Heterologe Expression und funktionelle Grundcharakterisierung von Myelinproteinen aus dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncorrhynchus mykiss) Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) des Fachbereiches Biologie/Chemie der Universität Osnabrück vorgelegt von Carsten Lanwert aus Osnabrück Frühjahr 2000
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Heterologe Expression
und funktionelle Grundcharakterisierung
von Myelinproteinen aus dem ZNS
der Regenbogenforelle (Oncorrhynchus mykiss)
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der
Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
des Fachbereiches Biologie/Chemieder Universität Osnabrück
vorgelegt von
Carsten Lanwertaus Osnabrück
Frühjahr 2000
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1 Einleitung
Im Laufe der Evolution haben die Vertebraten ein neuronales Netzwerk entwickelt, das in
Komplexität und Leistungsfähigkeit einzigartig ist. Die besondere Leistungsfähigkeit
verdankt es dem Myelin, welches die Axone der Nervenfasern des zentralen (ZNS) und
peripheren Nervensystems (PNS) umgibt und somit gegen transmembrane Ionenströme
isoliert. Die Erregungsleitung kann sich daher nur an nicht myelinisierten Bereichen der
Nervenfaser, den Ranvierschen Schnürringen, sprunghaft ausbreiten. Diese sog. saltatorische
Erregungsleitung spart gegenüber der kontinuierlichen Erregungsleitung Zeit, Energie und
Platz und bildet somit Grundstein für die unglaubliche Rechenleistung der Vertebratengehirne
(BUNGE, 1968; MORELL UND NORTON 1980; REVIEW: HILDEBRAND ET AL., 1993). Die
Myelinhülle wird von spezialisierten Gliazellen gebildet. Im zentralen Nervensystem sind
dieses die Oligodendrozyten, im PNS übernehmen die Schwannschen Zellen die Aufgabe der
Myelinogenese. Diese myelinformenden spezialisierten Zellen wickeln die Membranen ihrer
Zellfortsätze als flache Zunge mehrfach konzentrisch um die Axone von Nervenfasern und
bilden durch Verdichtung die typische
kompakte, multilamelläre Struktur des
Myelins (WOOD UND BUNGE, 1984,
PETERS ET AL., 1976; RUMSBY UND
CRANG, 1977). Innerhalb des kompakten
Myelins werden durch die dichte
Aufeinanderlagerung der cytoplas-
matischen Seiten der Plasmamembran der
Schwannschen Zellen, bzw. des
Oligodendrozyten die sog. „major dense
line“ gebildet, und durch Apposition der
extrazellulären Seiten des Bilayers die
sog. „intraperiod line“ des Myelins, die
nach ihrer Struktur in elektronen-
mikroskopischen Aufnahmen benannt wurden.
Die Fähigkeit zur elektrischen Isolation spiegelt sich in der biochemischen Zusammensetzung
Abbildung 1: ElektronenmikroskopischeAufnahme einer typischen myelinisiertenNervenfaser aus dem ZNS (Rückenmark Hund).Der Zellkörper des Oligodendrozyten istzuerkennen (Pfeil). Man sieht deutlich diecytoplasmatische „major dense line“ als scharfeschwarze Linie und die extrazelluläre„intraperiod line“ als gräuliche Substanz(x135000) (entnommen aus: „BasicNeurochemistry“ Lippincott-Raven, 1998)
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der Myelinmembran wieder: Sie besteht zu rund 70 % aus hydrophoben und elektrisch
isolierenden Lipiden (MORELL, 1977), unter denen das Galactocerebrosid (GalC) als
spezifischer Marker für Oligodendrozyten und Schwannschen Zellen identifiziert wurde (YU
UND IQBAL, 1979). Der Proteinanteil ist mit 30 % relativ gering, aber äußerst
charakteristisch. Eine wesentliche Funktion dieser Proteine ist es, die Adhäsion der einzelnen
Myelinlamellen im kompakten Myelin zu vermitteln. Im ZNS der höheren Vertebraten, wie
z.B. Säuger, Vögel, Reptilien und Amphibien, besteht der Proteinanteil zu 50 % aus dem
hydrophoben, nichtglykosilierten Proteolipid Protein PLP (LEES UND BROSTOFF, 1984). Die
basischen Myelinproteine (MBP’s) sind mit 30 % die zweithäufigsten Vertreter. Sie bilden
eine Klasse von Proteinen, deren Molekulargewicht von 12 bis 22 kDa reicht und von nur
einem Gen durch alternatives RNA-Splicing gebildet werden (BARBARESE ET AL., 1977;
GREENFIELD ET AL., 1982; REVIEW: KAMHOLZ UND WRABETZ, 1992). Weitere
charakteristische Proteine sind die 2’3’-cyclisches Nukleotid-3’-Phosphohydrolase (CNPase)
mit 5% und das Myelinassoziierte Glykoprotein (MAG), welches in zwei Isoformen vorliegt
und weniger als 1% der Proteine ausmacht (VOGEL UND THOMPSON, 1988; CAMPAGNONI,
1988, LAI ET AL., 1987).
Das PLP tritt ausschließlich im ZNS auf, während im PNS seine Funktion vom
transmembranen Glykoprotein P0, das mit bis zu 60 % den weitaus größten Teil der
gesamten Myelinproteinfraktion darstellt,
übernommen wird. Die Proteine PLP und P0
unterscheiden sich gravierend in der
Aminosäuresequenz, Membran-Topologie
und Genstruktur. Während das 30 kDa
große, stark acylierte PLP vier
Transmembran-Durchgänge aufweist, die
intra- und extrazellulär durch hydrophile
Schleifen verbunden sind (POPOT ET AL.,
1991), besitzt das P0-Protein nur ein
einzelnes Membran-Segment sowie eine
stark basische intrazelluläre Domäne (LEMKE UND AXEL, 1985, LAI ET AL., 1987; DING UND
BRUNDEN, 1994). Als weitere charakteristische PNS-Myelinproteine wurde das P2-Protein,
das periphere Myelinprotein 22 (PMP22) mit einem Anteil von bis zu 5 % (PAREEK ET AL.,
1993) MAG, MBP’s (bis zu 15 %) und Connexin 32 (Cx32) charakterisiert (BERGOFFEN ET
AL., 1993; REVIEW: SNIPES UND SUTER, 1995).
Das Myelin aus dem ZNS phylogenetisch älterer Vertebraten, wie den Fischen, unterscheidet
sich in seinem Proteinmuster von dem der übrigen Vertebraten (JESERICH 1983; WAEHNELDT
UND JESERICH, 1984). PLP sucht man hier vergeblich: es wird durch P0-ähnliche Proteine
ersetzt. Bei der Forelle sind dieses die intermediären, in zwei Isoformen durch alternatives
Splicing auftretenden Glykoproteine IP1 und IP2. (JESERICH UND WAEHNELDT, 1986A;
JESERICH UND WAEHNELDT, 1987). Die Sequenz von IP1 konnte bestimmt und ihre
strukturelle Verwandtschaft zu P0, auf die im folgenden noch genauer eingegangen wird,
näher charakterisiert werden (STRATMANN UND JESERICH, 1995). Interessanterweise ist die
Expression der Splice-Varianten IP1 und IP2 entwicklungsabhängig, denn die größere
Isoform wird während der Oligodendrozytenentwicklung früher exprimiert als die kleinere
(JESERICH ET AL. 1990).
Ein weiteres einzigartiges, nur im ZNS der Fische vorkommendes Protein ist ein
nichtglykosiliertes, cytoplasmatisches, membranassoziiertes Protein mit dem
Molekulargewicht von 36 kDa, genannt 36K-Protein (JESERICH, 1983; JESERICH UND
WAEHNELDT, 1986B). Die cDNA-, bzw. Proteinsequenz ist bislang nicht vollständig bekannt,
doch aufgrund von computergestützten Vorhersagen, basierend auf gDNA-Teilfragmenten,
wurde deutlich, daß sich das 36K-Protein in Sequenz und Struktur von allen von höheren
Vertebraten bekannten Myelinproteinen unterscheidet. Statt dessen konnte eine auffällige
Ähnlichkeit zu Vertretern der kurzkettigen NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen
ausgemacht werden (STRELAU, DISSERTATION, 1997). Die Aufgabe dieser einzigartigen
Myelinkomponente ist bislang noch ein Rätsel. Im PNS der Forelle fehlt 36K. Es treten neben
zwei weiteren IP-ähnlichen Proteinen (IPb und IPc) MAG und niedermolekulare basische
Proteine auf. Zusammenfassend läßt sich demnach sagen, daß die Oligodendrozyten aus dem
ZNS der Fische bezüglich ihrer Morphologie den Säuger-Oligodendrozyten ähneln, bezüglich
ihrer biochemischen Zusammensetzung jedoch Ähnlichkeit zu Säuger-Schwannzellen
aufweisen.
Die besondere Stellung von Fisch-Oligodendrozyten zeigt sich, außer in der oben
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beschriebenen biochemische Zusammensetzung, in einer weiteren außergewöhnlichen
Eigenschaft. Sie besitzen die Fähigkeit, Axone nach Verletzungen vollständig zu
remyelinisieren (WOLBURG, 1981), eine Fähigkeit, die sonst nur bei Schwannschen Zellen im
PNS zu finden ist. Außerdem unterstützen sie in vitro die neuronale Regeneration
(BASTMEYER ET AL. 1991). Da dem P0-Protein aus dem PNS der Säuger die Fähigkeit
nachgewiesen wurde, das Auswachsen von Neuriten zu fördern (SCHNEIDER-SCHAULIES ET
AL., 1990, YAZAKI ET AL., 1994), ist es denkbar, daß im Fisch-ZNS die P0-ähnlichen
Proteine IP1 und IP2 in den Remyelinisierungs- und Regenerationsprozessen involviert sind.
Aufgrund der auffälligen
Sekundärstruktur von IP1 und IP2
werden diese Forellenmyelinproteine als
typische Vertreter der Immunglobulin-
Superfamilie (Ig-CAM) angesehen
(STRATMANN & JESERICH, 1995).
Vertreter dieser Proteinfamilie definieren
sich über Regionen, die Ähnlichkeiten
mit der variablen Domäne der
Immunglobuline aufweisen. Diese
Immunglobulin-Domänen bestehen aus
alternierenden hydrophoben und
hydrophilen Aminosäureresten, die eine
Serie aus antiparallelen β-Strängen
bilden. Diese β-Stränge falten sich zu 2
β-Faltblättern, die durch Disulfidbrücken stabilisiert werden (WILLIAMS UND BARCLAY,
1987; EDELMAN, 1988). Zu den Ig-CAM gehören z.B. das N-CAM (neural cell adhesion
molecule), MAG und P0. Man konnte allen diesen aufgeführten Proteinen eine Funktion als
homophiles/heterophiles Adhäsionsmolekül sowohl im Nerven- als auch im Immunsystem
experimentell nachweisen (FILBIN ET AL, 1990; D’URSO ET AL., 1990; SALZER UND COLMAN,
1989; AFAR ET AL., 1991; POLTORAK ET AL., 1987).
Abbildung 3: Vertreter der Ig-CAM Superfamilie: Zuihnen gehören P0, NCAM, MAG und weitere Vertreter.Die überwältigende Mehrheit der Moleküle sindVertreter der Subklasse Typ I zu denen auch dieForellenmyelinproteine IP1/2 zählen. (entnommen aus:„Basic Neurochemistry“ Lippincott-Raven, 1998)
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Da das IP1-Protein der Forelle eine auffällige Ähnlichkeit zu dem P0-Protein der Säuger
aufweist, wurde bereits 1995
von Stratmann und Jeserich
vorgeschlagen, daß es P0-
ähnliche Adhäsionsaufgaben
in der extrazellulären
„intraperiod line“ zur
Kompaktierung des
Forellenmyelins ausführen
könnte. Zur Kompaktierung
der cytoplasmatischen „major
dense line“ des Forellenmyelin
wäre es denkbar, daß die
cytoplasmatischen Domänen
der IP Splice-Varianten
hierbei von großer Bedeutung
sind. Zwar ist die vollständige
Sequenz der längeren IP2
Splice-Variante noch nicht
bekannt, dennoch wird deutlich, daß die cytoplasmatischen Domänen der IP-Proteine eine
positive Nettoladung aufweisen und somit über elektrostatische Wechselwirkungen an saure
d.h. negativ-geladene Phospholipide der Plasmamembran binden könnten (STRATMANN UND
JESERICH, 1995). Eine derartige Eigenschaft konnte den korrespondieren Proteindomänen
des P0-Protein und den Basischen Myelinproteinen bereits nachgewiesen werden (DING UND
BRUNDEN, 1994; CHEIFETZ ET AL., 1985, ROUX ET AL. 1994; REVIEW: STAUGAITIS ET AL.,
1995) Die Funktion des Forellen ZNS-spezifischen 36K Proteines ist noch völlig ungeklärt.
Es ist denkbar, daß es aufgrund seiner ebenfalls stark basischen d.h. positiven Ladung an
negativ-geladene saure Phospholipide der Zellmembran bindet und so die Apposition der
cytoplasmatischen „major dense line“ unterstützt.
In der vorliegenden Dissertation sollten mit Hilfe der heterologen Expression erste
experimentelle Hinweise auf die Funktion der Hauptmyelinproteine IP1 und IP2 sowie 36K
Abbildung 4: Hypothetisches Forellenmyelinmodell: Zelladhäsionan der intraperiod line wird druch die IgCAM Proteine IP1/2vermittelt. Die Apposition der cytoplasmatischen major dense lineerfolgt über die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 sowie überdie Basischen Myelinproteine (BP) und 36K. ElektrostatischeAnziehungskräfte sind gestrichelt angedeutet
6
gewonnen werden. Diese funktionellen Grundcharakterisierungen könnten zum besseren
Verständinis der Myelinogenese beitragen und als Basis für weiterführende Experimente
dienen.
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2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Bakterienstämme
Bakterienstamm Genotyp
E. coli JM 109 mcrA, rec A1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17,supE44, relA1, ∆(lac-proAB), [F´ tra∆36,proAB, lacIq, lacZ∆M15]
Lösung A 6 g Glyzerin (Fa. Fluka), 6 ml dH2O, 2,4 g Gelvatol, 2ml TrisHCl
(pH 8,5)
Lösung B 0,5 g N-Propyl-Gallat (Fa. Sigma), 12,6 g Glyzerin, 0,176 g
NaCl, 10 ml 0,2 M TrisHCl (pH 8,5)
Die Lösungen A und B wurden im Verhältnis 1:3 gemischt und unter Alufolie bei 4° C
gelagert.
Zur indirekten Immunfluoreszenz wurden mono- bzw. polyklonale Antikörper verwendet, die
ein oder mehrere spezifische Epitope des speziellen Proteins erkennen. Die verwendeten
primären Antikörper sind bereits in früheren Studien hinreichend charakterisiert worden. Die
Zellkulturen wurden zweimal mit MEM („Minimal essential Medium“ nach Eagles, 10 mM
Hepes, 0,076 % Bicarbonat; pH 7,4) gewaschen und wahlweise mit Methanol für 20 min bei
-20° C oder mit 4 % Paraformaldehyd für 10 min bei RT fixiert. Die Methanolfixierung
permeabilisiert die Zellmembranen und bietet daher die Möglichkeit auch cytoplasmatische
Epitope zu erkennen. Die Paraformaldehydfixierung wurde für Oberflächenmarkierungen
eingesetzt. Die Zellen wurden vor der Inkubation mit einem Antikörper jeweils fünfmal mit
MEM gewaschen. Zur Absättigung unspezifischer Bindungen wurden die Zellen jeweils 45
min bei RT mit MEM/1% BSA inkubiert. Die verwendeten monoklonalen Antikörper
wurden unverdünnt, die polyklonalen ersten Antikörper wurden 1:50-1:100 verdünnt in
MEM/BSA auf die Zellen gegeben und für 30 min bis 24 h bei RT inkubiert. Als zweite
Antikörper dienten FITC oder Cy3-markierte Fluoreszenzkonjugate, die ebenfalls in
MEM/BSA 1:50 (bzw. 1:400 bei Cy3) verdünnt wurden und für 30 min bis 2 h inkubiert
wurden. Die Präparate wurden abschließend fünfmal mit MEM gewaschen und anschließend
mit wenigen Tropfen Gelvatol mit einem Deckgläschen eingedeckelt, bzw. ohne
Deckgläschen in TBS gehalten. Sie wurden unter einem Olympus Fluoreszenz Mikroskop
Typ ITM-2. mit geeigneten Fluoreszenzfiltern betrachtet und ggf. auf einem Foto
dokumentiert.
41
42
3 Ergebnisse
3.1 Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz für das IP2-Protein
Vor Beginn dieser Arbeit lag eine vollständige
exprimierbare cDNA für das in der cytoplasmatischen
Domäne kürzeren IP1 Splicevariante vor, während von
der längeren Isoform (IP2) lediglich ein Teilfragment
existierte (STRATMANN & JESERICH, 1995). Mit Hilfe
der IP2-Teilfragment-Sequenzinformation wurde ein
spezifischer PCR-Primer generiert und für eine 3‘
RACE PCR (2.2.13.6) eingesetzt. So konnte die
fehlende codierende Region für die cytoplasmatische
Domäne inkl. 3‘ UTR gefunden werden. Durch eine
unabhängige RT-PCR (2.2.13.5) wurde die vollständige
codierende Region der IP2 Splice-Variante verifiziert
und kloniert (Abbildung 5). Die Nukleotidsequenz der
cDNA der IP2 Isoform in Abbildung 8 ist ab den in
beiden Varianten unterschiedlichen cytoplasmatischen Domänen dargestellt. Die codierende
Region der cytoplasmatischen Domäne der IP2 Variante ist im Vergleich zu IP1 um 90 bp
(inkl. Stop-Codon) auf 180 bp verlängert. Im Anschluß an das Stop-Codon erstreckt sich
eine IP2-spezifische 3‘ UTR von 133 bp Länge, welche in Position 940 in eine Sequenz
mündet, die mit der 3‘ UTR der bereits bekannten kürzeren Splice-Variante identisch ist.
Eine schematische Darstellung der cDNA Sequenzen der beiden Splice-Varianten IP1 und
IP2 ist in Abbildung 6 dargestellt. Aufgrund der neugewonnenen Sequenzdaten und der aus
der cDNA abgeleiteten Membran-Topologie konnte ein hypothetisches Modell für die
zugrundeliegende Struktur des IP-Genes vorgeschlagen werden (Abbildung 6).
1 2 St
1000 bp
Abbildung 5: Agarosegel Spur 1:RT-PCR mit IP-5-F/ IP2 C3-R; Spur2: 3‘RACE-PCR mit IP2-CIZ-F/Ankerprimer 2; St: Standard (smartladder, Fa. Eurogentec)
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Abbildung 6: Hypothetische Genstruktur des IP-Genes, schwarze Winkel: konstitutive Splice-Vorgänge, roteWinkel: alternative Splicevorgänge
Abbildung 7: cDNA Schema der IP Splice-Varianten
44
Abbildung 8: IP2 cDNA Sequenz dargestellt ab Beginn der cytoplasmatischen Domäne; codierende Regionist grau unterlegt, IP2 spezifische 3‘ UTR ist rot unterstrichen, Rest 3‘ UTR ist identisch mit IP1 3‘UTR
3.1.1 Aminosäuresequenz der vollständigen cytoplasmatischen Domäne von IP2
625 ATG AGG TTC CTG GTG GCC CGC AGA GTC TTC AAC CTC AGT GTC172 Met Arg Phe Leu Val Ala Arg Arg Val Phe Asn Leu Ser Val
667 AGC AAA CAT GGA AAG AAA GGG AAG GGT AAA GAG GGA TCA CAG186 Ser Lys His Gly Lys Lys Gly Lys Gly Lys Glu Gly Ser Gln
709 CAG AGA CAG GGC CCA ACT CTC TCC ATC GGA GAC CCG TCC AAG200 Gln Arg Gln Gly Pro Thr Leu Ser Ile Gly Asp Pro Ser Arg
751 CTG AAG GCC GCC GCC TCA GAA AAG AAG AAG CAG GAG TCG CGC214 Leu Arg Ala Ala Ala Ser Glu Lys Lys Lys Gln Glu Ser Arg
793 AAG GAT AAG AAA TAG228 Lys Asp Lys Lys ---
Abbildung 9: Translatierte AS-Sequenz der cytoplasmatischen Domäne von IP2
Die cytoplasmatische Domäne der IP2 Splice-Variante (IP2cyto) ist im Vergleich zu IP1 um
45
29 AS länger und somit insgesamt 59 Aminosäuren lang, woraus sich ein vollständiges IP2-
Protein von 231 AS und ein Molekulargewicht des reifen Proteines von 23 kDa ergibt.
Dieses paßt gut zu früheren Untersuchungen von Jeserich & Waehneldt (1987), in denen dem
reifen deglykosiliertem IP2 Protein ein apparentes Molekulargewicht von 23 kDa zugewiesen
werden konnte. Ein Sequenzvergleich des verlängerten C-Terminus des IP2 Proteins mit der
intrazellulären Domäne des P0-Proteins verschiedener Vertebratenspezies (Abbildung 10
nächste Seite) ließ mehrere konservierte, meist basische, positiv geladene Aminosäuren in
diesem Bereich erkennen. Das gehäufte Auftreten von Lysinen und Argininen am C-
Terminus der cytoplasmatischen Domäne steht im Einklang mit der ansonsten stark positiven
Ladung dieser Proteinregion. Während die cytoplasmatischen Domänen der aufgeführten
Vertebraten Spezies zwischen 69 AS (Mensch und Ratte) bzw. 68 AS (Hai) aufweisen, ist
der IP2 C-Terminus der Forelle mit einer Länge von 59 AS um 9 bzw. 10 AS kürzer. Säuger
und Hai besitzen im Vergleich zu IP2 einen „Einschub“ von 9 AS im Anschluß an das
Transmembransegment zu Beginn der cytoplasmatischen Domäne. In diesem Bereich ist die
Aminosäureübereinstimmung zwischen IP2 und den aufgeführten Spezies daher mit 34 %
relativ gering, während der C-Terminus von IP2cyto ca. 71% Sequenzübereinstimmung mit
den P0-Homologen aufweist. Die letzten 7 AS sind in allen aufgeführten Vertebratenspezies
identisch. In IP2cyto konnten zwei putative Phosphorylierungs-Stellen für Casein-Kinase II
(Position 207-210: SIGD bzw. Position 226-229: SRKD) ausgemacht werden, wobei die
letztere ebenfalls als putative Phosphorylierungsstelle für die Protein-Kinase C (Position 226-
228: SRK) angesehen werden kann. Darüber hinaus wurde eine zweite potentielle PKC-
Phosphorylierungsstelle in Position 219-221: (SEK) ausgemacht.
3.2 Untersuchungen zur Funktion von IP1/2 alsAdhäsionsmolekül
In der vorliegenden Dissertation sollten experimentelle Hinweise auf die Funktion von IP1/2
als homophiles Adhäsionsmolekül gesammelt werden. Hierzu wurde der Ansatz der
heterologen Expression von IP in eukaryotischen Zellinien gewählt. Transfizierte Zellen
sollten sich aufgrund ihres differierenden Membranproteinrepertoires in Suspension unter
definierten Bedingungen im Adhäsionsverhalten von nicht-transfizierten Kontrollzellen
- +- - + + -++ +- - ++-++ ↑Abbildung 10: Aminosäuresequenzvergleich zwischen den cytoplasmatischen Domänen von P0verschiedener Vertebratenspezies mit IP1 bzw. IP2. Identische AS-Reste sind schwarz unterlegt, ähnlichegrau. +/- repräsentieren geladene AS. Das Ende der kürzeren IP1 Isoform ist mit einem Pfeil markiert.Auffällig ist die Häufung konservierter positiv-geladener AS am C-Terminus der verglichenen Proteine.
3.2.1 Aufbau eines Adhäsionsassays
Mit Hilfe der Zellinien OLN-93, einer Oligodendrogliazelle, (RICHTER-LANDSBERG UND
HEINRICH, 1996) , CHO-K1, einer Fibroblastenzelle und stabil exprimierenden rP0/CHO-
DG44-Zellen (freundliche Gabe von M. Filbin, New York) konnte ein Adhäsionsassay
etabliert werden, der es möglich machte, die Abnahme der absoluten Partikelzahl mit der Zeit
einhergehend mit der Zunahme von Zellaggregaten zu quantifizieren. Im Rahmen dieser
Dissertation wurden verschiedene Protokolle mit unterschiedlichen Inkubationsbedingungen,
Medien und Temperaturen erarbeitet und verglichen. Durch Trypan-Blau-Ausschlußtest
(2.2.37) wurde die Vitalität der Zellen überprüft und somit sichergestellt, daß eine Adhäsion
nicht auf die unspezifische Verklumpung toter Zellen zurückzuführen ist. Desweiteren wurde
deutlich, daß die Intensität der Zellablösung durch Trypsin entscheidenden Einfluß auf das
Adhäsionsverhalten hatte. Wurden die Zellen zu lange trypsiniert, war absolut keine
Adhäsion mehr detektierbar, was belegt, daß die gemessenen Adhäsionen auf
Proteininteraktionen zurückzuführen sind. Es zeigte sich, daß das unter 2.2.36 detailliert
beschriebene Protokoll geeignet war und reproduzierbare Ergebnisse lieferte.
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Abbildung 11: Adhäsionsassay mit OLN 93, CHO-K1 und rP0/CHO-Zellen. Abnahme der absolutenTeilchenzahl in Suspension mit der Zeit (N(t) /N(0) ).
Während des Versuchszeitraumes bildeten die Einzelzellsuspensionen für jeden Zelltyp
charakteristische Zellaggregate aus mehreren Zellen. Die mit der Zunahme der Zellaggregate
korrelierende Abnahme der absoluten Partikelzahl in der Suspension konnte mit einem
automatischen Teilchenzählgerät quantifiziert werden. Bereits untransfizierte
Oligodendoglialzellen (OLN-93-Zellen) waren nach 90 min stark adhäsiv und bildeten
Zellklumpen, die mit einem N(t)/N(0)-Wert von 0,19 (+/- 0,06) quantifiziert werden konnten.
Untransfizierte CHO-K1-Zellen bildeten im gleichen Zeitraum signifikant weniger
Zellaggregate (N(t=90)/N(0) Werte von 0,45 (+/- 0,08)), während für stabile rP0/CHO-Zellen
nach 90 min ein N(t) /N(0)-Wert von 0,1 (+/- 0,03) ermittelt wurde. Der unterschiedliche Grad
der Verklumpung der Zellen wurde im Mikroskop weit deutlicher. Untransfizierte CHO-
Zellen bildeten nach 90 min hauptsächlich Zellaggregate aus drei bis vier Zellen, während
0 20 40 60 800,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0 CHO P0 OLN93
N(t
)/N
(0)
t [min]
48
OLN-93 Zellklumpen aus bis zu 30 Zellen und rP0/CHO-DG44 Aggregate aus mehreren
hundert Zellen bildeten. Das hier ermittelte Aggregationsverhalten von rP0/CHO-
Kontrollzellen paßt gut zu früheren Studien (WONG UND FILBIN, 1996) und belegt somit die
Funktionalität und Reproduzierbarkeit des etablierten Adhäsionsassays.
Da die intrinsischen Adhäsionseigenschaften der myelinbildenden Oligodendrogliazelle OLN-
93 Zellen wie erwartet bereits zu starker Aggregation führten, wurden für die folgenden
Untersuchungen die Fibroblastenzelline CHO-K1 als Wirtszelle für die Adhäsionsassays
verwendet.
3.2.2 Heterologe transiente Expression von IP1 und IP2 in CHO-K1-Zellen
Zur heterologen Expression in CHO-K1-Zellen wurden die vollständigen codierenden
Regionen der cDNAs von IP1 bzw. IP2 in den bicistronischen Expressionsvektor pIRES-neo
kloniert (7.1 und 7.2). Mit Hilfe der Transfectam-Methode (2.2.49) konnten ca. 5 %. einer
CHO-K1-Zellkultur erfolgreich transfiziert werden. 48 h nach Transfektion zeigten
transfizierte CHO-K1-Zellen nach Methanolfixierung eine starke granuläre Immunfärbung im
Cytoplasma der Zelle. Mit Hilfe der Paraformaldehydfixierung / Oberflächenmarkierung
(2.2.54) konnten mit den polyklonalen Antikörpern αIP1 und αIP2 eine Fluoreszenzfärbung
der extrazellulären Domäne von rIP1-, bzw. rIP2-CHO-Zellen detektiert werden, die die
Integration der Forellenmyelinproteine in die Zellmembran der Säugerwirtszelle belegte
(Abbildung 12). Oberflächenfluoreszenzmarkierungen an rIP1/CHO-Zellen mit dem
monoklonalen Antikörper 7C4, spezifisch für die intrazelluläre Domäne von IP1
(STROTMANN, DIPLOMARBEIT, 1988), blieben negativ und stützten obiges Resultat.
variiert werden (Daten nicht gezeigt). Der Einfluß des MBP-Fusionsanteiles ist unter diesen
Bedingungen nicht genau bestimmbar, so daß quantitative Messungen zur Membranaffinität
des IP2cyto mit der MBP/IP2cyto-Fusion nicht möglich waren.
Abbildung 27: SDS-PAGE nach Elution von Transilkügelchen; 1: Transil neutral, 2: Transil positiv geladen,3: Transil neg. und pos. geladen, 4: Transil mit Phosphatidylserin; 5: Transil mit Phophatidylcholin; 6:Probe ohne Transil
3.3.2 Untersuchung zu Protein-Protein-Wechselwirkungen von IP1/2cyto
Die eluierten Proteinfraktionen MBP/IP1cyto und MBP/IP2cyto wurden auf ein natives-
PAGE (2.2.33) in Abwesenheit von denaturierenden Detergenzien wie SDS aufgetragen. Im
apparenten Laufverhalten der nativen MBP/IP1cyto und MBP/IP2cyto ist im Vergleich zur
denaturierenden SDS-PAGE kein Unterschied erkennbar (Abbildung 28). Dieses ist als
Hinweis zu deuten, daß die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 nicht zur
Oligomerisierung neigen und daher als Monomer vorliegen.
Um Hinweise auf eine denkbare Interaktion von IP1cyto und IP2cyto zu erhalten, wurde eine
Protein-Protein-Bindungsstudie mit dem Overlay-Assay (2.2.40) durchgeführt. Hierzu wurde
62
sowohl MBP/IP1cyto auf einer Nitrozellulosemembran als „Köder“ immobilisiert und in einer
Proteinlösung mit MBP/IP2cyto inkubiert, als auch vice versa. Mit Hilfe der für die jeweilige
Isoform spezifischen Antikörperkombination (7C4/anti-Maus-IgG -Peroxidase für Ip1cyto
und αIP2/anti-Hase-IgG-Peroxidase für IP2cyto) konnte gezeigt werden, daß
MBP/IP1/2cyto offensichtlich nicht die Tendenz haben, spezifische intermolekulare Protein-
Protein-Interaktionen einzugehen (Abbildung 29). Es konnte in keinem Fall am Köderprotein
gebundenes Zielprotein detektiert werden.
Abbildung 29: Overlayblot: 1: immobil. IP1cyto mit IP2cyto inkubiert (Nachweis mit α IP2); 2: immobil.IP2cyto mit IP1cyto inkubiert (Nachweis mit 7C4); 3: Positiv-Kontrolle immobil. IP1cyto (Nachweis mit7C4); 4: Positiv-Kontrolle immobil. IP2cyto (Nachweis αIP2)
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3.4 Isolierung der cDNA Sequenz für das 36K- Protein
Das zweite Hauptmyelinprotein der Forelle ist das cytoplasmatische und membranassoziierte
36K. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, ist es denkbar, daß 36K eine Rolle in der
Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“ ausübt, ähnlich wie oben für IP1/2cyto
vermutet. Um erste Hinweise auf die Funktion dieses zweiten Hauptmyelinproteines zu
erhalten, wurde im Rahmen dieser Dissertation wiederum die Methode der heterologen
Expression gewählt.
Vor Beginn dieser Arbeit existierte keine exprimierbare
cDNA des 36K-Proteins. Es lag lediglich ein
Teilfragment der 36K cDNA Sequenz sowie eine gDNA
Teilsequenz für das 36K-Protein vor (STRELAU,
DISSERTATION 1997), so daß zunächst eine vollständige
cDNA isoliert werden mußte. Mit Hilfe der bereits
bekannten Teilsequenzen war es möglich, per PCR eine
DIG-markierte Sonde herzustellen, mit der eine Forellen
cDNA λ-Phagenbank durchsucht werden konnte. Wie
unter 2.2.18 f beschrieben, konnte ein positiver
Phagenklon isoliert, durch dreimaliges Rescreening
gereinigt und amplifiziert werden. Nach in vivo Excision
lag das cDNA-Fragment als Insert in pBluescript vor
und konnte sequenziert werden. In einer unabhängigen RT-PCR an Forellen konnte die
Existenz der isolierten cDNA-Sequenz verifiziert werden. Abbildung 30 zeigt das PCR-
Amplifikat in der erwarteten Höhe von 950 bp. Das Amplifikat wurde kloniert und
sequenziert und stimmte mit der in Abbildung 31 gezeigten durch Genbank-Screening
gefundenen cDNA Sequenz zu 100% überein.
950 bp
Abbildung 30: Agarosegelelek-trophorese, Spur 1: RT-PCR mit36K-CL-F4/36K2R an ForellenHirn; Spur 2: Standard (smartladder, Fa. Eurogentec); Spur 3:H2O-PCR (neg. Kontrolle)
64
Abbildung 31: Sequenz der 36K cDNA nach λ-Phagenbank Screening, ATG und TGA sind durch Fettdruckhervorgehoben; die codierende Region in Großbuchstaben ist grau unterlegt, die 5‘ UTR und die 3‘ UTR istdurch Kleinbuchstaben dargestellt; poly(a) Signale fett
65
Die vollständige 36K cDNA ist 2120 bp lang. Der größte offene Leserahmen ist 963 bp lang,
befindet sich zwischen Position 10 (Start ATG) und Stop-Codon (TGA) in Position 973 und
codiert für ein 320 Aminosäuren großes Protein. Die untranslatierte 5‘Region ist mit 10 bp
auffällig kurz, während die untranslatierte 3‘ Region 1167 bp lang ist. Sie trägt in Position
1838, 2034 und überlappend in Position 2087 und 2089 am 3‘ Ende 3 poly (A) Signale (nach
PROUDFOOT UND BROWNLEE, 1976).
3.4.1 Aminosäuresequenz des 36K-Proteins
Die aus den 320 Triplett des größten offenen Leserahmens abgeleitete Aminosäuresequenz
ist in Abbildung 32 dargestellt.
1 ATG TCT CTT TAC CGC AAC TCT GCG TGG TTT CTG AAA GGA ATG1 Met Ser Leu Tyr Arg Asn Ser Ala Trp Phe Leu Lys Gly Met
42 ACT GAA TTC ACC AGG AGT GCG TTC CTC TCT GCC GCC AAA CAC14 Thr Glu Phe Thr Arg Ser Ala Phe Leu Ser Ala Ala Lys His
84 TTT GTG GAA AAG GAC CTG GAG GTG TCC ATG GCA GGC AGG GTC28 Phe Val Glu Lys Asp Leu Glu Val Ser Met Ala Gly Arg Val
126 TTC ATG ATC ACC GGA GCC AAC AGT GGC ATA GGG AGA GCT ACA42 Phe Met Ile Thr Gly Ala Asn Ser Gly Ile Gly Arg Ala Thr
168 GCC ATG GCC ATC GCC AAG AGA GGT GGT ACA GTC CAC ATG GTG56 Ala Met Ala Ile Ala Lys Arg Gly Gly Thr Val His Met Val
210 TGC AGG AAC AAG GAC AAA GCA GAA GAG GCC AGG GCT GAC ATT70 Cys Arg Asn Lys Asp Lys Ala Glu Glu Ala Arg Ala Asp Ile
252 GTC AAG GAG TCA GGA AAT AAA GAA ATA TAT GTC CAC ATT CTG84 Val Lys Glu Ser Gly Asn Lys Glu Ile Tyr Val His Ile Leu
294 GAC CTG TCT GAG ACA CGG AAG GTT TGG GAG TTT GCA GAG GCC98 Asp Leu Ser Glu Thr Arg Lys Val Trp Glu Phe Ala Glu Ala
336 TTC AAG AGG AAG TAC AAA GCC TTG AAT GTA CTG ATA AAT AAT112 Phe Lys Arg Lys Tyr Lys Ala Leu Asn Val Leu Ile Asn Asn
378 GCA GGC TGC ATC ATG AGT GAG AGG GAT GTG AAC GCT GAG GGG126 Ala Gly Cys Ile Met Ser Glu Arg Asp Val Asn Ala Glu Gly
66
420 CTG GAG AAG AGC TTT GCC AGT AAC GTC ATG GGT GTG TAT ATC140 Leu Glu Lys Ser Phe Ala Ser Asn Val Met Gly Val Tyr Ile
462 CTG ACC AAG GGC CTG ATT CCT TTA CTG GAG AAG AGT GCA GAG154 Leu Thr Lys Gly Leu Ile Pro Leu Leu Glu Lys Ser Ala Glu
504 CCA AGA GTG ATC ACA GTT TCA TCT GGA GGG ATG CTG GTC CAG168 Pro Arg Val Ile Thr Val Ser Ser Gly Gly Met Leu Val Gln
546 AAG CTG AGG ACA GGG AAC CTG CAG ACA GAA ATA GGT CGC TAT182 Lys Leu Arg Thr Gly Asn Leu Gln Thr Glu Ile Gly Arg Tyr
588 GAC GGC ACC ATG GTC TAC GCA CAG CAC AAG AGG CAA CAG GTG196 Asp Gly Thr Met Val Tyr Ala Gln His Lys Arg Gln Gln Val
630 GTG ATG ACA GAG CAG TGG GCC AAG ACC CAT AGC AAC GTC CAC210 Val Met Thr Glu Gln Trp Ala Lys Thr His Ser Asn Val His
672 TTC TCA GTG ATG CAC CCT GGC TGG GTG GAC ACG CCG GCG GTG224 Phe Ser Val Met His Pro Gly Trp Val Asp Thr Pro Ala Val
714 GCC AAT GCC ATG CCT GAC TTC CAC CAG TCT ATG AAG GAC AGT238 Ala Asn Ala Met Pro Asp Phe His Gln Ser Met Lys Asp Ser
756 ATG AGG ACC CCG GAG CAG GGG GCT GAC ACC ACG GTG TGG TTG252 Met Arg Thr Pro Glu Gln Gly Ala Asp Thr Thr Val Trp Leu
798 GCC ATC TCA GAG GCC GCC GCC ACC AAG CCC AGC GGA AGC TTC266 Ala Ile Ser Glu Ala Ala Ala Thr Lys Pro Ser Gly Ser Phe
840 TTC CAG GAT CGG AGG ATG GTG TCG GCC CAC CTG CCC CTG GCC280 Phe Gln Asp Arg Arg Met Val Ser Ala His Leu Pro Leu Ala
882 TGG ACC CAC AGT TCC CAG TTG GAG CAG CAG AAG TTC ATG AGT294 Trp Thr His Ser Ser Gln Leu Glu Gln Gln Lys Phe Met Ser
924 GTG ATG GAG GAT CTG GCC AAG ACC TTC CAG CCC CAC TGA308 Val Met Glu Asp Leu Ala Lys Thr Phe Gln Pro His ***
Abbildung 32: Translatierte Aminosäuresequenz der isolierten 36K cDNA
Es konnte eine eindeutige Codonpräferenz festgestellt werden; dieses gilt vor allem für die
Tripletts der Aminosäuren Ala (20 von 33: GCC), Phe (10 von 14: TTC), Leu (15 von 17:
CTG), His (10 von 11: CAC), Gln (12 von 13: CAG), Lys (17 von 21: AAG), Arg (10 von
17: AGG), Val (14 von 25: GTG). Diese Codonnutzung entspricht der von WADA (1991) für
67
Knochenfische festgestellten Präferenz.
Anhand der Aminosäuresequenz wurde ein Molekulargewicht errechnet, welches mit 35,7
kDa annähernd dem apparenten Molekulargewicht des 36K-Proteins in der SDS-
Gelelektrophorese entspricht. Der kalkulierte isoelektrische Punkt liegt bei pH 9,54.
Computergestützte Sequenzanalysen sagen kein sekretorisches Signalpeptid voraus.
Ebenfalls fehlt ein Transmembransegment, so daß es sich um ein cytoplasmatisches Protein
handeln dürfte. Es können 4 potentielle Phosphorylierungsstellen für Protein-Kinase-C
ausgemacht werden (Position 103-105: TRK; Position 132-134: SER; Position 248-250:
SMK; Position 252-254: SMR). Außerdem sind 4 putative Phosphorylierungsstellen für
Casein Kinase II auszumachen (Position 132-135: SERD; Position 248-251: SMKD;
Position 299-302: SQLE; Position 308-311: SVME). Wie schon in der Einleitung erwähnt,
konnte vor Beginn dieser Arbeit bereits anhand von gDNA-Fragmenten ein putatives 36K-
Protein vorausgesagt werden. Vergleicht man diese Voraussage mit der hier isolierten
translatierten cDNA Sequenz, fällt auf, daß sich beide Proteine im N-Terminus
unterscheiden, was aber keine Auswirkungen auf die vorhergesagte Sekundärstruktur des
Proteines hat (näheres unter 3.5.1).
Sekundärstrukturanalysen mit der hier isolierten Sequenz nach dem Chou/Fasman
Algorithmus (1978) ergaben eine charakteristische Abfolge von 6 β-Faltblätter und 6 α-
Helices. Innerhalb dieser 6 β-Faltblätter wurden außerdem Bereiche mit hohem β-Turn-
Potential identifiziert. Diese β6/α6-Struktur ist bereits 1974 von Rossman et al. beschrieben
worden. Gestützt durch Proteindatenbank-Sequenzvergleiche wurde deutlich, daß 36K daher
eine signifikante Ähnlichkeit zu klassischen Vertretern dieser charakteristisch strukturierten
Proteine, den NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen aufweist. Diese bestehen zumeist
aus einer Dinukleotid- und einer substratbindenden Domäne. Das aktive Zentrum der
Enzyme liegt dabei zwischen beiden Abschnitten. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit
durchgeführten Sekundärstrukturvorhersagen stützten die bereits von Strelau postulierte
Struktur des vorhergesagten putativen 36K-Proteins, so daß an dieser Stelle auf diese Arbeit
verwiesen werden kann. (STRELAU, DISSERTATION 1997).
68
Abbildung 33: Hypothetisches Sekundärstrukturmodell von 36K, gestützt durch Protein-Datenbankvergleiche; β-Faltblätter sind durch blaue Pfeile dargestellt, die alternierenden α-Helices durchrote Tonnen; eine putative NAD/NADP-Bindestelle ist durch die rote Strukturformel angedeutet. DieseSekundärstruktur ähnelt den Rossman-gefalteten Oxido-Reduktasen.
3.5 Untersuchungen zur 36K-Genstruktur durch PCR
Um Aufschluß über die zugrundeliegenden Genstruktur zu
erhalten und somit die Intron/Exon-Grenzen festlegen zu
können, wurde gDNA aus der Forellenleber isoliert und
als Template für eine PCR eingesetzt. Es ergab sich ein
heterologes Amplifikat aus Fragmenten unterschiedlicher
Länge. Es konnten jedoch fünf prominente Banden
ausgemacht werden (Abbildung 34), die zur Verifikation
kloniert und sequenziert wurden. Durch
Sequenzvergleiche mit der in dieser Arbeit isolierten
cDNA konnten die erhaltenen Amplifikate auf ihre
Spezifität verifiziert und das größte Amplifikat von ca.
2000 bp Länge eindeutig als das zugrundeliegende
Genfragment identifiziert werden. So war es möglich, die Intron/Exon-Strukturen des 36K-
Abbildung 34: AgarosegelelektrophoreseSpur 1: gDNA-PCR mit 36K-CL-F4/36KR2; 1968 bp Amplifikat ist 36KGenfragment, Spur 2: Smart Ladder(Standard); Spur 3: gleiche PCR mit H20(neg. Kontrolle)
69
Genes in diesem Bereich festzulegen (Abbildung 36). Das 5‘ Ende des gDNA-Amplifikates
entsprach exakt dem 5‘ Ende des codierenden Bereiches der in dieser Arbeit isolierten
cDNA-Sequenz. Der als Exon I bezeichnete Bereich endet nach 56 bp in einen kanonischen
5‘ Splice Donor (GT). Das 1551 bp lange Intron I endet bei Nukleotid 1607 in einen
kanonischen 3‘ Splice Akzeptor (AG). Strangabwärts folgen 138 bp Exon II, die wiederum
in einen kanonischen GT 5‘ Splice Donor münden (Position 1745). Das Intron II umfaßt die
folgenden 172 bp und endet mit AG als 3‘ Splice-Akzeptor, an dem sich das Exon III
anschließt, welches bis zur Primersequenz dargestellt ist. Alle gefundenen Splice-Punkte des
36K-Genes unterliegen demnach der GT/AG Regel von Breathnach et al. (1978). Eine
Intron/Exon-Karte des 36K-Genes ist in Abbildung 35 dargestellt.
Abbildung 35: Karte der Intron/Exon-Struktur des 36K-Genes (modifiziert nach Strelau); für die Rossman-Faltung der Proteinstruktur wichtige Domänen (βn αn) sind in keinem Falle durch Introns getrennt.
70
71
Abbildung 36 (vorherige Seite): Sequenz des zugrundeliegenden 36K-Genes (gDNA-PCR): verwendetePrimer sind fett gedruckt, Start-ATG ist unterstrichen; codierende Regionen (Exons) in Großbuchstaben sindgrau unterlegt; Splice-Punkte sind rot dargestellt. Von Strelau (Dissertation,1997) ermittelterTranskriptionsstart ist fett/kursiv, die postulierten alternativen Start-ATG’s sind unterstrichen(Erläuterungen hierzu siehe 3.5.1)
3.5.1 Diskrepanz zwischen isolierter und vorhergesagter 36K-Sequenz
Vergleicht man die Aminosäuresequenz bzw. die zugrundeliegende Nukleotidsequenz der
hier isolierten 36k cDNA mit der von Strelau (DISSERTATION, 1997) anhand von gDNA-
Fragmenten vorhergesagten cDNA-Sequenz, fällt auf, daß sie sich im N-Terminus der
codierenden Region unterscheiden. Diese Diskrepanz erklärt sich durch eine abweichende
Nukleotidfolge (TTCCA statt TTCA) in der gDNA-Sequenz, die als Grundlage für die
Vorhersage der putativen 36K-Sequenz diente. Interessanterweise ergibt sich durch die
abweichende Sequenz eine translatierte Proteinsequenz, die bis auf 40 AS im N-Terminus mit
der hier isolierten Sequenz identisch ist und keinen Einfluß auf die vorhergesagte
Sekundärstruktur des Proteines hat (siehe auch 3.4.1, bzw. STRELAU, DISSERTATION, 1997).
Abbildung 37: Nukleotidvergleich zwischen N-Terminus der vorhergesagten cDNA-Sequenz (Strelau,Dissertation, 1997) in rot und hier isolierter cDNA Sequenz in schwarz; Start-ATG sind unterstrichen;Sequenzunterschiede (Cytosin-Insertion) ist eingerahmt
Die von Strelau zur cDNA-Vorhersage verwendetet gDNA-Sequenz ist mit der im Rahmen
dieser Dissertation ermittelten und oben beschriebenen Gensequenz in Abbildung 36 bis zur
Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym ClaI identisch (exklusive der Cytosin-Insertion;
Abbildung). Durch RT-PCR konnte in dieser Arbeit das von Strelau durch Primerextension
gefundene Transkript (Transkriptionsstart und putative Start-ATGs sind in Abbildung 36
verzeichnet) verifiziert werden. Die ermittelte Sequenz entsprach wiederum der TTCA-
Nukleotidfolge, wie sie im Rahmen dieser Arbeit stets gefunden wurde. Eine Translation
72
dieses Transkriptes, ausgehend von den von Strelau vorgeschlagenen Start-ATGs, ergibt ein
Protein von 78 AS Länge.
Abbildung 38: Agarosegelelektrophorese Verifikation eines weiteren nicht 36K-Transkriptes Spur 1: RT-PCR mit 36K CF1/36KR2; Spur 2: H2O-PCR; St: 100bp Ladder (Fa. Gibco); Spur 3: RT-PCR 36KCL-F4/36KR2; Spur 4: H2O-PCR
3.5.2 Klonierung einer putativen Promotorregion des 36K-Genes durch „inversePCR“
Nachdem die oben beschriebene Intron/Exon-Struktur des 36K-Genes nunmehr vollständig
aufgeklärt war (Abbildung 35), ergab sich die Frage nach der Sequenz und Struktur des
zugrundeliegenden Promotors. Damit einher ging die Frage nach dem Transkriptionsstart des
36K codierenden Transkriptes. Der bisher unbekannte Bereich strangaufwärts des Start-
ATGs sollte mit Hilfe der inversen PCR (2.2.13.3), die im Rahmen dieser Dissertation
etabliert wurde, kloniert werden.
Per PCR wurde eine ca. 300 bp lange DIG-markierte
Sonde spezifisch gegen den Bereich strangaufwärts
der Erkennungsstelle für Cla I inkl. des Exon I,
codierend für den N-Terminus von 36K, generiert.
Nach southernbotting von Cla I verdauter Forellen
gDNA war in Höhe von 1,2 kb sowie in Höhe von ca.
3,5 kb ein schwach positives Signal erkennbar. Aus
einem Parallelgel wurde Cla I verdaute gDNA diesesAbbildung 39: Agarosegel-elektrophorese, inverse PCR anzirkularisierter Cla I verdautergDNA mit 36K-CL-R6/ 36K-CL-F71: Template 3,5 kb gDNA; 2: 1,2 kbgDNA
73
Größenbereiches herausgeschnitten, aufgereinigt und zur Selbstligation/Zirkularisierung über
die Cla I kompatiblen Enden eingesetzt (2.2.13.3). Die inverse PCR an zirkularisierter 1,2 kb
DNA als Matrize ergab eine prominente Bande in der erwarteten Höhe, an zirklarisierter 3 kb
DNA war kein PCR-Amplifikat detektierbar (Abbildung 39). Nach Klonierung,
Sequenzierung und Sequenzvergleich mit der bislang bekannten 36K-Gensequenz konnte die
ermittelte Sequenz der 1,2 kb Bande eindeutig als distaler gDNA Bereich stromaufwärts des
Start-ATGs eingestuft werden (Abbildung 40). Die Existenz und Orientierung dieser
neugewonnenen Nukleotidsequenz konnte in einer unabhängigen PCR an unverdauter gDNA
Abbildung 40: Durch inverse PCR erhaltene gDNA-Sequenz (putative Promotorregion); codierende Regionist grau unterlegt; Erkennungsstelle für Cla I ist umrahmt; Start-ATG der isolierten 36K cDNA ist rot und
74
unterstrichen; putatives Start-ATG in Position 1024 rot; strangauwärts „in-frame“ Stop-codon rot; putativeTATA-Boxen kursiv
Die neugewonnene putative Promotor-, bzw. 5‘ UTR-Sequenz ist in Abbildung 40 in der
korrespondierenden Genstruktur dargestellt. In Position 1039 befindet sich das Start-ATG
der isolierten cDNA. Die N-terminale codierende Region erstreckt sich bis zum Ende der
dargestellten Sequenz. Der Bereich zwischen Position 1029-1039 ist bis auf ein
Nukleotidaustausch (Position 1034 T statt A) mit der als 5‘ UTR interpretierten Sequenz der
isolierten 36K cDNA (Abbildung 31) identisch. In Position 1024 befindet sich im gleichen
Leserahmen wie das isolierte 36K-Transkript als erstes ATG hinter einem Stop-Codon
(Position 998) ein weiteres putatives Start-ATG. Innerhalb der putativen Promotorregion
konnten mehrere potentielle TATA-Boxen gefunden werden (Position 589, Position 681;
Position 703; Position 823). Die potentiellen TATA-Boxen in Position 823 (Sequenz
TTAATTCAA), in Position 589 (Sequenz TTATTTCAT) und in Position 681 (Sequenz
TTATTATCAA) weisen auffällige Ähnlichkeiten zu der für das IP-Gen gefundenen TATA-
Box (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997), dargestellt in Abbildung 41 auf.
Abbildung 41: Sequenzvergleich zwischen putativen TATA-Boxen des 36K-Genes mit der TATA-Box des IP-Genes; identische Nukleotide sind grau hinterlegt
3.6 Heterologe Expression der isolierten 36K cDNA in CHO-K1
Die codierende Region der isolierten 36K cDNA wurde wie unter 7.5 beschrieben, in den
pIRES-hygro Expressionsvektor kloniert und diente zur Transfektion von CHO-K1-Zellen
(2.2.49). 48h nach Transfektion zeigten ca. 5% der CHO-Zellen eine deutliche granuläre
Immunfärbung im Bereich des Cytoplasmas (Abbildung 43). Der korrespondierende
Westernblot (Abbildung 42) zeigt eine immunopositve Bande, die leicht unterhalb der
nichtrekombinanten Forellenmyelin 36K-Probe läuft. Eine Klonierung von stabilen
Expressoren mit Hilfe der Hygromycin/G418-Selektion (2.2.51) ist leider trotz mehrerer
75
Ansätze nicht gelungen.
Abbildung 42. Westernblot mit 36K transfizierten CHO-Zellen (36K/CHO); daneben Forellenmyelin (My)bzw. untransfizierte CHOZellen (CHO); (Nachweis mit α36K)
Abbildung 43: Immunfloureszenz 48 h nach Transfektion: r36K/CHO-Zellen (Methanolfixierung α36K/cy3,600x)
3.7 Expression in E. coli (pET-System)Im Rahmen dieser Dissertation wurden drei verschiedene präparative E. coli
Expressionssysteme etabliert und vergleichend eingesetzt. Hierbei handelte es sich um das
IMPACT-System, pMAL-System (2.2.27 und 2.2.21) sowie das pET-System (2.2.23).
Es zeigte sich, daß weder das IMPACT-System noch das pMAL-System für die Expression
76
von r36K geeignet war. Nach Induktion und Aufreinigung (2.2.27 und 2.2.21 f ) waren nur
marginale Proteinausbeuten von ≤ 550µg/ 1l Kultur detektierbar, die außerdem stark mit
Fremdprotein kontaminiert waren. Das Zielprotein machte somit nur ca. 15 % aus (Daten
nicht gezeigt). Diese geringen Ausbeuten waren durch Veränderung der
Induktionsbedingungen (Zeitpunkt und -dauer und/oder Temperatur nach Induktion) nicht zu
verbessern. Daher wurden diese Ansätze verworfen. Das pET-System lieferte jedoch
ansprechende Resultate.
In dieser Dissertation ist es gelungen, 36K mit Hilfe des pET-System (Klonierungsschema
siehe 7.7) unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von 6M Harnstoff in großen
Mengen aufzureinigen (2.2.23 ff). Nach
dreistündiger Induktion bei 37° C war im
Vergleich zur nicht induzierten Spur auf dem
SDS-PAGE in Abbildung 44 eine prominente
Bande in der erwarteten Größe sichtbar.
Nach Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie
in Gegenwart von 6M Harnstoff konnte das
rHis-Tag-36K-Protein nahezu ohne
Fremdproteinkontaminationen aufgereinigt
werden. Eine vergleichende Aufreinigung
unter nativen Bedingungen ohne Harnstoff
brachte nur unbefriedigende Ausbeuten und
starke Kontaminationen durch Fremdprotein
(Abbildung 44) Das rekombinante His-Tag-
36K liegt in der Bakterienwirtszelle nach
Induktion offensichtlich zum größten Teil in
Einschlußkörpern („inclusion bodies“) vor. Der korrespondierende Westernblot zeigt ein
immunopositives Signal auf der Höhe der eluierten Bande. Das elektrophoretische
Laufverhalten des rHis-Tag-36K Proteins weicht von dem des „nativen“ 36K aus dem Myelin
der Forelle aufgrund der „His-Tag“-Erweiterung durch zusätzliche 21 Aminosäuren, davon
10 geladene Histidine, in der erwarteten Weise ab (Abbildung 44). Die denaturierende
Aufreinigung des rHis Tag-36K ergab Ausbeuten von ≥ 7,5 mg Zielprotein / 1l Kultur.
Abbildung 44: SDS-PAGE/Westernblot einertypischen Expression von 36KHT in E.coli BL 21(DE3)/pLysS-36K/pET16b und Aufreinigung inGegenwart von 6M Harnstoff; Spur 1: nicht induzierteZellen; Spur 2: 3h nach Induktion bei 37°C; Spur 3:denaturiernd aufgereinigtes 36KHT in Gegenwart von6M Harnstoff; Spur4: nativ aufgereinigtes Eluat; Spur5: Westernblot vom 36KHT Eluat denat.
77
3.7.1 Alternative Aufreinigung von His-Tag-36K durch Affinitätschromatographiemit Farbsepharosen
Um erste Hinweise auf eine denkbare NAD- bzw. NADP-bindende Funktion des 36K
Proteines zu erhalten wurde eine Affinitätschromatographie mit Farbsepharosen (2.2.26)
durchgeführt. Wie aus Abbildung 45 deutlich wird, konnte jedoch natives HisTag-36K mit
dieser Methode unter den gewählten Bedingungen nicht aufgereinigt werden. Durch
Veränderung der Pufferbedingungen und/oder der Farbsepharose könnten weiterführende
Studien mit renaturiertem, gereinigtem 36KHT jedoch Hinweise auf eine NAD/NADP-
Abhängigkeit des HisTag-36K-Proteines bringen.
Abbildung 45: Westernblot alternative 36K Aufreinigung mit „reactive red“ Sepharose; my: ZNS Myelin;neg.: E coli Zellysat nicht induziert; 1: nativ aufgereinigtes 36KHT Eluat nach Umpuffern; Spur 2: nicht anSäule gebundener Durchlauf; Spur 3: Waschdurchlauf; Spur 4 und 5: Elution mit 20 mM NAD bzw. NADP
3.8 Expression in Insektenzellen / Baculovirus-SystemVergleichend zu den E. coli Systemen wurde in der vorliegenden Dissertation die Methode
der Baculovirus-Expression „Bac-to-Bac“ (siehe 2.2.20 f.) als weitere heterologe
eukaryotische Proteinexpressionsmethode etabliert. Als Wirtszellen dienten HighFive-Zellen
(H5) bzw. Sf21-Zellen. Da die Baculovirus-Expression zur Lyse der infizierten Wirtszelle
führt, ist es günstig, den Erfolg und den zeitlichen Verlauf der Infektion überprüfen zu
können (3.2.9). Hierzu diente in der vorliegenden Arbeit das Grünfluoreszierende Protein
(GFP) als Reportergen. Das komplexe Klonierungsschema des Konstruktes, bestehend aus
78
Reportergen und Zielproteingen, ist unter 7.6 ausführlich dargestellt. Wie unter 2.2.20.1 f
beschrieben, konnten r36KHT/GFP-DualAcNPV kloniert werden, die für die
Proteinexpression (2.2.20.3) eingesetzt wurden.
Abbildung 46 zeigt zeigt r36KHT/GFP-DualAcNPV infizierte HighFive-Zellen im
Fluoreszenzmikroskop 72h nach Infektion. Zu diesem Zeitpunkt waren bereits ca. 50 % aller
Zellen infiziert und zeigten eine deutliche Immunfärbung.
Abbildung 46: links: Immunfloureszenz 72h nach Infektion 36KHT/GFP-Dual/High Five (α36K/cy3, 400x),GFP-Markierung der 36KHT/GFP-Dual-Expressoren
Abbildung 47: SDS-PAGE; 1: HighFive Zellysat; 2: HighFive 3 Tage nach Infektion mit r36KHT/AcNPV; 3:r36KHT Eluat nach Aufreinigung; 4: Westernblot (α36K) an r36KHT-Eluat
Die SDS-PAGE in Abbildung 47 zeigt eine typische Expression und His-Tag -Aufreinigung
(2.2.24) des rHis-Tag 36K aus HighFive-Zellen in Gegenwart von 6M Guanidin-HCl,
79
daneben der korrespondierende Westernblot mit einer immunopositiven Bande in der
erwarteten Höhe. Das Laufverhalten des rHis-Tag-36K weicht aufgrund der His-Tag-
Erweiterung um insgesamt 28 Aminosäuren wie schon unter 3.7 beobachtet ab. Die
Ausbeuten der Baculovirus-Expression fielen mit ca. 500µg Zielprotein /1l Kultur um eine
10er Potenz geringer aus als das vergleichbare E. coli System (3.7).
80
4 Diskussion
Im Rahmen dieser Dissertation konnten die cDNAs der Hauptmyelinproteine IP2 und 36K
aus dem ZNS der Forelle vervollständigt und in unterschiedlichen Systemen heterolog
exprimiert werden, so daß eine erste Grundcharakterisierung dieser Proteine möglich wurde.
Es konnten erste experimentelle Hinweise auf die Funktionen dieser putativen
Adhäsionsmyelinproteine in mimetischen Systemen gewonnen und darüberhinaus weitere
Einsichten in die Sequenz und Struktur der zugrundeliegenden Myelinproteingene erhalten
werden.
Da die Sequenz der IP2 cDNA vor Beginn der Arbeit nicht vollständig bekannt war, wurde
sie zunächst durch PCR-gestützte Techniken komplettiert. Die IP2 cDNA Nukleotidsequenz
ist in dem codierenden Bereich mit der cDNA-Sequenz der bereits isolierten IP1-Isoform
identisch, am 3‘ Ende aber um 90 bp verlängert. Die 3‘ UTR der IP2 cDNA ist mit ca. 1000
bp auffällig lang und besitzt charakteristische Merkmale. Im Anschluß an die verlängerte
codierende Region erstreckt sich eine kurze IP2 spezifische 3‘UTR, die in eine für beide IP-
Isoformen identische 3‘UTR inkl. poly (A). mündet. Die cDNAs der beiden Splice-Varianten
IP1 und IP2 unterscheiden sich also außer in der verlängerten cytoplasmatischen Domäne nur
durch kurze Isoform-spezifische 3‘ UTR-Abschnitte. Es ist zur Zeit noch nicht geklärt, ob
die gemeinsame 3‘ UTR-Sequenz zweimal auf der gemeinsamen prä-mRNA vertreten ist
oder aber als konstitutives Exon innerhalb der 3‘ UTR entsprechend für beide Varianten
prozessiert wird. Über die physiologische Bedeutung von 3‘ UTRs ist allgemein wenig
bekannt, doch dürften sie eine wichtige Rolle bei der Prozessierung von Transkripten und
somit bei der Regulation des alternativen Splicings spielen. Beiden IP-Isoformen liegt der
gleiche Promotor zugrunde (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997), die Expression der
Proteinvarianten wird jedoch entwicklungsabhängig gesteuert. Hierbei wird zunächst die
längere IP2 Isoform exprimiert, erst in späteren Entwicklungsstadien folgt die Expression
von IP1 (JESERICH ET AL., 1990A). Es ist daher anzunehmen, daß sich auf der beiden
Varianten zugrundeliegenden gemeinsamen prä-mRNA Sequenzmotive befinden, die die
Auswahl der alternativen Splice-Punkte beeinflussen und somit die differentielle
Proteinexpression regulieren. Die Regulation von alternativen Splice-Vorgängen ist bisher
nur wenig verstanden, doch konnten hierfür bereits Protein-Protein-, Protein-RNA-, und
81
RNA-RNA-Interaktionen verantwortlich gemacht werden, die ihrerseits
entwicklungsabhängig reguliert werden. (STOJDL UND BELL, 1999; ZHAO ET AL, 1999;
LOPEZ, 1998; VARANI UND NAGAI, 1998). Innerhalb der gemeinsamen reifen 3‘ UTR von
IP1 und IP2 konnten außerdem AT-reiche Sequenzmotive gefunden werden. Diese Motive
könnten Determinanten für die Instabilität einer mRNA darstellen und ihre Degradation
beeinflussen (SHAW UND KAMEN, 1986). Weiterhin gibt es Hinweise, daß die 3‘ UTR-
Sequenzen von Myelinproteinen die Translationseffizienz beeinflussen und so zur Regulation
der Proteinexpression beitragen können. So sind z. B. für das Basische Myelinprotein durch
progressive Deletionen der 3‘ UTR bis zu zehnfache Unterschiede in der Translations-
effizienz beobachtet worden (UENO ET AL., 1994). Auch für das Periphere Myelinprotein 22
(PMP22) ist seit kurzem bekannt, daß die 3‘ UTR cis-inhibierenden Motive enthält, welche
die Translationseffizienz beeinflussen (BOSSE ET AL., 1999) Der molekulare Mechanismus
hinter dieser post-transkriptionellen Regulation sowie eventuelle konservierte Konsensus-
Sequenzmotive sind bislang jedoch noch nicht bekannt. Ein weiterer denkbarer Aspekt für
die Funktion der IP1/2 spezifischen 3‘ UTR ist die Regulation der Proteinlokalisation des
translatierten Proteines. Erst kürzlich konnte in Drosophila-Oozyten gezeigt werden, daß die
subzelluläre Lokalisation dreier durch alternatives Splicing entstandener Genprodukte durch
unterschiedliche 3‘ UTRs reguliert wird. (WHITTAKER ET AL. 1999). Ähnliche mRNA-
abhängige Proteintranslokation ist ebenfalls für das Basische Myelinprotein beschrieben,
wobei die regulatorischen Sequenzmotive jedoch nicht ausschließlich auf die 3‘ UTR
beschränkt, sondern auch innerhalb der codierenden Region auszumachen sind (BOCCACIO ET
AL., 1999; WOODRUFF UND FRANKLIN,1998; COLMAN ET AL., 1982; GOTTLIEB, 1992;
REVIEW: CARSON ET AL.,1998). Weiterführende Arbeiten, in denen die 3‘UTR von IP1/2
hinter die codierende Region eines Reportergenes wie das Grünfluoreszierende Protein
(GFP) oder Chloramphenicol-Acetly-Transferase (CAT) kloniert werden würde sowie die
Isolierung der zugrundeliegenden Gen-, bzw. prä-mRNA-Sequenz, könnten interessante
physiologische Aufgaben der proteinspezifischen bzw. gemeinsamen 3‘ UTR liefern.
Anhand der isolierten cDNA-Sequenz wurde die Aminosäuresequenz des IP2-Proteines
abgeleitet. Für viele der in der IP2 cDNA-Sequenz codierten Aminosäuren konnte eine
auffällige Codonpräferenz ausgemacht werden. Die bevorzugten Codons stehen in
Übereinstimmung mit der von Wada et al. (1991) veröffentlichten Codonpräferenz von
82
Knochenfischen. Das IP2-Protein ist 231 Aminosäuren lang und in der cytoplasmatischen
Domäne im Vergleich zur IP1-Splice-Variante um 29 Aminosäurereste verlängert. Das
kalkulierte Molekulargewicht des reifen Proteines von 23 kDa steht in guter
Übereinstimmung mit der elektrophoretischen Mobilität des reifen deglykosilierten IP2-
Moleküls (JESERICH UND WAEHNELDT, 1987). Außerdem stimmt der vorhergesagte
isoelektrische Punkt des Proteines (pI: 10,53) mit früher gewonnenen Resultaten aus 2 D-
Gelektrophorese-Analysen überein (JESERICH UND WAEHNELDT, 1986).
Sequenzvergleiche der cytoplasmatischen Domäne des IP2-Porteins aus dem ZNS der Forelle
mit den cytoplasmatischen Domänen des obligatorischen PNS-Adhäsionsprotein P0 von
Ratte (LEMKE UND AXEL, 1985), Mensch (HAYASAKA ET AL., 1991) und Hai (SAAVEDRA ET
AL., 1989) zeigten eine charakteristische Verteilung von identischen Aminosäuren. Diese
Aminosäureübereinstimmung ist im verlängerten C-terminalen Proteinbereich, der nur in der
IP2 Splice-Variante zu finden ist, mit 71% besonders hoch. Die letzten sieben Aminosäuren
mit einer positiven Nettoladung sind in allen verglichenen Spezies identisch. In dem Teil der
cytoplasmatischen Domäne, der von IP1 und IP2 geteilt wird, beträgt die Aminosäure-
übereinstimmung lediglich 34%. Phylogenetisch konservierte Aminosäuren sind meist
basisch, d.h. positiv-geladen. Zu den konservierten Bereichen gehören auch zwei Protein-
Kinase C-Phosphorylierungsstellen. Aufgrund der auffälligen Verteilung von konservierten
Aminosäuren ist eine wichtige funktionelle Rolle der cytoplasmatischen Domäne des IP2-
Proteines zu vermuten. Es ist denkbar, daß die stark positiv-geladene, basische Domäne
aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen an saure negativ-geladene
Membranphospholipide bindet, also als „Membrananker“ fungiert und somit die Apposition
der cytoplasmatischen „major dense line“ unterstützt. Eine derartige Membranassoziation
wurde bereits 1985 von Lemke und Axel für das P0-Protein postuliert und konnte
experimentell mit Hilfe von artifiziellen negativ-geladenen Liposomen und die durch
chemische Spaltung als Peptidfragmente isolierte cytoplasmatische Domäne des P0-Proteins
nachgewiesen werden (DING UND BRUNDEN, 1994). In diesem Zusammenhang ist
erwähnenswert, daß die verwendeten cytoplasmatischen P0-Domänen eine
Mikroheterogenität in der Nettoladung aufwiesen, die auf einen unterschiedlichen
Phosphorylierungsgrad zurückzuführen ist. Die Zelle ist so in der Lage, aufgrund von
Phosphorylierungen die Membranbindung der cytoplasmatischen Domäne zu modulieren. Die
83
phylogenetische Konservierung der Position der Protein-Kinase C-Phosphorylierungstellen
zwischen dem evolutiv weit entfernten P0-Protein der Säuger und dem IP2-Protein der
Forelle läßt eine vergleichbare Funktion nicht abwegig erscheinen. Eine ebenfalls für P0
beschriebene Membranverankerung durch Palmytilierung der cytoplasmatischen Domäne
(GAO UND FILBIN, 1999), die z.B. auch in dem neuralen Zelladhäsionsmolekül N-CAM
(LITTLE ET AL., 1998) und PLP (POPOT ET AL., 1991) gefunden werden konnte, scheidet für
das IP2-Protein aus, da es keine cytoplasmatischen acylierbaren Cysteinreste besitzt.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß durch die hier gefundenen auffälligen Sequenzüberein-
stimmungen zwischen IP2 und P0 innerhalb der cytoplasmatischen Domäne die bereits von
Stratmann und Jeserich (1995) beschriebene strukturelle und sequentielle Ähnlichkeit
zwischen IP und dem obligatorischen Adhäsionsprotein P0 gestützt werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die adhäsiven Eigenschaften der in beiden
Isoformen identischen extrazellulären Domänen von IP in einem mimetischen Zellsystems zu
untersuchen. Dazu wurde ein Adhäsionstest etabliert, der es ermöglichte, das
Aggregationsverhalten von transfizierten und nicht transfizierten Einzelzell-Suspensionen zu
vergleichen. Da sich eine transfizierte Zelle nur durch die Expression des jeweiligen
Zielproteins von einer nicht-transfizierten Zelle unterscheidet, konnten Unterschiede im
Aggregationsverhalten auf adhäsive Eigenschaften des heterolog exprimierten Zielproteins
zurückgeführt werden. Durch Trypanblau-Ausschluß-Test wurde überprüft, daß die
aggregierten Zellen vital sind, so daß eine unspezifische Verklumpung von toten Zellen
auszuschließen ist. Die Zunahme der gebildeten Zellaggregate in der Zellsuspension wurde
mit einem automatischen Teilchenzählgerät quantifiziert und zusätzlich mikroskopisch
analysiert. Wie erwartet aggregierten bereits untransfizierte Zellen der myelinbildenden
oligodrendroglialen OLN-93-Zellinie aufgrund starker intrinsischer Adhäsionseigenschaften
zu großen Zellaggregaten und kamen daher als Wirtszelle für die Adhäsionsassays nicht in
Frage. Untransfizierte CHO-K1-Zellen waren deutlich weniger adhäsiv, so daß sie als
Wirtszelle für alle folgenden Experimente eingesetzt wurde. Es wurde deutlich, daß bei
alleiniger Betrachtung der durch die automatische Quantifizierung der absoluten Teilchenzahl
in der Zellsuspension ermittelten N(t)/N(0)-Werte die durch mikroskopische Analyse ermittelte
Aggregation unterschätzt werden kann. Es ist denkbar, daß durch auftretenden Scherkräfte
während der Partikelzählung Zellaggregate partiell dissoziieren können, so daß nur sehr
84
starke Adhäsionen quantifizierbar sind. Durch die mikroskopische Analyse ist daher
zusätzlich eine Detektion von schwächeren Bindungen bzw. Interaktionen möglich. Die
Funktionalität und Reproduzierbarkeit des etablierten Adhäsionsassays konnte mit Hilfe der
rP0/CHO-Kontrollzellen überprüft werden, da die im Rahmen dieser Dissertation
gemessenen und beobachteten Adhäsionen frühere Untersuchungen mit diesen Zellen
stützten (FILBIN ET AL, 1990; WONG UND FILBIN, 1996; GAO UND FILBIN, 1999).
IP1 und IP2 konnten transient in CHO-Zellen exprimiert werden. 48 h nach Transfektion
zeigten ca. 5% der transfizierten Zellen eine deutliche Immunfärbung. Durch eine
Oberflächenmarkierung von nicht permeabilisierten transfizierten Wirtszellen wurde deutlich,
daß IP1 und IP2 auch in CHO-Zellen in die Zellmembran integriert wurden. Im
korrespondierenden Westernblot zeigte sich, daß IP1/2 auch in der CHO-Wirtszelle
glykosiliert werden, da das apparente Laufverhalten der heterolog exprimierten IP-Splice-
Varianten exakt mit dem Laufverhalten der aus Forellenmyelin isolierten IP-Proteine
übereinstimmte. Diese Glykosilierung könnte eine wichtige funktionelle Bedeutung für IP1/2
besitzen. Zwar ist die Kohlenhydratseitenkette von IP noch nicht im Detail analysiert, doch
konnte in gereinigtem PNS-Myelin der Forelle sowie im ZNS-Myelin des Karpfens durch
Immunreaktion das Kohlenhydrat-Epitop HNK-1 nachgewiesen werden (HAMMER ET AL.,
1993; TAKEI ET AL., 1993), welches außer im Immunsystem und einer Anzahl von neuralen
Adhäsionsproteinen auch im P0-Protein auftritt (BOLLENSEN UND SCHACHNER, 1987). Die
Kohlenhydratseitenkette wurde für P0 durch Kristallstrukturanalysen an der Basis der
extrazellulären Domäne in der Nähe der Zellmembran positioniert (SHAPIRO ET AL., 1996).
Die Funktion ist bislang umstritten. Während Filbin und Tennekoon 1991 dem
Kohlenhydratrest eine für die homophile Adhäsion essentielle Lectin-ähnliche Funktion
zugeschrieben haben, fanden Schachner und Mitarbeiter, daß die bakteriell heterolog
exprimierte extrazelluläre P0-Domäne, die demnach nicht-glykosiliert vorliegt, ebenfalls
homophile Bindekapazitäten besitzt (GRIFFITH ET AL., 1992). Kürzlich konnte die Struktur
des HNK-1 Kohlenhydratkette des P0-Proteines aus Rind durch NMR-Spektroskopie
bestimmt werden, die genaue Funktion bleibt aber weiterhin unbekannt (VOSHOL ET AL.,
1996). Durch Untersuchungen mit Endoglykosidase F konnten neben dem gemeinsamen
HNK-1-Epitop signifikante Unterschiede im Kohlenhydratrest der IP-Proteine der Forelle
und dem P0-Protein aufgedeckt werden (JESERICH UND WAEHNELDT, 1987), so daß auch
85
über die Funktion der IP-Glykosilierung bislang nur spekuliert werden kann.
Es konnte ein stabiler IP1/CHO-Zellklon durch Antibiotikaselektion und limitierender
Verdünnung selektiert, expandiert und für die Adhäsionstests eingesetzt werden. Nahezu
100% der Zellen wurden per Immunfärbung als positive Expressoren identifiziert. Aufgrund
der im Vergleich zur transienten Expression schwächeren Fluoreszenzfärbung von stabilen
Transfektanden, kann davon ausgegangen werden, daß das Expressionsniveau stabiler
Expressoren pro Zelle unter dem von transient exprimierenden Zellen lag. Während bei der
transienten Expression offensichtlich mehrere Kopien des Expressionsvektor-Konstruktes in
der Zelle vorliegen, integriert bei der stabilen Expression durch das seltene Ereignis der
nicht-homologen Rekombination nur eine oder wenige Kopien des Expressionsvektors in das
Genom der Zelle, so daß das Expressionsniveau sinkt. Es ist an dieser Stelle wichtig zu
erwähnen, daß die als Positivkontrolle verwendeten rP0/CHO-Zellen ein deutlich höheres
Expressionsniveau aufweisen: Bei den verwendeten P0-Zellen handelt es sich nämlich um
eine spezielle Dihydrofolat-Reduktase (dhfr) defiziente CHO-DG44-Zelle. Dieser Gendefekt
des essentielle Enzymes wurde in trans mit dem Expressionsvektor, der auch das P0-
Zielprotein codiert, komplementiert. So war es möglich, durch Zellkultivierung in
ansteigenden Methotrexat (MTX)-Dosen (dhfr-Antagonist), aufgrund des bislang nicht
detailliert beschriebenen Phänomens der Genamplifikation, das Expressionsniveau von P0 zu
erhöhen. Im Vergleich zu nicht geboosteten transfizierten Zellen liegen mehrere Kopien
integriert im Genom der Wirtszelle vor, was mit einer Steigerung der P0 Expression um
590% einhergeht und somit 8-16 fach über dem Expressionsniveau von kultivierten
Sekundären Schwannzellen liegt (FILBIN UND TENNEKOON, 1990). Das Phänomen der
Genamplifikation ist offensichtlich auf einige spezielle Gene, darunter die beschrieben dhfr-
Amplifikation, beschränkt (SINGER UND BERG, 1992; KAUFMAN ET AL., 1979; MONTOYA-
ZAVALA ET AL., 1985), da es in dieser Arbeit nicht gelungen ist, durch ansteigende
Antibiotikakonzentrationen das Expressionsniveau von IP in CHO-Zellen zu steigern. Eine
vergleichende Quantifizierung des Oberflächenexpressionsniveaus der P0-Zellen mit den in
dieser Arbeit isolierten stabilen IP-Expressoren, z.B. durch einen Zell-ELISA, ist nicht
möglich, da hierfür unterschiedliche Antikörper verwendet werden müßten, zwischen denen
nicht verglichen werden kann. Folglich ist auch ein direkter quantitativer Vergleich zwischen
allen im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Adhäsionswerten der IP-Expressoren und den P0-
86
Kontrollzellen nicht möglich.
In den im Rahmen dieser Dissertation erstmals durchgeführten Adhäsionstests konnte gezeigt
werden, daß das IP-Protein der Forelle eine Funktion als Adhäsionsmolekül ausübt. Stabil
transfizierte rIP1/CHO-Zellen waren im Vergleich zu nicht transfizierten CHO-Zellen
schwach adhäsiv. Die absolute Partikelzahl ging in der rIP1/CHO-Zellpopulation auf ca. 36%
zurück, während in nicht-transfizierten CHO-Kontrollzellen aufgrund ihrer intrinsischen
Adhäsionseigenschaften die Teilchenzahl auf ca. 45% zurückging. Noch deutlicher wurde die
gemessene Adhäsion in der mikroskopischen Anlayse: rIP1/CHO-Zellen bildeten
hauptsächlich Zellaggregate aus bis zu 10 Zellen, während sich untransfizierte CHO-Zellen
überwiegend zu Tripletts zusammenfanden. Die gebildeten rIP1/CHO-Zellaggregate konnten
allerdings durch mehrmaliges Invertieren wieder dissoziiert werden. Es dürfte sich daher bei
der IP1-vermittelten Adhäsion um recht schwache Interaktionen handeln. Dieses könnte den
Unterschied zwischen der durch automatische Teilchenzählung (Scherkräfte) gemessenen
und der mikroskopisch beobachteten Adhäsion erklären.
rIP-P0/CHO-Zellen, die ein chimäres Fusionsprotein bestehend aus der extrazellulären und
transmembranellen Domäne des IP und der vollständigen cytoplasmatischen Domäne des P0
Proteins exprimierten, waren deutlich adhäsiver als rIP1/CHO-Zellen. Die absolute
Partikelzahl von rIP-P0/CHO ging im Adhäsionsassay auf ca. 24% zurück, im Gegensatz zu
ca. 45% bei den nicht-transfizierten Kontrollzellen und 36% bei rIP1/CHO. Auch in diesem
Fall wurde die Adhäsion von rIP-P0/CHO-Zellen in der mikroskopischen Kontrolle
deutlicher: rIP-P0/CHO-Zellen bildeten während des Adhäsionsassays Zellaggregate von bis
zu 35 Zellen, während sich IP1/CHO-Zellen zu kleineren Aggregaten von 6-10 Zellen
zusammenfanden. Diese Unterschiede im Aggregationsverhalten lassen sich nicht durch die in
einem vergleichenden Zell-ELISA detektierten geringen, aber nicht-signifikanten
Unterschiede im Oberflächenexpressionsniveau (ca. 1,3 fach mehr IP-P0 als IP1) erklären.
Der Unterschied im Adhäsionsverhalten zwischen rIP-P0/CHO und rIP1/CHO ist daher nicht
auf einen Gendosiseffekt, sondern auf die unterschiedlichen cytoplasmatischen Domänen der
Adhäsionsproteine zurückzuführen. Die cytoplasmatische Domäne wirkt offenbar als eine Art
„Membran/Cytoskelettanker“ was somit eine stärkere Adhäsion ermöglichen würde. Der hier
gefundene Einfluß der cytoplasmatischen Domäne auf die Adhäsionseigenschaften des IP-
87
Proteins steht in Übereinstimmung mit Untersuchungen beim P0-Protein. Mutierte bzw.
trunkierte P0 Varianten (Deletion der cytoplasmatischen Domäne) waren im Adhäsionsassay
nicht von untransfizierten Zellen zu unterscheiden (GAO UND FILBIN 1999; WONG UND
FILBIN, 1994). Nicht nur für P0, sondern auch für die Cadherine, eine Gruppe von
Adhäsionsmolekülen, die nicht wie IP und P0 zur Immunglobulin-Superfamilie gezählt
werden, ist bekannt, daß die intakte cytoplasmatische Domäne mit Bestandteilen des
Cytoskeletts interagiert und so essentiell für die Funktion als Adhäsionsmolekül ist
(NAGAFUCHI UND TAKEICHI, 1988; NAGAFUCHI ET AL., 1991; HIRANO ET AL., 1992).
Die adhäsiven Eigenschaften der rIP-P0/CHO-Zellen waren durch Zugabe des αIP1-
Antikörpers, der in dieser Arbeit als spezifischer Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne
von IP charakterisiert wurde, vollständig und selektiv zu blockieren. Durch Antikörper
blockierte rIP-P0/CHO-Zellen waren praktisch nicht von untransfizierten CHO-
Kontrollzellen zu unterscheiden, auf die der Antikörper keinen Effekt hatte. Beide
Zellpopulationen bildeten Zellaggregate aus bis zu 5 Zellen, während sich rIP-P0/CHO-
Zellen ohne Antikörperzugabe zu Zellaggregaten aus bis zu 35 Zellen zusammenfanden.
Diese selektive Inhibierung der Adhäsion durch einen spezifischen Antikörper gegen ein
Oberflächenepitop der IP-Proteine unterstreicht die Korrelation zwischen IP-Expression und
Zellaggregation und paßt gut zu vergleichbaren Studien mit dem P0-Protein (ZHANG ET AL.,
1996). Der Antikörper bindet an der extrazellulären Domäne und maskiert sie gegen
Proteininteraktionen. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Untersuchungen, daß die
extrazelluläre Immunglobulin-ähnliche Domäne der IP-Splice-Varianten Zell-Zell-Adhäsion
vermittelt. Die cytoplasmatische Domäne fungiert wahrscheinlich als Membran-, bzw.
Cytoskelettanker und festigt somit die Zell-Zell-Kontakte. IP1/2 ist demnach als Vertreter
der Ig-CAM-Superfamilie ebenfalls als typisches Adhäsionsprotein einzustufen.
Weiterführende Studien mit mehreren verschiedenen Zellklonen stabiler IP2-Expressoren
könnten wichtige neue Einsichten zur Funktion der cytoplasmatischen Domänen der IP-
Splicevarianten ermöglichen. Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung innerhalb der
cytoplasmatischen Domänen zwischen P0 und IP2, könnte für IP2 ein dem chimären IP-P0-
Fusionsprotein ähnliches Aggregationsverhalten vermutet werden. Besonders interessant
wären auch Untersuchungen zur Adhäsivität von IP1/IP2 Co-Expressoren. Es ist nämlich für
88
das P0-Protein bekannt, daß die Fähigkeit zur Adhäsion durch Co-Expression einer in der
cytoplasmatischen Domäne trunkierten Proteinvariante zusammen mit einem vollständigen
P0-Protein inhibiert wurde. Die trunkierte P0-Variante übt also einen inhibierenden
dominant-negativen Einfluß auf die Adhäsion aus (WONG UND FILBIN 1996). Im
Forellenmyelin hingegen liegen eine „verkürzte“ und eine „vollständige“ IP-Splicevariante in
vivo gemeinsam im kompakten Forellenmyelin vor. Es wäre daher denkbar, daß durch die
Expression zweier putativ unterschiedlich adhäsiver Proteine die Kompaktierung des
Myelinmembran moduliert werden kann. Weiterführende Arbeiten mit entsprechenden
IP1/IP2 Co-Expressoren könnten Einblick in diesen interessanten Aspekt der Myelinogenese
ermöglichen.
Es ist an dieser Stelle interessant zu erwähnen, daß das IP-P0-Fusionsprotein im Westernblot
nur durch die Antikörper αIP1 bzw. 4C5 detektiert werden konnte. Diese Antikörper sind
demnach spezifisch für die extrazelluläre Domäne des IP-Proteins. Überaschenderweise
weicht das apparente Laufverhalten von IP-P0 von seinem kalkulierten Molekulargewicht ab.
Es wurde bereits mehrfach beschrieben, daß P0 äußerst empfindlich auf Proteolyse reagiert
(CAMMER ET AL., 1981; WONG UND FILBIN, 1996). Da die Zellyse von rIP-P0/CHO-Zellen
zur Probenvorbereitung ohne Proteaseinhibitoren durchgeführt wurde, ist es wahrscheinlich,
daß es sich hierbei um ein Proteolyseprodukt handelt. Da diese Proteolyse nur bei lysierten
Zellen auftritt, dürfte sie die Zelladhäsion der vitalen Zelle nicht beeinflussen.
Um weitere Hinweise auf die Funktion der unterschiedlichen cytoplasmatischen IP-Domänen
zu erhalten, wurden sie als Peptidfusionen in E. coli heterolog exprimiert. Hierzu wurden
vergleichend drei verschiedene Expressionssysteme eingesetzt. Es zeigte sich, daß nur das
pMAL-System geeignet war, um ausreichende Mengen der Peptidfragmente präparativ
aufzureinigen. Es konnte ein Protokoll entwickelt werden, welches die Aufreinigung von ca.
2 mg/l Kultur ermöglichte. Neben den IP1/2cyto-Maltosebindeproteinfusionen (MBP) wurde
stets ein ca. 42 kDa Protein co-präpariert, welches in subsidiären Westernblot-Analysen
immuno-negativ blieb, so daß es sich hierbei offensichtlich um degradiertes, nicht-fusioniertes
Maltosebindeprotein handelt. Durch die Westernblot-Analysen wurde auch deutlich, daß der
monoklonale Antikörper 7C4 spezifisch für die cytoplasmatische Domäne der IP1-Splice-
89
Variante ist, während sich der polyklonale Antikörper αIP2 im Westernblot spezifisch für die
cytoplasmatische Domäne der IP2-Isoform erwies. Es waren keine Kreuzreaktionen
detektierbar. Der monoklonale Antikörper 7C4 erkennt also ein Epitop, welches
offensichtlich mit der letzten freien Aminosäure (Glutamin) der IP1-Sequenz korreliert,
während der αIP2-Antikörper Epitope im IP2-spezifischen cytoplasmatischen Proteinbereich
erkennt.
Da sich das Laufverhalten der IP-MBP-Fusionen in einem nativen PAGE nicht von dem
Laufverhalten im SDS-PAGE unterscheidet, ist offensichtlich keine Tendenz zur
Oligomerisierung der cytoplasmatischen Domänen auszumachen. Ein inhibierender Einfluß
des Maltosebindeproteines hierbei ist eher unwahrscheinlich, da mit einem ähnlichen Ansatz
bereits Untersuchungen zur Dimerisierung des Blauzungen-Virus Nucleocapsid Protein VP4
ohne störende Einflüsse des Fusionsanteils durchgeführt werden konnten (RAMADEVI ET AL.,
1998). Für das P0-Protein ist bekannt, daß das Protein in großen Clustern in der
Zellmembran auftritt (D’URSO ET AL., 1990, FILBIN ET AL., 1990). Dieses Clustering ist
essentiell für die Funktion des P0 als Adhäsionsmolekül. In der cytoplasmatischen Domäne
trunkierte P0-Proteine clustern nicht und sind nicht adhäsiv. (WONG UND FILBIN, 1996). Es
ist bislang jedoch nicht bekannt, ob das Clustering von P0, wie von Shapiro et al. (1996)
aufgrund von Kristallstrukturuntersuchungen vorgeschlagen, auf Protein-Protein-
Wechselwirkungen zwischen den extrazellulären Domänen beruht, so daß eine Inhibierung
des Clustering durch eine trunkierte cytoplasmatische Domäne auf sterische Veränderungen
innerhalb des Proteinkomplexes zurückzuführen wäre, oder aber, ob die cytoplasmatische
Domäne selbst Sequenzmotive bzw. Proteinbereiche besitzt, die für die Interaktionen
verantwortlich sind. Für einen Vergleich der Funktionen der cytoplasmatischen Domänen von
IP1/2 und P0 wäre in der Zukunft daher ein oben beschriebenes Experiment mit P0-MBP-
Fusionen äußerst interessant.
Desweiteren wurden erste Experimente zur Detektion von putativen Protein-Protein-
Interaktionen zwischen den cytoplasmatischen Domänen von IP1 und IP2 durchgeführt. Es
war nicht möglich, durch Immobilisierung einer Splice-Variante als Köderprotein die andere
Splice-Variante zu binden und immunologisch zu detektieren. Zwar müssen weiterführende
Studien mit sensitiveren Detektionsmethoden und anderen Puffersystemen, sowie Studien mit
90
nicht-fusionierten IP-Peptidfragmenten abgewartet werden, doch ist vom derzeitigen
Standpunkt aus eine IP1 /IP2-Interaktion auf Seiten der cytoplasmatischen Domäne eher
unwahrscheinlich.
Wahrscheinlicher ist eine Interaktion der cytoplasmatischen Domäne von IP2 mit sauren
Phospholipiden der Zellmembran. Erste experimentelle Untersuchungen mit artifiziellen
Zellmembranen definierter Phospholipidzusammensetzung (Transil), ergaben eine Bindung
von IP2cyto/MBP an eine Oberfläche mit negativ-geladenem Phosphatidylserin, und in
verminderter Form auch an Phophatidylcholin. Aufgrund des stark basischen isoelektrischen
Punktes der IP2-Domäne dürften diese Wechselwirkungen elektrostatischer Natur sein. Der
Einfluß des Maltosebindeproteinanteils ist zur Zeit nicht genau quantifizierbar, doch stehen
die gefundenen Ergebnisse für IP2 in Einklang mit der für P0cyto gefundenen
elektrostatischen Wechselwirkung mit sauren Phospholipiden (DING UND BRUNDEN, 1994).
Es ist daher denkbar, daß auch die cytoplasmatische Domäne von IP2 an der Apposition der
cytoplasmatischen „major dense line beteiligt“ ist. Weiterführende Untersuchung mit
nichtfusionierten IP1 bzw. IP2 Peptidfragmenten wären diesbezüglich von großem Nutzen.
Hierfür könnte ein erst kürzlich speziell zur Expression von kurzen Peptidfragmenten unter
10 kDa entwickeltes heterologes Expressionsystem (Fa. Novagen) besonders hilfreich sein.
Aufgrund der im Rahmen dieser Dissertation neu gewonnenen Erkenntnisse wird folgendes
Modell zur Kompaktierung des Forellenmyelin in Anlehnung an das von Wong und Filbin
1996 für P0 entwickelte Adhäsionsmodell vorgeschlagen: IP1/2 sind typische Vertreter der
Ig-CAM Superfamilie und fungieren als Adhäsionsproteine innerhalb der extrazellulären
„intraperiod line“. Die cytoplasmatische Domäne dient als Membran-, bzw.
Cytoskelettverankerung und beeinflußt so die Adhäsion. Die in der cytoplasmatischen
Domäne längere IP2-Variante, welche in der Embryonalentwicklung der Forelle zuerst
exprimiert wird (JESERICH ET AL., 1990), ermöglicht die initiale starke Adhäsion der
Myelinmembranen. In diesem Entwicklungsstadium ist die Myelinmembran noch recht locker
um das Axon gewunden und das Cytoskelett der Zelle für die Membranproteine zugänglich.
Durch Interaktionen der cytoplasmatischen Domäne von IP2 mit sauren negativ-geladenen
Phospholipiden der Zellmembran und/oder mit dem Cytoskelett wird die Adhäsion gefestigt.
Im Zuge der weiteren Entwicklung kompaktiert das Myelin zunehmend, welches mit der
91
Expression der Myelinproteine 36K und IP1 korreliert. Da im kompakten Myelin kein
Cytoskelett mehr detektierbar ist, wird die gefundene Membranadhäsion durch eine
Cytoskelett unabhängige Adhäsion durch die kürzere IP1 Splice-Variante vermittelt.
In diesem Zusammenhang stellt sich die spannende Frage nach putativen Protein-
Bindungspartnern von IP. So konnte für das P0-Protein durch Co-
Immunpräzipitationsuntersuchungen eine Interaktion mit PMP22 nachgewiesen werden
(D’URSO ET AL., 1999). Für das Forellenmyelin wäre es daher denkbar, daß IP1/2 während
der Myelinogenese mit dem Basischen Myelinprotein und/oder dem 36K-Protein interagieren
und somit die Adhäsion der Myelinmembranen festigen. Darüber hinaus sind im kompakten
adulten Forellenmyelin Interaktionen von IP1/2 mit dem DM20 Protein denkbar. 1996
konnte nämlich von Yoshida und Colman durch immunologische Analysen eine Co-
Lokalisation von DM20 und IP1/2, im kompakten Goldfischmyelin nachgewiesen werden.
Tang et al. (1996) fanden DM20 auch im Hirn der Forelle. Die Funktion des DM20 im
Forellenmyelin ist bislang noch unbekannt, so daß über die Funktion einer denkbaren
IP/DM20 Interaktion nur spekuliert werden kann. Das Expressionsniveau von DM20 ist
während der Myelinogenese jedoch äußerst gering. Erst im jungadulten Zustand fünf Wochen
nach Eischlupf ist eine erhöhte DM20-Expression durch Northernblot-Analysen detektiert
worden. Eine mögliche Funktion der IP/DM20-Interaktion könnte weniger zur Festigung der
Adhäsion während der Myelinogenese, sondern vielmehr zur Modulation der Adhäsion im
kompakten Myelin der Forelle genutzt werden. Co-Immunpräziptationsstudien, Detektion
von Proteininteraktion mittels des Hefe-, oder Säuger-Two-Hybrid-Systems, sowie
Adhäsionsassays von entsprechenden Co-Expressoren wären diesbezüglich sehr hilfreich und
von großem Interesse in der Zukunft.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte die cDNA des zweiten
Hauptmyelinproteins aus dem ZNS der Forelle, dem 36K-Protein kloniert werden. Der
größte offene Leserahmen codiert für ein 320 Aminosäuren großes Protein. Die
untranslatierte 5‘ Region ist auffällig kurz, während die untranslatierte 3‘ Region mit über
1000 bp eine ähnliche Länge wie die 3‘UTR der IP1/2 Splice-Varianten aufweist. Wie bereits
oben für das IP-Protein ausführlich diskutiert, ist die physiologische Funktion der 3‘UTR des
36K-Proteins bisher noch unklar.
92
Vor Beginn der vorliegenden Arbeit waren bereits Teile der zugrundeliegenden 36K-
Genstruktur bekannt (STRELAU, DISSERTATION, 1997). Durch PCR an genomischer Forellen-
DNA konnten die Intron/Exon-Grenzen der zugrundeliegenden Genstruktur im bisher
fehlenden 5‘-Bereich identifiziert werden, so daß nunmehr die vollständige Genstruktur
aufgeklärt ist. Das 5‘ Ende des gDNA-Amplifikates entsprach exakt dem 5‘ Ende des
codierenden Bereiches der in dieser Arbeit isolierten cDNA-Sequenz. Es folgt ein ca. 1500
bp langes Intron I, welches in einen kanonischen 3‘ Splice Akzeptor endet. Strangabwärts
konnten ebenfalls die Intron/Exon-Grenzen exakt festgelegt werden. Alle gefundenen Splice-
Punkte des 36K-Genes unterliegen der GT/AG Regel von Breathnach et al. (1978).
Da die Expression des 36K Proteins nicht nur gewebespezifisch, sondern auch
entwicklungsabhängig reguliert wird (JESERICH ET AL. 1990), könnte die Entschlüsselung der
zugrundeliegenden Promotorregion interessante neue Einblicke in die differentielle
Genexpression ermöglichen. Daher wurde mit Hilfe der inversen PCR ein Genabschnitt
kloniert, der durch Sequenzvergleich mit der isolierten 36K cDNA als putativer Promotor
bzw. 5‘ UTR einzustufen ist. Die Existenz dieses Genabschnittes konnte durch unabhängige
gDNA-PCRs verifiziert werden. Es wurde deutlich, daß sich 15bp strangaufwärts neben dem
durch cDNA-Isolierung identifizierten Start-ATG ein weiteres potentielles Start-ATG im
gleichen Leserahmen befindet. Innerhalb des putativen 36K Promotors konnten TATA-Box-
ähnliche Sequenzmotive gefunden werden. Diese besaßen eine auffällige
Sequenzübereinstimmung mit der für das IP-Gen identifizierten TATA-Box (JESERICH,
STRELAU UND LANWERT, 1997). Die für viele Promotoren typischen TATA-Sequenzen
(Konsensus: TATAA/TAA/T) befinden sich in einem Abstand von annähernd 30 bp vom
Transkriptionsstart entfernt und stellen Bindesequenzen für das TATA-Bindeprotein TBP
bzw. TFIID dar (LATCHMAN, 1995). Alle gefundenen putativen TATA-Boxen sind im
Vergleich zur Konsensussequenz degeneriert, was für Myelinproteine typisch ist (FORS ET
AL.,1993; TAMURA ET AL., 1990; NAVE ET AL., 1991). Da der Transkriptionsstart, der die
Promotorregion und daher auch putative TATA-Boxen und alle weiteren putativen
regulatorischen Sequenzmotive definiert, für die 36K codierende mRNA bislang aber noch
nicht bekannt ist, ist eine weiterführende Interpretation dieser Sequenzmotive zur Zeit nicht
möglich. In weiterführenden Studien nach exakter Identifikation des Transkriptionsstart des
36K-Transkriptes durch Primerextension könnten Sequenzvergleiche mit verschiedenen
93
Myelinproteinpromotoren Aufschluß über etwaige gemeinsame putativ-regulatorische
Sequenzbereiche liefern. Die Transkriptionsaktivität des 36K-Promotors könnte weiterhin
durch progressive Deletionen in Reportergenassays quantifiziert und charakterisiert und so
eventuelle funktionelle und regulatorische Ähnlichkeiten mit dem bereits charakterisierten IP-
Promotor deutlich werden (JESERICH, STRELAU UND LANWERT, 1997).
Anhand der isolierten 36K cDNA konnte ein 320 Aminosäuren großes Protein abgeleitet
werden. Die gefundene Codonpräferenz entsprach der Präferenz von Knochenfischen.
(WADA ET AL., 1991) Das korrespondierende Molekulargewicht entspricht mit 35,7 kDa
annähernd dem apparenten Molekulargewicht des 36K Proteins in der SDS-
Gelelektrophorese (JESERICH, 1983). Der kalkulierte isoelektrische Punkt von pH 9,54 steht
in Übereinstimmung mit früher gewonnenen Resultaten aus 2-D-Gelelektrophorese-Analysen
(JESERICH UND WAEHNELDT, 1986). Es ist an dieser Stelle erwähnenswert, daß Strelau mit
Hilfe von gDNA-Fragmenten eine cDNA-Sequenz vorausgesagt hat, die sich von der in
dieser Arbeit isolierten Sequenz im N-Terminus unterscheidet (STRELAU, DISSERTATION,
1997). Diese unterschiedlichen N-Termini sind auf einen Sequenzierfehler innerhalb der für
die Vorhersage genutzten gDNA-Sequenzen zurückzuführen und haben offensichtlich keine
Auswirkung auf die vorhergesagte Sekundärstruktur des Proteins. Sekundärstrukturanalysen
mit der hier isolierten Sequenz nach dem Chou/Fasman Algorithmus, ergaben eine
charakteristische Abfolge von 6 β-Faltblätter und 6 α-Helices. Innerhalb dieser 6 β-
Faltblätter wurden außerdem Bereiche mit hohem β-Turn-Potential identifiziert. Diese
β6/α6-Struktur ist bereits 1974 von Rossman et al. beschrieben worden. Gestützt durch
Proteindatenbank-Sequenzvergleiche wurde deutlich, daß 36K eine signifikante Ähnlichkeit
zu klassischen Vertretern dieser charakteristisch strukturierten Proteine, den NAD/NADP-
abhängigen Oxido-Reduktasen aufweist. Charakteristisches Merkmal dieser Proteinfamilie ist
eine Konzentrierung der phylogenetisch konservierten Sequenzmotive auf die Dinukleotid-
und der substratbindenden Domäne. Das aktive Zentrum der Enzyme liegt dabei zwischen
beiden Abschnitten und ist äußerst variabel (SCRUTTON ET AL., 1990; PERSON ET AL., 1991).
Das 36K-Protein unterscheidet sich von allen bislang gefundenen Myelinproteinen, was gut
zu früheren Untersuchungen paßt, in denen der 36K-Antikörper keinerlei Kreuzreaktionen
gegen Myelinproteine der Säuger, Vögel, Reptilien und Amphibien zeigte (WAEHNELDT ET
AL., 1986B). Überraschenderweise ähnelt das 36K-Protein der Protochlorophyllid-Reduktase
94
aus der Thylakoidmembran der Erbse (STRELAU, DISSERTATION 1997). Die Gruppe der
Oxido-Reduktasen ist in Bezug auf ihre Funktionen äußerst heterogen (LABESSE ET AL.,
1994). Sie reichen von der Reduktion verschiedenster Carbonylverbindungen über die
Inaktivierung von Steroiden bis hin zu wichtigen Funktionen bei der Synthese von
Antibiotika (ALBALAT ET AL., 1992; CHEN ET AL., 1993; BAKER, 1994). Dieses weite
Aktivitätsspektrum und die großen Sequenzunterschiede im katalytischen Bereich der
Enzyme machen eine funktionelle Interpretation äußerst schwierig. Über eine mögliche
enzymatische Funktion der einzigartigen Myelinkomponente 36K kann daher bislang nur
spekuliert werden. Eine für das Myelinprotein 36K sehr naheliegende putative Funktion ist
jedoch, daß es aufgrund seines kalkulierten isoelektrischen Punktes von pH 9,54 wie oben
bereits detailliert für die cytoplasmatischen Domänen von IP beschrieben, an der Apposition
der „major dense line“ durch elektrostatische Wechselwirkung mit sauren
Membrankomponenten beteiligt ist. Durch eine NAD-, bzw. NADP-Abhängigkeit wäre eine
regulatorische Modulation dieser Apposition denkbar.
Um erste Hinweise auf die Funktion des 36K-Proteines zu erhalten wurde im Rahmen dieser
Dissertation verschiedene Ansätze zur heterologen Expression in Eukaryoten wie in
Prokaryoten vergleichend eingesetzt. Permeabilisierte CHO-Zellen zeigten 48h nach
Transfektion eine starke granuläre Immunfärbung im Bereich des Cytoplasmas. Durch
Oberflächenmakierung konnte keine 36K-Expression detektiert werden, was den
cytoplasmatischen Charakter des 36K-Proteines unterstreicht. Im Westernblot wies das
heterolog exprimierte 36K-Protein im Vergleich zur native Form aus dem Forellenmyelin ein
etwa 0,5 bis 1 kDa kleineres apparentes Molekulargewicht auf. Bei der im Rahmen dieser
Arbeit isolierten 36K-cDNA handelt es sich offenbar um eine nicht ganz vollständige
Sequenz. Wie bereits oben im Zuge der Promotorklonierung beschrieben, befindet sich auf
der zugrundeliegenden Genstruktur strangaufwärts vom 5‘ Ende der klonierten cDNA-
Sequenz ein weiteres putatives Start-ATG im gleichen Leserahmen. Es ist daher sehr
wahrscheinlich, daß die vollständige codierende Region der 36K-cDNA am N-Terminus um
5 Aminosäuren länger ist als der isolierte Klon, was die Diskrepanz im Laufverhalten erklären
würde. Die Existenz eines entsprechenden Transkriptes konnte durch unabhängige RT-PCR-
Analysen bereits verifiziert werden. Diese N-terminale „Verlängerung“ hat keinen Einfluß auf
die vorhergesagte Sekundärstruktur des 36K-Proteines. Leider sind alle Versuche stabile
95
r36K/CHO-Expressoren zu klonieren bislang erfolglos geblieben, so daß ein möglicher
Einfluß auf das Aggregationsverhalten der Zellen im Adhäsionsassay nicht untersucht werden
konnte. Weiterführende Studien, vorallem Co-Expressoren mit IP1 bzw. IP2 könnten
interessante neue Hinweise auf die putative Funktion des Proteines ermöglichen.
Weiterhin wurde das 36K Protein als His-Tag-Fusion (36KHT) in einem E. coli und einem
Baculovirus-System exprimiert und präparativ aufgereinigt. Es zeigte sich, daß das
bakterielle System weitaus höhere Proteinausbeuten ermöglichte als das Baculovirus-System,
und ist daher zur Produktion von rekombinantem Protein im großen Maßstab gut geeignet.
36K wird in E. coli hauptsächlich in Einschlußkörpern gebildet, so daß eine Aufreinigung nur
unter denaturierenden Bedingungen in Gegenwart von chaotropen Salzen wie 6M Harnstoff
bzw. Guanidin-Hydrochlorid möglich war. Das elektrophoretische Laufverhalten des
präparierten 36KHT-Proteins weicht von dem des „nativen“ 36K aus dem Myelin der Forelle
aufgrund der „His-Tag“ Erweiterung durch zusätzliche Aminosäuren, davon 10 geladene
Histidine, in der erwarteten Weise ab. Interessanterweise war auch in dem Baculovirus-
System eine Aufreinigung nur im Gegenwart von chaotropen Salzen möglich. Da 36KHT
unter nativen Bedingungen stets zusammen mit unlöslichen Bestandteilen der Wirtszelle
durch Zentrifugation pelletiert wurde, könnte dieses ein erster Hinweis auf eine Membran-,
bzw. Cytoskelettassoziation sein, was jedoch in weiterführenden Untersuchungen geklärt
werden müßte. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation ist erstmals eine Methode etabliert
worden, die die Überexpression und präparative Aufreinigung eines Forellenmyelinproteins
ermöglichte. Diese erarbeitete methodische Basis dürfte vielfältige weiterführende Studien
zur funktionellen Bedeutung des Proteines ermöglichen. Es wären z.B. denkbar mit
renaturiertem 36KHT-Protein Bindestudien mit artifiziellen Lipidmembranen, wie oben für
die cytoplasmatische Domäne von IP2 beschrieben, durchzuführen. Darüberhinaus könnten
mit Hilfe der Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie Aussagen über die Sekundärstruktur
des renaturierten Proteins möglich sein. Hierbei wäre es von besonderem Interesse, ob eine
putative Konformationsänderung des 36K-Protein aufgrund von Interaktionen mit
Lipidvesikeln, ähnlich wie für das Basische Myelinprotein beschrieben, mit Hilfe der CD-
Spektren detektierbar wäre (KENIRY UND SMITH, 1978, CHEIFETZ ET AL. 1985). Die erzielten
Ausbeuten der heterologen Expression von 36KHT in E. coli würden es eventuell erlauben,
das Protein zu kristallisieren und seine Struktur durch Röntgenstrukturanalyse aufzuklären.
96
97
5 Zusammenfassung
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte die cDNA der IP2 Splice-Variante
vervollständigt werden. Es zeigte sich, daß der codierende Bereich exakt mit der IP1-
Splicevariante übereinstimmte, die cytoplasmatische Domäne ist jedoch um 90 bp verlängert.
Anschließend folgt eine IP2-spezifische 3‘ UTR von 133 bp Länge, die in eine beiden IP-
Splicevariante identische 3‘UTR mündet. Da den beiden IP-Isoformen der gleiche Promotor
zugrundeliegt, beide Proteine während der Myelinogenese jedoch unterschiedlich d.h.
entwicklungsabhängig exprimiert werden, ist ein Einfluß der 3‘ UTR auf die Regulation des
alternativen Splicings denkbar.
Die translatierte Aminosäuresequenz der verlängerten cytoplasmatischen Domäne der IP2-
Isoform wies, im Gegensatz zur IP1cyto-Domäne, eine auffällige Sequenzübereinstimmung
mit der cytoplasmatischen Domäne des P0-Proteins auf. Phylogenetisch konservierte
Aminosäuren sind meist basisch. Auch zwei PKC-Kinase-Stellen sind zwischen allen Spezies
konserviert, so daß man in diesem Bereich wichtige funktionelle Bereiche vermuten kann.
Beide IP Splice-Varianten konnten in CHO-Zellen exprimiert und durch Immunfluoreszenz,
sowie durch Westernblot detektiert werden. IP1/2 werden auch in der heterologen Wirtszelle
glykosiliert und in die Zellmembran integriert.
Es konnten ein Adhäsionsassay in einem mimetischen Zellsystem etabliert werden, mit dem
die adhäsive Funktion der extrazellulären Domäne der IP-Proteine charakterisiert werden
konnte. Nach Klonierung eines stabil-exprimierenden rIP1/CHO-Zellklones zeigte sich, daß
IP1 eine Adhäsion vermittelt, die zur Aggregation von bis zu zehn rIP1/CHO-Zellen führte.
Um zu untersuchen, ob die cytoplasmatische Domäne Einfluß auf die Adhäsion ausübt,
wurde eine Chimäre aus der extrazellulären und transmembranellen Domäne des IP-Proteins
und der P0cyto Domäne konstruiert und exprimiert. Stabile rIP-P0/CHO-Zellen waren im
Adhäsionsassay deutlich quantifizierbar adhäsiver. Sie bildeten Zellaggregate aus bis zu 35
Zellen. Die cytoplasmatische Domäne hat offensichtlich einen Einfluß auf die Adhäsion. Die
geringen, aber nicht-signifikanten Unterschiede im Oberflächenexpressionsniveau zwischen
rIP/CHO und rIP-P0/CHO-Zellen können die Unterschiede im Adhäsionsverhalten nicht
erklären. Die cytoplasmatischen Domänen von IP1 und vorallem von IP2 sind stark basisch,
98
d.h. positiv geladen und könnten somit durch Bindung an saure, d.h. negativ geladene
Phospholipide der Zellmembran die Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“
unterstützen. Durch die Zugabe eines spezifischen Antikörpers gegen die extrazelluläre
Domäne von IP konnte die Adhäsion von rIP-P0/CHO-Zellen vollständig inhibiert werden.
IP ist daher als typisches Adhäsionsprotein der Immunglobulin-Superfamilie einzustufen. Die
cytoplasmatische Domäne hat Einfluß auf die Adhäsion des Proteins.
Die cytoplasmatischen Domänen von IP1/2 konnten in E. coli als Peptidfragmente heterolog
exprimiert und aufgereinigt werden. Es zeigte sich, daß hierzu nur ein von drei getesteten
Expressionssytemen geeignet war. Mit der aufgereinigten IP2cyto/MBP-Fusion konnten
Bindestudien mit artifiziellen Lipidoberflächen durchgeführt werden. Zwar ist der Einfluß des
zur Aufreinigung benötigtem MBP-Fusionsanteils nicht genau quantifizierbar, doch konnten
erste experimentelle Hinweise auf eine Bindung von IP2cyto an negativ geladene
Phophatidylserin-haltige Lipidoberflächen gewonnen werden, die die obige Theorie stützen.
Eine Protein-Protein Interaktion zwischen den IP1cyto-, und IP2cyto-Domänen ist zum
derzeitigen Standpunkt eher unwahrscheinlich.
Darüber hinaus konnte die cDNA des 36K-Proteines isoliert, der korrespondierende putative
Promotor bzw. 5‘ UTR durch invers PCR kloniert, sowie die Intron/Exon-Grenzen eindeutig
kartiert werden. Somit ist die vollständige Struktur des 36K-Genes aufgeklärt. Innerhalb des
putativen 36K-Promotors konnten putative TATA-Boxen identifiziert werden, die auffällige
Ähnlichkeit zur TATA-Box des IP-Genes aufwiesen.
Das 36K-Protein besitzt keine Ähnlichkeit mit Myelinproteinen, sondern ähnelt den
NAD/NADP-abhängigen Oxido-Reduktasen. Seine Funktion ist bislang noch unklar, doch
aufgrund seines basisch-positiven Charakters könnte es wie oben beschrieben als
Membrananker bei der Apposition der cytoplasmatischen „major dense line“ beteiligt sein.
36K konnte als His-Tag-Fusion sowohl mit Hilfe eines Baculoviren-Systems als auch mit
einem von drei getesteten E. coli Systemen exprimiert und präparativ aufgereinigt werden.
Weiterführende Studien mit artifiziellen Lipidoberflächen, sowie spektroskopische Ansätze
könnten neue Einblicke in die Funktion und Struktur des Proteins ermöglichen.
99
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110
7 Anhang
7.1 Klonierung von IP1/pIRES-neo
Die Klonierung der codierenden Region der IP1 cDNA ohne poly(A)-Signale erfolgte wie
folgt: IP1-cDNA wurde HindIII verdaut, anschließend gebluntet und mit EcoRI
nachgeschnitten. Der pIRES-neo Vektor wurde mit BamHI geöffnet, anschließend gebluntet
und mit EcoRI nachgeschnitten. So konnte IP1 EcoRI/blunt gerichtet kloniert werden.
7.2 Klonierung von IP2/pIRES-neo
Da die vollständige codierende Region der IP2 cDNA durch PCR mit den Primern IP-5F und
IP2 C3-R gewonnen und in pGEM-T easy subkloniert wurde, erfolgte eine ungerichtete
Ligation in pIRES-neo über die flankierenden Not I Schnittstellen.
7.3 Klonierung von IP-P0/pIRES-neo
Die cytoplasmatische Domäne von P0 wurde mit Hilfe der PCR mit den Primern P0-fus3 ,
der eine Xba I Schnittstelle trägt und T7 an pBK-CMV mod/P0 ohne 3‘ UTR amplifiziert
Das Amplifikat trägt am 5‘ Ende eine XbaI Schnittstelle von Primer P0-fus3 und am 3‘ Ende
kurz vor der T7 Sequenz ebenfalls eine XbaI Schnittstelle, die aus der Multicloningsite des
pBK-CMV mod/P0 ohne 3‘ UTR stammt. Es wurde XbaI verdaut und in den gleichermaßen
geöffneten pBK-CMV ligiert
Es befindet sich innerhalb der codierenden Region der IP cDNA (direkt an der Grenze
zwischen Transmembransegment und cytoplasmatischer Domäne) eine BspHI Schnittstelle.
Die cDNA wurde BspHI geschnitten und mit T4-Polymerase zu blunt-ends aufgefüllt.
Anschließend wurde der Extrazellulär- und Transmembrandomäne umfassende cDNA Teil
durch EcoRI Verdau abgetrennt. Der pBK-CMV/P0cyto Vektor, der bereits wie oben
beschrieben die P0cyto Domäne trägt, wurde durch EcoRI/ScaI geöffnet. Das EcoRI/ blunt
IP-Eluat konnte so in den pBK-CMV/P0cyto ligiert werden. Da sich der IP-Teil und P0-Teil
im gleichen Leserahmen befinden, entsteht eine Proteinfusion aus IP und P0 mit einer
Linkersequenz von nur 9 bp (3 AS). Die entstandene Fusionsstelle wurde durch
Sequenzierung verifiziert. Das vollständige IP-P0 Fusionskonstrukt wurde EcoRI/SmaI
verdaut und konnte so in den oben unter 7.1 beschriebenen pIRES-neo EcoRI/blunt ligiert.
111
7.4 Klonierung von IP1 in pFastbac
Die komplette IP1-cDNA wurde über seine flankierenden EcoRI/XhoI Schnittstellen aus
pBluescript in den gleichermaßen geöffneten pFastbac-Vektor ligiert.
112
7.5 Klonierung von 36K/pIRES-hygro
Die Klonierung der codierenden Region der 36K cDNA ohne poly(A)-Signale erfolgte über
seine flankierenden BamHI/ScaI Schnittstellen aus pBluescript. Der pIRES-hygro Vektor
wurde BstXI verdaut, anschließend gebluntet und mit BamHI nachgeschnitten. So konnte
36K BamHI/blunt gerichtet kloniert werden.
7.6 Klonierung von 36KHT/Dual Fastbac
Zur Expression wurde durch PCR Mutagenese mit den Primern 36K-mal F2/36K-mal R2 an
der isolierten 36KcDNA eine BamHI vor dem Start ATG und eine Xba I Schnittstelle hinter
dem Stop-TGA eingefügt. Das PCR-Amplifikat wurde mit diesen beiden
Restriktionsenzymen geschnitten und pFastbac-HTb-Vektors mit den gleichen Enzymen
geöffnet. Auf diese Weise konnte eine His(6)-Tag-36K Fusion kloniert werden. Parallel dazu
wurde die codierende Region des Grünfluoreszierenden Proteins (GFP) aus dem
pGreenlantern Vektor (Fa. Gibco) über seine flankierenden Not I Sequenzen
herausgeschnitten, gebluntet und in die Multicloningsite II (p10 Promotor) des mit Sma I
geöffneten pFastbac Dual Vektors kloniert. Das oben beschriebene His-Tag-36K-Konstrukt
aus pFastbac HTb wurde mit Hilfe einer weiteren PCR-Mutagenese mit den Primern HTb-
F1/ 36K-mal R2 in pGEM-T easy (2.2.11) subkloniert, anschließend über seine flankierenden
Not I Schnittstellen in die Multicloningsite I des auf gleiche Weise geöffneten pFastbac-
Dual/GFP kloniert und subsidiär durch Sequenzierung auf Richtigkeit und eventuelle
Nukleotidaustausche überprüft. Das entstandene Konstrukt erlaubt die Expression des His-
Tag-36K Fusionsproteines unter der Kontrolle des konstitutiven Polyhedrin-Promotors,
sowie zeitgleich die Expression des GFP-Reportergenes unter der Kontrolle des ebenfalls
konstitutiven p10-Promotors.
113
7.7 Klonierung von 36K/pET16b
Durch PCR-gerichtete Mutagenese mit dem Vorwärts Primer 36K-CL-F4, der eine NdeI
Schnittstelle trägt und direkt am Start ATG bindet und dem 36K2R Primer entstanden PCR-
Amplifikate, die nach blunten mit T4 Polymerase mit Nde I verdaut wurde. Der pET 16b
Vektor wurde mit BamHI geöffnet, anschließend gebluntet und mit Nde I nachgeschnitten.
So konnte Nde/blunt gerichtet kloniert werden. Es entstand eine His -Tag 36K Fusion, die
durch Sequenzieren auf Richtigkeit kontrolliert wurde.
7.8 Klonierung von IP1/2cyto/pMal-C2
Durch PCR-gerichtete Mutagenese mit dem vorwärts Primer IP-Cyto F1, der am Beginn der
cytoplasmatischen Domäne beider Isoformen bindet, in Kombination mit den reversen
Primern IP-4E-mal (für IP1) bzw. IP2-C3-malR (für IP2), entstanden PCR-Fragmente, die
114
am 5‘ Ende eine eingefügte EcoRI, am 3‘ Ende eine Hind III Schnittstelle besaßen. Diese
Amplifikate wurden EcoRI/Hind III verdaut, der Restriktionsansatz über Qiagen PCR
Purification Kit aufgereinigt und in den gleichermaßen vorbereiten pMAL-C2 Vektor
kloniert. Das entstandene Konstrukt wurde durch PCR und Restriktionsverdau, sowie durch
Sequenzierung auf Richtigkeit kontrolliert.
7.9 Abkürzungsverzeichnis% v/v Volumenprozente% w/v Gewichtsprozenteµ mikroADP AdenosindiphosphatAmp Ampicillinbp BasenpaarBSA RinderserumalbumincDNA komplementäre DesoxyribonukleinsäureDNA DesoxyribonukleinsäuredNTP 2’-DesoxyribonukleosidtriphosphatE. coli Escherichia coliEDTA Etylendiamintetraessigsäureg 1x ErdanziehungskraftHis-tag Histidin-„tag“ (engl. für Fortsatz, Anhang)IPcyto (bzw. IP2, P0) cytoplasmatische Domäne des IP1, bzw. IP2, P0-ProteinesIPTG Isopropylthiogalaktosidkb Kilobase(n)kDa Kilo-Daltonm milliM molarMBP Maltose-Binde-ProteinMCS „Multiple Cloning Site“ (multiple Klonierungsstelle)mRNA „Messenger“-RibonukleinsäureNAD(P) Nicotinamid-adenin-dinukleotid(-phosphat)OD600 optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nmPAGE Polyacrylamid-GelelektrophoresePCR „Polymerase Chain Reaction“ (Polymerase-Kettenreaktion)PEG PolyethlenglykolPLP ProteolipidproteinPNS peripheres Nervensystemr ResistenzgenRif RifampicinrIP1/CHO bzw. IP-P0 rekombinant exprimiertes IP1 bzw. IP-P0 in CHO-ZellenRNA Ribonukleinsäurerpm Umdrehung pro MinuteSDS Natrium-(„Sodium“-)dodecylsulfatTCA TrichloressigsäureTet TetrazyklinTris Tris-HydroxymethylaminomethanUTR untranslatierte RegionZNS zentrales Nervensystem
115
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Meeting „Myelination and Myelin Disorders: New Vistas“ Rügen, Deutschland (1999)
2 Material und Methoden............................................................................................... 7
2.1 Material............................................................................................................................ 72.1.1 Bakterienstämme....................................................................................................................72.1.2 Plasmide.................................................................................................................................82.1.3 Larvenstadien und Jungfische der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss).........................82.1.4 Zellinien .................................................................................................................................82.1.5 Chemikalien ...........................................................................................................................92.1.6 Medien zur Anzucht von Bakterien.........................................................................................92.1.7 PCR Primer .......................................................................................................................... 10
2.2 Methoden ....................................................................................................................... 112.2.1 Bakterienkulturen/Kryokonservierung von Bakterienkulturen ............................................... 112.2.2 Plasmidpräparationen ........................................................................................................... 112.2.3 RNA/DNA-Quantifizierung durch Methylen-Blau-Spot-Test ................................................ 122.2.4 RNA/DNA-Quantifizierung durch Photometrie..................................................................... 132.2.5 Restriktion von DNA mit Restriktionsendonukleasen............................................................ 132.2.6 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................... 132.2.7 Gelextraktionsmethoden ....................................................................................................... 132.2.8 Klonierungen........................................................................................................................ 142.2.9 Herstellung von glatten Enden mit T4 Polymerase („blunting“) ............................................ 152.2.10 Reinigung von DNA Fragment aus wäßrigen enzymatischen Lösungen ................................ 152.2.11 Klonierung von PCR-Produkten / pGEM-T easy................................................................... 162.2.12 Plasmid Transformation........................................................................................................ 162.2.13 Polymerase-chain-reaction (PCR)-Techniken........................................................................ 172.2.14 Chemolumineszenzdetektion/ ECL-Kit (Fa. Amersham)....................................................... 202.2.15 Alkalische Phosphatase-NBT/BCIP-Farbreaktion ................................................................. 202.2.16 Alkalische Phophatasenachweis mit CSPD (Fa. Boehringer)................................................. 212.2.17 Peroxidasenachweis mit 4-Chloro-1-Naphtol (4CN) (nach Sambrock).................................. 212.2.18 Screening einer λ-UNI ZAP-cDNA Libary mit DIG markierten DNA-Sonden...................... 212.2.19 In vivo excision positiver cDNA/Phagen-Klone.................................................................... 222.2.20 Heterologe Expression in Insektenzellen mit Baculoviren / Bac-to-Bac-System (Fa.Gibco) ... 232.2.21 Heterologe Expression in E. coli /pMAL-System (Fa. NEB) ................................................. 262.2.22 Affinitätschromatographie mit Amylose-Beads (pMAL-System) ........................................... 272.2.23 Heterologe Expression in E. coli/pET-System (Fa. Novagen) ................................................ 272.2.24 Affinitätschromatographie mit Ni2+-chelatierender Sepharose............................................... 282.2.25 Aufschluß von Einschlußkörpern (inclusion bodies).............................................................. 282.2.26 Affinitätschromatographie mit Farbsepharosen (reactive-red, Fa. Merck).............................. 292.2.27 Heterologe Expression in E. coli /IMPACT-System (Fa. NEB)............................................. 292.2.28 Proteinbestimmung (nach Bradford, 1979)............................................................................ 292.2.29 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz-Tüpfel Test.............................................................. 302.2.30 Proteinfällung mit Aceton..................................................................................................... 302.2.31 Proteinfällung mit TCA........................................................................................................ 302.2.32 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (nach Laemmli) .................................. 302.2.33 Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Native-PAGE)...................................................... 312.2.34 Proteintransfer auf Nitrozellulosemembran (Westernblot) ..................................................... 312.2.35 Immunologischer Nachweis von Proteinen auf Nitrozellulosemembran................................. 312.2.36 Zellaggregations/Adhäsionstest............................................................................................. 322.2.37 Trypan-Blau-Ausschlußtest................................................................................................... 332.2.38 ELISA zur Quantifikation extrazellulärer IP-Proteindomänen............................................... 33
117
2.2.39 Protein-Phospholipid-Bindungstudien mit Transil-Kügelchen (Fa. Nimbus) ......................... 342.2.40 Protein-Protein-Bindungsstudien („overlay-assay“) ............................................................... 342.2.41 DNA-Transfer auf positivierter Nylonmembran (Southern-Blot) ........................................... 342.2.42 Radioaktive DNA-Kettenabbruch-Sequenzierungen (nach Sanger)....................................... 352.2.43 Auftragssequenzierungen...................................................................................................... 352.2.44 Computergestützte Sequenzanalysen..................................................................................... 352.2.45 Eukaryotische Zellkulturlinien .............................................................................................. 362.2.46 Subkultivieren („passagieren“) von Säuger-Zellkulturen ....................................................... 362.2.47 Subkultivieren („passagieren“) von Insektenzellen ................................................................ 362.2.48 Kryokonservierung von eukaryotischen Zellinien.................................................................. 372.2.49 Transfektionen von Säugerzellen /Transfectam Methode ...................................................... 372.2.50 Transfektion von Insektenzellen/ Cellfectin (Gibco).............................................................. 372.2.51 Hygromycin und G-418 („Geneticin“) Selektion /Stabile Transfektion mit pIRES-neo.......... 372.2.52 Dynabead oligo d(T)-mRNA-Isolierungen aus Hirngewebe................................................. 382.2.53 cDNA Erststrangsynthese (Reverse Transkription)................................................................ 392.2.54 Immunocytochemie/indirekte Immunfluoreszenz .................................................................. 40
3.1 Isolierung der vollständigen cDNA Sequenz für das IP2-Protein.................................. 423.1.1 Aminosäuresequenz der vollständigen cytoplasmatischen Domäne von IP2 .......................... 44
3.2 Untersuchungen zur Funktion von IP1/2 als Adhäsionsmolekül.................................... 453.2.1 Aufbau eines Adhäsionsassays .............................................................................................. 463.2.2 Heterologe transiente Expression von IP1 und IP2 in CHO-K1-Zellen .................................. 483.2.3 Klonierung von stabil-transfizierten rIP1/CHO-K1-Zellen .................................................... 503.2.4 Adhäsion von rIP1/CHO-Zellen unter definierten Bedingungen............................................ 503.2.5 Konstruktion einer IP-P0-Chimäre........................................................................................ 523.2.6 Stabile Expression und Adhäsionsverhalten von rIP-P0/CHO-Zellen .................................... 523.2.7 Vergleichende Quantifizierung der Oberflächenexpression ................................................... 553.2.8 Inhibierung der Zell/Zell-Adhäsion von rIP-P0/CHO durch Antikörper ................................ 563.2.9 Heterologe Expression und Adhäsion von IP1 in Insektenzellen............................................ 58
3.3 Heterologe Expression der cytoplasmatischen Domänen von IP1 und IP2 in E. coli .... 593.3.1 Bindestudien von MBP/IP2cyto an phospholipidbeschichteten Trägermatrices (Transil) ....... 603.3.2 Untersuchung zu Protein-Protein-Wechselwirkungen von IP1/2cyto..................................... 61
3.4 Isolierung der cDNA Sequenz für das 36K- Protein...................................................... 633.4.1 Aminosäuresequenz des 36K-Proteins................................................................................... 65
3.5 Untersuchungen zur 36K-Genstruktur durch PCR....................................................... 683.5.1 Diskrepanz zwischen isolierter und vorhergesagter 36K-Sequenz ......................................... 713.5.2 Klonierung einer putativen Promotorregion des 36K-Genes durch „inverse PCR“................. 72
3.6 Heterologe Expression der isolierten 36K cDNA in CHO-K1 ...................................... 74
3.7 Expression in E. coli (pET-System) ............................................................................... 753.7.1 Alternative Aufreinigung von His-Tag-36K durch Affinitätschromatographie mitFarbsepharosen .................................................................................................................................... 77
3.8 Expression in Insektenzellen / Baculovirus-System ....................................................... 77
1982 - 1989 Angelaschule Osnabrück, Abschluß mit Abitur
1989 - 1990 Grundwehrdienst im Jägerbataillon 522 in Fürstenau
Studium
10/90 – 4/96 Immatrikulation an der Universität Osnabrück Fach: Biologie/Diplom
Diplomarbeit mit dem Thema: „Heterologe Expression vonMyelinproteingenen aus dem ZNS der Forelle in OLN- 93 Zellen derRatte“
23.4.96 Erfolgreicher Abschluß und Verleihung des akademischen Grades desDiplom Biologen
Promotion
5/96 bis 12/99 wissenschaftlicher Angestellter an der Universität Osnabrück imSonderforschungsbereich 171
5/96 bis 3/00 Doktorand in der Arbeitsgruppe Zoophysiologie, Anfertigung derDissertation unter der Leitung von Prof. Dr. G. Jeserich mit dem Thema:„Heterolge Expression und funktionelle Grundcharakterisierung vonMyelinproteinen aus dem ZNS der Regenbogenforelle (Oncorhynchusmykiss)“
120
Eidesstattliche Versicherung
Ich versichere, daß ich die vorliegende Dissertation entsprechend § 3 Absatz 2 der
Promotionsordnung selbständig und ohne unerlaubte Hilfe verfaßt und die benutzten
Hilfsmittel vollständig angegeben habe.
Ich versichere, daß ich weder an der Universität Osnabrück noch anderweitig versucht habe,
eine Dissertation einzureichen oder mich einer Doktorprüfung zu unterziehen.