Page 1
32
HASIL
Identifikasi Isolat PMP 0126y
Isolat PMP 0126y merupakan isolat koleksi BBP4BKP yang diisolasi dari
limbah hasil pengolahan rumput laut Glacilaria sp. menjadi agar-agar di daerah
Pemeungpeuk, Jawa Barat. Isolat PMP 0126y dapat tumbuh baik pada media
agar-agar nutrien dan tergolong pada bakteri mesofilik karena tumbuh pada suhu
37 0C.
Isolat PMP 0126y diidentifikasi secara langsung dengan melihat morfologi
koloni bakteri (Gambar 7). Ciri morfologi yang dimiliki oleh isolat PMP 0126y
yaitu warna koloni kuning jingga, bundar, mengkilat. Berdasarkan hasil
pewarnaan Gram menggunakan mikroskop (Olympus DP12) dengan perbesaran
1000 x, isolat PMP 0126y tergolong dalam bakteri Gram negatif berbentuk batang
pendek (Gambar 8).
Gambar 7 Isolat PMP 0126y. Gambar 8 Pewarnaan Gram isolat
PMP 0126y dengan
perbesaran 1000 x.
Analisis gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dilakukan dengan
proses amplifikasi dengan PCR (GeneAMP PCR System 9700, Applied
Biosystem) menggunakan sekuen komplemen DNA genom isolat PMP 0126y
yang digandakan dengan primer 63f dan 1387r. Gen penyandi 16S-rRNA dari
isolat PMP 0126y yang berhasil diamplifikasi dengan PCR sebesar ±1282 pasang
basa (Gambar 9). Hasil analisis sekuen parsial DNA penyandi 16S-rRNA isolat
PMP 0126y sebanyak 1282 pasang basa dari arah 5’-3’ (Gambar 10).
Page 2
33
Gambar 9 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y.
1 GAGAGCGGCG TACGGGTGCG GAACACGTGT GCAACCTGCC TTTATCTGGG
51 GGATAGCCTT TCGAAAGGAA GATTAATACC CCATAATATA TTGAATGGCA
101 TCATTTGATA TTGAAAACTC CGGTGGATAG AGATGGGCAC GCGCAAGATT
151 AGATAGTTGG TGAGGTAACG GCTCACCAAG TCAGCGATCT TTAGGGGGCC
201 TGAGAGGGTG ATCCCCCACA YTGGTAMTTG AGACAMGGRC CCAGAMTYCT
251 TACGGGAGGG CAGCCAGTGA AGGAATATTT GGACAATGGG GTGAGAGCCT
301 TGATCCCAGC CATCCCGGCG TGAAAGGACG ACGGCCCTTA TGGGTTGTAA
351 ACTTYTTTTT GTATAGGGGA TAAACCTACC CTCGTGAGGG TAGCTGAAGG
401 TACTATACGA ATAAGCACCG GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA
451 CGGAGGGTGC AAGCGTTATC CGGATTTATT GGGTTTAAAG GGTCCGTAGG
501 CTGATTTGTA AGTCAGTGGT GAAATCTCAC AGCTTAACTG TGAAACTGCC
551 ATTGATACTG CAAGTCTTGA GTGTTGTTGA AGTAGCTGGA ATAAGTAGTG
601 TAGCGGTGAA ATGCATAGAT ATTACTTAGA ACACCAATTG CGAAGGCAGG
651 TTACTAAGCA ACAACTGACG CTGATGGACG AAAGCGTGGG GAGCGAACAG
701 GATTAGATAC CCTGGTAGTC CACGCCGTAA ACGATGCTAA CTCGTTTTTG
751 GGCTTTTGGG TTCAGAGACT AAGCGAAAGT GATAAGTTAG CCACCTGGGG
801 AGTACGAACG CAAGTTTGAA ACTCAAAGGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA
851 GCGGTGGATT ATGTGGTTTA ATTCGATGAT ACGCGAGGAA CCTTACCAAG
901 GCTTAAATGG GGAAATGACA GGCTTAGAAA ATAGGCTTTT CTTCGGACAT
951 TTTTCAAGGT GCTGCATGGT TGTCGTCAGC TCSTGCCCGT GAGGTGTTAA
1001 GGTTAAGTCC TTGCAACGAA GCGCAACCCC TTGTCACTAR TTTGCCATCA
1051 TTTAAKTTGG GGGACTCTAG TKARAACTGC CTACSCCAAG TARARARGAA
1101 AAGKTGGGGA TRAMGTCAAA TCATCACGGC CCTTACGCCT TGGGCCACAC
1151 ACGTAATACA ATGGCCGGTA CAGAGGGCAG CTACACTGCG AAGTGATGCA
1201 AATCTCGAAA GCCGGTCTCA GTTCGGATTG GAGTCTGCAA CTCGACTCTA
1251 TGAAGCTGGA ATCGCTAGTA ATCGCGCATC AG
Gambar 10 Sebagian sekuen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y dari
(arah 5’-3’).
Sekuen komplemen DNA penyandi 16S-rRNA isolat PMP 0126y
dianalisis dengan program FASTA dari koleksi Genebank National Center
Biotechnology Information (NCBI). Berdasarkan analisis sekuen DNA tersebut,
isolat PMP 0126y memiliki kemiripan sebesar 96% dari 1282 nukleotida yang
M + - PMP 0126Y
1282 bp
bp
Page 3
34
overlapped (bertumpang tindih) dengan 1234 nukleotida dengan bakteri
Chryseobacterium indologenes galur McR-1 (Gambar 11).
Gambar 11 Pohon filogenetik isolat PMP 0126y.
Pertumbuhan dan Produksi Enzim Selulase
Isolat PMP 0126y ditumbuhkan pada media agar-agar yang mengandung
1% CMC membentuk zona bening pada uji kualitatif yang dilakukan (Gambar
12). Zona bening yang dihasilkan menunjukkan adanya enzim selulase
ekstraseluler yang dikeluarkan oleh isolat PMP 0126y. Indeks selulolitik isolat
PMP 0126y sebesar 1,9 pada inkubasi hari kelima dengan pH media 6 dan suhu
37 0C.
Page 4
35
Gambar 12 Zona bening isolat PMP 0126y.
Isolat PMP 0126y merupakan bakteri aerob yang membutuhkan oksigen
untuk pertumbuhannya. Pada saat dilakukan optimasi produksi enzim, isolat ini
ditumbuhkan pada suhu 30 0C dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Pertumbuhan
bakteri dilihat dari nilai kerapatan optis yang dihasilkan pada setiap jam
pengukuran yaitu setiap 3 jam pada panjang gelombang 600 nm (Lampiran 4).
Isolat PMP 0126y mulai mengalami peningkatan pertumbuhan bakteri
(fase eksponensial) pada 6-12 jam inkubasi dengan jumlah sel yang tertinggi
dihasilkan sebesar 9,7 log10 CFU/mL. Selanjutnya pada jam ke-12 sampai jam ke-
21, jumlah sel yang dihasilkan konstan yaitu 9,7 log10 CFU/mL. Pada jam ke-24
sampai jam ke-27 isolat PMP 0126y terjadi penurunan menjadi 8,9 log10 CFU/mL
(Gambar 13).
Gambar 13 Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y.
Kurva pertumbuhan isolat PMP 0126y yang dihasilkan menjadi dasar
waktu penuangan inokulum yang terbaik yaitu saat isolat berumur 6-9 jam.
Diperkirakan bahwa kultur isolat yang akan dituang ke dalam media produksi
sekitar 9,4-9,5 Log sel10/mL. Selanjutnya, optimasi produksi enzim selulase
dilihat dengan mengukur aktivitas selulase yang dihasilkan selama waktu
inkubasi/fermentasi. Pada akhirnya diperoleh aktivitas enzim selulase yang
tertinggi selama enam hari pengamatan yaitu pada hari ketiga inkubasi (Lampiran
Page 5
36
5), dengan aktivitas selulase sebesar 0,108 U/mL dan aktivitas spesifik
0,120 U/mg serta kadar protein sebesar 0,895 mg/mL. Kadar glukosa yang
dihasilkan pada saat itu sebesar 0,117 mg/L. Fase pertumbuhan eksponensial
bakteri pada media produksi pada hari pertama dan kedua sebesar 9,1 log10
CFU/mL dan jumlah sel terus stabil sampai hari keempat dan semakin menurun
sampai hari keenam dengan jumlah sel bakteri sebesar 8,9 Log10 CFU/mL
(Gambar 14, Lampiran 5).
Gambar 14 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri
PMP 0126y.
Produksi selulase oleh isolat PMP 0126y pada media yang mengandung
glukosa 0,1% menunjukkan aktivitas selulase tertinggi dihasilkan pada hari ketiga
inkubasi (Gambar 15, Lampiran 5) sama seperti pada media produksi yang tidak
mengandung glukosa (Gambar 14).
Gambar 15 Kurva aktivitas selulase, aktivitas spesifik, dan jumlah sel bakteri
PMP 0126y pada media yang mengandung glukosa 0,1%.
Page 6
37
Penambahan glukosa sebanyak 0,1% pada media produksi menghasilkan
jumlah sel sebesar 9,4 log10 CFU/mL, sedangkan jumlah sel tertinggi pada media
produksi tanpa glukosa hanya 9,1 log10 CFU/mL. Aktivitas selulase yang tertinggi
pada hari ketiga sebesar 0,070 U/mL dan aktivitas spesifik 0,116 U/mg dengan
kadar protein sebesar 0,606 mg/mL pada media produksi yang mengandung
glukosa 0,1%.
Pemurnian Enzim Selulase
Enzim selulase diproduksi selama 3 hari yang menunjukkan waktu
produksi tertinggi, kemudian dimurnikan dengan melakukan pemekatan enzim
melalui dua cara pemekatan yaitu pengendapan amonium sulfat dan ultrafiltrasi.
Persen kadar amonium sulfat yang menghasilkan aktivitas selulase tertinggi
diperoleh pada 50% kejenuhan amonium sulfat. Aktivitas selulase yang dihasilkan
sebesar 0,072 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 0,128 U/mg pada endapan,
sedangkan pada supernatan dihasilkan aktivitas selulase sebesar 0,068 U/mL dan
aktivitas spesifik sebesar 0,105 U/mg. Selulase tanpa penambahan amonium sulfat
(kontrol) memiliki aktivitas sebesar 0,064 U/mL dan aktivitas spesifik
0,075 U/mg (Gambar 16, Lampiran 5).
Gambar 16 Aktivitas spesifik dari pengendapan selulase dengan amonium sulfat.
Selain melakukan pemekatan enzim dengan amonium sulfat, pemekatan
enzim juga dilakukan dengan ultrafiltrasi. Aktivitas selulase yang diperoleh pada
ultrafiltrasi 10 kali pemekatan (10.000 NMWC) sebesar 0,112 U/mL pada hasil
ultrafiltrasi (retentat), dan 0,059 U/mL pada filtrat yang keluar dari alat
Page 7
38
ultrafiltrasi (permeat). Aktivitas selulase tanpa pemekatan dengan ultrafiltrasi
(kontrol) menghasilkan aktivitas sebesar 0,069 U/mL (Tabel 7).
Tabel 7 Aktivitas selulase hasil ultrafiltrasi
Enzim
selulase
Kadar
glukosa
(mg/L)
Aktivitas
selulase (U/mL)
Kadar protein
(mg/mL)
Aktivitas
spesifik
(U/mg)
Ultrafiltrasi
Retentat 0,121 0,112 0,822 0,136
Permeat
Kontrol
0,064
0,069
0,059
0,064
0,598
0,750
0,099
0,086
Hasil ultrafiltrasi kemudian dimurnikan dengan menggunakan
kromatografi penukar anion menggunakan alat Akta Purifier. Dari 75 fraksi hasil
kromatografi penukar anion, puncak tertinggi dihasilkan oleh fraksi ke-48 pada
konsentrasi NaCl sebesar 37,3 mM (Gambar 17). Hasil uji aktivitas selulase fraksi
ke-48 sebesar 0,154 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar 1,301 U/mg. Aktivitas
selulase pada fraksi ke-51 sebesar 0,147 U/mL dan aktivitas spesifik sebesar
1,591 U/mg.
No Fraksi
Gambar 17 Profil elusi enzim selulase pada kromatografi DEAE penukar ion
menggunakan matriks Sepharose.
Hasil uji aktivitas selulase yang dilakukan, memperlihatkan bahwa fraksi
yang membentuk fraksi puncak (fraksi 46-55) dapat menghasilkan aktivitas
mA
U
1 M
NaCl (0,5 M)
0,0 M
46
6
55
6
48
6 51
6
Page 8
39
selulase (Lampiran 5). Selulase dari fraksi ke-48 dan 51 digabung dan diukur
aktivitasnya sebesar 0,143 U/mL dengan aktivitas spesifik sebesar 1,361 U/mg.
Gabungan fraksi ke-46 sampai fraksi ke-55 (tanpa fraksi 48 & 51) menghasilkan
aktivitas selulase sebesar 0,157 U/ml dengan aktivitas spesifik sebesar
1,297 U/mg.
Hasil pengukuran tingkat kemurnian enzim selulase yang dihasilkan oleh
ultrafiltrasi sebesar 1,58 kali dibandingkan ekstrak kasar, dan tingkat kemurnian
enzim hasil penukar anion (fraksi 48 & 51, fraksi 46-55) secara berturut-turut
sebesar 15,82 dan 15,08 kali (Tabel 8).
Tabel 8 Hasil uji aktivitas selulase PMP 0126y pada beberapa tahap pemurnian
Tahap
pemur-
nian
Volu
me
(ml)
Aktivi-
tas
selulase
(U/mL)
Aktivi-
tas total
(unit)
Konsen-
trasi
protein
(mg/mL)
Protein
total
(mg)
Aktivi-
tas spe-
sifik
(U/mg)
Ren-
de
men
(%)
Ting-
kat
Kemur-
Nian
Ekstrak
kasar 500 0,064 32,0 0,750 375 0,086 100 1,000
Ultrafil-
trasi 50 0,112 5,6 0,822 41,1 0,136 17,5 1,581
Penukar
anion
(fraksi
48 & 51)
10 0,143 1,43 0,105 0,840 1,361 4,47 15,825
Penukar
anion
(46-55)
40 0,157 6,28 0,121 4,84 1,297 19,6 15,081
Analisis Berat Molekul Enzim Selulase Menggunakan SDS-PAGE dan
Zimogram
Pada setiap tahap pemurnian, selulase dari isolat PMP 0126y dianalisis
jumlah pita protein dan berat molekulnya dengan SDS-PAGE (Gambar 18), dan
zimogram dengan menggunakan substrat CMC 0,1% (Gambar 19). Pita protein
enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y hasil pemekatan
ultrafiltrasi, dengan pewarnaan perak nitrat didapatkan sebanyak 13 pita dengan
berat molekul masing-masing sebesar : 84, 59, 55, 44, 39, 34, 30, 25, 21, 20, 17,
16, 14 kDa. Setelah dilakukan pemurnian ke dalam kolom dengan matriks
Sepharose, pita protein yang dihasilkan sebanyak 5 pita dengan berat molekul
masing-masing pita yaitu 75, 55, 39, 25, 19 kDa.
Page 9
40
Gambar 18 Hasil elekroforesis SDS-PAGE enzim ultrafiltrasi dan fraksi
pemurnian kromatografi penukar anion (kiri) dan ilustrasi berat
molekul protein selulase PMP 0126y (kanan). Keterangan:
A: Penanda berat protein rendah, B: Ultrafiltrasi, C: Fraksi 47, D:
Fraksi 48, E: Fraksi 49.
Selain SDS-PAGE, analisis zimogram juga dilakukan untuk mengetahui
berat molekul protein enzim selulase yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126y.
Hasil zimogram ditandai dengan terbentuknya zona bening pada gel yang
menunjukkan adanya aktivitas selulase pada gel akrilamida yang mengandung
0,1% CMC. Hasil optimasi waktu inkubasi gel memperlihatkan waktu terbaik
yaitu 60 menit dengan menggunakan bufer sitrat fosfat pH 5 yang didahului
dengan perlakuan renaturasi menggunakan larutan 2,5% Triton X-100 selama
1 jam. Hasil zimogram enzim hasil pemekatan (ultrafiltrasi) menunjukkan ada tiga
molekul protein yang memiliki aktivitas selulolitik pada gel dengan masing-
masing berat molekul yaitu 39, 30, 14 kDa yang dihitung berdasarkan mobilitas
relatif terhadap standar protein (Gambar 19).
Page 10
41
Gambar 19 Hasil zimogram PMP 0126y pada gel akrilamida mengandung CMC
0,1% (kiri) dan ilustrasi pita yang terbentuk dalam zimogram (kanan).
Keterangan: M: Marker protein rendah A : Enzim hasil ultrafiltrasi,
B : Fraksi KPA (Fraksi 48 & 51).
Ketiga pita protein yang dapat diukur ditunjukkan pada enzim selulase
hasil ultrafiltrasi. Enzim hasil pemurnian dengan kromatografi penukar anion
(gabungan fraksi 48 & 51) tidak dapat terdeteksi. Jumlah enzim yang terlalu
sedikit pada selulase hasil pemurnian kromatografi diduga menjadi penyebab
sehingga zona bening tidak terlihat pada gel dan hanya terlihat pada enzim hasil
ultrafiltrasi.
Karakterisasi Enzim Selulase
pH Optimum. Aktivitas selulase enzim hasil ultrafiltrasi tertinggi
didapatkan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dengan nilai aktivitas selulase sebesar
0,088 U/mL (Gambar 20), sedangkan aktivitas tertinggi enzim selulase hasil
pemurnian dengan kromatografi penukar anion (KPA) didapatkan pada bufer dan
pH yang sama yaitu pH 5 dengan aktivitas selulase sebesar 0,142 U/ml (Gambar
21).
Page 11
42
Gambar 20 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.
Pengukuran dilakukan pada suhu 30 0C.
Gambar 21 Pengaruh pH terhadap aktivitas selulase PMP 0126y hasil
kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada suhu
30 0C.
Suhu Optimum. Aktivitas selulase tertinggi yang dihasilkan oleh isolat
PMP 0126y pada enzim hasil ultrafiltrasi didapatkan pada suhu 30 0C dengan nilai
aktivitas sebesar 0,086 U/mL, sedangkan suhu optimum enzim hasil kromatografi
penukar anion ialah suhu 40 0C dengan aktivitas sebesar 0,145 U/mL (Gambar
22).
Page 12
43
Gambar 22 Suhu optimum aktivitas selulase PMP 0126y hasil ultrafiltrasi dan
kromatografi penukar anion. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat
fosfat pH 5.
Hasil uji stabilitas pada variasi suhu 30, 40, 50 0C yang diperlakukan pada
enzim selulase PMP 0126y memperlihatkan bahwa enzim selulase relatif stabil
pada ketiga suhu tersebut. Sampai dengan 240 jam waktu inkubasi enzim, tidak
terjadi penurunan aktivitas relatif enzim masih di atas 50% dari aktivitas relatif
optimum (Gambar 23).
Gambar 23 Pengaruh suhu dan waktu inkubasi terhadap aktivitas selulase PMP
0126y. Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu
30 0C, 40
0C, 50
0C.
Substrat Spesifik. Pengujian aktivitas enzim selulase hasil ultrafiltasi
pada berbagai substrat menunjukkan aktivitas tertinggi pada substrat limbah
rumput laut Glacilaria sp. dari pengolahan agar-agar Pameungpeuk yang telah
(0C)
Waktu inkubasi enzim (menit)
Page 13
44
didelignifikasi dengan NaOH 6% (Lampiran 6), dengan aktivitas selulase sebesar
0,149 U/mL, diikuti aktivitas selulase pada limbah rumput laut dari pengolahan
agar-agar PT. Agarindo sebesar 0,133 U/mL (Gambar 24).
Gambar 24 Substrat spesifik enzim selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi.
Pengukuran dilakukan pada bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.
Keterangan : a) CMC murni, b) CMC teknis, c) Avisel, d) kertas
Whatman No.1 e) limbah agar-agar PT Agarindo NaOH 6%, f) limbah
Alginat, g) limbah agar-agar Pameungpeuk NaOH 4%, h) limbah
agar-agar Pameungpeuk NaOH 6%, dan i) limbah agar-agar
Pameungpeuk H2SO4 1%.
Pengaruh Ion Logam terhadap Aktivitas Selulase. Beberapa ion logam
ditambahkan pada reaksi uji aktivitas selulase isolat PMP 0126y untuk
mengetahui pengaruh ion logam terhadap aktivitas selulase. Pada konsentrasi
5 mM logam dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut menjadi
153% pada CaCl2 dan 129% pada MgCl2 dari aktivitas relatif optimum (100%)
enzim selulase tanpa penambahan logam. Akan tetapi, pada konsentrasi 10 mM,
logam KCl dan FeCl3 dapat meningkatkan aktivitas relatif secara berturut-turut
menjadi 109% dan 111%. Penurunan aktivitas relatif sebanyak 50% terjadi pada
penambahan logam ZnCl2 10 mM yaitu sebesar 78% dengan aktivitas relatif yang
tersisa sebesar 22% (Gambar 25, Lampiran 4).
Page 14
45
Gambar 25 Aktivitas relatif selulase isolat PMP 0126y hasil ultrafiltrasi pada
penambahan logam 5 mM dan 10 mM. Pengukuran dilakukan pada
bufer sitrat fosfat pH 5 dan suhu 30 0C.
Pada penambahan senyawa pengkelat logam seperti EDTA dapat
menurunkan aktivitas relatif selulase PMP 0126y sebesar 19% pada konsentrasi
5 mM dan 34% pada konsentrasi 10 mM. Penambahan senyawa pengkelat logam
dengan CaCl2 5 mM menurunkan aktivitas relatif sebesar 53% dengan aktivitas
relatif yang tersisa sebesar 47%.
MgCl2 FeCl3 CaCl2 ZnCl2