HEMOGRAMA AUTOMATIZADO BQCO. GONZALO OJEDA HEMATOLOGÍA CLÍNICA FaCENA – UNNE 2013
TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO
Sangre entera(EDTA-K3)Volumen requeridoProcesamiento dentro de las 8 hConservar refrigeradaTemperatura ambiente
PRINCIPIOS DE MEDICION
Impedancia EléctricaEspectrometría de AbsorciónCitometría de FlujoDispersión ópticaFluorescenciaCitoquímica: Peroxidasa
EQUIPOS
IMPEDANCIA + ESPECTROMETRÍA ABSORCIÓN : COULTER (RBC-INDICE HEMATIMÉTRICOS – PLT – WBC – HB)IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN: 3 DIFFIMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA + DISPERCIÓN DE LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS 5 DIFF
IMPEDANCIA ELECTRÓNICA Y RADIOFRECUENCIAImpedancia electrónica o la resistencia a la corriente continua (cc) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuenciaLa radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC.
IMPEDANCIA ELECTRÓNICAEl principio de impedancia en el recuento de células se basa en la detección y medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad ,se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio
Impedancia VolumétricaN° Pulsos :proporcional al N° de célulasAmplitud del pulso :proporcional al tamaño de la célula
El numero de pulsos es proporcional al numero de células contadas
El tamaño del pulso de voltaje es proporcional al tamaño de la célula (volumen)
Lo que permite la discriminación y el conteo de células de tamaño especifico
Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de pulsos
Los datos se trazan en un grafico de distribución de frecuencias o histograma de distribución de tamaño con el numero relativo en el eje de las y el tamaño ( numero del canal equivalente al tamaño especifico) en el eje de las x
El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.
Limite flotante para división de PLQ/RBC Media
MCV
Ancho de Distribución
Conteo por impedancia: RBC y PLT
50 100 150 200 250 300 350
MCV
Zona Microcitica.
Zona Macrocitica.
PLQ's
Linfocitos.
50 100 150 200 250 300 350
PLQ'sAncho de Distribución Eritrocítica.
Conteo por impedancia: RBC y PLT.
ADE – RDW – INDICE DE ANISOCITOSISLa amplitud de distribución eritrocitaria (RDW) se calcula a partir del histograma como el coeficiente de variación de la distribución del volumen eritrocitario. Con valores de referencia de 11.5-14 %El RDW es un índice de anisocitocis, que en realidad refleja la relación entre la desviación estándar y el VCMEl VCM es un promedio tomado de los datos de distribución eritrocitaria de tamaño.
¿Qué significa RDW?
“RDW – Ancho de la distribución de la curva de los eritrocitos ”
Dos fórmulas matemáticas usadas para describir la variación de tamaño de los eritrocitos (Anisocitosis).
RDW-CV
Definición: Es el coeficiente de variación alrededor de la media (X) correspondiente a la curva de distribución del volumen de los glóbulos rojosVR: 11.5 – 14 %
RDW-SD
Definición: Medida directa (en fl) del ancho de lacurva de los glóbulos rojos (RBC) Tomada 20%arriba de la línea base
El ancho es medido al 20% de la altura relativa. Aesta altura es donde se encuentra la mayorvariación de tamaños de las células
RDW-SD
Tamaño de los Eritrocitos en fl
20%
Alturarelativa
Histograma de Eritrocitos
La curva más anchaRepresenta a la poblaciónCon mayor anisocitosis
FACTORES QUE PRODUCEN INTERFERENCIA
FACTORES PARÁMETROAFECTADO
Crioaglutinina GR ,VCM ,CHCM Aglutinaciòn de GR
Lipemia ,ictericia ,quilomicrones
Hb HbCM La turbidez afecta la lectura espectrofotomètrica
Hemólisis GR , Hto Gr lisados y no contados
GR resistentes a la lisis con Hb anormales
GB , Hb Gr (Hb : S,C,F) no pueden lisarse y se cuentan como GB
Microcitosis o esquistocitos
GR El tamaño eritrocitario < que el umbral
GR nucleados ,fragmento de Megacariocitos
GB Se cuentan como GB
2 fl Plaquetas
Límite para la zona de plaquetas.
Zona para cálculo del . VPM
Límite flotante para división de PLQ/RBC
35 fl
Histograma de plaquetas.
5 10 15 20 25 30 352
Histograma normal de plaquetas.El punto de partida debe ser 2 fl en la base del histograma.
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.
5 10 15 20 25 30 352
Histograma normal de plaquetas.
El VPM es la media aritmética de la población de plaquetas.No será calculado en presencia de alertas de plaquetas.
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.
5 10 15 20 25 30 352
Histograma normal de plaquetas.
El histograma debe hacerse asintótico con la horizontal hacia los 25-30 fl
INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.
RECUENTO DE LEUCOCITOS El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens. Los impulsos eléctricos detectados son clasificados y
almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho
SOBREESTIMACIÓN POR PRESENCIA DE ERITROBLASTOS Ej: WBC 30.000 /mm3
200 eritroblastos por cada 100 GB
300 (WBC+EB)-----------10030.000 ---------------------x=10.000
Gb corregidos= Gb contador – (Gb contador x 100)(EB+100)
50 100 150 200 250 300 350
Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia.
Conteo por impedancia: WBC.
50 100 150 200 250 300 350
Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. LIM MID GRAN
Conteo por impedancia: WBC.
50100 150 200 250 300 350
Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia.
Ubicación Normal del pico LIM es entre 50-75 fl
Conteo por impedancia: WBC.
50 100 150 200 250 300 350
Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia.
MID La región MID debe ser un valle entre las regiones LIM y GRAN.
Conteo por impedancia: WBC.
DOSAJE DE HEMOGLOBINASe utiliza el sobrante de la dilución con que se realizó el conteo de WBC.Método de la CianmetahemoglobinaSe realiza la lectura en la celda de hemoglobina a 540 nm con un blanco para cada muestra.El valor de absorbancia obtenido se interpola en la curva de calibración almacenada en el instrumento.
Una corriente de muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular por el que pasa una fuente de luz centrada (un láser de helio neón polarizado en sentido vertical). La luz dispersada se divide en varios ángulos
Se utilizan varias combinaciones de estas mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitaria principales :neutrófilos ,linfocitos ,monocitos , eosinófilosy basófilos
Enfoque hidrodinámicoMinimiza la acumulación de proteínasElimina la circulación retrogradaReduce la irregularidad de la altura de pulsoReduce la perdida por pasaje coincidente
Enfoque analíticoIluminado por medio de un laser helio neón
Enfocado hidrodinámicamente a traves de una celda de flujo de diseño especial
Medición de las carácteristicas de dispersión óptica de la luz para las celdas individuales
Separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S).
-La dispersión frontal de luz 0° :se usa para determinar el TAMAÑO CELULAR (FORWARD SCATTER)
-La dispersión ortogonal de 90° : para determinar la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER)
-La dispersión de la luz en ángulo estrecho de 10°:se correlaciona con COMPLEJIDAD CELULAR (SIDE SCATTER)
-La dispersión de luz despolarizada de 90° (90D)para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.
El citograma MAPSS final muestra los eventos de celdas individuales los cuales se definen por medio del uso del color
La muestra una vez tratada es dirigida a una celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseño hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan formados uno a uno y en donde se realizan las siguientes mediciones
VolumenMediante impedancia de baja frecuencia se determina el
volumen de la célula Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)
ConductividadLa densidad interna de la célula es proporcional al
tamaño del pulso o al cambio de la señal de Radiofrecuencia RF(ola resistencia a la corriente magnética de alta
voltaje)
Los cambios de voltaje de CC y RF pueden detectarse en forma simultánea
Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se formaUn citograma de distribución bidimensional ,este trazado de dispersión muestra poblaciones celulares como cúmulos <por análisis computarizado se determinan los recuentos celulares
DF1: Volumen vs. Scatter
El trazado de dispersión de la función de discriminación DF1 del volumen vs dispersión de la luz muestra. una separación clara de Nt ,L y, Mo, Eo
Descripción del Cell Dyn 3200Tecnología óptica :PLT,WBC;RBCTecnología diferencial MAPSSReticulocitos
Tecnología para HemoglobinaReactivo libre de cianuro Grupo hidrofóbico del SLS que se une a la molécula de la globina Ocurre un cambio de configuración Oxidación de Fe 2+ --> Fe 3+
Grupos Hidrofílicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb
Fe 2+ Fe 3+Fe 3+
SLS
Sysmex XS-1000iTecnologíaEn los Xs el Hto se mide electrónicamente, basado en el principio de que el pulso producido cuando un Gr pasa a través de la apertura es proporcional al volumen de la célula
El Hto se determina comparando el volumen total o acumulado de Gr con el volumen de sangre completa en la dilución
Por Citometría de Flujo se obtiene información acerca de la composición y madurez celular
Dispersión lateral
Información del contenido de RNA y DNA
Información de la estructura interna
Tamaño de la célula
Dispersión frontal
Fluorescencia
Láser
Cuantificación de Gránulos InmadurosInformación útil sobre el diferencial extendido de leucocitos
IG:promielocitosmielocitosmetamielocitos
promielo mielo metamieloBlastos bandas segmentos
Maduración de neutrófilos
IG
Cuantificación de Gránulos InmadurosIG Master
Canal del diferencial
IG % , #
Normal
Dispersión lateral
Análisis óptico de las plaquetasPor medio del uso de
un enfoque de dispersión óptica de la luz con ángulo dual se logra una buena separación de los GR y las plqAdemas , la
presencia de los cúmulos de plq se puede detectar en forma confiable
Medida de los eritroblastos
Los EB son contados y separados de los WBC basados en su tamaño y cantidad de fluorescencia
Recuentos de Reticulocitos
Método de Referencia: Azul de MetilenoVariación entre observadoresAltos coeficientes de variaciónLaboriosos
Métodos automatizadosAzul de metilenoFluorescentes
Canal reticulocitos - Fluorescente
Fl alta
Fl baja
Fl muy alta
Tinción: Polimetino: ARNOxazina: ADN
RET
WBC
RBC
RETSEARCH II (Diluyente + Colorante)
Utilidad Clínica - FIR.Confirmación de Anemia Aplástica.Permite la clasificación de anemias por su capacidad eritropoyética.Talasemia vs. deficiencia de Hierro.Anemia de los procesos crónicos.Hipoproducción vs. respuesta eritroide
temprana.Detección de implante correcto luego de transplante
Contenido de Hb de los reticulocitosRet-He
Reticulocitos con contenido de Hb<28pg HipocrómicosSon identificados con colorantes fluorescentes por la posición en el dispersograma de acuerdo con la fluorescencia y la luz dispersada frontalmente