepandimal germinal matriks hemorajisi ile
tıkanması sonucu oluĢur.17
2.1.4.6. Fokal ve Multifokal Ġskemik Beyin Hasarı
Fokal nekroz, asfiktik bebeklerin % 5-20'sinde görülebilen ana serebral
arterlerden birinin tıkanması sonucu geliĢen bir iskemik beyin hasarıdır. Arteriyel
oklüzyonla iliĢkili fokal iskemik serebral lezyonlar prematürelerde daha az görülür.
Prematüre bebeklerde daha çok multipl küçük damarların tıkanması sonucu oluĢan çok
sayıda, küçük, dağılmıĢ infarktlar görülür. Tromboembolizm fokal beyin hasarının en
muhtemel nedeni olarak kabul edilir. Embolinin kaynağı genellikle plasental infarkt,
harabiyete uğramıĢ veya kateterize edilmiĢ damarlardır. Polisitemi, hiperkoagülabililite
(protein C ve S, antitrombin III eksikliği), yaygın damar içi koagülasyon diğer nedenler
arasındadır. Lezyon, vakaların yaklaĢık yarısında orta serebral arterin sulama alanında
gözlenir ve yaygındır. Bu tip lezyonlarda hücrenin tüm organellerinde nekroz oluĢur.
Anoksik nöronal değiĢiklikten 18–24 saat sonra ıĢık mikroskobunda değiĢiklikler
izlenmeye baĢlar. Bölgeye aktive monosit-makrofaj migrasyonu olur. 36–48 saat sonra
bu hücreler geniĢ, köpüksü makrofajlara dönüĢür. Bir süre sonra astrositik hipertrofi ve
proliferasyon geliĢir. Bazı lezyonlarda kalsifikasyon izlense de genellikle ventrikülle
bağlantılı veya bağlantısız kistik kavitasyon ile sonuçlanır. Kavite oluĢumuna bağlı
Page 20
10
lezyon tek ve büyük bir boĢluk Ģeklinde olduğunda “porensefali” olarak tanımlanır.
“Hidranensefali”de ise bilateral masif nekroz oluĢur ve bu kavitelere beyin omurilik
sıvısı (BOS) dolar. Bir diğer lezyon “multikistik ensefalomalazi”de bilateral küçük
kavitasyon odakları geliĢir. Bu lezyon daha çok beyaz cevherde izlenir. Fokal ve
multifokal iskemik beyin lezyonları kraniyal USG, BBT ve MR ile diğer lezyonlara
göre daha kolay saptanabilirler.1,16,18
2.1.5. Perinatal Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Patogenezi
Hipoksi-iskemi prematür ve matür bebeklerde farklı nöropatolojik olaylara yol
açar. Term bebeklerde esas olay nöron hasarı iken prematür bebeklerde
oligodendroglial/beyaz cevher hasarı daha hâkimdir. Hipoksik-iskemik serebral hasarın
önlenebilmesi, hücre yıkımına yol açan biyokimyasal olayların anlaĢılması ile mümkün
olabilir.10
Serebral hasar ile sonuçlanan hipoksik iskemik ensefalopati tablosunun
patogenezinden hipoksi ve iskeminin birlikteliği sonucunda meydana gelen bir dizi
biyokimyasal ve patolojik reaksiyonlar sorumludur. Tek baĢına hipoksi, iskemi ya da ATP
gibi enerji kaynağı olan moleküllerin azalmasının hipoksik-iskemik (H-Ġ) serebral hasar
oluĢması için yeterli olmadığı çok sayıda yapılan hayvan deneylerinde gösterilmiĢtir.1,19,20
H-Ġ beyin hasarının esas bulguları akut hipoksi-iskemi döneminde değil, daha
çok reperfüzyon ve reoksijenasyon döneminde ortaya çıkmaktadır. Ġlk oluĢan olay
glikoz ve oksijenin azalmasıdır. Hücre ölümüne neden olan olaylar hipoksik-iskemik
olayın sonlanmasından sonra ve reperfüzyon sırasında enerjide çok da fazla düĢüĢ
olmasını beklemeden oluĢur ve bunu glutamat reseptörlerinin aktivasyonu izler. Nöron
ölümüne neden olan diğer olaylar sitozolik kalsiyumun artması ve kalsiyuma bağlı
süperoksid anyon, hidroksi radikaller gibi serbest radikallerin ve nitrik oksit
derivelerinin oluĢması gibi çeĢitli zararlı olayların aktive olmasıdır. Nöron ölümüne
neden olan olaylar kaskadı hipoksik-iskemik hasarın sonlanmasından birkaç saat sonra
oluĢur. Bu nedenle bu dönemde beyin hasarını azaltabilecek veya daha kötü olmasını
engelleyebilecek önemli giriĢimler yapılabilir.10
HĠE‟de geliĢen patolojik mekanizmalar Ģematik olarak ġekil-1‟de gösterilmiĢtir.1
Page 21
11
Primer nöron ölümü
ATP tükenişi
Nötrofil PAF+ Serbest
aktivasyonu eikosanoidler radikaller
Lipit peroksidasyonu
+
Mikrovasküler tıkanma Otoregülasyon Vazojenik
DNA kırılması kaybı ödem
DNA Lipaz Proteaz Yetersiz
Kırılması oksidatif
fosforilasyon
ATP tükeniĢi
Pompa Yetersizliği Hipoksantin
Serbest radikaller
Hipoksik İskemik Hasar
Sitotoksik ödem
Resusitasyon Reperfüzyon ve
Oksijenasyon
Serbest Radikaller
Glutamat Salınımı
Serebrovasküler disfonksiyon
NMDA
Kalsiyum
NĠTRĠK
OKSĠT
Apoptozis
SEKONDER NÖRONAL ÖLÜM
ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakıĢ 10
Page 22
12
2.1.5.1. Hipoksemi
Intrauterin dönemde fetus, O2 basıncının 22-28 mmHg arasında olduğu fizyolojik
hipoksemik bir ortamdadır. PO2‟nin 15 mmHg‟e kadar düĢtüğü durumlarda normal
kardiyovasküler fonksiyonların bir kaç saat kadar devam edebildiği, kalp hızının ve
sistemik kan basıncının düĢmesi ile birlikte ilerleyici laktik asideminin oluĢtuğu
gösterilmiĢtir. Dokuda yüksek enerjili fosfat rezervleri (özellikle ATP), hipoksemi
esnasında oldukça iyi korunur. Ancak sistemik hipotansiyona hipoksemi eĢlik ediyorsa ve
serebral iskemi oluĢmuĢsa beyin hasarının meydana gelme Ģansı yüksektir.21,22
2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi
Hipoksinin meydana getirdiği beyin hasarında doku O2‟nin azalmasına ek olarak
bir veya daha fazla faktörün rol oynadığı düĢünülmektedir. Hayvanlardaki ilk çalıĢmalar
Myers ve arkadaĢları tarafından yapılmıĢtır.5 Annelerinin abdominal aortası sıkıĢtırılarak
asfiksi yaratılan term maymun fetüslerinde iyileĢmeyi takiben esas olarak serebral
hemisferlerde zararlanma olduğu gösterilmiĢtir. Ayrıca kortikal gri cevherde atrofi, beyaz
cevherde skleroz ve bazal gangliyonlarda status marmoratus Ģeklinde hasarlanma
gözlenmiĢtir. Benzer lezyonlar perinatal periyotta serebral hipoksi-iskemi meydana gelip
yaĢayan bebeklerde de saptanmıĢtır. Bu çalıĢmalara ek olarak Brann ve Myers, gaz
anestezik ve halotan ile annelerinde hipotansiyon yaratarak parsiyel intrauterin asfiksiye
maruz bıraktıkları termindeki maymun fetüslerinde ağır hipoksemi ile birlikte kombine
metabolik ve respiratuvar asidoz oluĢtuğunu tespit etmiĢlerdir. Doğumu ve resüsitasyonu
izleyen dönemde maymunların mekanik ventilasyona gereksinim duydukları, konvülziyon
geçirdikleri ve 96 saatten önce stabilize olmadıkları görülmüĢtür. Yapılan nöropatolojik
incelemelerde yaygın beyin ödemi ve soluklukla birlikte, hemorajik nekrozun özellikle
serebral korteks ve subkortikal beyaz cevherde oluĢtuğu gösterilmiĢtir. Sistemik kan
basıncı daha düĢük olan maymunlarda asfiksinin daha ağır beyin hasarına yol açtığı
görülmüĢtür. Hipoksik kardiyovasküler depresyon sonucu sistemik hipotansiyon oluĢması
için O2 basıncının %40 veya altında olması gerekmektedir. Hipoksemi esnasında kan
basıncı daha düĢük olduğunda serebral iskemi daha da artmakta ve beyin hasarı daha ağır
olmaktadır.5,21
Page 23
13
Beyin hasarının oluĢabilmesi için serebral hipoksi-iskeminin minimum ne kadar
sürmesi gerektiği sorusu en önemli sorudur. Bu sorunun yanıtı serebral hipoksi-iskeminin
ağırlığına, olayın olduğu zamanki beynin anatomik ve fonksiyonel maturasyonuna
bağlıdır. Hipoksi-iskemi esnasında daha matür hayvanlarda daha kısa total asfiksi
süresinde beyin hasarı meydana gelmektedir. Parsiyel serebral H-Ġ‟de bu süre daha uzun
olmaktadır. Hayvanlarda yapılan deneylerde bu süre muhtemelen üç saatten daha fazla
değildir. Üç saatten daha az hipoksi-iskemiye maruz kalan hayvanların baĢarılı bir Ģekilde
canlandırıldığı görülmüĢtür.21
Deneysel verilere ek olarak klinikte de sistemik hipoksemiye
bağlı serebral iskeminin meydana getirdiği beyin hasarı radyografik bulgular, prognoz ve
postmortem sonuçlar ile değerlendirilmiĢtir. Yapılan çalıĢmalarda hipoksemi ile birlikte
sistemik hipotansiyonun özellikle prematür bebeklerde subkortikal veya periventriküler
lökomalaziye neden olduğu tespit edilmiĢtir. Miall-Allen ve arkadaĢları, 31 haftanın
altındaki 33 yenidoğan bebekte ortalama arteriyel kan basıncının bir saatten daha fazla 30
mmHg‟nın altında seyretmesi durumunda periventriküler beyaz cevherde ağır hemorajik
infarkt veya iskemi geliĢtiğini göstermiĢtir. Ortalama arteriyel kan basıncı 30 mmHg
üzerinde olan bebeklerde ise daha az lezyon geliĢmiĢtir.5
2.1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma
2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü
Ġrreversibl doku hasarına neden olan serebral H-Ġ‟de beynin enerji durumunda
belirgin değiĢiklikler söz konusudur. Hipoksiye ilk metabolik yanıt anaerobik
glikolizdir. Doku O2 basıncı kritik bir değer altına indiğinde (<0.1 mmHg)
mitokondrilerin sitokrom sistemleri ansatüre hale gelir. Redükte ajanlar (NADH,
FADH) birikmeye baĢlar. Oksidatif fosforilasyonla oluĢan ATP üretimi durur. ATP, tüm
hücrelerde olduğu gibi nöronlarda da primer enerji kaynağıdır. Ġki yüksek enerjili fosfat
bağı biyokimyasal reaksiyonlar ve fizyolojik olaylarla yakından iliĢkilidir. ATP enerji
tüketen reaksiyonlarda ve iyon pompalanması gibi fizyolojik iĢlemlerde önemli rol oynar.
ATP‟ye bağımlı Na+ pompası ve değiĢimi, Na
+‟un intrasellüler birikimine neden olarak
sitotoksik ödeme yol açar.23
Aerobik ortamda mitokondriumlarda gerçekleĢen oksidatif fosforilasyon ile 36
mol ATP üretilirken anaerobik glikoliz ile sadece 2 mol ATP üretilir. Enerji ihtiyacının
Page 24
14
karĢılanması için anaerobik glikoliz hızının 18 kat artması gerekir. Ancak glikolizisin
maksimum stimülasyonu ile kapasite en çok 4–5 kat artabilir. Bunun nedeni bu sırada
biriken NADH‟tan kaynaklanan H+ iyon birikiminin glikolizin kilit enzimlerinden biri
olan fosfofruktokinaz (PFK) aktivitesini inhibe etmesidir. Böylece glikoliz, parsiyel
oksijen yokluğunda oksidatif fosforilasyonu stimüle edebilmesine karĢın, hiçbir zaman
mitokondriyal oksidasyonun yerini dolduramaz.1,23
Hipoksi-iskemi sırasında primer enerji yetmezliğinin ardından geliĢen ve
enerjinin kısmen geri kazanıldığı bir reperfüzyon devresi vardır. YaklaĢık 24 saatlik bir
latent süre sonunda yeterli serebral perfüzyon ve oksijenizasyonun olmasına rağmen
ikinci bir enerji yetmezliğinin olduğu dönem geliĢir. Latent faz döneminde gecikmiĢ
hücre hasarı oluĢur. Bu dönem çalıĢmaların yoğun olarak yapıldığı ilgi çeken bir
dönemdir.10
2.1.5.3.2. Ġntrasellüler asidoz
Beyinde hasar oluĢturacak kadar yeterli H-Ġ, hemen daima doku asidozu ile
birliktedir. Bunun nedeni laktik asit birikimidir.1 Ġntrasellüler laktik asidoz, glikozun
oksidatif metabolizmasının kısmi veya total anaerobik glikolizise dönüĢümü sonucu
meydana gelir. Bu olay esnasında doku O2‟i çok düĢük seviyelere iner. Bazı araĢtırıcılar
beyindeki laktik asidozun hipoksik-iskemik hasarın major nedeni olduğunu öne
sürmüĢlerse de yapılan bazı araĢtırmalarda immatür hayvanlarda serebral laktik asidozun
beyin hasarı oluĢmasında kritik rolünün bulunmadığı yönünde bulgular da elde
edilmiĢtir.24
Hipoksi-iskemide laktik aside ek olarak hidrojen iyonlarının da hücresel
asidoza neden olduğu düĢünülmüĢtür. ĠndirgenmiĢ ekivalanların major kaynağı, ATP‟nin
asit hidrolizi ile oluĢan ve sellüler enerji kaybı ile biriken NADH+, H
+‟dir.
25
Hipoksi-iskemi esnasındaki sellüler asidoza bağlı nöronal nekrozdan değiĢik
mekanizmalar da sorumlu olabilir. Bunlar arasında mitokondriyal fonksiyonun
inhibisyonu, iyon dengesinin bozulması, Ca+2
birikimi ve ödem oluĢumunun artıĢı
gösterilebilir.5
2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması
H-Ġ serebral hasarın en önemli nedenlerinden birisi sinapslarda eksitatör
nörotransmitterlerin birikmesidir. Eksitatör aminoasitlerin en önemli özelliği fizyolojik
Page 25
15
düzeyleriyle toksik düzeyleri arasındaki farkın çok az olmasıdır. Ġnsanda en çok
bulunan eksitatör nörotrasmitter aminoasit L- glutamattır. Daha az miktarda bulunan L-
aspartat da önemli bir eksitatör aminoasittir.1,26
L-glutamat sinaptik aralıktan ATP‟ye
bağımlı aktif transport ile geri emilir. Astrositler içine alınan glutamat, ATP‟ye bağımlı
bir enzim olan glutamin sentetaz aracılığıyla NH3 ile birleĢerek glutamin Ģeklinde
ortamdan uzaklaĢtırılmıĢ olur. Hipoksik iskemi durumunda ATP‟nin üretiminde azalma
olması nedeniyle sinaptik aralıktan uzaklaĢtırılamayan L-glutamat, nörotoksik etkisini
bağlandığı reseptörler aracılığıyla gösterir (ġekil-2). Bu reseptörler baĢlıca; N-metil D-
aspartat (NMDA), alfa amino 3-OH 5-metil 4 isoksazol propionik asit (AMPA), kainat
(KA) ve 1-amino-siklopentan-15,3R-dikarboksilik asittir (ACPD veya kuiskalat-B).
NMDA, AMPA ve KA reseptörleri postsinaptik membrandan Na+ ve Ca
+2 iyon geçiĢini
sağladıkları için bunlara iyonotropik reseptörler denir. ACPD reseptörüne ise fosfoinositol
hidrolizi, protein kinaz-C aktivasyonu ve endoplazmik retikulumdan Ca+2
mobilizasyonunu sağladığı için metabolizmayı uyaran anlamında metabotropik reseptör
denir. Ġyonotropik reseptörlerin hepsinde Na+, K
+ geçiĢi sağlanır. NMDA reseptöründeki
iyon kanalından Na+ ve K
+‟a ek olarak Ca
+2‟ da geçer. AMPA reseptörü yalnız immatür
nöronlarda Ca+2
‟a geçirgen özellik taĢır.1,27
ġekil-2. Akson terminalinden salınan glutamatın postsinaptik dentrit ve astrosit içerisindeki
döngüsü, reseptörleri ve iyon kanalları (VBKK: voltaj bağımlı kalsiyum kanalı, Glu: glutamat, Gln:
glutamin).
Page 26
16
Nöronal hücre kültürlerinde yapılan çalıĢmalarda iyona bağımlı nöronal hasar
mekanizması iki Ģekilde açıklanmıĢtır:
A- Erken nörotoksisite: Depolarizasyon esnasında nöronların içine fazla
miktarda Na+ ve Cl
- geçiĢinin olması nedeniyle hücre içi ozmolaritesi artar. Hücre içine
su giriĢi artar. Sitotoksik ödem meydana gelir ve hücre ölümü gerçekleĢir.
B- GecikmiĢ nörotoksisite: NMDA reseptörlerine bağlı kanallar yoluyla hücre
içine giren fazla miktardaki Ca+2
iyonları, biyokimyasal bazı olayları harekete
geçirirerek nöron ölümüne yol açar.
Eksitatör aminoasitlerin, serebral hipoksi iskemide, nöronal zedelenmenin
nedeni olduğunu gösteren bulgular Ģunlardır:
1. Beynin hipoksiye daha duyarlı olan bölgeleri glutamik asit içeren
sonlanmanın en fazla olduğu yerlerdir.
2. HIE'li yenidoğanlarda BOS glutamat ve aspartat düzeylerinin arttığı
gösterilmiĢtir.
3. Beyine glutamat enjekte edildiğinde HĠE benzeri değiĢiklikler olmaktadır.
Glutamat salım inhibitörü (BMW 1003C87 triklorofenil- diaminopirimidin) verilmesi
H-Ġ beyin hasarını büyük ölçüde önlerken glutamat alım inhibitörü (L- trans 2, 4-
Pyrolidin dikarboksilat) verilmesi nörotoksik etki yapmaktadır.28,29
4. Glutamat reseptör antagonistleri H-Ġ hasarı büyük ölçüde önler. NMDA
reseptör antagonisti olan MK801 'in ve AMPA reseptör antagonisti olan NBQX'un
hasarı azalttığı; bunda NMDA reseptör antagonistlerinin daha etkili olduğu
gösterilmiĢtir.30
NMDA reseptör kanal kompleksinde antagonistik etki yapan ilaçların (ketamin,
dekstrometorfan, fensiklidin) ve magnezyumun hasarı önlemede yararlı olduğu
gösterilmiĢtir. Magnezyum antikonvülzan etkisini NMDA reseptörünü bloke ederek
yapmaktadır. Nitekim annelerine Ģiddetli preeklamsi nedeniyle magnezyum sülfat
tedavisi uygulanan bebeklerin uzun dönem izlemlerinde nörolojik prognozlarının daha
iyi olduğu özellikle serebral felç oranının daha az olduğu saptanmıĢtır. Ancak bu
konuda yapılan baĢka bir çalıĢmada benzer sonuçların alınmadığı bildirilmiĢtir.31,32
Page 27
17
2.1.5.3.4. Ġntrasellüler kalsiyum birikimi
Bir hücrenin yaĢam fonksiyonlarını sürdürebilmesi için hücre içi homeostazı
sağlayan enzimlerin iĢlevlerini etkileyen intrasellüler ikinci bir messenger olarak görev
yapan Ca+2
iyon konsantrasyonunun çok dar bir aralıkta tutulması gerekmektedir. Hücre
içinde fazla miktarda Ca+2
birikimi nöron ölümü ve membran bütünlüğünün bozulmasına
neden olur. Normalde serbest Ca+2
hücre içinde çok düĢük düzeylerde olup, tamamına
yakını mitokondri ve endoplazmik retikulumda, az miktarı ise nöronun plazma
membranı ve nükleus gibi hücre içi organellere bağlı halde bulunur. Bağlanma iĢlevi
enerjiye (ATP) bağımlı ve intrasellüler pH‟dan etkilenen bağımsız olaylar ile meydana
gelir. Ayrıca Ca+2
bağlayan çok özel proteinler de sitozol içinde bulunur ve bunlar serbest
Ca+2
konsantrasyonlarının hücre içerisinde dar sınırlarda korunmasını sağlarlar.
Kalsiyumun fizyolojik ekstrasellüler seviyeleri plazma membranı boyunca serbest
kalsiyumun hücreye giriĢ çıkıĢına imkân verir.1
Hipoksi-iskemi‟de glutamat reseptörlerinin aĢırı uyarılması sonucu hücre içinde
serbest sitozolik Ca+2
konsantrasyonu artar.1 Bu yükselmenin iki kaynağının olduğu
tahmin edilmektedir:
1. Kalsiyumun intrasellüler depolardan serbest hale geçmesi
2. Plazma membranı boyunca geçiĢinin artması
Açığa çıkan serbest sitozolik Ca+2
, potansiyel olarak toksik seviyelere eriĢir.
Sitozolde kalsiyum birikimi Ģu Ģekilde gerçekleĢir; AMPA reseptörlerinin uyarılması
hücre membranının sağladığı Na+-K
+ dengesini bozarak depolarizasyona neden olur. Bu
depolarizasyon NMDA reseptörlerindeki magnezyumun uzaklaĢmasına yol açarak
hücre içine daha fazla Ca+2
girmesine neden olur. Hücre, önce Na+ giriĢinin artmasıyla
ĢiĢerse de, esas zedelenme hücre içindeki Ca+2
düzeyinin artmasıyla olur.1 ACPD
(kuiskalat) reseptörlerinde ise intrensek iyon kanalı yoktur. Etkilerini G proteinlerini
aktive ederek gösterirler. G proteini fosfolipaz C'yi aktive eder. Bu enzim hücre zarının
iç kısmındaki fosfatidil inositol'ü inositol trifosfat ve diaçilgliserole parçalar.
Diaçilgliserol bazı hücre içi proteinleri aktif hale getirirken, inositol trifosfat hücre içi
depolardan sitoplazmaya serbest Ca+2
salınmasına neden olur (ġekil -3). Kalsiyum
dengesinde meydana gelen bu değiĢiklikler hücre içerisinde birçok enzimin
aktivasyonuna yol açarak nöronun canlılığının devamını etkiler.1
Page 28
18
ġekil-3. Hücre içi kalsiyum homeostazı (DAG: diaçil gliserol, PL-C: fosfolipaz- C, PIP2:fosfatidil
inositol -4,5 -difosfat, IP3:inozitol trifosfat).
Hücre içi serbest Ca+2
'un artması
1. Endonükleazların aktive olmasıyla DNA, proteazların aktive olmasıyla
sitoskeletal proteinler ve bazı membran proteinleri parçalanır.
2. Fosfolipaz A2 aktive olur ve membran fosfolipidlerinin yıkılmasına yol açar.
Hücrede araĢidonik asit birikir. Siklooksijenaz enziminin aktivasyonu ile
prostoglandinler ve tromboksan A2 meydana gelir. Siklooksijenaz yolağı ve hipoksik-
iskemik serebral hasardaki rolü aĢağıdaki bölümlerde daha detaylı anlatılacaktır.
Lipooksigenaz enzimi de aktive olarak lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikalleri
açığa çıkar (ġekil-4).
3. ATP düzeyi azalır; ADP, AMP, adenozin, ve hipoksantin oluĢur. Ksantin
dehidrogenaz enzimi ksantin oksidaza çevrilir bu enzimle hipoksantin parçalanır ve bol
miktarda serbest oksijen radikali ortaya çıkar.1
4. Ca+2
-kalmodülin kompleksi NOS‟u aktive etmesiyle NO oluĢur. NO
‟in
HĠE patogenezindeki rolüne daha sonraki bölümlerde ayrıntılı bir Ģekilde değinilecektir.
Nörotransmitterlerin salınımı ile artan hücre içi kalsiyum, Ca+2
-kalmodulin
bağımlı protein kinaz II enzimini aktive eder. Bu enzim, içi nörotransmitterlerle dolu
vezikülleri skeletal proteinlere bağlı tutan „„sinapsin‟‟ adlı proteini fosforile ederek bu
veziküllerin serbestleĢmesine neden olur. Serbest kalan veziküller yine Ca+2
yardımıyla
Page 29
19
presinaptik bölgedeki „‟sinaptofizin‟‟ adlı proteinle birleĢir ve içeriklerini sinaptik
aralığa boĢaltırlar. Eksitatör aminoasitlerin ekstrasellüler aralığa salınmasıyla olay daha
da Ģiddetlenir. ÇeĢitli lipaz, proteaz ve endonükleazların da aktivasyonu sonucu diğer
nöronlar da etkilenir. Kalsiyum ayrıca ksantin ve prostoglandin formasyonu ile serbest O2
radikallerinin oluĢumuna da yol açar. Nihayet intrasellüler serbest Ca+2
‟un yüksek
konsantrasyonları mitokondriyumda oksidatif fosforilasyonun kesintiye uğramasına neden
olur.1,33
2.1.5.3.5. Serbest radikaller
Özellikle reperfüzyon-reoksijenizasyon döneminde prostaglandinlerin yapımı,
hipoksantinin parçalanması ve NO artıĢı ile serbest radikaller açığa çıkmaktadır (Ģekil-
4). Bunlar doğrudan hücre için toksik olabildikleri gibi, retikülo endotelial hücrelerin
aktive olmalarına yol açarak doku zedelenmesini de arttırırlar.34
Burada toplanan
lökositlerin ürettikleri O2 radikalleri, sitokinler ve proteazlarla hücre zedelenmesi
yaparlar.35
Hipoksi-iskemi (Eksitatör aminoasit etkisi)
ATP Fosfolipitler Arjinin
Hipoksantin AraĢidonik asit Nitrik oksit
Ksantin Lökotrienler Peroksinitrit
Serbest oksijen radikalleri Zedelenme
Reperfüzyon- Oksijenasyon
ġekil- 4. Reperfüzyon reoksijenizasyon döneminde serbest oksijen radikallerinin oluĢumu.
Page 30
20
2.1.5.3.6. Sitokinler
Proinflamatuvar sitokinler birkaç değiĢik mekanizma ile beyin hasarına neden
olurlar. Ġnflamatuvar sitokinler direk serebral sitotoksik etki göstererek oligodendrosit
öncüllerinin farklılaĢmasını önlerler,36
oligodendrosit apoptosisini stimüle ederler.37,38
ve vakuoler myelin dejenerasyonuna neden olurlar.39
Sitokinlerin potent vazomotor ve
vazooklusif etkileri olabilir.40,41
Son bilgiler sitokin toksisitesinin glutamat
transportundaki bozukluklar nedeni ile olabileceğini göstermiĢtir.42
Ekstrasellüler
glutamat regülâsyonunda önemli rolü olan astrositler, glutamatı 1000 kat konsantre
etme yeteneğine sahiptir. Glial kültürlerde proinflamatuvar sitokinlerden Ġnterlökin
(ĠL)-1β ve Tümör nekrozis faktör (TNF)- α‟nın glutamat transportörünün fonksiyonunu
bozdukları ve glutamat aracılıklı oksidatif stresi arttırdıkları gösterilmiĢtir.42
Buna
karĢın anti-inflamatuvar olan ĠL-4 ve ĠL-10 bu etkiyi pro-inflamatuvar sitokinlerin
üretimini engelleyerek indirek yoldan inhibe eder. Astrositlerdeki glutamatı temizleme
kapasitesindeki bozulma antioksidanlar, vitamin-E ve glutatyon ile düzeltilebilir. Bu
durum, astrositik glutamat transportörlerinin serbest radikaller ile kısmen de olsa
hasarlandığını göstermektedir. Oligodendrositlerdeki glutamat transportörlerindeki
geriye dönüĢüm de hipoksik-iskemik hasarın mekanizması ile iliĢkilendirilmiĢtir.43
Son
olarak glutamat reseptörlerinin fetal geliĢim sırasında aksonlarda geçici olarak
bulunduğu tanımlanmıĢtır, bu nedenle aksonal zedelenme immatür beyaz cevherdeki
glutamat birikiminin diğer bir nedeni olabilir.44
DolaĢımda yer alan sitokinler, iskemi veya maternal, fetal ve neonatal kaynaklı
enfeksiyon zemininde oluĢabilirler. Tek baĢına iskemi dolaĢımdaki sitokinlerin
artmasına neden olabilir. Buna karĢın ĠL-1β ve TNF-α gibi inflamatuvar sitokinlerin in-
situ üretimi endotoksinler aracılığı ile mikroglialar üzerinde toll-like reseptörlerin
aktivasyonu ile sağlanır ve oligodendrosit ölümüne neden olur.45
2.1.5.3.8. Apopitoz
Hipoksi iskemiden sonra nöronlar dejenere olur. Nöronların nasıl öldüğünü
anlamak tedavinin yönlendirilmesi için oldukça önemlidir. Nöronlar farklı yollarla
ölebilir. Hücre ölümü apopitoz ve nekroz diye iki farklı tip olarak sınıflandırılmıĢtır. Bu
hücre dejenerasyonun yapısal ve biyokimyasal açıdan farklı oldğuna inanılmaktadır.1
Page 31
21
Apopitoz özel moleküler yolaklarla ilerleyen kendine özgü meknizmaların
karıĢtığı aktif organize programlanmıĢ hücre ölümüdür. Apopitoz genelde geliĢen
beyinin fizyolojik hücre ölümü olarak görülür. Memelilerde birkaç gen ailesi apopitozu
düzenler (Tablo 6). Bcl-2 ailesi; sistein içeren kaspaz ailesi, aspartat spesifik proteazlar;
apopitoz inhibitör protein (AĠP); ailesi, tümör nekrozis faktör (TNF) reseptör ailesi ve
p53 gen ailesi46
Bcl-2 protoonkogen ailesi birtakım etkileĢimler yoluyla proteinleri
kodlayan apopitozis düzenleyici bir gen grubudur. Bu Bcl-2 ailesi içerisindeki
etkileĢimler hücresel yaĢam ve ölüme etki eder. Kaspazlar (sisteinil aspartat- spesifik
proteazlar) proenzimler tarafından aktive edilirler. Nükleer proteinler, hücre iskeleti
proteinleri, sitozolik proteinler kaspazlar tarafından parçalanan hedef proteinlerdir.
Normal hücrelerde istenmeyen apopitozu önlemek için proapopitotik proteinlerin
aktiviteleri apopitoz inhibitör proteinler tarafından etkisizleĢtirilir. Apopitoza bağlı
hücre ölümü hücre membranında bulunan ölüm reseptörleri olarak adlandrılan yüzey
reseptörlerince baĢlatılabilir. Tümor nekrozis faktör reseptör ailesi ölüm reseptörleri
olarak görev yapar. Fas (CD95/Apo–1) ve p75 (düĢük afiniteli sinir büyüme faktör
reseptörü) bu ailenin üyeleridir. Bu mekanizmayla apopitoz Fas‟ın hücre yüzeyinde
birikimi ile baĢlatılır. Çok değerli Fas ligandların TNF ailesinden bir üye tarafından
bağlanması ile Fas aktivasyonuna neden olur. P53 ve onun iki homologu olan p63 ve
p73 apopitozu harekete geçirir.46
Nekroz, hücreye dıĢarıdan gelen saldırılardan (osmotik, termal, toksik veya
travmatik) dolayı hemostazı sürdürememesi ile sonuçlanan hücre ölümüdür. Hücresel
nekroz süreci hücre membranın yapısal ve fonksiyonel içerğinin hasarı, hızlı iyon ve su
giriĢi sonuç olarak hücrenin çözülmesini içerir. Böylece hücresel nekroz hücre içindeki
bir program değil fakat ani veya yavaĢ homostatik karıĢıklıklar ve fizyolojik
durumlardan gelen değiĢiklikler tarafından baĢlatılır. Hipoksi iskemiden sonra
nörodejeneratif hastalıklardan farklı bir hücre ölümü meydana gelir. Havyan modelleri
HĠE için tedaviler geliĢtirilmesine yardım edebilir. Bu tedaviler anahtar enzim
aktivasyonunun inhibisyonu, hücre membranındaki iyon kanallarının (NMDA, Ca+2
kanalları), diğer proteinlerin veya nöronal hasar sürecinde ortaya çıkan toksik kimyasal
ürünlerin (serbest oksijen radikaller) bloke edilmesi veya aktivasyonunun önlenmesini
sağlayan ilaçlar olabilir.47
Page 32
22
Ġmmatür beyinde nörodejerasyon fenotipik olarak heterojenöz veya bölgeye
özeldir. Hayvan modelinde korpus striatum nöronal hasar daha baskın bulunmuĢtur.48-50
Yenidoğan rat beyninde apopitoz daha çok saptanmıĢtır.51-53
EriĢkinlerde hipoksi
iskemiden sonra selektif nöronların apopitoza yatkın olması kavramı halen
tartıĢmalıdır.54,55
Yenidoğan beyninde, bu düĢünce daha çok sorgulanmalıdır. Hipoksi
iskemiden sonra apopitozun ve nekrozun nöronal ölüme katkısının doğru olarak
tanımlanması son derece önemlidir. Çünkü hem klinik çalıĢamalarda hemde hayvan
modellerinde hipoksi-iskemiden sonra antiapopitotik tedaviler önerilmiĢtir.56
Hipoksi iskemiden sonra striatal nöronlarda 24 saatten sonra nekroz geliĢir.
Golgi aygıtında ve endoplamik retikulumda 3–12 saatte hasar oluĢurken, mitokondri 12
saate kadar sağlamdır. Mitokondride önce aktivitede bir baskılanma daha sonra
zararlnma ve sonunda mitokondriyal yetersizlik geliĢir. Lizozomlarda hasar 3-6 saatte
görülür. Na,K-ATPaz inaktivasyonu 3 saatte gözlenir. Hipoksinin 6 saatinde DNA ve
RNA hidroksil readikallerinden zarar görür.49,50,54
Nöronal apopitoz hipoksi iskemiden
sonraki ilk 24 saatte nöron ölümünün en büyük nedeni değildir. Nöron ve mikrogliadaki
apopitoza en büyük katkı gecikmiĢ veya ikincil hücre ölümünde görülür.49,50,57
Hipoksik iskemik yenidoğan ratlarda nörodejenerasyon hem nekroz hem de apopitoz
Ģeklinde görülmektedir. Ayrıca bu iki nöronal hücre ölümü karıĢık olarak ta görüldüğü
bildirilmiĢtir. Bu çalıĢamalarda nöronal nekroz serebral kortekste daha belirgin iken,
apopitoz talamus ve beyin sapında, hem nekroz hemde apopitoz ise hipokampus ve
striatumda görülmektedir.52,58
Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöron apopitozu
yapısal olarak kortikal zedelenmeden sonraki talamik nöron apopitozu ile benzerdir.51,58
Yenidoğan rat beyninde hipoksi-iskemiden sonraki talamik nöronlardaki apopitoza Fas
ölüm resptölerinin ve kaspaz–8 düzeylerinde hızlı bir artıĢın eĢlik ettiği saptanmıĢtır.
Aynı zamanda mitokindriden zengin hücre fraksiyonlarında Bax ve çüzülebilir protein
kısmında sitokrom c düzeyinin arttığı gösterilmiĢtir. Talamusta artan Fas ölüm
reseptörü ve Bax, sitokrom c birikimi ve kaspaz–8 kaspaz-3‟ün belirgin artıĢına ve
apopitoz oluĢumuna neden olur.52
Bir haftalık ratlarda hipoksi-iskemiden sonra talamustaki yapısal nöron
dejenerasyonunun apopitoz olduğu bildrilmiĢtir.59
Bununla birlikte elektron
mikroskopik çalıĢmalar yalnız apopitozun olmadığını nekrozun da devam ettiğini ve
Page 33
23
devam eden apopitoz-nekroz olayının olduğunu göstermiĢitir.54,57,60
DNA
fragmantasyon analizleri bu yorumu destekler niteliktedir.61,62
2.1.5.3.8.1. Nekroz ve Apopitozda Hücresel DeğiĢiklikler
Hipoksi- iskemi süresince dokulara zarar veren metabolik değiĢiklikler
meydana gelir. Hücrede aerobik metabolizmadan anaerobik metabolizmaya kayıĢ olur. 63
Tablo 5. Nekroz ve apopitoz arasında anatomik ve iĢlevsel farklılıklar 63
Nekroz Apopitoz
Hücresel hemostaz bozulur Hücresel hemostaz sağlamdır
Hücre zarında iyon akıĢı artar (Na+, Ca
+2) Hücre zarında iyon akıĢı korunur
Organeller ĢiĢer Sitozol yoğunlaĢır
Enerji tükenir Enerji depoları korunur
Makromoleküler sentaz azalır Makromoleküler sentez uyarılır
Kromatin aggregasyonunda kayıp olur Kromatin aggregasyonu yoğunlaĢır
Pasif atrofi Aktif bozulma
Bunun sonucunda NADH, FADH ve laktik asit birikimi H+‟unu arttırır. Anaerobik
metabolizma hücrenin enerji ihtiyacını karĢılayamaz ve yüksek enerjili fosfat depoları
boĢalır. Transselüler iyon pompasının yetersizliği hücre içi Na+, Cl
- ve su birikimine
neden olur (sitotoksik ödem). Hipoksi iskemi aynı zamanda akson sonlanmalarından
eksitator aminoasitlerin (glutamat) salınımını uyarır. Sinaptik aralığa glutamat salınımı
dendritlerdeki AMPA-QA ve NMDA yüzey reseptörlerini uyararak Na+ ve Ca
+2 akıĢına
neden olur. Sitozoldeki Ca iyonu birikimi hücre zarına akıĢı arttırır, dıĢarı akıĢı azaltır.
Bu etki nöron ölümüne neden olan biyokimyasal olaylar kaskadını baĢlatır.63
Nöronlar hem nekroz hem de apopitoza uğradıklarında reperfüzyon sırasında
nöronların iĢlevsel ve antomik bütünlüğünde belirgin farklılıklar oluĢur. Nöron nekroza
gittiğinde yeni oksijen ve substrat gereksiniminden dolayı en az bazı biyokimyasal
oluĢumlarda tersine dönmeyi içeren yavaĢ ilerleyen metabolik bozukluklar görülür.
Hücresel asidoz ve laktat glikolizisi inhibe eder. Sonuç olarak glukoz tüketimi azalır ve
hücre içi glukoz birikimine neden olur. Oksidatif metabolizma yeniden gerçekleĢtiğinde
NADH ve FADH mitokondride tüketilir, hem mitokondri hem de sitozol okside olur.
Page 34
24
Oksijenizasyonla birlikte değiĢik metabolik süreçler yoluyla serbest radikal üretilir.
Mitokondriyal Ca+2 ve serbest radikal birikimi oksidatif fosforilasyonu bozarak ikincil
enerji yetersizliğine neden olur. Hücre memebranı parçalanmaya baĢlar ve özellikle
mitokondride daha belirgin olmak üzere organellerde ĢiĢme meydana gelir. Çekirdek
kromatini yoğunlaĢır ve piknozis oluĢur, sonuçta nöron çözülür ve ölür.64
Apopitozdaki iĢlevsel ve anatomik değiĢiklikler nekrozdan farklıdır. En belirgin
bozukluk mitokondride meydana gelir, ikinci olarak çekirdekte etkiler görülür.
Histolojik olarak çekirdek DNA‟sındaki değiĢiklikler özel bir boyama yöntemi olan
“terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling (TUNEL)” ile gösterilebilir.63–
67
Tablo 6. Apopitozun moleküler düzenlenmesi 66
Bcl-2 ailesi
Antiapitotik
proteinler
Proapopitotik
proteinler
Kaspaz ailesi
Apopitoz inhibitör
proteinler (AIP)
Tümör
süresör
ailesi
Bcl-2 Bax Apopitoz “baĢlatıcılar” :
kaspaz -2, -8, -9, -10
NAIP
SMN
p53
p63
p73
Bcl-x1 Bak Apopitoz “cellâtlar” :
kaspaz–3, -6, -7
Sitokin iĢlemciler: kaspaz -
1, -4, -5, -11, -12, -14
AIP1
Boo Bcl-xs
Bad
Bid
Bik
AIP2
XAIP
2.1.5.3.8.2. Ekstrinsik Apopitotik Yolak
Ölüm reseptörlerinin bulunduğu bölgede adaptör proteinlerin trimerizasyonu ile
apopitoz baĢlatıcıları olan prokaspaz–8, -10 ve -2‟nin etkisi, prokaspaz–3,-6 ve -7‟nin
aktivasyonuna yol açar. Bu membran reseptörleri tumör nekrozis faktor ile iliĢkili
apopitoz reseptör–1 ve -2, CD95/Fas/APO–1, tumör nekrozis faktör reseptör 1 ve 2,
Page 35
25
TWEK resptörlerini içerir. FAS/APO–1 (CD95) sitokin reseptör gibi hücre yüzeyi
reseptörleri hem apopitoz hem de enflamatuvar mekanizmalara karıĢır.68
2.1.5.3.8.3. Ġntrinsik Apopitotik Yolak
Bu yolak mitokondri bağımlıdır, mitokondri iç membranından salınan Bax ve
Bcl–2 ailesi üyeleri bu yolakta rol alır. Apopitotik uyarılar mitokondriyal fonksiyonları
bozar ve aĢırı miktarda serbest radikal üretimine ve serbest radikallerin yok edilmesini
sağlayan glutatyon gibi serbest radikal temizleyici sistemlerin azalmasına neden olur.
Ġskemiden sonra reperfüzyon ile birlikte serbest radikaller hücre içinde intrinsik
apopitotik yolağı etkin hale getirirler. Ayrıca mitokondriyal fonksiyonların bozulması
birlikte elektron transport zincirinin ve ADP fosforilasyonunun bozulmasına, Ca+2
‟nin
hücre içinde artmasına neden olur. Ca+2
birikimi enerji üretilmesine engel olarak
mitokondriyal transitiyon permeabilite poru‟nun (mPTP) açılmasına yol açar. Bu durum
proapopitotik protein olan Bax‟ın mitokondri içinden dıĢına çıkmasını sağlar.69
Fizyolojik koĢularda Bcl-2 bir antiapopitotik proteindir ve Bcl-2 ailesi üyesidir,
mitokondri dıĢ memranında yerĢik olup membran bütünlüğünü ve sitokrom salınıını
düzenler. Burada Bcl-2, kaspazdan bağımsız olarak apopitoz baĢlatır. Sitokrom c
salınımı prokaspaz-9 yoluyla apopitozu baĢlatır.68
2.1.5.3.8.4. Kaspaz Bağımsız Apopitoz Aktivasyonu
Kaspaz bağımsız apopitoz mitokondri iç membranından salınan daha sonra
hücre çekirdeğine yerleĢen AIF tarafından oluĢturulan ölüm sinyaline bir yanıttır.68
2.1.5.3.8.5. Kaspaz Bağımlı Apopitoz aktivasyonu
Proteolitik enzimler olan kaspaz -3, -6 ve -7 aktive olduklarında çeĢitli
proteinleri parçalarlar. Bu proteinler kinazlardan sitoskletal proteinlere, transkripsiyonel
regulatorlere kadar değiĢebilir. CAD (Caspase activated deoxyribonuclease) ve PARP
(poly ADP-ribose polymerase) apopitozu gösteren DNA parçalanmasına katkıda
bulunan iki aktive kazpaz parçasıdır. CAD sitozolden çekirdeğe geçerek orada DNA‟yı
parçalar.68
Page 36
26
2.1.6. Hipoksik iskemik beyin hasarının önlenmesine yönelik giriĢimler
Son çalıĢmalarda H-Ġ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen sürenin çok kritik
olduğu görülmüĢ ve bu dönem „terapodik pencere‟ olarak adlandırılmıĢtır. Bu dönemde
oluĢan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte
çok yararlıdır. Bu dönem fetal koyunda 6 saat kadardır.70
Fetüste ve yenidoğan bebekte
olayın baĢlangıç zamanını ve ciddiyetini bilmek zordur. Term yenidoğanda H-Ġ‟e neden
olan intrauterin asfiksinin ne zaman beyin hasarına yol açtığını belirleyen bir metot
henüz yoktur. Benzer Ģekilde beyin hasarlarının daha çok postnatal dönemde olduğu
prematürelerdeki beyin hasarı genellikle bulgu vermez veya sessizdir. Bu nedenle hem
prematürelerde hem de term bebeklerde beyin hasarının geç tespit edilmesi „terapodik
pencere‟ döneminin kaçırılmasına neden olur. Tablo 5‟te hipoksik-iskemik beyin
hasarının önlenmesinde değerli olan mevcut giriĢimler gösterilmiĢtir.10
2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması
Enerji kaybı çok ciddi olmasa dahi iskemiden sonra nöron ölümüne yol açan
kaskadı baĢlatan olaydır. Glikoz düzeyleri normal değerlerin çok üstüne çıktığında
serebral laktat düzeyleri yükselmektedir. Bu nedenle glikozun fizyolojik düzeylerde
tutulması önemlidir.1
Yüksek doz barbitüratın serebral metabolik hızı azalttığı ve böylece enerjinin
korunmasını arttırdığı bilinmektedir. Ġnsanlarda yüksek doz barbitürat kullanımı ile
ilgili çalıĢmalar yapılmıĢtır. Hafif hiperkapninin de hayvan modellerinde protektif etkisi
olduğu gösterilmiĢtir. Enerji tüketiminin azaltılmasında en umut verici giriĢim hafif
hipotermi gibi görünmektedir. Biyokimyasal etkiler bu giriĢimin nöroprotektif yararları
ile korelasyon göstermektedir. Dahası, hafif hipotermi reperfüzyondan saatler sonra
geliĢen ikincil enerji yetersizliğini de azaltır. Hafif hipoterminin perinatal hayvan
modellerinde, H-Ġ‟deki etkisi birçok çalıĢmada incelenmiĢ ve etkisi gösterilmiĢtir.
Hemen hemen tüm çalıĢmalarda hipotermi H-Ġ sırasında veya reperfüzyondan hemen
sonra veya her iki dönemde birden uygulanmıĢtır. Ancak iskemik kuzularda yapılan bir
çalıĢmada olaydan 5,5 saat sonra kranyumun hafif soğutulmasının da hasarı azalttığı
elektrofizyolojik ve nöropatolojik olarak gösterilmiĢtir. Tüm bu anlatılan giriĢimlerden
hafif hipoterminin önemli bir nöroprotektif etkisi olduğu görülmektedir.10
Page 37
27
2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu
Ekstrasellüler glutamat birikimi hem nöronal hem de oligodendroglial hücre
ölümüne yol açar. Presinaptik sinir uçlarından glutamat salınımının kalsiyum aracılıklı
olduğu ve magnezyumun bu olayı bloke ettiği için, kalsiyum kanal blokörleri veya
magnezyumun bu basamakta yararlı olabileceği bildirilmiĢtir. Ancak kalsiyum kanal
blokörlerinin kardiyovasküler yan etkilerinin olması, magnezyumun da bir çok H-Ġ
modelinde tam olarak yararlı olduğunun gösterilememiĢ olması nedeniyle rutin tedavide
kullanımı önerilmemiĢtir.10
Adenozin reseptörlerinin inhibisyonu glutamat salınımını inhibe ettiği için
adenozin, adenozin antagonistleri ve adenozin agonistlerinin nöroprotektif etkisi üzerine
çalıĢmalar yapılmıĢtır. Bazı perinatal modellerde adenozin agonistlerinin etkili olduğu
görülmüĢ olsa da mevcut bilgiler her zaman tutarlı sonuçlar göstermemektedir. 20
Kültüre edilmiĢ nöronlarda ve yenidoğan domuzlarda yapılmıĢ çalıĢmalarda
hafif hipoterminin nöroprotektif etkisinin bir kısmından sinaptik sinir uçlarından
glutamat salınımını inhibe etmesinin sorumlu olduğu gösterilmiĢtir. Ancak çalıĢmaların
bazılarında bu gösterilememiĢtir. 10
Serbest radikal tutucularının nöroprotektif etkisi, kısmen glutamat salınım
düzeyinde etki göstermesine bağlı olabilir çünkü serbest radikallerin bazı modellerde
nöronal glutamat salınımını arttırdığı görülmüĢtür. Ayrıca fenitoin ve lamotrijinin de H-
Ġ‟de yararlı etkisinin görülmesi bu antikonvülzanların glutamat salınımını inhibe
etmesinden kaynaklanmaktadır. 10
2.1.6.3. Glutamat geri alımındaki bozukluğun iyileĢtirilmesi
Hipoksi-iskemi‟de ekstrasellüler glutamat artıĢının nedeni sadece artmıĢ salınım
değil aynı zamanda astrosit ve presinaptik sinir uçlarından geri alımın bozulmasıdır
(Ģekil-2). Hipotermi, iskemi nedeni ile geliĢen astrositlerde enerji bağımlı glutamat
alımındaki bozukluğu azaltarak bir miktar nöroprotektif etki sağlayabilir. Bu kanıya
kültüre astrositlerdeki çalıĢmalar sonucunda varılmıĢtır. 10
Page 38
28
Tablo 7. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki mevcut değerli giriĢimler1
1. Enerji kaybının azaltılması
Glikoz
Hipotermi
Barbitürat
Hiperkapni (hafif)
2. Glutamat salınımının inhibisyonu
Kalsiyum kanal blokörleri
Magnezyum
Adenozin/adenozin agonistleri
Hipotermi
Serbest radikal tutucuları
Lamotrijin
Fenitoin
3. Glutamat alım yetersizliğinin düzeltilmesi
Hipotermi
4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi
NMDA reseptör antagonistlerinin (MK–801, magnezyum, ketamin, dekstrofan) verilmesi
Non-NMDA reseptör antagonistlerinin (NBQX, CNQX) verilmesi
5. Lökosit/ mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu
Nötropeni
Platelet aktivasyon faktör (PAF) antagonistleri
IL-1 reseptör antagonistleri
Anti-ICAM-1 antikoru
Antisitokin antikorları/ilaçları
6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi
Hipotermi
Serbest radikal sentez inhibitörleri (allopurinol, indometazin, demir Ģelatörleri,
magnezyum)
Serbest radikal tutucuları (vitamin E, 21-aminosteroidler)
NOS inhibitörleri/tutucuları (nitroarjinin deriveleri)
Growth faktörleri (ĠGF–1, BDNF, GH, NGF) içeren anti-apopitotik ajanlar
Monosialogangliosidler (GM–1)
Page 39
29
2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi
NMDA reseptör antagonistlerinden özellikle MK–801, magnezyum; ketamin ve
destrofan‟ın iskemik nöron hasarının değiĢik modellerinde hem kültür hem de in-vivo
Ģartlarda nöroprotektif etkisinin olduğu gösterilmiĢtir. Benzer Ģekilde bazı modellerde
non-NMDA (AMPA/kainate) antagonistlerinin (örn.NBQX, CNQX) kullanımı ile ek
yararlı etki gösterilmiĢtir.
Bu ajanlar daha sıklıkla hasardan birkaç saat sonra veya hasarın sonlanmasından
hemen sonra uygulandığında nöroprotektif etkisi belirgindir. 10
Non-NMDA reseptörlerin inhibisyonu sadece nöronal zedelenmeyi değil aynı
zamanda oligodendroglial zedelenmeyi de inhibe eder. Son çalıĢmalar AMPA/kainate
reseptörlerinin aktivasyonunun kültüre oligodendrositlerin ve in-vivo çalıĢmalarda
oligodendrogliaların ölümüne neden olduklarını göstermiĢtir.10
Bu bulguların hepsi
birden değerlendirildiğinde glutamatın hem reseptör hem de non-reseptör aracılıklı
mekanizmalar ile immatür oligodendroglialara toksik etki gösterdiği görülmektedir.
Mekanizmaların her ikisi de non-reseptör aracılıklı olanlar serbest radikal tutucuları ile
ve reseptör aracılıklı olanlar da spesifik reseptör antagonistleri ile önlenebilir. Non-
NMDA antagonistlerinin farklılaĢan oligodendrositleri hipoksik-iskemik olaydan
korumadaki yararlı etkisinden dolayı bu ajanlar hem nöronal hem de beyaz cevher
hasarına karĢı koruyucu olabilir. Oligodendrositler NMDA reseptörü eksprese etmezler
ve nöronlardan farklı olarak NMDA antagonistleri oligodendroglial korumada önemli
görünmemektedir. 10
2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu
Hipoksi-iskemiye maruz kalan immatür oligodendrositler sitokinlerden en fazla
zarar gören hücrelerdir.3 Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi
hipoksik-iskemik beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu
düzeyde nöroproteksiyon ile ilgili çalıĢmalar azdır. Ġn-vivo perinatal hipoksik iskemik
hasarda H-Ġ öncesi yaratılan nötropeninin yararlı etkisi olduğu gösterilmiĢtir. 10
Ġskemi/reperfüzyon ile artan PAF lökosit adezyonunda ve daha sonra geliĢen
inflamatuvar kaskatta önemlidir. Ġmmatür ratta PAF antagonistinin hem tedavi öncesi
hem de tedavi sonrası reperfüzyondan sonra uygulanmasının infarkt sahasını azalttığı
gösterilmiĢtir.10,71
EriĢkin hayvanlarda yapılan çalıĢmalarda lökosit adezyon molekülleri
Page 40
30
veya değiĢik sitokinlerin üzerine etki eden antikor veya ilaçların önemli nöroprotektif
etkisi olduğu görülmüĢtür. Mikroglia/makrofajların önemli bir ürünü IL-1β‟dır. IL-1β
TNF-α‟yı da içeren diğer proinflamatuvar sitokinlerin salınımını sağlar. Yenidoğan ratta
H-Ġ‟de IL-1β reseptör antagonistinin olaydan önce ve reperfüzyon sırasında
kullanılmasının yararlı etkileri olduğu gösterilmiĢtir.10
Benzer Ģekilde bir fosfodiesteraz
inhibitörü olan, H-Ġ‟den sonra beyinde arttığı bilinen ve TNF-α üretimini inhibe eden
pentoksifilin‟in H-Ġ‟den hemen önce uygulandığında hipoksik-iskemik hasarını azalttığı
görülmüĢtür (Tablo 8). 10
Tablo 8. Deneysel modellerde perinatal hipoksik iskemik beyin hasarında inflamasyon ve
sitokinler10
Hipoksi- iskemiden sonra hızlı ve aktif bir Ģekilde mikroglia aktivasyonu olur
Nötropeni koruyucudur
Sitokinler (özellikle de IL-1β ve TNF-α) H-Ġ‟den sonra hızlı bir Ģekilde artar
TNF-α antagonisti olan pentoksifilin H-Ġ‟den hemen önce uygulandığında hipoksik iskemik
beyin hasarını azaltır
IL-1 β reseptör antagonistleri H-Ġ‟den önce veya H-Ġ sonlandıktan hemen sonra uygulandığında
hipoksik- iskemik beyin hasarını azaltmaktadır
2.1.6.6. Ġntrasellüler olayların akıĢının bloke edilmesi
Hücre ölümüne neden olan intrasellüler biyokimyasal olayların akıĢının blokajı
kalsiyumla aktive olan iĢlemler, serbest oksijen radikallerinin oluĢumu, nitrik oksit
sentezi ve apopitotik ve nekrotik hücre ölümüdür. Hipotermi bu kaskadta bir çok
düzeyde etki eder ancak bu etkiler arasında en belirgin olanları serbest radikal oluĢumu
ve nitrik oksit sentezindeki azalmadır. DeğiĢik H-Ġ modellerinde nöroprotektif olduğu
gösterilen serbest radikal inhibitörleri; ksantin oksidazı inhibe eden allopurinol,
siklooksijenazı inhibe eden indometazin, Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikallerin
üretimini azaltan demir Ģelatörleri ve lipid peroksidasyonunu inhibe eden
magnezyum‟dur. Serbest radikal tutucularının (vitamin E, 21-aminosteroidler,
idebenon) nöroprotektif etkilerinin olduğu gösterilmiĢtir.10
Deneysel modeller hem
nöronal hem de oligodendroglial hasarı içermektedir.
Page 41
31
2.2. Eikozanoidler (AraĢidonik asid metabolitleri) ve Otakoidler
Eikozanoidler yirmi karbon atomlu yağ asidlerinden türeyen ve güçlü biyolojik
etkinlik gösteren endojen maddelerdir. Eikozanoid adı Yunanca yirmi anlamına gelen
“eicosa”dan gelir. Yirmi karbonlu yağ asidi iskeleti üzerinde varolan yapı
değiĢikliklerine göre, doğrudan biyolojik etkinliği olan primer eikozanoidler değiĢik alt-
gruplarda toplanırlar. Bu alt-gruplardaki maddeler dokularda araĢidonik asid ve diğer
prekürsör yağ asidleri üzerine belirli enzimlerin etkimesi sonucu oluĢurlar. Bu enzimler
siklooksijenazlar, lipooksijenazlar ve sitokrom P450 monooksijenaz enzimleridir.72
Eikozanoidler, prekürsör yağ asidlerinden oluĢmalarında rol oynayan enzim
türüne göre siklooksijenaz ürünleri, lipooksijenaz ürünleri ve 450 mono oksijenaz
ürünleri Ģeklinde üç gruba ayrılır. Bu grupların fizyolojik ve patolojik olaylara katkıları
ve çeĢitli sistem ve organlara etkileri bakımından aralarında belirgin farklar vardır.72
2.2.1.Eikozanoid Biyosentezi
Eikozanoidlerin biyosentezi, araĢidonik asidin hücre membranındaki
fosfolipidler veya diğer kompleks lipidlerden fosfolipaz A2 (PLA2) gibi eikozanoid
sentez enzimleri aracılığı ile mobilize edilmesine veya salınımına bağımlıdır.
AraĢidonik asid kısmen de fosfatidilinozitidlerden fosfolipaz C ve digliserid lipaz
kombinasyonu aracılığı ile sentezlenmektedir.73,74
Eikozanoid biyosentezindeki artıĢ, genel olarak fiziksel, kimyasal ve hormonal uyarılara
cevap olarak oluĢmakta veya düzenlenmektedir. Daha sonraki basamakta araĢidonik
asid, dört ayrı sentez yolağına girer: siklooksijenaz (prostaglandin endoperoksidaz
sentaz), lipooksijenaz, P450 epoksijenaz (sitokrom P450) ve izoprostan (ġekil 1).74
2.2.1.1. Siklooksijenaz Ürünleri (Prostaglandinler, Prostasiklinler ve
Tromboksanlar)
Siklooksijenaz enziminin 2 izoformu vardır: siklooksijenaz-1 (COX- 1) ve
siklooksijenaz-2 (COX-2). COX-l bir çok hücrenin içeriğinde gösterilmiĢtir ve daima
vardır. Aksine COX-2 normal olarak bulunmaz fakat belli serum faktörleri, tümör
promotorları, sitokinler ve growth faktörler ile indüklenebilir ve bu etki deksametazon
Page 42
32
gibi glukokortikoidler ile inhibe edilebilir. Lipopolisakkarid (endotoksin) kısmen bu
indükleme yönünden potent bir ajandır. Bu sentez basamakları üzerinde nonsteroidal
anti-infiamatuvar ilaçların kendi terapötik etkilerini göstermesi açısından büyük önem
taĢır. Ġndometazin ve sulindak baĢlıca COX-l üzerinden etkisini gösterir. Meklofenamat
ve ibuprofen COX- 1 ve COX-2 üzerinde eĢit derecede potent etki gösterirken.
selokoksib ve rofekoksib tercihen COX-2‟yi inhibe etmektedir. Selektif COX-2
inhibitörleri, COX-l inhibitörlerine göre daha az gastrik strese neden olmakta ve kronik
inflamasyonun tedavisinde daha tercih edilmektedir. Aspirin her iki enzimi de farklı
uzantılarda asetiller ve inhibe eder. Siklooksijenazların iki farklı aktivitesi mevcuttur:
(1) endoperoksidaz aktivitesi esterleĢmemiĢ prekürsör yağ asidlerini siklik endoperoksid
prostaglandin G (PGG)‟ye oksijenalize ve siklize eder, (2) peroksidaz aktivitesi ile
PGG‟yi prostaglandin H (PGH)‟ye dönüĢtürür. Stabil olmayan PGG ve PGH ileri
basamaklarda prostasiklin (PGI2), tromboksan (TXA), prostaglandin E (PGE),
prostaglandin F (PGF) veya prostaglandin D (PGD) gibi ürünlere dönüĢür. PGE2 ve
PGD2 sentezi için farklı izomerazlar tespit edilmiĢtir. PGH2‟nin PGF2‟ye dönüĢümünü
katalizleyen bir redüktaz enzimi de karakterize edilmiĢtir. PGH2 ayrıca iki ayrı stabil
olmayan ve oldukça aktif maddelere dönüĢür: (1) tromboksan A2 (TXA2) tromboksan
sentaz ile oluĢturulmaktadır. Bu ürün 30 saniye içinde stabil fakat inaktif TXB2‟ye
dönüĢmektedir. PGI2 prostasiklin sentaz ile oluĢturulmakta ve nonenzimatik olarak
inaktif 6-keto PGFct‟ye dönüĢmektedir. Çoğu dokuların serbest araĢidonik asidden
PGG ve PGH sentezi yapabilme yeteneği varken, her bir dokuda enzimlerin varlığına ve
miktarına bağlı olarak yazgıları değiĢmektedir. Örneğin, akciğer ve dalak bu ürünlerin
tümünü sentezleyebilir. Buna karĢılık trombositler PGH‟yi metabolize eden baĢlıca
enzim olarak tromboksan sentaz enzimini içermekte iken, endotel hücreleri baĢlıca
prostasiklin sentaz enzimini içermektedir.72
2.2.1.2. Lipooksijenaz Ürünleri
AraĢidonik asidin 5-, 12- ve 15-lipoksijenaz ile metabolize olması sonucu
hidroksiperoksieikozatet raenoik asid (HPETEs) oluĢur, daha sonra bu ara ürün hızlı bir
Ģekilde hidroksi türevlerine (HETEs) ve lökotrienlere dönüĢür. Aktif olarak araĢtırılan
lökotrienlerin çoğu inflamatuvar hücrelerde (PMNs, bazofil, mast hücreleri, eozinofil,
Page 43
33
makrofaj) 5- lipooksijenaz tarafından oluĢturulmaktadır. Bu yolak astım ve anafilaktik
Ģok ile iliĢkili olduğundan önem taĢır. Bu hücrelerin uyarılması intraselüler kalsiyum
seviyesini yükseltir ve araĢidonik asid salımmına, daha sonra da 5-lipooksijenaz ile
unstabil epoksid lökotrien A1 (LTA1) oluĢumuna neden olur. Bu ara ürün dihidroksi
lökotrien B4 (LTB4) ya da lökotrien C4 (LTC4)‟e dönüĢür. LTC4 peptidazlarla LTD4
ve LTE4‟e dönüĢebilir. LTC4 ve LTD4 kuvvetli bronkokonstriktördür ve “slow-
reacting substance of anaphylaxis (SRS-A)”ın baĢlıca yapıları olarak fark edilmiĢlerdir.
Anti-lökotrien ilaç geliĢimine yönelik dört yaklaĢım vardır: 5-lipooksijenaz enzim
inhibitörleri, lökotrien reseptör antagonistleri, membrana bağlı 5- lipooksijenaz aktive
edici protein (FLAP) inhibitörleri ve fosfolipaz A2 inhibitörleri. Diğer bir grup
lipoksinlerin LXA ve LXB‟in biyolojik rolleri henüz aydınlanamamıĢtır.10
2.2.1.3. Eikozanoid Metabolizması
Prostaglandinler sentez edildikleri dokularda bulunan enzimler tarafından veya
akciğer ve böbrek korteksinde bulunan enzimler tarafindan inaktive edilirler. Özellikle
akciğer damar yatağı bu maddeleri inaktive etmekte oldukça etkindir ve bu organda
%95‟e varan bir oranda inaktivasyon gerçekleĢir. Tüm prostaglandinlerin biyolojik
aktivitesi için önemli olan C15-hidroksil grubu ilk olarak prostaglandin 15-
hidroksidehidrojenaz enzimi ile okside edilir. Ardı sıra gelen bir dizi olaydan sonra PGE
ve PGF‟ler inaktif tetranor (16 karbonlu) metabolitlerine, PGD2 ise PGJ2‟ye dönüĢür.
Prostasiklin akciğerde parçalanmaz fakat karaciğer ve böbrekte inaktive edilir. Ana
metaboliti olan 6-keto-prostagiandin F1‟ya yıkılır. TXA2 inaktivasyonu ise karmaĢıktır.
Enzimatik olmayan bir hidrolizle TXB2‟ye dönüĢür. LTC4‟ün inaktivasyonu akciğerler,
böbrek ve karaciğerde geliĢir. BaĢlangıç basamağında LTE4‟e dönüĢür ve biyolojik
aktivitesini kaybeder. LTB4‟ün metabolizması ise baĢlıca oksidasyonla oluĢur.75
2.2.1.4. Eikozanoidlerin Etki Mekanizması
Eikozanoidler otokrin ve parakrin özellik gösterirler ve hücre yüzeyinde
reseptörlere bağlamrlar. Prostanoidlerin farmakolojik spesifikliği farklı hücrelerde
reseptör tipi ve yoğunluğu ile belirlenir. Bütün reseptörler ve alt tipleri G-proteinine
kenetli olarak etkilerini gösterirler. Ġkincil ulaklar olarak adenilil siklaz stimülasyonu
Page 44
34
(cAMP artıĢı) veya inbibisyonu (cAMP azalıĢı) ya da fosfolipaz C stimülasyonu
(diaçilgliserol ve inozitol 1,4,5- trifosfat artıĢı sonucunda hücre içi kalsiyum artar)
meydana gelir. Eikozanoidlerin düz kas üzerindeki kontraktil etkileri kalsiyum salınımı
aracılığı ile olurken, onların gevĢetici etkileri cAMP üretimi ile olmaktadır.
Eikozanoidlerin immün sistem dâhil birçok hedef hücrede etkileri benzer Ģekilde
açıklanabilir. Eikozanoidlerin çoğunun kontraktil etkileri ekstraselüler kalsiyumun
azaltılması veya kalsiyum kanal blokörü ilaç kullanımı ile inhibe edilebilir.
Lökotrien Reseptörleri: DeğiĢik hücre ve dokularda LTB4, LTC4 ve LTD4 için
reseptörler tanımlanmıĢtır (cysLT1 ve cysLT2). Lökotrien reseptörleri de G proteine
kenetlidir ve onların aktivasyonu intraslüler kalsiyum konsantrasyonunu artırır.75
2.2.2. Fosfolipaz A2 ve Hipoksik Ġskemik Serebral Hasar
Beyin fosfolipaz A2, sn-2 pozisyonundaki membran fosfolipidlerindeki açil
esterlerini parçalayan bir esterazdır, serbest yağ asidi ve lizofosfolipid üretimine neden
olur. AraĢidonik asit ve lizofosfolipid fosfolipaz A2‟nin katalizlediği en önemli
reaksiyonlardır. Normal koĢullar altında bir kısım araĢidonik asit inflamatuvar
mediyatörlere, prostaglandinlere, lökotrienlere ve tromboksanlara çevrilirken araĢidonik
asitin büyük bir kısmı tekrar beyin fosfolipidlerinin içerisine katılır.76
Fosfolipaz A2
ailesi sekretuvar fosfolipaz A2, sitozolik fosfolipaz A2 ve kalsiyum bağımsız fosfolipaz
A2‟den oluĢur. AraĢidonik asit salınımı genellikle sitozolik fosfolipaz A2 yoluyla
meydana gelir. Sekretuvar fosfolipaz A2, intraselüler olarak sentez edilir daha sonra
ektraselüler olarak seekrete edilir. Sekretuvar fosfolipaz A2 esas olarak sinaptazomlarda
ve sinaptik vesiküllerde depo edilir.77,78
Fosfolipaz A2 iki tip hücre yüzeyi reseptörüne
bağlanır. N tipi reseptör nöronlarda, M tipi reseptör ise kaslarda bulunur.79
Beyin
sekretuvaar fosfolipaz A2, bir sekresyon molekülü ve enzim aktivasyonu için gerekli
milimolar konsantrasyonda Ca+2
içeririr. Bu enzim fosfolipid yağ açil zincirleri için
seçici özellik göstermez. Sektretuvar fosfolipaz A2 memeli beyinin tüm bölgelerinde
bulunur. Fakat hipokampus, medulla oblongata ve ponsta daha yüksek aktivite
gösterir.80
Page 45
35
Rat beyin sinaptozomlarında ve nöron hücre kültürlerinde sekretuvar fosfolipaz
A2, asetil kolin, glutamat reseptörleri, veya voltaj bağımlı kalsiyum kanalları yoluyla
depolarizasyona neden olduğu gösterilmiĢtir. Bu bulgulara göre sekretuvar fosfolipaz
A2 nöronal metabolizmada önemli rol oynayabilir.78,81
Glutamat ve analogları sekretuvar fosfolipaz A2‟yi doza ve zamana bağlı olarak
uyarır.82
Kortikal hücre kültürlerinde glutamat nörotoksisitesinin artmıĢ sekretuvar
fosfolipaz A2 ile birlikteliği vardır. Bu gözlem glutamatın sinaptik aktivitesinin
sekretuvar fosfolipaz A2 tarafından düzenlendiğini gösterebilir.83
Sitozolik fosfolipaz A2 tüm beyin dokularında bulunmasına karĢın tam olarak
pürifye edilelmemiĢtir. Rat beyninde sitozolik fosfolipaz A2‟nin Hve L diye iki formu
bulunmuĢtur. Fosfolipaz A2-H kalsiyum ile inhibe olurken, fosfolipaz A2 –L‟nin aktivite
göstermesi için mikromolar konsantrasyonda kalsiyuma gereksinim vardır.84
Sitozolik
fosfolipaz A2 izoenzimleri araĢidonik asit salınımı ve eikozonoid formasyonundan
sorumlu olduğu düĢünülür.85
Hücresel seviyede, kalsiyum mobilizasyonu, sitoplazmik
fosfolipaz A2 ve ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A2 arasındaki etkileĢim eikozanoid
artıĢından sorumlu olabilir. Patolojik koĢullar altında kalsiyum, fosfolipaz A2 ve
ektraselüler sitoplazmik fosfolipaz A2 arasındaki etkileĢim oksidatif stres ve
inflamasyonun eĢlik ettiği nörolojik hastalıkların patofizyolojisinde önemli rol
oyanayabilir. Kalsiyumdan bağımsız fosfolipaz A2 nöronal hücre proliferasyonu,
apopitozis ve diferensiyasyonunda görev alır.77
2.3. Ġnflamatuvar Merdiyatörler ve Neonatal Beyin Hasarı
Hipoksik-iskemik beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında baĢlayıp resusitasyon
ardından iyileĢme döneminde devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal
nekroz veya infarkt Ģeklinde gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre
yapısının bozulması ile devam eder. Ġnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan
nöronlarda nekroz ya da programlanmıĢ hücre ölümü yani apopitozis geliĢir.11
Özellikle
prematüre bebeklerde son yıllarda yapılan epidemiyolojik ve deneysel çalıĢmalarda
inflamasyon, periventriküler lökomalazi ve serebral palsi arasında yakın iliĢki olduğu
görülmüĢtür.3 Nekroz geliĢmiĢ hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz konusu değildir.
Ancak infarkt etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi bu dönemde
meydana gelen biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir.
Page 46
36
Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük
damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve
ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan serbest radikaller
lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini aktive ederek
lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Kan beyin bariyerinin bozulmasıyla
serbest radikaller parankim içine boĢalarak hasarın yayılmasına neden olur.86
Neonatal
beyin hasarının erken döneminde gözlenen nötrofil akümülasyonu ile hasarın derecesi
arasında yakın iliĢki olduğuna inanılmaktadır. Ayrıca serebral iskemide santral sinir
sisteminde inflamatuvar mediyatörlerin açığa çıktığı bilinmektedir. EriĢkin ve immatür
kemirgen hayvanlarda hipoksi iskemi sonrasında beyinde IL-1 ve TNF- gibi
sitokinlerin açığa çıktığı gösterilmiĢtir.87
2.3.1. Prostaglandin ve Hipoksik-iskemik Beyin Hasarı
Ġskemik zedelenme beyin dokusunda fosfolipaz A2 uyarısı doğurur. Bu
enzimlerin uyarılması beyinde büyük miktarda serbest yağ asidi salınımı ile
sonuçlanır.77
Serbest yağ asidi oluĢumu, ATP‟nin tükenmesi ve iyon hemostazındaki
değiĢiklilkler membren fonksiyon bozukluğu ve hücresel hasara neden olur.77
Ayrıca
iskemik zedelenmeden sonra sitoplazmik fosfolipaz A2 mRNA gen ekpresyonunda artıĢ
meydana gelir.88
Sitoplazmik fosfolipaz A2‟nin nöronal hasar ile iliĢikisi güçlü bir
biçimde ortaya konmuĢtur.89
Orta serebral arterin bağlanmasından sonra sitoplazmik
fosfolipaz A2 genetik olarak olmayan farelerde daha az nöronal hasar, daha az infarkt ve
beyin ödemi oluĢtuğu gösterilmiĢtir. Yine bu grup farelerde prostaglandin ve lökotrien
üretiminin önemli ölçüde azalmıĢtır.90
Hipoksi iskemiden sonra sitozolik Ca++
konsantrasyonu artar. Artan sitozolik
fosfolipaz A2‟yi aktive eder ve serbest yağ asitleri ve araĢidonik asit üretimine neden
olur. AraĢidonik asit metabolizasyonu sonrası serbest oksijen radikallerinin üretimi ile
sonuçlanır. HĠE geliĢen yenidoğan bebeklerde HĠE‟nin ağırlığı ile BOS‟ta ölçülen
prostanoidlerin konsantrasyonu arasında iliĢki olduğu bildirilmiĢtir.6,91
Ġndometazin uygulaması PGD2‟nin yükselmesini ve hasarlı bölgenin alanını
azaltmıĢtır. PGD2 sentezinin inhibisyonu bu etkileri reseptör aracılı mekanizmalar ile
Page 47
37
iliĢkili olabileceği gibi sikjlooksijenazın katalize ettiği ve serbest radikallerin üretimine
neden olan yolak gecikmiĢ nöronal ölüme neden olabilir. Yine prostanoide bağlı beyin
hasarı glutamat toksistesi ile iliĢkili olabilir.6
Ġskemiyi takiben doku hasarı ve apopitozis meydana gelir. Hipoksi-iskemiden
sonra siklooksijenaz–2‟nin upregülasyonu ve PGE2 düzeyinin arttığı bildirilmiĢtir.93
Bir çalıĢmada PGE2‟nin uyardığı apopitozis kaspaz-3 bağımlı olduğu ve kaspaz
inhibitörleri PGE2‟nin uyardığı apopitozisi önlediği gösterilmiĢtir. Bu olayda kapsaz-8
ve kaspaz-7‟de olaya karıĢmıĢ olabileceği ileri ileri sürülmüĢtür. 94
Iedocala ve arkadaĢları95
genetik olarak COX-2 negatif ratlarda iskemiye olan
yatkınlığın azaldığını göstermiĢtir. Bu veriler PGE2 „nin gecikmiĢ nöronal ölümde rol
aldığını göstermektedir.
COX-2 aktivasyonu ile bazı prostanoidler üretilir ve bu durum doğrudan nöronal
ölüm ile iliĢkili olabilir.96
Ayrıca PGE2 sitokin üretimini arttırarak nörotoksisiteye
katkıda bulunabilir veya glutamat toksisitesini arttırabilir.97
NS-398 uygulaması
glutamat toksisitesine bağlı nöronal hasardan korur. Belki de hücre içi Ca++
hemostazını
sağlayarak bunu gerçekleĢtirir.98
COX inhibitörlerinin verilmesinin deney hayvanlarında geçici ön beyin
iskemisinden sonra gecikmiĢ hipokampal CA1 nöronal ölümü azalttığını göstermiĢitir.99
Ayrıca nonselektif COX inihibisyonunun iskemik infarkt alanını küçülttüğünü
göstermiĢtir.100
.
Öte yandan kortikal hücre kültürlerinde NMDA reseptör aracılı
nörotoksistenin patogenezinde COX-2‟nin katkısının olduğu ve nöronal hücre hasarında
COX-2 mRNA eksprsyonu ve aktivitesini takiben nörotoksik NMDA konsantrasyonu
arttığı ileri sürülmüĢtür. Nonselektif COX enzim blokajı prostaglandinlerin uyardığı
NMDA„yı azaltır. Bu etki sadece COX-2 inhibisyonu ile meydana gelir COX-1
inhibisyonun böyle bir etkisi yoktur. Yine COX-2 inhibisyonu ile yalnızca NMDA
aracılı nöroprotektif etki meydana gelir.98
Page 48
38
3. GEREÇ ve YÖNTEM
Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarının patogenezinin anlaĢılması ve yeni
tedavi yaklaĢımlarının belirlenmesi amacıyla yıllardan beri immatür rat modelleri
kullanılmaktadır.101-103
Yedi günlük ratların tercih edilmesinin nedeni bunların
beyinlerinin geliĢim düzeyinin histolojik olarak 32-34 haftalık insan fetusları ile olan
benzerliğidir. Yedi günlük ratlarda serebral kortikal nöron tabakası geliĢimini
tamamlamıĢ, germinal matriks involüsyona uğramıĢ ve beyaz cevher henüz miyelinize
olmaya baĢlamıĢtır. Postnatal 12-13 günlük ratların beyinleri ise fulterm
yenidoğanlarınkine benzemektedir. Ġmmatür ratlarda hipoksi-iskemi oluĢturmak
amacıyla tek taraflı karotis arter ligasyonu ardından % 8 oksijen, % 92 nitrojen
karıĢımının inhalasyonu Ģeklinde uygulanan Levin‟in rat modeli kullanılmaktadır.80
Bu çalıĢma, hipoksi-iskemi modeli oluĢturulan 7 günlük Winstar-albino ratlar
üzerinde yapıldı. ÇalıĢmaya alınan ratlar Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi
Deneyler AraĢtırma ve Uygulama Merkezinde üretime alınan 10 ayrı rat çiftinin
bulunduğu kafeslerden seçildi. Aynı merkezde oluĢturulan etik kurul tarafından
çalıĢmanın etik onayı alındı. Ratların bulunduğu ortamda 12 saat gündüz, 12 saat gece
ortamı sağlandı. 0da sıcaklığı sürekli olarak 21-23 0C ve nemi % 40-60 arasında tutuldu.
Üretime alınan eriĢkin ratlar Adana TavaĢ yem fabrikasından temin edilen standart rat
yemi ile beslendi.
ÇalıĢmaya ağırlıkları ve cinsiyetleri arasında fark olmayan üç tedavi, bir hipoksi
iskemi grubu ve bir kontrol olmak üzere toplam beĢ grup rat alındı. Ġlk doğdukları
günden itibaren annelerinin yanında bulunan ve anne sütü ile beslenen rat yavruları 7
günlük olduklarında çalıĢmaya alındı. Her bir ratın hangi gruba alınacağı randomize
seçimle belirlendi. Grup 1, hipoksi ve iskemi iĢlemi uygulanmayan ancak sadece cilt
kesisi yapılan ve tek doz 2 ml /kg % 0,9 NaCl (serum fizyolojik=SF) verilen shame
grubu (n=15). Grup 2, hipoksi iskemi grubu hipoksi iskemi iĢlemi yapılan ve 2 ml/kg %
0,9 NaCl (serum fizyolojik: SF) (n: 15), Grup 3, hipoksi iskemi iĢleminden 30 dakika
öncesinde tek doz 2 mg/kg/doz indometazin verilen grup (n: 15). Grup 4, hipoksi iskemi
iĢlemi sonrası 2 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15, Grup 5, hipoksi
iskemi iĢlemi sonrası 4 mg/kg/doz indometazin tedavisi verilen grup (n: 15) olarak
belirlendi. ÇalıĢmaya alınan rat yavrularının iĢlem öncesi ağırlıkları ve cinsiyetleri
kaydedildi. Eter anestezisi altında boyun ortasından, trakeanın hemen solundan
Page 49
39
uygulanan 0,5 cm‟lik kesi ile sol arteria karotis kommunis bulundu. 4/0 ipek sutur
materyali ile arter iki tarafından bağlanılarak ortası kesildi. Cilt aynı sutur materyali ile
kapatıldıktan sonra 1-2 saat süreyle anestezi etkisi geçene kadar annelerinin yanına
verilen ratlar beĢerli gruplar halinde % 8 oksijen, % 92 nitrojen içeren transparan
fiberglastan yapılmıĢ, çevre ısısı ıĢık kaynağı yardımıyla 33 oC‟ye ayarlanan bir kafeste
2,5 saat bekletildi. Ortamdaki oksijen konsantrasyonu oksijen monitörü (ohmeda 5120
seri numarası: FABQ0104 USA) ile sürekli ölçülerek %8 oksijen içeren hipoksik ortam
2,5 saat süreyle korundu. Bu iĢlemin ardından yarım saat oda havasında iyileĢmeye
bırakılan ratlar deney sonuna kadar kalmak üzere annelerinin yanına verildi.
Ġlaçlar ve SF; intraperitoneal yoldan 50lt içerisinde, insülin enjektörleri ile
uygulandı. Grup 1‟de (Shame grubu) tek doz 2 ml/kg % 0,9 NaCl uygulandı. Grup 2‟de
(Hipoksik iskemik grup) 2 ml /kg % 0,9 NaCl hipoksi-iskemi iĢlemi bittikten yarım saat
sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Ġndometazin (ConfortidR flakon
50 mg Alpharma-ISIS Germany) verilen grup 3‟de indometazin 2 mg/kg dozda hipoksi-
iskemi iĢleminden yarım saat önce tek doz verildi. Grup 4‟te indometazin 2 mg/kg
dozda hipoksi-iskemi iĢlemi bittikten yarım saat sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla
toplam 3 doz verildi. Grup 5‟de indometazin 4 mg/kg dozda hipoksi-iskemi iĢlemi
bittikten yarım saat sonra baĢlanıp 12 saat aralıklarla toplam 3 doz verildi. Üç günün
sonunda 10 günlükken deney ve kotrol grubunda yer alan ratlar derin anestezi altında
intrakardiyak formaldehit perfüzyonu ardından dekapite edildi.
Organ perfüzyonu öncesi her bir deney hayvanına 50 mg/kg intraperitoneal
yoldan pentotal verildi. Derin anestezi sağlandıktan sonra toraks açıldı, sol ventrikülden
girilip sağ atriumdan drene olacak Ģekilde 1 dk süreyle SF perfüzyonunun ardından %
10 formaldehit içeren solüsyon ile 5 dk süreyle organ perfüzyonu sağlandı. Bu iĢlemin
ardından kraniyum açılarak beyin dokusu çıkarıldı ve % 10 formaldehit içinde patolojik
inceleme yapılacağı güne kadar bekletildi.
Beyinlerden, 10 günlük rat atlası kaynak alınarak hipokampal bölgeyi tam olarak
temsil eden koronal kesitler örneklendi (82). Her bir kesitte iskemik hasar oluĢması
beklenen sol hemisferin lokalizasyonunu belirlemek için çentik ile iĢaret konuldu. % 10
Formaldehitle tespit edilen kesit örneklerinden parafin bloklar hazırlandı. Hazırlanan
parafin bloklardan 5 kalınlığında kesitler alınıp, Histokimyasal inceleme için S7100
Page 50
40
ApopTag® Peroxidase ile iĢleme tabi tutuldu. IĢık mikroskobunda değerlendirilip, her
bir grupta apopitotik hücreler sayılarak kaydedildi.
3.1.Histokimyasal Olarak S7100 ApopTag® Peroxidase Uygulanması
3.1.1.Dokuların Hazırlanması
Parafin bloklardan, lam üzerine 5 kalınlığında kesitler alındı.
a. Her kesit 5 dakika süre ile 3 kez XYLENE içinde yıkandı.
b. Her kesit 5 dakika süre ile 2 kez ABSOLUTE ETHANOL içinde yıkandı.
c. Her kesit önce %95 ETHANOL i.çinde tekrar yıkanır yıkanmaz % 70‟lik
ETHANOL içinde 3 dakika süre ile yıkandı.
d. Her kesit deparafinize edilip alkolden geçirildikten sonra fosfat tamponlu
salinde (PBS, pH 7,4) 5 dakika süre ile yıkandı. Her kesitin çevresi kurutulduktan sonra,
kesitler nemli ortama konuldu. Bu evreden baĢlayarak her basamakta kurutma iĢlemi
tekrarlandı.
3.1.2 Endojen peroksidazların giderilmesi
a. Her kesitin üzerini tamamen kaplayacak Ģekilde 2-3 damla “Peroksidase
Blocking Reagent” (% 3‟lük H2O2) damlatılarak 5 dakika oda sıcaklığında bekletildi.
b. Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi.
Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.
c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.
3.1.3 Dokuların hazırlanması
a. Kesitler proteinaz K ile 15 dakiaka süre ile oda ısısnda iĢleme tabi tutuldu (60-
150 μL/5 cm2).
b. . Ġlk durulama için kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi.
Sıkılabilir bir ĢiĢe ile PBS‟nin akması sağlandı
c. Kesitler 2 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.
3.1.4 Denge Tamponun uygulanması (EQUILIBRATION BUFFER)
a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı.
b. Hemen EQUILIBRATION BUFFER (60 μL/5 cm2, #S7100) doğrudan kesit
üzerine uygulandı. 10 saniye süreile oda ısısında inkübe edildi.
Page 51
41
c. Kesitler 10–16 saat süre ile 16–22 °C‟de nemli bir ortam içerisinde inkübe
edildi.
3.1.5 Working Strength Ligase Enziminin uyglanması
a. Nazikçe fazla sıvı preparat üzerinden alındı.
b. Bir pipet yarımıyla kesitler üzerine hemen Working Strength Ligase Enzimi
(60 μL/5 cm) uygulandı.
3.1.6 Yıkama
a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile
PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.
b. Kesitler 10 dakika süre ile 2 kez deiyonize su ile yıkandı.
3.1.7 Streptavidin-Peroxidase Conjugate uygulaması
a. Hemen bir pipetle kesit üzerine STREPTAVIDIN-PEROXIDASE (50–60
μL/5 cm2 of S7200–5) uygulandı.
b. Nemli bir ortam içerisinde 30 dakika süre ile inkübe edildi.
3.1.8 PBS içerisinde yıkama
a. Kesitler dikey olarak lavabo içine doğru silkelendi. Sıkılabilir bir ĢiĢe ile
PBS‟nin kesit üzerine akması sağlandı.
b. Oda ısısında 5 dakika süreyle 3 kez PBS değiĢtirilerek yıkandı.
3.1.9 Peroxidase Substratında renk geliĢimi
a. Kesitin üzerindeki fazla sıvı nazikçe alındı.
b. Yeterli miktardaki PEROXIDASE SUBSTRATE (75 μL/5 cm2) kestin
üzerini örterecek Ģekilde uygulandı.
c. Oda ısısında 3-6 dakika koyulaĢaması için beklendi.
d. Optimal koyulaĢmayı bulmak için ıĢık mikroskobu altında bakıldı.
3.1.10 Kesitlerin yıkanması
a. Kesitler distile su ile 3 kez 1 dakika süre ie yıkandı.
b. kesitle oda ısısnda 5 dakika süreyle distile su içinde inkübe edildi.
Page 52
42
3.1.11 Ġkinci kez örneklerim koyulaĢtırılması
a. Oda ısısında 10 süre ile %0.5 methyl green uygulandı.
b. Kesitler 3 kez distle su ile yıkandı.
c. Kesitler % 100N-BUTANOL içine 3 kez 30 saniye süre ile daldırıldı.
3.1.12. Örnekleri mikroskop altında incelemeye hazırlama
a. Örnekleri dehidrate etmek için 3 XYLENE‟li kavanozda ikiĢer dakika süreyle
örnekler bekletildi.
b. Örnekler üzerindeki sıvı nazikçe alındı.
c. Lam üzerine lamel kapatıldı.
3.1.13. Mikroskop altında inceleme
a.Örnekler ıĢık mikroskopualtında incelenmeye alındı.
3.2. Histopatolojik değerlendirme
Rat beyinleri %10‟luk formaldehitde tespit edildikden sonra, hipokampus
seviyesinden geçen bir dilim ile örneklendi. Bu dilimden parafin bloklar hazırlanarak
seri kesitler yapıldı. Hazırlanan toplam 60 histolojik kesit Histokimyasal Olarak S7100
ApopTag® Peroxidase ile iĢleme tabi tutularak ıĢık mikroskobunda değerlendirildi.
Apopitotik hücre sayımı bilateral hipokampus CA1 bölgesi ve parietal kortekste yapıldı.
10 X 40 güçteki ıĢık mikroskobunda patolog tarafından hücre sayımı 5 alanda sayılarak
kaydedildi ve Nicon® E500 fotograf makinesi ile görüntülendi (Resim–1,2,3,4).
3.3. Ġstatistiksel Değerlendirme
Tedavi ve kontrol grubunda yer alan ratların özellikleri ve sonuçlar hazır istatistik
programı SPSS version 11.0 ile değerlendirildi. Sonuçların değerlendirilmesinde Mann
Whitney U testi ve ki-kare analiz yöntemleri kullanıldı. Kontrol ile tedavi grupları
arasında yapılan ikili karĢılaĢtırmalarda; genel hata oranı = 0,05‟te tutulabilmesi için
her bir karĢılaĢtırmada önemlilik seviyesi /k olarak alındı (k=karĢılaĢtırma sayısı). P
değeri 0.05‟den küçük bulunduğunda anlamlı farklılık olduğu kabul edildi.
Page 53
43
4. BULGULAR
Serum fizyolojik verilen shame grubuna (Grup 1) ağırlıkları 9,8–13 gr arasında değiĢen,
ortalama 10,31,21 gr ağırlığında sekiz‟i erkek 15 rat alındı. Hipoksi iskemi iĢlemi
uygulanan ve serum fizyolojik verilen hipoksik iskemik grubuna (Grup 2) ağırlıkları
9,1–13,5 gr arasında değiĢen, ortalama 10,81,1 gr ağırlığında yedi‟si erkek 15 rat
alındı. Hipoksi –iskemi iĢlemi öncesi indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 3)
ağırlıkları 10,0–13,1 gr arasında değiĢen, ortalama 10,30,7 gr ağırlığında dokuz‟u
erkek 18 rat alındı. Hipoksi-iskemi iĢlemi sonrası 2 mg/kg indometazin verilen tedavi
grubuna (Grup 4) ağırlıkları 9,3–15,3 gr arasında değiĢen, ortalama 10,61,9 gr
ağırlığında sekiz‟i erkek 15 rat alındı. Son grup hipoksi- iskemi sonrası 4 mg/kg
indometazin verilen tedavi grubuna (Grup 5) ağırlıkları 8,9–13,9 gr arasında değiĢen,
ortalama 10,51,3 gr ağırlığında yedi‟si erkek 15 rat alındı. Tablo-9‟da gruplara göre
cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı gösterildi. Gruplar arasında ağırlık ve cinsiyet
bakımından istatistiksel farklılık yoktu (p>0,005).
Tablo 9. Gruplara göre cinsiyet ve ağırlıkların dağılımı
Grup Cinsiyet Ağırlık (gr)
OrtalamaSS
(alt sınır-üst sınır)
1 (Sham) n=15
7 diĢi, 8 erkek
10,31,21
(9,8–13,0)
2 (Hipoksik-iskemik) n:15
8 diĢi, 7 erkek
10,81,1
(9,1–13,5)
3 (Hipoksi–iskemi öncesi 2 mg/kg
indometazin)
n:15
8 diĢi, 7 erkek
10,30,7
(10,0–13,1)
4 (Hipoksi–iskemi sonrası 2 mg/kg
indometazin)
n:15
7 diĢi, 8 erkek
10,61,9
(9,3–15,3)
5 (Hipoksi–iskemi sonrası 4 mg/kg
indometazin)
n:15
8 diĢi, 7 erkek
10,51,3
(8,9–13,9)
Page 54
44
Gruplar arasında cinsiyet ve ağırlık ortalamaları arasında istatistiksel olarak fark
saptanmadı. Hipoksik-iskemiden sonraki 72. saatte TUNEL positif hücre sayısı grup
2‟de 22.00±5.28 iken, sham grubunda 3,86±1,09 idi (p<0.001). Hem H-I öncesi hem de
H-I sonrası 2mg indometazin tedavisi ile apopitotik hücre sayısı yaklaĢık yarı yarıya
azaldı (sırasıyla 9,83±1,23, 9,50±0,73, p<0,001 ve p<0,001). H-I sonrası 4 mg/kg
indometazin tedavisi ile TUNEL pozitif hücre sayısını (6,30±1,12) neredeyse sham
grubundaki apopitotik hücre sayısına yakın bir düzeye azalttı ve sham grubu apoptotik
hücre sayısı ile karĢılaĢtırıldığında aralarında anlamlı istatistiksel farklılık yoktu
(p>0,05). Tedavi grupları içerisinde en iyi nöroprotektif etkiyi H-I sonrası 4mg/kg
indometazin gösterdi. Yine H-I sonrası 2 mg/kg indometazin tedavisi gibi H-I öncesi
tek 2 mg/kg indometazin tedavisi de oldukça baĢarılı biçimde nöroprotektif etki
gösterdi.
Tablo 10. Gruplara göre apopitotik hücre dağılımı
Gruplar TUNEL pozitiv boyanan apopitotik hücre sayıları
Ortalama ± SS
(alt-üst sınır)
Sağ hemisfer Sol hemisfer p
1 (Sham)
(n: 15)
3,90±1,10
(2–5) 3,53 1,06
(2–5)
>0,05
2 (Hipoksik-iskemik)
(n: 15)
12,40±1,58a
(11–14) 31,46 0,97
a
(13–47)
<0,01
3 (Hipoksi-iskemi öncesi 2 mg/kg
indometazin)
(n: 15)
8,26±1,03 a
(6–10) 11,331,58
a
(10 – 14)
<0,05
4 (Hipoksi-iskemi sonrası 2mg/kg
indometazin)
(n: 15)
7,93±0,79 a
(6–10) 11,000,65
a
(10–12)
<0,05
5 (Hipoksi-iskemi sonrası 4mg/kg
indometazin)
(n:15)
5,86±0,91
(5–7) 6,60 1,40
(5–8)
>0,05
a Grup 2, 3, 4‟te sağ ve sol hemisferler arasında TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücre sayıları arasında
istatisitiksel farklılık saptandı.
Gruplarda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler Ģekil 5-9‟da
görülmektedir
Page 55
45
ġekil 5. Sham grubunda az sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).
ġekil 6. Hipoksik-iskemik hasar oluĢturulan grupta artan sayıda TUNEL pozitif boyanan apopitotik
hücreler (10x40).
Page 56
46
ġekil 7. Hipoksik-iskemik hasar öncesi 2mg/kg indometazin uygulanan grupta TUNEL pozitif
boyanan apopitotik hücreler (10x40).
ġekil 8. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 2mg/kg indometazin verilen grupta daha az sayıda TUNEL
pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).
Page 57
47
ġekil 9. Hipoksik-iskemik hasar sonrası 4mg/kg indometazin uygulanan grupta belirgin olarak azalan
TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücreler (10x40).
Indometazinin beyin hemisferlerinde hipoksi ve hipoksik-iskemi üzerine etkileri
değerlendirildiğinde; sham ve H-I sonrası 4mg/kg indometazin tedavi grubu hariç tüm
gruplarda sol hemisferlerdeki apopitotik hücre sayısı sağ hemisferdeki hücrelerden
istatistiksel olarak anlamlı ölçüde daha yüksekti (p<0,05), (Tablo 10).
Sol hemisferlerde; H-I öncesi ve sonrası 2 mg/kg indometazin tedavileri
apopitotik hücre sayısını 3 kat azaltırken (p<0,01), H-I sonrası 4 mg/kg indometazin
tedavisi ise apopitotik hücre sayısı H-I grup ile karĢılaĢtırıldığında yaklaĢık 5 kat azalttı
(p<0,001).
Page 58
48
5. TARTIġMA
Neonatoloji ve perinatoloji alanındaki ilerlemelere rağmen kalıcı nörolojik
sekellerin en sık nedeni olarak gösterilen hipoksik-iskemik beyin hasarı, obstetrisyen ve
neonatologları uğraĢtıran yenidoğanın önemli sorunlarından biridir.10
Hipoksik-iskemik
beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında baĢlayıp resusitasyon ardından iyileĢme döneminde
devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal nekroz veya infarkt Ģeklinde
gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre yapısının bozulması ile devam eder.
Ġnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan nöronlarda nekroz ya da programlanmıĢ hücre
ölümü yani apoptozis geliĢir.21
Nekroz geliĢmiĢ hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz
konusu değildir. Ancak infarkt etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi
bu dönemde meydana gelen biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir.
Son çalıĢmalarda H-Ġ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen latent dönemin çok
kritik olduğu görülmüĢ ve bu dönem “terapodik pencere” olarak adlandırılmıĢtır.
Hipoksi-iskemiye maruz kalan bir yenidoğan bebekte bu süre 6 ile 12 saat arasında
değiĢmektedir.10
Terapodik pencere döneminde oluĢan hücre ölümüne neden olan
moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte çok yararlıdır.58
Hipoksik-iskemik serebral hasar, hücresel düzeyde oksidatif metabolizmanın
anaerobik metabolizmaya kayması ile baĢlar. Glikozun anaerobik yoldan yıkımı
sonucunda hücrede NADH, FADH gibi redükte ajanlar ile laktik asit ve H iyonları
birikmeye baĢlar. Anaerobik glikoliz, hücrenin enerji gereksinimini karĢılayamadığı için
ATP gibi yüksek enerjili fosfat rezervleri tüketilmeye baĢlar. Bunun sonucunda hücreler
arasında iyon geçiĢini sağlayan ATP‟e bağımlı pompa fonksiyonları bozulur. Hücre
içerisinde Na, Ca
2, Cl
- ve su birikerek sitotoksik ödem meydana gelir. Hipoksi-
iskemi aynı zamanda glutamat gibi eksitotoksik aminoasitlerin akson terminallerinden
salınımını stimüle eder. Glutamat salınımı glutamat hücre reseptörlerini aktive ederek
Na ve Ca
2 iyonlarının hücre içerisine girmesine neden olur. Membran fosfolipitlerinin
turnoverinin artması sonucu sitozol içerisinde serbest yağ asitleri birikir daha sonra
mitokondri içerisinde devam eden indirgenme reaksiyonlarının sonucunda oluĢan
serbest oksijen radikalleri, membran fosfolipitlerinin peroksidasyonuna yol açar.
Reaksiyonun ürünü olarak açığa çıkan prostaglandin, ksantin, ürik asit ve Ca2
sitosol
içerisinde birikmeye baĢlar. Kalsiyumun intrasellüler depolardan (mitokondri ve
Page 59
49
endoplazmik retikulum) serbest hale geçmesi ve plazma membranı boyunca geçiĢinin
artması sonucunda hücre sitoplâzmasında yüksek seviyelere ulaĢır. Özetle sellüler enerji
yetmezliği, asidoz, glutamat ve serbest radikal oluĢumu, hücre içinde Ca2
birikimi ve
lipit peroksidasyonu hücrenin yapısal komponentlerinin bozulmasına ve nihayetinde
hücre ölümüne yol açan biyokimyasal kaskadlar dizisidir.21
Hipoksi-iskemi ardından intrasellüler kalsiyum konsantrasyonunun artmasıyla
fosfolipaz A2‟nin aktive olduğu, membran fosfolipidlerinin yıkılmasıyla hücrede
araĢidonik asid biriktiği, siklooksijenaz ve lipooksigenaz enzimlerinin aktivasyonuyla
prostoglandinler, tromboksan A2 ve lökotrienlerle beraber serbest oksijen radikallerinin
açığa çıktığı bilinmektedir.43,75
Özellikle prematüre bebeklerde son yıllarda yapılan
epidemiyolojik ve deneysel çalıĢmalarda inflamasyon, periventriküler lökomalazi ve
serebral palsi arasında yakın iliĢki olduğu görülmüĢtür.3 EriĢkin ve immatür kemirgen
hayvanlarda hipoksi iskemi sonrasında beyinde ĠL-1 ve TNF- gibi sitokinlerin açığa
çıktığı gösterilmiĢtir.74
Bu sitokinlerin NOS-2 (iNOS) enzimini uyardıkları gibi
siklooksijenaz-2 (COX-2) enziminin de uyarılmasını sağlayarak NO ve prostaglandin
üretimine neden oldukları bilinmektedir. iNOS ile COX–2 enzimleri iĢlevleri
bakımından birbirine çok benzemektedir. Hipoksi-iskeminin neden olduğu inflamatuvar
sitokinlerin açığa çıkması ile iNOS ile aynı dönemde COX–2 yolağı aktive olur.65
Reperfüzyon-reoksijenasyondan önce bir siklooksijenaz inhibitörü olan
indometazin verilmesinin, postiskemik hipoperfüzyonu önlediği gösterilmiĢtir.8 Ayrıca
NMDA aracılıklı geliĢen pial arteiolar dilatasyonu önlediği, süperoksit serbest
radikallerin üretimini baskıladığı, serebral enerji metabolizmasını ve elektiriksel
kortikal aktiviteyi koruduğu, dolaĢımdaki nötrofil sayısını ve sitokin üretimini azalttığı
bildirilmiĢtir.10,21,91
Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük
damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve
ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir.86
Sikloooksijeneaz yolağının
upregulasyonu, artmıĢ prostaglandin ürünleri (özellikle PGE2) ve ROS plasma
membranındaki ölüm reseptörlerini ve kaspaz-8‟i aktive ederek hücreyi apopitozise
götüren kaspaz-3 aktivasyonuna yol açarak nöronal apopitozise yol açtığı ileri
sürülmüĢtür.104
Bir kaç çalıĢmada COX inhibitörlerinin kaspaz aktivasyonununu
önlediği, PGE2 üretimini baskıladığı, geç nöronal ölümü azalttığı ve iskeminin neden
Page 60
50
olduğu infarkt alanını küçülttüğü gösterilmiĢtir.105,106
Ġndometazinin kaspaz aktivasyonu
hangi mekanizmalarla önlediği kesin olarak bilinmemektedir. Ancak daha önce yapılan
çalıĢmalarda COX-2 aktivitesinin prostaglandin reseptölörlerini aktive ederek
intranöronal kalsiyum birikimine neden olduğu, bu sırada ROS üretiminin olduğu,
NMDA aracılı nörotoksisteye neden olduğu, öte yandan özellikle PGE2‟nin
intranörönal kalsiyum birikimine neden olduğu kalsiyum birikiminin ise hücre içi bazı
olaylardan sonra proapopitotik transkripsiyon ve kaspaz-8‟in expresyonunun artĢına
neden olduğu ve sonuç olarak kaspaz aracılı nöronal ölüm gerçekleĢtiği ileri
sürülmektedir.8,98,104
Daha önce yapılan çalıĢmalarda indometazinin dozu ve uygulama
zamanı ile ilgili fikir birliği yoktur. Buccelatti ve arkadaĢları8 fokal iskemik rat
beyninde iskemiden 1 saat önce 20 mg/kg/doz indometazin tedavisinin kontrol grubuna
göre infarkt alanını küçülttüğünü göstermiĢti. Tutak ve arkadaĢları7 ise deneysel
hipoksik iskemik rat beyninde hipoksik-iskemiden 30 dakika sonrası 0,2 mg/kg (12 saat
arayla 3 doz) indometazin tedavisinin kontrol grubuna göre rat beyninde infarkt alanının
küçüldüğünü bildirdiler. Öte yandan Kondo ve arkadaĢları107
geçici ön beyin iskemisi
oluĢturulan grebillerde iskemiden 5 dakika önce uyguladıkları 5 mg/kg/doz indometazin
tedavisinin kontrol grubuna göre TUNEL pozitif boyanan apopitotik hücre sayısının
anlamlı ölçüde düĢtüğü ve dolayısıyla gecikmiĢ nöronal hasarı önlediğini ortaya koydu.
Bizim çalıĢmamızda ise H-I rat modelinde H-I‟den 30 dakika önce tek doz 2 mg/kg
indometazin tedavisiyle apopitotik hücre sayısını kontrol grubuna göre düĢük bulduk.
Yine bu çalıĢmada aynı zamanda H-I sonrası 3 kez 12 saat arayla uygulanan 2 mg/kg
indometazin tedavisi de apopitotik hücre sayısını azalttı ve H-I öncesi 2 mg/kg
indometazin tedavisine eĢ nöroprotektif etki gösterdi. ÇalıĢmamızda H-I sonrası tek doz
indometazin uygulaması yapılmadığından, H-I sonrası tek doz indometazinin rat beyni
üzerine etkilerinin sonuçlarını bilemiyoruz.
Ek olarak bu çalıĢmada H-I‟den 30 dakika sonra 4 mg/kg/doz indometazin
tedavisinin H-I öncesi ve sonrası 2 m/kg/doz indometazin tedavisinden daha baĢarılı bir
Ģekilde apopitozisi önlediğini ortaya koydu. H-I sonrası yüksek doz indometazin
tedavisi iskeminin neden olduğu gecikmiĢ nöronal hasar derecesini, hipoksinin neden
olduğu nöronal hasar düzeylerine indirmesi oldukça ilginç bir bulgu olarak
değerlendirildi. Daha önce yapılan çalıĢmalarda PGE2 miktarı ile gecikmiĢ nöronal
hasar arasında iliĢki olduğunu ve PGE2‟nin doza bağımlı olarak nöronal apopitoza
Page 61
51
neden olduğu ileri sürülmüĢtü.108
Bizim çalıĢmamızda yüksek indometazin tedavisinin
doza bağımlı nöroproektif etki göstermesi belki de doz bağımlı artmıĢ siklooksijenaz
inhibisyonu ve dolayısıyla azalmıĢ prostaglandin ürünleri ve serbest radikal miktarı ile
iliĢkili olabilir. Bu konuda kapsamlı çalıĢmalara ihtiyaç vardır.
Sonuç olarak yaptığımız bu çalıĢma; indometazinin hipoksik iskemik hasar
öncesi ve sonrası gecikmiĢ nöronal hasarı önlediğini gösterdi. Özellikle 4 mg/kg gibi
yüksek doz indometazin tedavisinin düĢük doz indometazin tedavilerinden daha çok
nörorotektif etkisinin olduğunu ortaya koydu. Ancak indometazinin hiposik iskemik
ensefalopati tedavisinde geç nöronal hasarı önleme ve optimal tedavi dozu ile ilgili daha
kapsamlı çalıĢmalara ihtiyaç vardır.
Page 62
52
SONUÇLAR
1- Hipoksik –iskemik hasardan sonra apopitotik hücre sayısı sham grubundan
oldukça fazlaydı (p<0.001)
2- Hipoksi iskemi öncesi tek doz 2 mg/kg indometazin verilmesi, hipoksik
iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).
3- Hipoksik-iskemik hasardan sonra 2 mg/kg indometazin verilmesi hipoksik
iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).
4- Hipoksik-iskemik hasardan sonra 4 mg/kg indometazin verilmesi hipoksik
iskemik gruba göre apopitotik hücre sayısını azalttı (p<0,05).
5- H-I‟den 30 dakika sonra 4 mg/kg/doz indometazin tedavisinin H-I öncesi ve
sonrası 2m/kg/doz indometazin tedavisinden yaklaĢık 2 kat daha baĢarılı bir Ģekilde
apopitozu önledi. (p<0,05).
Page 63
53
7. KAYNAKLAR
1) Volpe JJ. Hypoxic-Ischemic Encephalopathy: Neuropathology and pathogenesis. In:
Volpe J, ed. Neurology of the Newborn. 4rd ed. Philadelphia, PA: WB Saunders; 2000;
217–394.
2) Perlman JM. Intrapartum hypoxic-ischemic cerebral injury and subsequent cerebral
palsy. Pediatrics 1997; 99:851–8.
3) du Plessis AJ, Volpe J. Perinatal brain injury in the preterm and term newborn.
Current Opinion in Neurology 2002; 15:151–7.
4) Szabo C. Physiological and pathophysiological roles of nitric oxide in the central
nervous system. Brain Res Bull 1996; 41:13–41.
5) Vannucci RC, Palmer C. Hypoxic-ischemic encephalopathy: pathogenesis and
neuropathology. In: Fanaroff AA, Martin RJ, eds. Neonatal-Perinatal Medicine.
Philadelphia, PA: Mosby-Yearbook, Inc 1997: 856–77.
.
6) Vilanova JM, Figueras JA, Rosello J, Gomez G, Gelpi E, Jimenez R. Arachidonic
acid metabolites in CSF in hypoxic-ischaemic encephalopathy of newborn infants. Acta
Paediatrica 1998; 87:588-92.
7) Tutak E, Satar M, Zorludemir S, Erdoğan S, Yapicioğlu H, Narli N.
Neuroprotective effects of indomethacin and aminoguanidine in the newborn rats with
hypoxic-ischemic cerebral injury. Neurochem Res 2005; 30:937–42.
8) Buccellati C, Folco GC, Sala A, Scelsi R, Masoero E, Poggi P, et al. Inhibition of
prostanoid synthesis protects against neuronal damage induced by focal ischemia in rat
brain. Neurosci Lett 1998; 257:123-6.
9) Greene KR, Rosen KG, Levene MI. Perinatal asphyxia, in fetal and neonatal
neurology and neurosurgery, 2nd ed. (Eds, Levene MI, Lilford RJ, Bennett MJ, Punt J),
Churchill Livingstone, Edinburgh 1995; 387–442.
10) Volpe JJ. Perinatal Brain Injury: From pathogenesis to neuroprotection. Mental
Retardation and Develepmental Reviews 2001; 7:56–64.
11) Vannucci RC, Perlman JM. Interventions for Perinatal Hypoxic-Ischemic
Encephalopathy. Pediatrics 1997; 100:1004–114.
12) Hill A, Volpe JJ. Neurological and Neuromuscular Disorders. In: Avery GB, Fletcher
MA, MacDonald MG.(eds). Neonatology Pathophysiology & Management of the
Newborn. 5th ed. Philadelpha; Lippincott Williams&Wilkins 1999: 1231-52.
13) Pasternak JF: Hypoxic-ischemic brain damage in the term infant: Lessons form
laboratory. Ped Clin N A 1993; 40:061–72.
Page 64
54
14) Satar M, Narlı N, Kırımi E, Atıcı A, Türkmen M, Yapıcıoğlu H. Hipoksik iskemik
ensefalopatili 205 olgunun değerlendirilmesi. T Klin Pediatri 2001; 10:36-41.
15) Martin-Ancel A, Garcia-Alix A, Gaya F, Cabanas F, Burgueros M, Quero J: Multiple organ involvement in perinatal asphyxia. J Pediatr 1995; 127:786–793.
16) Evans DJ, Levene MI: Hypoxic-ischaemic injury. In: Textbook of Neonatology, 3rd
ed. (Eds, Rennie JM, Roberton NRC). Churchill Livingstone, Edinburgh 1999: 1235–
1251.
17) Hill A, Volpe JJ. Hypoxic-ischemic Cerebral Injury in the Newborn. In: Swaimann
KF, Ashwal S (eds.). Pediatric Neurology. 3nd ed. St. Louis; Mosby Inc 1999: 191-
205.
18) Fitzhardinge PM, Flodmark O, Fitz CR, Ashby S: The prognostic value of
computed tonography as an adjunct assesment of the term infant with postasphyxial
encephalopathy. J Pediatr 1981; 99:777-781.
19) Vannucci RC, Yager JY, Vannucci SJ: Cerebral glucose and energy utilization
during the evolution of hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat. J Cereb
Blood Flow Metab 1994; 143:279-288.
20) Harkness RA: Is post-hypoxic-ischemic cell damage associated with excessive ATP
consumption rather than a failure of ATP production? Acta Paediatr 1997; 86:1-5.
21) Vannucci RC. Hypoxia-Ischemia: Clinical Aspects. In: Fanaroff AA, Martin RJ eds.
Neonatal-Perinatal Medicine, Disease of the Fetus and Infant.6th
ed. St Louis: Mosby
1997: 812-951.
22) Plum F: What causes infarction in ischemic brain?. The Robert Wartenberg Lecture,
Neurology 1983; 33:222-233.
23) Yager JY, Brucklacher RM, Vannucci RC. Cerebral energy metabolism during
hypoxia-ischemia and early recovery in the immature rats. Am J Physiol 1992; 262:
672-7.
24) Rehncroná S, Rosen I, Siesjo BK. Brain lactic acidosis and ischemic cell damage: I.
Biochemistry and neurophysiology. J Cereb Blood Flow Metabol 1981;1:297-311.
25) Paschen W, Djuricic B, Mies G, Schmidt-Kastner R, Linn F. Lactate and pH in the
brain: association and dissociation in diferent pathophysiological states. J Neurochem
1987; 48:154-159.
26) Feet BA, Gilland E, Groenedaal F, Brun NC, Hagberg H, Saugstad OD: Cerebral
excitatory aminoacids and Na, K-ATP ase activity during resuscitation of severely
hypoxic newborn piglets. Acta Pediatr 1998; 87:889-95.
Page 65
55
27) McDonald JW, Johnston MV. Phsiological and pathophysiological roles of excitatory
amino acids during central nervous system development. Brain Res Rev 1990; 15:41-
70.
28) Gilland E, Puka-Sundvall M, Andine P, Bona E, HagbergH. Hypoxic-ischemic
injury in the neonatal rat brain: effect of pre-and post-treatment with the glutamate
release inhibitor BW1003C87. Brain Res Brain Res Rev 1994; 83:79-84.
29) Barks JD, Silverstein FS, The glutamate uptake inhibitor L-trans–2, 4-pyrrolidine
dicarboxylate is neurotoxic in neonatal rat brain. Mol Chem Neuropathol 1994; 23:201-
215.
30) Jensen FE, Blume H, Alvarado S, Firkunsy I, Geary C. NBQX blocks acute and
late epileptogenic effects of perinatal hypoxia. Epilepsia 1995; 36:966-972.
31) Nelson KB, Grether JK. Can magnesium sulfate reduce the risk of cerebral palsi in
very low birth weight infants? Pediatrics 1995; 95:263-9.
32) Paneth N, Jetton J, Pinto-Martin J, Susser M, The Neonatal Brain Hemorrhage
Study Analysis Group. Magnesium sulfate in labor and risk of neonatal brain lesions
and cerebral palsy in low birth weight infants. Pediatrics 1988; 82:533-542.
33) D’Souza SW, Slater P: Excitator amino acids in neonatal brain: contributions to
pathology and their therapeutic strategies. Arch Dis Child 1994; 70:147-50.
34) Schleien CL, Kuluz JW. The role of leukocytes in global and focal brain ischemia. In:
TibboelD, van der Voort E (eds). İntensive care in Childhood: A Challenge to the
Future. Berlin: Springer- Verlag; 1996: 175-86.
35) Bulkley GB. Reactive oxygen metabolites and reperfusion injury: abberrant triggering
of reticuloendothelial function. Lancet 1994; 344:934-6.
36) Cammer W, Zhang H. Maturation of oligodendrocytes is more sensitive to TNF alpha
than is survival of precursors and immature oligodendrocytes. J Neuroimmunol 1999;
97:37-42.
37) Selmaj K, Walczak A, Mycko M. Supression of experimental autoimmune
encephalomyelitis with a TNF binding protein (TNF bp) correlates with down-
regulation of VCAM–1/VLA–4. Eur J Immunol 1998; 28:2035–2044.
38) Louis JC, Magal E, Takayama S, Varon S. CNTF protection of oligodendrocytes
against natural and tumor necrosis factor-induced death. Science 1993; 259:689-92.
39) Taupin V, Renno T, Bourbonniere L. Increasedseverity of experimental autoimmune
ancephalomyelitis, chronic macrophage/microglial reactivity, and demyelination in
transgenic mice producing tumor necrosis factor-alpha in the central nervous system.
Eur J Immunol 1997; 27:905-13.
Page 66
56
40) Brian J, Faraci F. Tumor necrosis factor-a-induced dilatation of cerebral arterioles.
Stroke 1998; 29:509-15
41) Brian J, Heistad D, Faraci F. Mechanism of endotoxin-induced dilatation of cerebral
arterioles. Am J Physiol Heart Circ Phys 1995; 38:783-8.
42) Liao SL, Chen CJ. Differantial effects of cytokines and redox potential on glutamate
uptake in rat cortical glial cultures. Neurosci Lett 2001; 299:113-6.
43) Fern R, Moller T. Rapid ischemic cell death in immature oligodendrocytes: a fatal
glutamate release feedback loop. J Neurosci 2000; 20:34-42 ,
44) Northington FJ, Traytsman RJ, Koehler RC, Martin LJ. GLT1, glial glutamate
transporter, is transiently expressed in neurons and develops astrocyte spesificity only
after midgestation in the ovine fetal brain. J Neurobiol 1999; 39:515-26,
45) Kopp EB, Medzhitov R. The Toll-receptor family and control of innate immunity.
Curr Opin Immunol 1999; 11:13-8,
46) Martin LJ. Neuronal cell death in nervous system devolepment, disease, and injury.
Int J Mol Med 2001; 7:455-78.
47) Brambrink AM, Price AC, Kaiser A, Agnew DM, Ichord RN, Traystman RJ.
Neuronal death in newborn striatum after hypoxia-ischemia is necrosis and evolves
with oxidative stress. Neurobiol Dis. 2000; 7:169-91.
48) Martin LJ, Brambrink AM, Lehmann C, Portera-Cailliau C, Koehler R,
Rothstein J, Traystman RJ. Hypoxia-ischemia causes abnormalities in glutamate
transporters and death of astroglia and neurons in newborn striatum. Ann Neurol 1997;
42:335-48.
49) Martin LJ, Brambrink AM, Price AC, Kaiser A, Agnew DM, Ichord RN,
Traystman RJ. Neuronal death in newborn striatum after hypoxia-ischemia is necrosis
and evolves with oxidative stress. Neurobiol Dis 2000; 7:169-91.
50) Golden WC, Brambrink AM, Traystman RJ, Martin LJ. Failure to sustain
recovery of Na,K-ATPase function is a possible mechanism for striatal
neurodegeneration in hypoxic-ischemic newborn piglets. Brain Res Mol Brain Res
2001; 88:94-102.
51) Northington FJ, Ferriero DM, Graham EM, Traystman RJ, Martin LJ. Early
Neurodegeneration after Hypoxia-Ischemia in Neonatal Rat Is Necrosis while Delayed
Neuronal Death Is Apoptosis. Neurobiol Dis 2001; 8:207-19.
52) Nakajima W, Ishida A, Lange MS, Gabrielson KL, Wilson MA, Martin LJ, Blue
ME, Johnston MV. Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after
hypoxic ischemia in the newborn rat. J Neurosci 2000; 20:7994-8004.
Page 67
57
53) Northington FJ, Ferriero DM, Flock DL, Martin LJ. Delayed neurodegeneration in
neonatal rat thalamus after hypoxia-ischemia is apoptosis. J Neurosci 2001; 21:1931-8.
54) Martin LJ, Al-Abdulla NA, Brambrink AM, Kirsch JR, Sieber FE, Portera-
Cailliau C. Neurodegeneration in excitotoxicity, global cerebral ischemia, and target
deprivation: A perspective on the contributions of apoptosis and necrosis. Brain Res
Bull 1998; 46:281-309.
55) Yamashima T. Implication of cysteine proteases calpain, cathepsin and caspase in
ischemic neuronal death of primates. Prog Neurobiol 2000; 62:273-95.
56) Schulz JB, Weller M, Moskowitz MA. Caspases as treatment targets in stroke and
neurodegenerative diseases. Ann Neurol 1999; 45:421-9.
57) Martin LJ, Sieber FE, Traystman RJ. Apoptosis and necrosis occur in separate
neuronal populations in hippocampus and cerebellum after ischemia and are associated
with differential alterations in metabotropic glutamate receptor signaling pathways. J
Cereb Blood Flow Metab 2000; 20:153-67.
58) Northington FJ, Ferriero DM, Flock DL, Martin LJ. Delayed neurodegeneration in
neonatal rat thalamus after hypoxia-ischemia is apoptosis. J Neurosci 2001; 21:1931-8.
59) Cheng Y, Deshmukh M, D'Costa A, Demaro JA, Gidday JM, Shah A, Sun Y,
Jacquin MF, Johnson EM, Holtzman DM. Caspase inhibitor affords neuroprotection
with delayed administration in a rat model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury.
J Clin Invest 1998; 101:1992-9.
60) Ishimaru MJ, Ikonomidou C, Tenkova TI, Der TC, Dikranian K, Sesma MA,
Olney JW. Distinguishing excitotoxic from apoptotic neurodegeneration in the
developing rat brain. J Comp Neur 1999; 408:461-76.
61) Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. Excitotoxic neuronal death in the
immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J Comp Neurol
1997; 378:70-87.
62) Portera-Cailliau C, Price DL, Martin LJ. Non-NMDA and NMDA receptor-
mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct:
further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J Comp Neurol 1997; 378:88-
104.
63) Sastry PS, Rao KS. Apoptosis and the nervous system. J Neurochem 2000; 74:1-20.
64) Fiskum G, Murphy AN, Beal MF. Mitochondria in neurodegeneration: acute
ischemia and chronic neurodegenerative diseases. J Cereb Blood Flow Metab 1999;
19:351-69.
65) Murphy AN, Fiskum G, Beal MF. Mitochondria in neurodegeneration: bioenergetic
Page 68
58
function in cell life and death. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19:231-45.
66) Nicotera P, Lipton SA. Excitotoxins in neuronal apoptosis and necrosis. J Cereb
Blood Flow Metab 1999; 19:583-91.
67) Iijima T. Mitochondrial membrane potential and ischemic neuronal death. Neurosci
Res 2006; 55:234-43.
68) Lopez-Neblina F, Toledo AH, Toledo-Pereyra LH. Molecular Biology of Apoptosis
in Ischemia and Reperfusion. J Invest Surg 2005; 18:335–50.
69) De Giorgi F. Lartigue L, Bauer MK, Schubert A, Grimm S, Hanson GT,
Remington SJ, Youle RJ, Ichas F. The permeability transition pore signals apopsotis
by directingh Bax transolocation and multimerization. FASEB J 2002; 16:607–9.
70) Gunn AJ, Gunn TR, Gunning MI et al. Neuroprotection with prolonged heat cooling
started before postischemic seizures in fetal sheep. Pediatrics 1999; 102:1098-106.
71) Akisü M, Kültürsay N, Coker I, Hüseyinov A. Platelet-Activating Factor Is an
Important Mediator in Hypoxic Ischemic Brain Injury in the Newborn Rat. Biol
Neonate 1998; 74:439-44.
72) Kayaalp SO. Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji. Onuncu Basım, cilt 2,
Hacettepe TAŞ, Ankara 2006; 89:1502-25.
73) Goodman & Gilman’s. The Pharmacological Basis of Therapeutics. Joel G Hardman,
Lee E. Limbird. Tenth Edition 2001; 26: 669-85.
74) Bertram G. Katzung. Basic and Clinical Pharmacology. Eighth Edition. A lange
Medical Book 2001; 18: 311-25.
75) Richard A. Harwey, Pamela C. Champe. Pharmacology. Lippincott’s Illustrated
Reviews 1992; 39:379-80.
76) Leslie CC. Regulation of the specific release of arachidonic acid by cytosolic
phospholipase A2. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2004; 70:373-6.
77) Farooqui AA, Ong WY, Horrocks LA. Biochemical aspects of neurodegeneration in
human brain: involvement of neural membrane phospholipids and phospholipases A2.
Neuroche. Res 2004; 29:1961–77.
78) Ross BM, Kim DK, Bonventre JV, Kish SJ. Characterization of a novel
phospholipase A2 activity in human brain. J Neurochem 1995; 64:2213-21.
79) Hanasaki K, Arita H. Phospholipase A2 receptor: a regulator of biological functions
of secretory phospholipase A2. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002; 68-69:71-82.
80) Thwin MM, Ong WY, Fong CW, Sato K, Kodama K, Farooqui AA,
Page 69
59
Gopalakrishnakone P. Secretory phospholipase A2 activity in the normal and kainate
injected rat brain, and inhibition by a peptide derived from python serum. Exp Brain
Res 2003; 150:427-33.
81) Matsuzawa A, Murakami M, Atsumi G, Imai K, Prados P, Inoue K, Kudo I.
Release of secretory phospholipase A2 from rat neuronal cells and its possible function
in the regulation of catecholamine secretion. Biochem J. 1996; 318:701–9.
82) Xu NJ, Bao L, Fan HP, Bao GB, Pu L, Lu YJ, Wu CF, Zhang X, Pei G. Morphine
withdrawal increases glutamate uptake and surface expression of glutamate transporter
GLT1 at hippocampal synapses. J Neurosci 2003; 23:4775–84.
83) DeCoster MA, Lambeau G, Lazdunski M, Bazan NG. Secreted phospholipase A2
potentiates glutamate-induced calcium increase and cell death in primary neuronal
cultures. J Neurosci Res 2002; 67:634-45.
84) Yoshihara Y, Yamaji M, Kawasaki M, Watanabe Y. Ontogeny of cytosolic
phospholipase A2 activity in rat brain. Biochem Biophys Res Commun 1992; 185:350-
5.
85) Hernández M, Nieto ML, Sánchez Crespo M. Cytosolic phospholipase A2 and the
distinct transcriptional programs of astrocytoma cells. Trends Neurosci 2000; 23:259-
64.
86) du Plessis A, Johnston MV. Hypoxic-ischemic brain injury in the newborn: Cellular
mechanisms and potential strategies for neuroprotection. Clinics in Perinatology 1997;
24:627-54.
87) Saliba E, Henrot A.Inflamatory mediators and neonatal brain damage Biology of the
Neonate 2001; 79:224-7.
88) Lin TN, Wang Q, Simonyi A, Chen JJ, Cheung WM, He YY, Xu J, Sun AY, Hsu
CY, Sun GY. Induction of secretory phospholipase A2 in reactive astrocytes in
response to transient focal cerebral ischemia in the rat brain. J Neurochem 2004;
90:637-45.
89) Tabuchi S, Uozumi N, Ishii S, Shimizu Y, Watanabe T, Shimizu T. Mice deficient
in cytosolic phospholipase A2 are less susceptible to cerebral ischemia/reperfusion
injury. Acta Neurochir Suppl. 2003; 86:169-72.
90) Uozumi N, Shimizu T. Roles for cytosolic phospholipase A2alpha as revealed by
gene-targeted mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002; 68-69:59-69.
91) Westcott JY, Murphy RC, Stenmark K. Eicosanoids in human ventricular
cerebrospinal fluid following severe brain injury. Prostaglandins 1987; 34:877-87.
Page 70
60
92) Mirro R, Armstead W, Busija D, Green R, Leffler C. Increasing ventilation pressure
increases cortical subarachnoid cerebrospinal fluid prostanoids in newborn pigs.
Pediatr Res 1987; 22:647–50.
93) Miettinen S, Fusco FR, Yrjanheikki J, Keinanen R, Hirvonen T, Roivainen R,
Narhi M, Hokfelt T, Koistinaho J. Spreading depression and focal brain ischemia
induce cyclooxygenase–2 in cortical neurons through Nmethyl- d-aspartic acid-
receptors and phospholipase A2. Proc Natl Acad Sci 1997; 94;6500–5.
94) Miwa M, Saura R, Hirata S, Hayashi Y, Mizuno K, Itoh H. Induction of apoptosis
in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E(2) through cAMP-dependent
pathway. Osteoarthritis Cartilage 2000; 8:17–24.
95) Iadecola C, Niwa K, Nogawa S, Zhao X, Nagayama M, Araki E, Morham S, Ross
ME. Reduced susceptibility to ischemic brain injury and N-methyl-d-
aspartatemediated neurotoxicity in cyclooxygenase–2-deficient mice. Proc Natl Acad
Sci 2001; 98:1294–9.
96) Takadera T, Yumoto H, Tozuka Y, Ohyashiki T. Prostaglandin E (2) induces
caspase-dependent apoptosis in rat cortical cells. Neurosci Lett 2002; 317:61–4.
97) Fiebich BL, Schleicher S, Spleiss O, Czygan M, Hull M. Mechanisms of
prostaglandin E2-induced interleukin–6 release in astrocytes: possible involvement of
EP4-like receptors, p38 mitogen- activated protein kinase and protein kinase C. J
Neurochem 2001; 79:950–8.
98) Hewett SJ, Uliasz TF, Vidwans AS, Hewett JA. Cyclooxygenase–2 contributes to N-
methyl-D-aspartate-mediated neuronal cell death in primary cortical cell culture. J
Pharmacol Exp Ther 2000; 293:417–25.
98) Johnson AJ, Hsu AL, Lin HP, Song X, Chen CS. The cyclo-oxygenase–2 inhibitor
celecoxib perturbs intracellular calcium by inhibiting endoplasmic reticulum Ca2 -
ATPases: a plausible link with its anti-tumour effect and cardiovascular risks. Biochem
J 2002; 366:831–7.
99) Sasaki T, Nakagomi T, Kirino T, Tamura A, Noguchi M, Saito I, Takakura K.
Indomethacin ameliorates ischemic neuronal damage in the gerbil hippocampal CA1
sector. Stroke 1988; 19:1399-403.
100) Cole DJ, Patel PM, Reynolds L, Drummond JC, Marcantonio S. Temporary focal
cerebral ischemia in spontaneously hypertensive rats: The effect of ibuprofen on infarct
volume. J Pharmacol Exp Ther 1993; 266:1713-7.
101) Vannucci RC, Connor JR, Mauger DT, Palmer C, Smith MB, Towfighi J,
Vannucci SJ. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Journal of
Neuroscience Research 1999; 55:158-163.
Page 71
61
102) Levine S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol 1960; 36:1-17.
103) Rice JED, Vanucci RRC, Brierly JB. The influence of immaturity on hypoxic-
ischemic brain damage in the rat. Ann. Neurol 1981; 9:131-41.
104 Miwa M, Saura R, Hirata S, Hayashi Y, Mizuno K, Itoh H. Induction of apoptosis
in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E(2) through cAMP-dependent
pathway. Osteoarthritis Cartilage 2000; 8:17–24.
105) Li RC, Row BW, Gozal E, Kheirandish L, Fan Q, Brittian KR, Guo SZ,
Sachleben LR Jr, Gozal D. Cyclooxygenase 2 and intermittent hypoxia-induced
spatial deficits in the rat. Am J Respir Crit Care Med 2003; 168:469-75.
106) Lipper EG, Voorhies TM, Ross G, Vanucci RC, Auld PA. Early predictors of one-
year outcome for infants asphyxiated at birth, Dev Med Child Neurol 1986; 28:303-9.
107) Kondo F, Kondo Y, Gómez-Vargas M, Ogawa N. Indomethacin inhibits delayed
DNA fragmentation of hippocampal CA1 pyramidal neurons after transient forebrain
ischemia in gerbil. Brain Res 1998; 791: 352-6.
108) Takadera T, Ohyashiki T. Prostaglandin E2 deteriorates N-methyl-D-aspartate
receptor-mediated cytotoxicity possibly by activating EP2 receptors in cultured cortical
neurons. Life Sci 2006; 78:1878-83.
Page 72
62
8. ÖZGEÇMĠġ
Adı Soyadı : Erdal TAġKIN
Doğum Tarihi ve Yeri : 02.04.1970/Elazığ
Medeni durumu : Evli
Adres : Sürsürü M. MithatpaĢa Bulvarı No:133/8
Elazığ
Telefon : 0 242 2411533
Fax : -
E-mail : [email protected]
Mezun Olduğu Tıp Fakültesi : Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi
Varsa Mezuniyet Derecesi : -
Görev Yerleri : Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve
Hastalıkları Anabilim Dalı Elazığ
Dernek Üyelikleri : Milli Pediatri Derneği
Alınan Burslar : -
Yabancı Dil(ler) : Ġngilizce
Diğer Hususlar : -