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B i o c h e m . J . ( 1 9 7 1 ) 1 2 5 , 5 4 1 - 5 4 4P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

The E f f e c t o f A c e t o a c e t a t e o n Plasma I n s u l i n C o n c e n t r a t i o nBY R . A . HEAWKINS, K. G . M. M . ALBERTI, C . R . S . HOUGHTON,D . H . WILLIAMSON " A D H . A . KREBS

M e t a b o l i c R e s e a r c h L a b o r a t o r y , N u f f i e l d D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l M e d i c i n e , R a d c l i f f e I n f i r m a r y ,O x f o r d OX2 6HE, U . K .( R e c e i v e d 1 5 J u l y 1 9 7 1 )

1 . Sodium a c e t o a c e t a t e was i n f u s e d i n t o t h e i n f e r i o r v e n a c a v a o f f e d r a t s , 4 8 h -s t a r v e d r a t s , and f e d s t r e p t o z o t o c i n - d i a b e t i c r a t s t r e a t e d w i t h i n s u l i n . A r t e r i a lb l o o d was o b t a i n e d f r o m a f e m o r a l a r t e r y c a t h e t e r . 2 . A c e t o a c e t a t e i n f u s i o n c a u s e da f a l l i n b l o o d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n i n f e d r a t s f r o m 6 . 1 6 t o 5 . 1 1 mm i n 1 h , w h e r e a sno c h a n g e o c c u r r e d i n s t a r v e d o r f e d - d i a b e t i c r a t s . 3 . P l a s m a f r e e f a t t y a c i d sd e c r e a s e d w i t h i n 1 0 m i n , f r o m 0 . 8 2 t o 0 . 6 4 m e q u i v . / l i n f e d r a t s , 1 . 1 6 t o 0 . 7 9 m e q u i v . /1 i n s t a r v e d r a t s and 0 . 8 3 t o 0 . 6 5 m e q u i v . / l i n f e d - d i a b e t i c r a t s . 4 . At 1 0 m i n t h ep l a s m a c o n c e n t r a t i o n r o s e f r o m 2 0 t o 4 9 . 9 , u u n i t s / m l i n f e d u n a n a e s t h e t i z e d r a t s an df r o m 6 . 4 t o 1 8 . 5 p u n i t s / m l i n s t a r v e d r a t s . T h e r e was n o c h a n g e i n i n s u l i n c o n c e n t r a -t i o n i n t h e d i a b e t i c r a t s . 5 . N e m b u t a l - a n a e s t h e t i z e d f e d r a t s had a more markedi n c r e a s e i n p l a s m a i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n , f r o m 3 0 t o 1 0 1 j , u u n i t s / m l w i t h i n 1 0 m i n .6 . A f a l l i n b l o o d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n i n f e d r a t s and a d e c r e a s e i n f r e e f a t t y a c i d si n b o t h f e d an d s t a r v e d r a t s i s t o b e e x p e c t e d a s a c o n s e q u e n c e o f t h e i n c r e a s e i np l a s m a i n s u l i n . 7 . The f a l l i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e f a t t y a c i d s i n d i a b e t i c r a t sm a y b e d u e t o a d i r e c t e f f e c t o f k e t o n e b o d i e s o n a d i p o s e t i s s u e . A s i m i l a r e f f e c ton f r e e f a t t y a c i d s c o u l d a l s o b e o p e r a t i v e i n n o r m a l f e d o r s t a r v e d r a t s .

E x p e r i m e n t a l e l e v a t i o n o f t h e b l o o d c o n c e n t r a -t i o n s o f 3 - h y d r o x y b u t y r a t e o r a c e t o a c e t a t e i n manys p e c i e s c a u s e s a d e c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o fg l u c o s e an d p l a s m a f r e e f a t t y a c i d s ( N e p t u n e , 1 9 5 6 ;M a d i s o n , M e b a n e , Unger & o c h n e r , 1 9 6 4 ; B a l a s s e ,C o u t u r i e r & F r a n c k s o n , 1 9 6 7 ; B j o r n t o r p &S c h e r s t 6 n , 1 9 6 7 ; S e n i o r & L o r i d a n , 1 9 6 8 ; D e v e -c e r s k i , P i e r c e & F r a w l e y , 1 9 6 8 ) and an i n c r e a s e i np l a s m a i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s ( M a d i s o n e t a l . 1 9 6 4 ;P i - S u n y e r , C a m p b e l l & H a s h i m , 1 9 7 0 ) . The r i s e i nt h e i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s , h o w e v e r , h a s n o t b e e no b s e r v e d u n d e r a l l c o n d i t i o n s ( B a l a s s e e t a l . 1 9 6 7 ;B a l a s s e & Ooms, 1 9 6 8 ; D e v e c e r s k i e t a l . 1 9 6 8 ;L o r i d a n & S e n i o r , 1 9 7 0 ; S e n i o r & L o r i d a n , 1 9 6 8 ) .I n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s , where c i r c u l a t i n gk e t o n e - b o d y c o n c e n t r a t i o n s o f f e d r a t s were r a i s e dby i n f u s i n g a c e t o a c e t a t e , i t was n o t e d t h a t t h eg l u c o s e c o n c e n t r a t i o n was l o w e r t h a n n o r m a l i nf e d r a t s ( H a w k i n s , W i l l i a m s o n &K r e b s , 1 9 7 1 ) .F u r t h e r e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h i s o b s e r v a t i o nc o u l d b e a c c o u n t e d f o r by a s t i m u l a t o r y e f f e c t o fa c e t o a c e t a t e on i n s u l i n s e c r e t i o n a s d e s c r i b e d by t h ep r e v i o u s w o r k e r s . E x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h ep r e s e n t paper show t h a t i n f u s i o n o f a c e t o a c e t a t ei n t o f e d r a t s a t r a t e s s u f f i c i e n t t o m a i n t a i n k e t o n e -body c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 2 and 3 m l o r between6 and 7mM n i f o r m l y r e s u l t e d i n e l e v a t e d p e r i p h e r a li n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s . O t h e r c h a n g e s i n metabo-

l i t e c o n c e n t r a t i o n s were a s e x p e c t e d i n t h e pre s e nceo f i n c r e a s e d i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s .

MATERIALS AND METHODSR a t 8 . F e m a l e r a t s o f t h e W i s t a r s t r a i n w e i g h i n g 2 0 0 -2 5 0 g were u s e d . They had f r e e access t o f o o d u n l e s so t h e r w i s e i n d i c a t e d .R e a g e n t s a n d a n a l y t i c a l m e t h o d s . 1 2 5 I - l a b e l l e d i n s u l i n

was o b t a i n e d f r o m Abbott L a b o r a t o r i e s , North C h i c a g o ,I l l . , U . S . A . G u i n e a - p i g a n t i - i n s u l i n serum was a g i f t f r o mDr P . H . W r i g h t , U n i v e r s i t y o f I n d i a na S c h o o l o f M e d i -c i n e , I n d i a n a p o l i s , I n d . , U . S . A . G o a t a n t i - g u i n e a - p i gserum a n d p r o t a m i n e z i n c i n s u l i n were o b t a i n e d fromW e l l c o m e L a b o r a t o r i e s , B e c k e n h a m , K e n t , U .K . S t r e p t o -z o t o c i n was a g i f t o f t h e U p j o h n C o . , K a l a m a z o o , M i c h . ,U . S . A . Ra t i n s u l i n was o b t a i n e d f r o m N o v o , C o p e n h a g e n ,D e n m a r k .Sodium a c e t o a c e t a t e f o r i n f u s i o n was p r e p a r e d frome t h y l a c e t o a c e t a t e as d e s c r i b e d by Krebs & E g g l e s t o n( 1 9 4 1 ) . I t c o n t a i n e d no e t h a n o l when a n a l y s e d by t h emethod o f D i c k i n s o n & a l z i e l ( 1 9 6 7 ) .D e t e r m i n a t i o n o f m e t a b o l i t e s a n d i n s u l i n . The f o l l o w i n gm e t a b o l i t e s were d e t e r m i n e d i n whole b l o o d by standarde n z y m i c m e t h o d s : l a c t a t e an d p y r u v a t e ( H o h o r s t ,K r e u t z & B u i c h e r , 1 9 5 9 ) ; a c e t o a c e t a t e a n d 3 - h y d r o x y -b u t y r a t e ( W i l l i a m s o n , M e l l a n b y &K r e b s , 1 9 6 2 ) ; g l u c o s e( S l e i n , 1 9 6 3 ) . F r e e f a t t y a c i d s were determined i n p l a s m a( I t a y a &U i , 1 9 6 5 ) , as was i n s u l i n ( M o r g a n &L a z a r o w ,1 9 6 3 , a s m o d i f i e d by S o e l d n e r &S l o a n e , 1 9 6 5 ) . Ra t i n s u l i nwas u s e d as a r e f e r e n c e s t a n d a r d .

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R . A . H A W K I N S AND OTHERSD i a b e t i c r a t e . R a t s w e r e made d i a b e t i c b y i n j e c t i o n o f150mg o f s t r e p t o z o t o c i n / k g i n t o t h e t a i l v e i n , a d o s es u f f i c i e n t t o e l i m i n a t e p a n c r e a t i c , B - c e l l f u n c t i o n ( J u n o d ,L a m b e r t , S t a u f f a c h e r & R e n o l d , 1 9 6 9 ) . On e d a y a f t e ri n j e c t i o n , a l l r a t s w e r e s e v e r e l y d i a b e t i c w i t h u r i n e g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n s o f g r e a t e r t h a n 0 . 5 % ( C l i n i s t i x t e s t , M i l e sL a b o r a t o r i e s L t d . , E l k a r t , I n d . , U . S . A . ) . T h e y w e r e t h e ng i v e n 2 - 3 u n i t s o f p r o t a m i n e z i n c i n s u l i n a t 4 . 3 0 p . m . e a c h

d a y f o r a p e r i o d o f 7 d a y s . The d o s e w a s a d j u s t e d t o e a c hr a t ' s r e q u i r e m e n t o n t h e b a s i s o f w e i g h t m a i n t e n a n c e a n dt h e p r e s e n c e o f g l u c o s e a n d k e t o n e b o d i e s i n t h e u ri ne a st e s t e d w i t h C l i n i s t i x a n d K e t o s t i x . T h e r a t s l o s t ana v e r a g e o f 1 2 g t h e f i r s t d a y b u t m a i n t a i n e d c o n s t a n tw e i g h t t h e r e a f t e r .I n f u s i o n o f a c e t o a c e t a t e a n d c o l l e c t i o n o f b l o o d . Tw o d a y sb e f o r e t h e e x p e r i m e n t t h e r a t s w e r e p l a c e d i n r e s t r a i n i n gc a g e s t o a l l o w f a m i l i a r i z a t i o n w i t h t h e c a g e c o n d i t i o n s .On t h e p e n u l t i m a t e d a y t h e r a t s w e r e a na e s t h e t i z e d w i t hd i e t h y l e t h e r a n d c a t h e t e r s w e r e p l a c e d i n t h e f e m o r a la r t e r y a n d v e i n a s p r e v i o u s l y d e s c r i be d ( H a w k i n s e t a l .1 9 7 1 ) . A c e t o a c e t a t e w a s i n f u s e d a t e i t h e r 1 5 0 , u m o l / m i np e r k g f o r 1 0 m i n a n d 7 5 , u m o l / m i n p e r k g t h e r e a f t e r t op r o d u c e b l o o d c o n c e nt r a t i o ns o f k e t o n e b o d i e s i n f e d r a t sc o m p a r a b l e w i t h t h o s e o c c u r r i n g a f t e r 4 8 h s t a r v a t i o n( 2 - 3 mx) o r a t r a t e s d o u b l e t h o s e s t a t e d t o p r o d u c ea b n o r m a l l y h i g h k e t o n e - b o d y c o n c e n t r a t i o n s ( 6 - 7 m m ) .B l o o d ( 0 . 2 5 - 0 . 4 5 m l ) was s a m p l e d a t i n t e r v a l s f r o m t h ea r t e r i a l c a t h e t e r a n d c o a g u l a t i o n w a s r e t a r d e d b y a d d i n g0 . 2 m n e u t r a l ED TA t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 3 - 5 m M .B e t w e e n s a m p l i n g t h e c a n n u l a e w e r e k e p t o p e n w i t h0 . 1 5 4 m - N a C l . T h e t o t a l amount o f b l o o d r e m o v e d f r o m ar a t n e v e r e x c e e d e d 1 . 8 m l . A p o r t i o n ( 0 . 1 m l ) o f t h e b l o o dwas a c i d i f i e d i n 2 m l o f 0 . 3 M - H C 1 0 4 f o r m e t a b o l i t em e a s u r e m e n t s . T h e p l a s m a f r o m t h e r e m a i n d e r w a ss e p a r a t e d i m m e d i a t e l y b y c e n t r i f u g a t i o n f o r m e a s u r e -ment o f f r e e f a t t y a c i d s a n d i n s u l i n .

A n a e s t h e t i z e d r a t e . A l l e x p e r i m e n t s w e r e d o n e o nc o n s c i o u s r a t s w i t h t h e e x c e p t i o n o f o n e g r o u p w h i o h w e r e

a n a e s t h e t i z e d w i t h 3 0 m g o f f r e s h l y m a d e N e m b u t a la q u e o u s s o l u t i o n / k g a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y 4 5 m i nb e f o r e i n f u s i o n .R E S U L T S

B l o o d m e t a b o l i t e c o n c e n t r a t i o n s i n r e s t r a i n e d ,c a t h e t e r i z e d r a t s . The method by w h i c h b l o o ds a m p l e s a r e t a k e n and t h e t r e a t m e n t o f r a t s m a ya f f e c t m e t a b o l i t e c o n c e n t r a t i o n s . T a b l e 1 c o n t a i n s ac o m p a r i s o n o f m e t a b o l i t e c o n c e n t r a t i o n s o f mixedb l o o d f r o m u n a n a e s t h e t i z e d d e c a p i t a t e d r a t s ,a r t e r i a l b l o o d o f f r e s h l y a n a e s t h e t i z e d r a t s (50mgo f N e m b u t a l / k g a d m i n i s t e r e d 3 0 - 4 S m i n b e f o r es a m p l i n g ) and a r t e r i a l b l o o d o f c o n s c i o u s r e -s t r a i n e d r a t s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e M a t e r i a l sand M e t h o d s s e c t i o n .The c o n c e n t r a t i o n s o f g l u c o s e and f r e e f a t t y a c i d sd i d n o t d i f f e r b e t w e e n t h e v a r i o u s c o n d i t i o n s i ne i t h e r t h e f e d o r t h e s t a r v e d g r o u p .B l o o d f r o m d e c a p i t a t e d r a t s was p r i m a r i l y v e n o u sand t h e l a c t a t e c o n c e n t r a t i o n s w e r e h i g h e r t h a na r t e r i a l b l o o d i n b o t h f e d and s t a r v e d r a t s . T h i s i sp r o b a b l y d u e t o a n o x i a and t h e c o n s e q u e n t h i g hr a t e o f l a c t a t e p r o d u c t i o n t h a t i n e v i t a b l y o c c u r sa f t e r d e c a p i t a t i o n . The a r t e r i a l l a c t a t e c o n c e n t r a -t i o n o f f e d r e s t r a i n e d r a t s was a b o u t h a l f t h a t o ff e d a n a e s t h e t i z e d r a t s . S t a r v e d r e s t r a i n e d r a t s hada r t e r i a l l a c t a t e c o n c e n t r a t i o n s a b o u t 6 7% h i g h e rt h a n b l o o d o f a n a e s t h e t i z e d r a t s .The c o n c e n t r a t i o n o f k e t o n e b o d i e s i n f e d r e -s t r a i n e d r a t s was t h r e e - t o f o u r - f o l d h i g h e r an ds t a r v e d r e s t r a i n e d r a t s had c o n c e n t r a t i o n s 1 . 2 7 -1.72mm h i g h e r t h a n e i t h e r a n a e s t h e t i z e d r a t s o r

T a b l e 1 . B l o o d m e t a b o l i t e s o b t a i n e d u n d e r v a r i o u c o n d i t i o n s i n f e d a n d 4 8 h - s t a r v e d r a t sT h e r e s u l t s a r e mean v a l u e s ( S . D . ) w i t h t h e n u m b e r o f o b s e r v a t i o n s i n e a c h g r o u p i n p a r e n t h e s e s . F e d a n ds t a r v e d d e c a p i t a t e d r a t s w e r e u n a n a e s t h e t i z e d a n d b l o o d w a s o b t a i ne d o n e x s a n g u i n a t i o n . A n a e s t h e t i z e dr a t s w e r e g i v e n a n i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f N e m b u t a l ( 5 0 m g / k g ) 3 0 - 4 5 m i n b e f o r e b l o o d w a s o b t a i n e df r o m t h e f e m o r a l a r t e r y . C o n s c i o u s r a t e w e r e r e s t r a i n e d f o r 2 d a y s b e f o r e s a m p l i n g a n d h a d a n a r t e r i a l c a t h e t e rp l a c e d i n t h e f e m o r a l a r t e r y o n t h e p e n u l t i m a t e d a y .

G l u c o s e L a c t a t e P y r u v a t e3 - H y d r o x y -

b u t y r a t eA o e t o -a c e t a t e

T o t a lk e t o n eb o d i e s

F r e ef a t t ya c i d sC o n d i t i o n s ( m m ) ( m m ) ( m M ) ( m m ) ( m m ) ( m m ) ( m e q u i v . / I )

F e d , d e c a p i t a t e d , m i x e d 6 . 1 4 0 . 1 4 1 . 7 6 1 . 4 3 0 . 1 4 2 0 . 0 7 0 0 . 0 3 0 . 0 3 0 . 1 2 0 . 0 1 0 . 1 5 0 . 6 4 0 . 2 3b l o o d ( 6 )F e d , a n a e s t h e t i z e d , a r t e r i a l 6 . 3 4 0 . 4 7 1 . 1 0 0 . 5 7 0 . 1 4 1 0 . 0 5 3 0 . 0 9 0 . 0 4 0 . 1 3 0 . 0 3 0 . 2 2b l o o d ( 9 )F e d , c o n s c i o u s , a r t e r i a l 6 . 2 6 0 . 6 2 0 . 5 9 0 . 2 3 0 . 0 9 8 0 . 0 5 7 0 . 2 6 0 . 1 8 0 . 3 9 0 . 1 6 0 . 6 5 0 . 6 6 0 . 3 5b l o o d ( 2 3 )4 8 h - s t a r v e d , d e c a p i t a t e d , 4 . 0 6 0 . 2 1 2 . 1 5 0 . 7 1 0 . 2 3 4 - 0 . 0 7 5 1 . 8 3 0 . 5 3 0 . 5 3 0 . 0 9 2 . 3 6 1 . 4 2 0 . 3 4m i x e d b l o o d ( 6 )4 8 h - s t a r v e d , a n a e s t h e t i z e d , 4 . 7 6 0 . 9 2 0 . 5 4 0 . 1 5 0 . 0 5 9 0 . 0 0 8 2 . 0 0 0 . 4 9 0 . 8 1 0 . 1 6 2 . 8 1a r t e r i a l b l o o d ( 1 0 )4 8 h - s t a r v e d , c o n s c i o u s , 3 . 8 7 0 . 5 6 0 . 9 0 0 . 2 8 0 . 1 2 0 + 0 . 0 3 5 2 . 6 3 0 . 9 1 1 . 4 5 0 . 2 9 4 . 0 8 1 . 3 1 0 . 3 8a r t e r i a l b l o o d ( 1 3 )

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PLA S M A INSULIN AFTER ACETOACETATE INFUSIONd e c a p i t a t e d r a t s . The r e a s o n f o r t h i s i s n o t c l e a r .I n f u s i o n o f a c e t o a c e t a t e i n t o n o r m a l f e d r a t s .I n f u s i o n o f a c e t o a c e t a t e t o r a i s e t h e t o t a l k e t o n e -body c o n c e n t r a t i o n t o v a l u e s a p p r o x i m a t i n g t ot h o s e f o u n d i n s t a r v a t i o n ( 2 - 3 m M ) d i d n o t c h a n g et h e a r t e r i a l g l u c o s e c o nc e nt r a t i o n s i g n i f i c a n t l y( T a b l e 2 ) . The p l a s m a i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n r o s e by53% w i t h i n 1 0m in a nd d e c r e a s e d s l i g h t l y t h r o u g h -o u t t h e r e m a i n d e r o f t h e i n f u s i o n p e r i o d . R a p i da c e t o a c e t a t e i n f u s i o n r e s u l t i n g i n h i g h e r c o n c e n t r a -t i o n s ( 6 - 7 m m ) d e p r e s s e d t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o nw i t h i n 10min by 0 . 6 1 mM and by 1.05mM a t 6 0 m i n .T h i s was a c c o m p a n i e d by a 150% r i s e i n p l a s m ai n s u l i n d u r i n g t h e f i r s t I O m i n and a d e c r e a s e i n f r e ef a t t y a c i d s .N e m b u t a l - a n a e s t h e t i z e d r a t s . A n a e s t h e t i z e d r a t si n f u s e d a t t h e r a p i d r a t e s h o w e d a s i m i l a r p a t t e r nb u t t h e i nc r e a s e i n p l a s m a i n s u l i n c o n c e n t r a t i o nwas g r e a t e r t h a n i n u n a n a e s t h e t i z e d r a t s t h r o u g h -o u t t h e i n f u s i o n p e r i o d ( P < 0 . 1 , 0 . 0 2 5 an d 0 . 0 5 a t1 0 , 3 0 and 60min r e s p e c t i v e l y ) .I n f u s i o n o f f e d - d i a b e t i c r a s . The f e d , i n s u l i n -t r e a t e d d i a b e t i c r a t s showed no c o n s i s t e n t c h a n g ei n b l o o d g l u c o s e on a c e t o a c e t a t e i nf u s i o n a t t h eh i g h r a t e . The c o nc e nt r a t i o n o f p l a s m a i n s u l i nr e m a i n e d c o n s t a n t , a s was t o b e e x p e c t e d . H o w e v e r ,f r e e f a t t y a c i d s d e c r e a s e d by 23% w i t h i n I O m i n andr e m a i n e d c o n s t a n t t h e r e a f t e r .

I n f u s i o n o f n o r m a l s t a r v e d r a t s . I n f u s i o n o fa c e t o a c e t a t e i n t o 4 8 h - s t a r v e d r a t s a t t h e h i g h r a t er e s u l t e d i n a n i n c r e a s e o f t o t a l k e t o n e b o d i e s f r o m3.88mM t o 10.8mM i n 10min ( T a b l e 3 ) . At 30mina f t e r t h e i n f u s i o n was t e r m i n a t e d t h e k e t o n e -body c o n c e n t r a t i o n s w e r e a b o u t t w i c e t h e i r o r i g i n a lv a l u e ( 7 . 5 8 m M ) . T h e r e was n o s i g n i f i c a n t c h a n g ei n b l o o d g l u c o s e t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t , b u tt h e r e was a t h r e e f o l d r i s e i n t h e p l a s m a i n s u l i nc o n c e n t r a t i o n , w h i c h was m a i n t a i n e d u n t i l t h ei n f u s i o n was s t o p p e d a t 3 0 m i n , whereupon t h ei n s u l i n c o n c e n t r a t i o n r e t u r n e d t o n o r m a l by 6 0 m i n .F r e e f a t t y a c i d c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d by 3 2%w i t h i n I O m i n and r e m a i n e d l o w t h r o u g h o u t .

DISCUSSIONThe r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e show t h a t p l a s m ai n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e w hen t h e b l o o dk e t o n e - b o d y c o n c e n t r a t i o n s a r e r a i s e d f r o m l e s s

t h a n 1 mm t o 2 - 3 mM o r 6 - 7 mM i n f e d r a t s and f r o m3mM t o 1 l m m i n 4 8 h - s t a r v e d r a t s . T h i s e f f e c twas much l a r g e r i n f e d r a t s t h a n i n s t a r v e d o n e s ,a l t h o u g h i n t h e f e d s t a t e t h e i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n so f i n s u l i i n w e r e a b o u t 4 - 5 t i m e s h i g h e r t h a n i n t h es t a r v e d s t a t e . M a d i s o n e t a l . ( 1 9 6 4 ) , w h o f i r s to b s e r v e d t h i s e f f e c t o n d o g s , s u g g e s t e d t h a t t h es t i m u l a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n by k e t o n e b o d i e s

T a b l e 2 . E f f e c t o f a c e t o a c e t a t e i n f u s i o n o n c i r c u l a t i n g m e t a b o l i t e a n d i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s i n f e d r a t sT h e r e s u l t s a r e mean v a l u e s ( S . E . M . ) w i t h t h e number o f o b s e r v a t i o n s i n e a c h g r o u p i n p a r e n t h e s e s . T h es y m b o l s * a n d * * i n d i c a t e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e , a s c o m p a r e d w i t h t h e i n i t i a l v a l u e , o f 5 a n d 1% r e s p e c t i v e l y .I n f u s i o n s w e r e b e g u n a t z e r o t i m e a n d c o n t i n u e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . F o r d e t a i l s s e e t h e M at e r i a l s a n dM e t h o d s s e c t i o n .

C o n d i t i o n sA c e t o a c e t a t e - i n f u s e d a t s l o w r a t e ( 6 )

A c e t o a c e t a t e - i n f u s e d a t r a p i d r a t e( 9 )A c e t o a c e t a t e - i n f u s e d a t r a p i d r a t e ,N e m b u t a l - a n a e s t h e t i z e d ( 5 )I n s u l i n - m a i n t a i n e d d i a b e t i c r a t s ,a c e t o a c e t a t e - i n f u s e d a t r a p i d r a t e( 9 )N a C l - i n f u s e d ( 8 )

Time( m i n )0

1 02 06 00

1 03 06 00

1 03 06 00

1 03 06 00

1 03 06 0

G l u c o s e( m m )

6 . 7 8 0 . 2 46 . 7 2 0 . 4 36 . 4 4 0 . 0 96 . 7 2 0 . 1 66 . 1 6 0 . 1 95 . 5 5 0 . 2 1 *5 . 2 1 0 . 2 4 * *5 . 1 1 0 . 2 4 * *5 . 7 7 0 . 2 35 . 4 9 0 . 2 04 . 5 4 0 . 1 4 * *4 . 6 4 0 . 2 8 *3 . 3 2 0 . 8 43 . 7 6 0 . 9 93 . 5 8 1 . 2 64 . 4 0 1 . 9 25 . 9 8 0 . 1 96 . 1 1 0 . 2 96 . 1 2 0 . 2 26 . 1 1 0 . 2 4

3 - H y d r o x y -b u t y r a t e( m m )0 . 4 9 0 . 1 51 . 1 0 0 . 1 01 . 0 2 0 . 1 00 . 8 7 0 . 1 80 . 3 2 0 . 0 70 . 9 2 0 . 0 71 . 1 1 0 . 1 01 . 2 5 0 . 1 10 . 2 2 + 0 . 0 61 . 0 8 0 . 1 11 . 2 9 0 . 0 81 . 4 1 0 . 1 60 . 1 9 0 . 0 60 . 9 5 0 . 1 31 . 1 2 0 . 1 21 . 5 7 0 . 2 60 . 2 6 0 . 0 70 . 2 7 0 . 0 60 . 1 0 0 . 0 2

A c e t o -a c e t a t e( m m )0 . 4 7 0 . 0 92 . 6 3 0 . 2 22 . 2 7 0 . 1 42 . 0 0 0 . 1 90 . 5 0 0 . 0 44 . 9 9 0 . 2 64 . 8 8 0 . 2 55 . 1 2 0 . 3 00 . 4 9 0 . 0 55 . 8 5 0 . 4 26 . 0 1 0 . 5 26 . 1 9 0 . 9 00 . 8 5 0 . 1 35 . 4 3 0 . 7 15 . 8 1 0 . 6 06 . 7 4 0 . 6 90 . 3 5 0 . 0 40 . 3 2 0 . 0 50 . 3 5 0 . 0 60 . 3 6 0 . 0 5

F r e e f a t t ya c i d s( m e q u i v . / l )

0 . 8 2 0 . 1 40 . 7 3 0 . 1 00 . 6 5 0 . 1 0 *0 . 6 4 0 . 0 7 *

0 . 8 3 0 . 1 30 . 6 4 0 . 0 1 *0 . 5 8 0 . 0 8 * *0 . 6 5 0 . 0 60 . 5 0 0 . 0 70 . 4 7 0 . 0 80 . 4 8 0 . 1 10 . 5 8 0 . 0 9

I n s u l i n( , u u n i t s /m l )2 6 . 7 3 . 64 1 . 0 1 2 . 4 *3 9 . 0 1 0 . 7 *3 5 . 2 8 . 52 0 . 0 2 . 74 9 . 9 7 . 8 *2 8 . 6 + 4 . 23 1 . 7 6 . 53 0 . 0 7 . 11 0 1 . 2 2 6 . 3 *5 7 . 5 1 1 . 8 *6 7 . 6 1 7 . 3 *4 6 . 9 9 . 64 3 . 0 8 . 93 2 . 6 8 . 84 1 . 4 1 1 . 02 8 . 7 5 . 53 1 . 3 4 . 22 2 . 5 5 . 03 0 . 0 4 . 3

V o l . 1 2 5 5 4 3

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5 4 4 R . A . HAWKINS AND OTHERS 1 9 7 1T a b l e 3 . E f f e c t o f a c e t o a c e t a t e o n b l o o d m e t a b o l i t e 8 a n d i n 8 u l i n c o n c e n t r a t i o n i n 4 8 h - 8 t a r v e d r a t 8T h e r e s u l t s a r e mean v a l u e s ( + s . E . m . ) w i t h t h e number o f o b s e r v a t i o n s i n e a c h g r o u p i n p a r e n t h e s e s . Thes y m b o l s * a n d * * i n d i c a t e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e a s c o m p a r e d w i t h t h e i n i t i a l v a l u e , o f 5 a n d 1 % r e s p e c t i v e l y .I n f u s i o n s w e r e b e g u n a t z e r o t i m e a n d t e r m i n a t e d a f t e r 3 0 m i n . F o r d e t a i l s s e e t h e M a t e r i a l s a n d M e t h o d ss e c t i o n .

F r e e f a t t yTime G l u c o s e 3 - H y d r o x y b u t y r a t e A c e t o a c e t a t e a c i d s I n s u l i nC o n d i t i o n s ( m i n ) ( m m ) ( m m ) ( m m ) ( m e q u i v . / l ) ( , u n i t s / l )

A c e t o a c e t a t e - i n f u s e d a t 0 4 , O O + 0 . 1 9 2 . 4 4 + 0 . 3 3 1 . 4 4 0 . 1 1 1 . 1 6 0 . 1 4 * 6 . 4 1 . 7r a p i d r a t e ( 8 ) 1 0 4 . 2 0 0 . 2 4 3 . 0 7 0 . 3 5 7 . 7 7 0 . 4 9 0 . 7 9 0 . 1 3 * 1 8 . 5 3 . 5 * *3 0 3 . 6 1 0 . 2 9 3 . 2 3 0 . 3 5 8 . 5 3 0 . 5 7 0 . 8 0 + 0 . 1 0 * * 1 8 . 5 5 . 4 *6 0 3 . 7 6 0 . 3 1 3 . 6 4 0 . 4 5 3 . 9 4 0 . 4 6 0 . 7 7 0 . 1 0 * 7 . 5 1 . 7N a C l - i n f u s e d ( 5 ) 0 3 . 6 6 0 . 3 1 2 . 9 5 0 . 4 2 1 . 4 7 0 . 1 6 1 . 3 8 0 . 1 0 4 . 2 1 . 01 0 4 . 1 0 0 . 4 0 2 . 8 4 0 . 3 1 1 . 5 5 0 . 0 9 1 . 3 2 0 . 1 7 7 . 4 1 . 33 0 3 . 8 3 0 . 4 2 2 . 9 0 0 . 4 1 1 . 4 4 0 . 1 4 1 . 1 3 + 0 . 2 1 5 . 8 1 . 06 0 3 . 7 5 0 . 3 0 3 . 0 9 0 . 4 7 1 . 5 0 0 . 1 9 1 . 2 3 0 . 2 0 4 . 5 0 . 8

m a y b e o f i m p o r t a n c e i n t h e f e e d - b a c k r e g u l a t i o no f k e t o n e - b o d y p r o d u c t i o n . I n c r e a s e d i n s u l i nc o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e t h e f r e e f a t t y a c i d r e l e a s ef r o m a d i p o s e t i s s u e ( s e e Scow & C h e r n i c k , 1 9 7 0 ) an dt h e r e f o r e i n h i b i t k e t o g e n e s i s by l o w e r i n g t h e c o n -c e n t r a t i o n s o f t h e i r p r e c u r s o r s . I n a d d i t i o n t h e r ei s e v i d e n c e t h a t i n s u l i n m a y h a v e a d i r e c t e f f e c t o nh e p a t i c k e t o g e n e s i s ( B i e b e r d o r f , C h e r n i c k & S c o w ,1 9 7 0 ) .A f e e d - b a c k c o n t r o l n o t m e d i a t e d by i n s u l i na p p e a r s t o b e a d i r e c t i n h i b i t i o n o f f r e e f a t t y a c i dr e l e a s e f r o m a d i p o s e t i s s u e by k e t o n e b o d i e s( B j 6 r n t o r p , 1 9 6 6 ; H e l l m a n , S e n i o r & Goodman,1 9 6 9 ) . T h i s e f f e c t o c c u r s i n a l l o x a n - d i a b e t i c d o g sw h e r e i n s u l i n i s n o t l i k e l y t o b e i n v o l v e d ( B j o r n t o r p& S c h e r s t 6 n , 1 9 6 7 ) . The f i n d i n g t h a t i n f u s i o n o fa c e t o a c e t a t e d e c r e a s e d f r e e f a t t y a c i d c o n c e n t r a -t i o n s w i t h o u t any i n s u l i n c h a n g e i n s t r e p t o z o t o c i n -d i a b e t i c r a t s ( T a b l e 2 ) c o n f i r m s p r e v i o u s w o r k . I t i st h e r e f o r e l i k e l y t h a t i n n o r m a l a n i m a l s t h e d e c r e a s eo f f r e e f a t t y a c i d s i s d u e t o t h e o p e r a t i o n o f b o t hf e e d - b a c k m e c h a n i s m s .

T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m t h e M e d i c a lR e s e a r c h C o u n c i l a n d f r o m t h e U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e( G r a n t n o . AM 1 1 7 4 8 ) . D . H . W. i s a member o f t h ee x t e r n a l s t a f f o f t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l a n d R . A . H .i s a U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e P o s t d o c t o r a l R e s e a r c hF e l l o w ( F o 2 - A M - 3 0 , 2 7 3 - 0 1 ) . K . G . M . M . A . i s R e s e a r c hO f f i c e r a t t h e N u f f i e l d D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l M e d i c i n e ,R a d c l i f f e I n f i r m a r y , O x f o r d , a n d i s s u p p o r t e d b y t h eW e l l c o m e T r u s t .

REFERENCESB a l a s s e , E . , C o u t u r i e r , E . & F r a n c k s o n , J . R . M . ( 1 9 6 7 ) .D i a b e t o l o g i a , 3 , 4 8 8 .B a l a s s e , E . & O o m s , H . A . ( 1 9 6 8 ) . D i a b e t o l o g i a , 4 , 1 3 3 .

B i e b e r d o r f , F . A . , C h e r n i c k , S . S . & S c o w , R . 0 . ( 1 9 7 0 ) .J . c l i n . I n v e s t . 4 9 , 1 6 8 5 .B j o r n t o r p , P . ( 1 9 6 6 ) . J . L i p i d R e 8 . 7 , 6 2 1 .B j 6 r n t o r p , P . & S c h e r s t 6 n , T . ( 1 9 6 7 ) . Am. J . P h y 8 i o l . 2 1 2 ,6 8 3 .D e v e c e r s k i , M . , P i e r c e , C . E . & F r a w l e y , T . F . ( 1 9 6 8 ) .M e t a b o l i 8 m , 1 7 , 8 7 7 .D i c k i n s o n , F . M . & D a l z i e l , K . ( 1 9 6 7 ) . B i o c h e m . J . 1 0 4 ,1 6 5 .H a w k i n s , R . A . , W i l l i a m s o n , D . H . & K r e b s , H . A . ( 1 9 7 1 ) .B i o c h e m . J . 1 2 2 , 1 3 .H e i l m a n , D . E . , S e n i o r , B . & G o o d m a n , H . M . ( 1 9 6 9 ) .M e t a b o l i 8 m , 1 8 , 9 0 6 .H o h o r s t , H . J . , K r e u t z , F . H . & B u i c h e r , T h . ( 1 9 5 9 ) .B i o c h e m . Z . 3 3 2 , 1 8 .

I t a y a , K . & U i , M . ( 1 9 6 5 ) . J . L i p i d R e 8 . 6 , 1 6 .J u n o d , A . , L a m b e r t , A . E . , S t a u f f a c h e r , W. & R e n o l d ,A . E . ( 1 9 6 9 ) . J . c l i n . I n v e a t . 4 8 , 2 1 2 9 .K r e b s , H . A . & E g g l e s t o n , L . V . ( 1 9 4 1 ) . B i o c h e m . J .3 9 , 4 3 8 .L o r i d a n , L . & S e n i o r , B . ( 1 9 7 0 ) . J . P e d i a t . 7 6 , 6 9 .M a d i s o n , L . L . , M e b a n e , D . , U n g e r , R . H . & L o c h n e r , A .( 1 9 6 4 ) . J . c l i n . I n v e s t . 4 3 , 4 0 8 .M o r g a n , C . R . & L a z a r o w , A . ( 1 9 6 3 ) . D i a b e t e 8 , 1 2 ,1 1 5 .N e p t u n e , E . M . ( 1 9 5 6 ) . Am. J . P h y 8 i o l . 1 8 7 , 4 5 1 .P i - S u n y e r , F . X . , C a m p b e l l , R . G . & H a s h i m , S . A . ( 1 9 7 0 ) .M e t a b o l i 8 m , 1 9 , 2 6 3 .S c o w , R . 0 . & C h e r n i c k , S . S . ( 1 9 7 0 ) . I n C o m p r e h e n s i v eB i o c h e m i 8 t r y , v o l . 1 8 , p . 2 0 . E d . b y F l o r k i n , M . &S t o t z , E . H . A m s t e r d a m : E l s e v i e r P u b l i s h i n g C o .S e n i o r , B . & L o r i d a n , L . ( 1 9 6 8 ) . N a t u r e , L o n d . , 2 1 9 ,8 3 .S l e i n , M . W. ( 1 9 6 3 ) . I n M e t h o d s o f E n z y m a t i c A n a l y 8 i s ,p . 1 1 7 . E d . b y B e r g m e y e r , H . U . Ne w York a n dL o n d o n : A c a d e m i c P r e s s .S o e l d n e r , J . S . & S l o n e , D . ( 1 9 6 5 ) . D i a b e t e s , 1 4 , 7 7 1 .W i l l i a m s o n , D . H . , M e l l a n b y , J . & K r e b s , H . A . ( 1 9 6 2 ) .B i o c h e m . J . 8 2 , 9 0 .