2005. gada 21. aprīlī 11. lekcija HAPLOĪDU AUGU IEGŪŠANA IN VITRO POLIPLOIDIZĀCIJA IN VITRO
Mar 13, 2016
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.1. Haploīdu augu iegūšana in vitro
Haploīdus augus, t.i., augus ar pusi no taksonam raksturīgā hromosomu
komplekta, var iegūt no ģeneratīvajām šūnām – vēl nenobriedušiem putekšņiem,
putekšnīcas, olšūnas un ovārija.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Haploīdu augu iegūšanai ir liela nozīme ģenētikā un selekcijā,
jo no haploīdiem ir vieglāk izdalīt un atlasīt vērtīgas mutācijas,
bet ar kolhicīna palīdzību var iegūt pilnībā
homozigotus diploīdus augus.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Izolējot olšūnas vai putekšņus ar ieprogrammētu gametu
izveidošanu, audu kultūrās tie pārslēdzās uz
tādiem procesiem, kas raksturīgi somatiskajām šūnām.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.1.1. Putekšņu un putekšnīcu kultūras
Pirmo reizi par haploīdu audu iegūšanu no putekšnīcām ar sekojošu haploīdu audu
reģenerāciju ziņoja Guha un Maheshwari 1964.gadā ar Datura innoxia. Metodi tālāk
pilnveidoja Bourgin un Nitsch, kas 1967.gadā publicēja darba rezultātus par
haploīdas tabakas iegūšanu un pavairošanu.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Haploīdus augus, piemēram, no putekšņiem var iegūt divos veidos:
izraisot putekšņu dalīšanos un inducējot embrioģenēzi,
inducējot kallusa veidošanos un tajā savukārt izraisot organoģenēzi.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Abos gadījumos tas notiek pilnīgi atšķirīgi no normāliem procesiem in vivo.
Pēc 1-2 dalīšanās reizēm gametu veidošanās tiek bloķēta,
un tālāk tā iziet it kā somatiskās šūnassomatiskās šūnas stadiju,
bet tālāk šī šūna dalās kā zigotazigota, no kuras veidojas embrijsembrijs.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Vēlamāks ir tiešās androģenēzes ceļšVēlamāks ir tiešās androģenēzes ceļš, kurā mikrospora it kā pārtop par zigotu un
iziet veselu rindu embrioģenēzes etapu;
uz putekšnīcas var veidoties pat vesels audziņš – haploīds reģenerants.
Šis tiešais ceļš, piemēram, aprakstīts četrās Solanaceae dzimtas ģintīs – Datura,
Nicotiana, Atropa un Lycium.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija11.1.1.1. Putekšnīcu kultūras
Androģenēzes sekmīga indukcija ir lielā mērā atkarīga no putekšņu stāvokļa,
ievadot in vitro. Lai iegūtu haploīdus audus, rekomendē
putekšņus ievadīt sterilā kultūrā putekšņu pirmās mitozes laikā vai tūlīt pēc tam. Kā izejmateriāls ir derīgi neatvērušies ziedpumpuri ar putekšnīcām, kas satur
vienšūnas mikrosporas.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Reinert un Bajaj (1977) apraksta šādu metodiku:
Ziedpumpurus atdala un ievieto 2,5-5% Ca hipohlorīta šķīdumā uz 5-10 minūtēm,
tad skalo sterilā destilētā ūdenī. Ziedpumpuru ar skalpeli atver, un, lietojot pinceti ar
tieviem galiem, savāc putekšnīcas un ievieto sterilā Petri platītē.
Tur atdala putekšņu maciņus un pārvieto tos mēģenēs vai mazās Petri platītēs ar barotni.
Ja putekšņu maciņi ir sīki, tad darbu veic, skatoties caur lupu.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Nekādā gadījumā nedrīkst eksplantu ievainot;
bojātos objektus nestāda, bet atmet.
Pretējā gadījumā vai nu eksplants iet bojā, vai arī sāk veidoties kalluss nevis
no putekšņiem, bet no somatiskām diploīdām šūnām.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Kultūru var ievietot arī šķidrā barotnē Erlenmeijera kolbās kratītājā
ar nelielu kustībās ātrumu pa apli.
Kultūru inkubē 24º-27º C un 14 stundu apgaismojumā ar gaismas
intensitāti ~ 2000 lux.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Svarīgi, lai eksplanti būtu ņemti no relatīvi jauniem augiem, kas auguši
normālā apgaismojumā.
Veciem augiem ziedēšanas beigās veidojas sīki pumpuri, kam
putekšnīcas satur nekvalitatīvas mikrosporas, tās var būt ar defektiem.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Lai no putekšņiem in vitro veidotos reģenerants, nepieciešamas
vismaz 3-8 nedēļas.
Sunderland (1973) rekomendē jaunveidojušos sīkos audziņus atdalīt tūlīt atsevišķi un pārstādīt uz jaunas
barotnes.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Putekšnīcu kultivēšanai bieži izmanto kādu no trim barotnēm:
White, 1943 (Ephedra, Ginkgo, Taxus, Torreya, Lolium, Hordeum, Lycopesicum),
Murashige, Skoog, 1962 (Nicotiana),
Nitsch, Nitsch, 1969 (Datura, Brassica).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Liela nozīme šīm kultūrām ir cukuriem un dzelzij.
Parasti izmanto 2-4%2-4% saharozi, bet dažām kultūrām, kā, piemēram, miežiem, kviešiem un tomātiem,
lieto stipri augstākas koncentrācijas – 6-12%.6-12%.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Interesanti ir dati par fitohormonu pielietošanu šīm kultūrām.
Androģenēze dažiem Nicotiana taksoniem un Atropa beladonna noris bez
fitohormonu klātbūtnes; bet ja barotnei pievieno fitohormonus, tad tiek inducēta somatisko šūnu dalīšanās, kā
rezultātā veidojas kalluss, kas sastāv no šūnām ar dažādu ploiditāti.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Datura putekšnīcu kultūrā embrioģenēze no putekšņiem tiek inducēta
tikai ar kinetīnu, kurpretī auksīnu u.c. fizioloģiski aktīvo
savienojumu pievienošana izraisa putekšnīcas diploīdo audu pavairošanos
(Reinert, Bajaj, 1977).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Ar Brassica oleracea, B. oleracea x B. alboglabra un Orysa sativa
iegūti pretēji dati –
embrioģenēzes izraisīšanai putekšņu kultūrā bija nepieciešams tieši auksīns (Vasil,
1973).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Gemesne Juhasz u.c. (2001) darbā ar saldiem pipariem Capsicum annuum L.
no putekšnīcām ieguvuši haploīdus (n – 12).
Tālākajā darbā autori ieguvuši gan spontānos dihaploīdus (2n – 24),
gan ar kolhicīnu inducētos dihaploīdus (2n·) – DH.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Gametoklonālie varianti veidojas meijozē. No putekšnīcām izveidotās DH- līnijas ir
visvairāk piemērotie inbrīdi, piemēram, saldo piparu kultūru hibrīdu attīstībai,
jaunu šķirņu veidošanai ar jaunu augļu formu,
izmēru, krāsu u.c.,
kā arī rezistences veidošanai, īpaši pret vīrusu, tādu kā tabakas mozaīkas vīruss
un baktērija Xantomonas vesicatoria.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Lai veidotos dubultie haploīdi, ungāru zinātnieki haploīdos reģenerantus ievietoja
uz 4-6 dienām barotnē, kas saturēja 50-400 mg.L-1 kolhicīna.
Bet rezultāti parādīja, ka ģenētiskās izmaiņas, kas veidojas kolhicīna inducēto
genomu duplikācijā, nav vairāk, kā izmaiņas, ko izsauc meijotiskās
rekombinācijas.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.1.1.2. Putekšņu kultūras
Šai metodei ir vairākas priekšrocības, salīdzinot ar putekšnīcu kultūrām:
šīs kultūras attīstību nebremzē putekšnīcā atrodošies inhibitori,
nav konkurences starp putekšņu un somatisko šūnu augšanu un vairošanos.Savukārt putekšņu kultūras mīnuss ir
grūtības izraisīt putekšņu pirmo dalīšanos in vitro.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Sākotnēji androģenēzi putekšņu kultūrā izdevās izraisīt, izmantojot audus-“aukli”
(līdzīgas metodes aprakstu skat. 9. lekcijā!).
Zināmi panākumi kultivēšanā sasniegti, speciāli apstrādājot ziedpumpurus 2-5 dienas
pirms eksplantu noņemšanas. Viens no tādiem paņēmieniem ir
ziedpumpuru atdalīšana no auga 3 dienas pirms sterilās kultūras uzsākšanas, un
pumpuru uzglabāšana pazeminātā temperatūrā (5º C).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Ir iegūti arī dati, ka androģenēzes iniciācijai dažiem augiem ir svarīgs eksogēni pievienots
auksīns barotnei. Mikrosporu augšana un attīstība var noritēt arī
tad, ja mikrosporas apstrādā ar 0,04-0,05% kolhicīnu.
Bet tādā gadījumā, protams, hromosomu skaits divkāršojas, un tiek iegūtas homozigotas diploīdas šūnas, kas var dot pirmsākumu
fertiliem augiem.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Putekšņu kultivēšana pēc Nitsch metodes (1977)
Vispirms sterilizē neatvērušos pumpurus. Putekšņiem ir jābūt pirmās mitozes etapā.
To pārbauda, krāsojot putekšņus ar acetokarmīnu vai Šiffa reaktīvu.
Tūlīt pēc ziedpumpuru atdalīšanas tos centrifugē pusstundu ar 2000 apgriezieniem
minūtē un 5-10º C temperatūrā.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Tālāk tos saglabā pazeminātā temperatūrā un mitrumā 48 stundas.
Lai iegūtu homozigotus diploīdus augus, ziedpumpurus 24 stundas tur
2%-īgā dimetilsulfoksīdā izšķīdinātā 0,04%-īgā kolhicīnā
vakuumā un pazeminātā temperatūrā.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Pēc 24 stundām kolhicīnu atmazgā, un pumpurus vēl patur aukstumā un mitrumā.
Datura ziedpumpuriem, piemēram, šis nepieciešamais laiks bija 48 stundas; pēc tam
varēja izolēt putekšnīcas, Nicotiana un labībai vajadzēja 3 diennaktis.
Izolētās putekšnīcas uz 72 stundām ievietoja Halperina barotnē ar 2% saharozi un
5 mg.L-1 Fe-EDTA (pH 5,8) tā, lai uz katras putekšnīcas būtu 5 ml barotnes.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Putekšnīcas uzmanīgi pārspiež, piemēram, ar stikla irbulīti, un putekšņus atdala,
filtrējot caur sterilu neilona sietu.
Sieta poru diametram Datura kultūrai jābūt 40 µm,
tomātiem – 25 µm, kukurūzai – 100 µm, utt.
Suspensiju ar putekšņiem pēc tam centrifugē 5 minūtes ar 500-800
apgriezieniem minūtē.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Putekšņus pārvieto svaigā barotnē, ko vairākas reizes nomaina, resp.,
kultūru skalo, lai atbrīvotos no inhibitoriem, un lai
mikrosporas varētu augt un attīstīties.
Attiecībām jābūt tādām, lai 1 ml barotnē būtu 103 – 104 putekšņi.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Kultivēšanu veic Petri platītēs, pie kam šķīduma slānim ir jābūt plānam, lai
nodrošinātu kultūras aerāciju. Kultivēšana jāveic 27-30 C vājā
apgaismojumā vai arī sarkanā gaismā.
Mikrosporas labāk kultivēt šķidrā barotnē, bet var izmantot arī “mīkstu” agarizētu
barotni.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Jaunie embriji var veidoties barotnē apmēram pēc mēneša.
Barotni putekšņiem izmanto vienkāršu, bet embriju attīstībai vajag citu, sarežģītāku
barotnes sastāvu. Kā svarīgas sastāvdaļas tiek minēti
mezoinozīts, glutamīns un serīns.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.1.2. Olšūnu un ovāriju kultūras
Līdzīga pieeja kā putekšņu un putekšnīcu kultūrām ir arī olšūnu un ovāriju kultūrām.
Kā piemēru var minēt M.Sitbon (1981) publikāciju. Autora uzdevums bijis iegūt haploīdus augus no vairākām Gerbera
jamesonii šķirnēm.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Ziedu kurvīšus noņēma rudenī. Eksplantu izolēšanai izmantoja 4 malējos
riņķus ar mēlziediem. Kultūrā tika ievadītas neapaugļotas
olšūnas. Kalluss veidojās no olšūnu iekšpuses, savukārt no šā kallusa iegūti dzinumi. Šādā veidā tika iegūti vairāk nekā 10
dzinumi no viena eksplanta.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.1.3. Haploīdu iegūšanas jēga
Haploīdie augi, kas iegūti no putekšņu vai putekšnīcu kultūrām, ir sterili un
nedod sēklas. No šiem augiem var iegūt homozigotus
diploīdus.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Metodes būtība ir pirmkārt, spēja veidot monoploīdu augu
ar vienu hromosomu kompektu,otrkārt, veidot homozigotas, dubulti
haploīdas tīras līnijas (DH) un,treškārt, iegūt meijotiskus rekombinantus
ar unikālu genoma veidojumu (Caranta et al., 1996).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Kāpēc, piemēram, gerberai ir izdevīgi iegūt šādus DH augus?
Gerbera ir ļoti viegli pavairojama ar sēklām, taču šādā veidā šķirņu īpašības
nesaglabājas. Savukārt pavairošana ar spraudeņiem nav
tik efektīva un ir sarežģītāka, jo speciāli ir jāsagatavo mātes augi.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Gerberu šķirnes mēs pavairojam ar audu kultūru metodi, bet ar sēklām tas būtu krietni lētāk. Tad, lūk, iegūstot kādas
šķirnes haploīdu un no tā savukārt monozigotu diploīdu jeb DH, to iespējams pavairot arī ar sēklām. Tas būtu viens no
piemēriem.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Haploīdus augus izmanto arī atlasei pēc noteiktām īpašībām, teiksim, pēc izturības
pret herbicīdiem. Apskatīsim shēmu, ko attēlojis Chaleff
(1983). Tajā shematiski attēlotas galvenās darbības pozitīvo mutantu atlasei augu
audu kultūrās. Mutaģenēze palielina ģenētisko variabilitāti šūnu populācijā.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Inkubācija sākumā neselektīvos apstākļos ir svarīga, lai dotu iespēju eksperimentos inducēto
mutantu gēnu ekspresijai. Tālāk šūnas tiek pārstādītas herbicīdu saturošā barotnē, lai atlasītu šūnas, kas ir rezistentas pret
šo herbicīdu. Un nobeigumā Chaleff veicis diploidizāciju vai nu ar ķīmisku reaģentu palīdzību, vai notikusi spontāna diploidizācija, kā rezultātā iegūts DH
augs, kas spējīgs veidot fertilas sēklas.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.2. Poliploidizācija in vitro
Poliploidizācijas izraisīšana dod iespēju krāšņumaugu selekcionāriem iegūt parasti
lielākus vai arī pildītus ziedus.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Konkrēti rododendriem poliploidizācija bija devusi
lielākus ziedus, ilgāku ziedēšanas laiku un
tumšākas krāsas,dubultojoties hromosomām
(Väinölä et al, 2001).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Minētie somu zinātnieki pielietojuši kolhicīnu un orizalīnu (oryzalin).
Viņi secinājuši, ka orizalīnā bijusi sliktāka izdzīvotība nekā kolhicīnā, bet tetraploīdu skaits – lielāks.
Kopumā kolhicīns 0,05% koncentrācijā un orizalīns 0,005% koncentrācijā ar ekspozīcijas laiku 48 stundas devuši rododendru kloniem
~ 12% tetraploīdu.Šeit tomēr jāpiebilst, ka diploīdo klonu lapas
eksperimentos uzrādīja labāku izdzīvotību aukstumā nekā tetraploīdo.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
11.3. Daži svarīgi aspekti selekcijā in vitro
Ar šķirnēm diemžēl ir tā, ka augi ar krāšņākiem ziediem un lielākiem un saldākiem augļiem
mēdz būt neizturīgāki pret dažādiem ekoloģiskiem apstākļiem, piemēram,
krāšņās lilijas (Orientālā grupa) pret pastiprinātu nokrišņu daudzumu,
minētie rododendri pret ziemas apstākļiem (sals, temperatūras svārstības), utt.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Tādēļ arī Rietumeiropā un Amerikā parādījies jauns virziens selekcijā: atzīto kultūras šķirņu krustošana ar
sugām, kas ir dabā, kā arī vecajām šķirnēm
(lai “uzlasītu” pazaudētos gēnus).
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
2000.g. simpozijā Somijā, kas bija veltīts jaunām selekcijas metodēm in vitro,
Kanādas zinātnieki iepazīstināja ar plašu zemeņu selekcijas darbu šajā virzienā.
Viņiem norit sadarbība ar individuāliem fermeriem, kam nosacīti izolētos apstākļos ir
lielas lauku platības ar zemeņu sugu kolekciju.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Savukārt EUCARPIA simpozijā Beļģijā 2001.g. tika stāstīts par modernu rožu selekcijas virzienu, mēģinot
iekrustot dažādas sugas rozes, kā arī 19. un 20. sākumā veidotās šķirnes.
Tad ir jāsaka, ka Latvijas selekcionāre Dzidra Rieksta Nacionālajā botāniskajā dārzā Salaspilī
ar šādu rožu selekcijas virzienu darbojas jau no 20.gs. 60.-ajiem gadiem un ir ieguvusi tādas
parka rožu šķirnes, kādas ārzemnieki cenšas iegūt tikai tagad.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Kāpēc šāds darba virziens?Apskatīsim šo pašu piemēru par parka rozēm.
It kā tās nebūtu tik krāšņiem ziediem kā tējhibrīdrozes, bet āra apstākļos tās
veido kompaktu krūmu ar vienmērīgu zarojumu un lapojumu,
ziedi bagātīgi noklāj krūmu, un Dz. Riekstas veidotās šķirnes mūsu mainīgajās ziemās
pārziemo bez segšanas.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Visas šīs uzskaitītās īpašības nepiemīt tējhibīdrozēm.
Līdz ar to parka rozes dārzos un parka apstādījumos kopumā ir daudz
dekoratīvākas un prasa mazāk darbanekā tējhibrīdrozes.
Pie tam no parka rozēm var veidot arī cērpamu dzīvžogu, kas vasarā arī skaisti
ziedēs un smaržos.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Tikai lieta tāda, ka krustošanai derīgās sugas kā mātesaugi nevar dot pietiekamu krūma formu un ziedu krāsu daudzveidību, ja tās krusto ar ģenētiski radniecīgām rozēm.
Savukārt attālā hibridizācijā nevar iegūt fertilas sēklas ar klasiskās selekcijas metodēm.
Un, lūk, tieši šeit ir dažādu in vitro metožu pielietošanas nepieciešamība, kā
izolēto embriju kultūru, protoplastu kultūru, u.c.
2005. gada 21. aprīlī11. lekcija
Tajā pašā EUCARPIA simpozijā zinātnieki no Izraēlas ziņoja par saviem
mēģinājumiem gēnu inženierijas ceļā iegūt smaržīgas lizantes.
Lizante zied skaistiem, krāšņiem ziediem, bet tie nesmaržo.
Un tad tiek veikti eksperimenti, lai piemeklētu augus, no kuriem izolētie, par
smaržu atbildīgie gēni tiek pieņemti lizantēs.