Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie Medizinische Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Southern- und Northern- Blot-Analysen Gk-Methodenseminar.

Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologie

Medizinische Klinik IIINikolaus-Fiebiger-Zentrum

Southern- und Northern-Blot-Analysen

Gk-MethodenseminarErlangen, März 2007

Graduiertenkolleg 592: Lymphozyten – Reifung, Differenzierung & Deviation 2

Modifiziert aus Elelectrophoresis in Practice by Westermeier, 2nd Edition

DNA

Migration

Elektrophorese

Transfer

Nachweis

BlockBlocksubstanz

Spezifische Sonde bzw. Antikörper

Southern

Übersicht: Blotting-Methoden

WesternProteinNorthern RNASouthwesternNorthwestern


Methode zum qualitativen (z.B. Größe) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter DNA-Sequenzen

Isolierung der DNA bzw. PCR-Amplifikation

Restriktionsverdau isolierter DNA

Agarosegelelektrophorese

Transfer

Hybridisierung mit spezifischer DNA-Sonde

Signalentwicklung

Southern-Blot-Analyse


Größen-Standard

Modifiziert aus Recombinant DNA by Watson et al., 2nd Edition

Sonde hybridisiert mit komplementären Sequenzen

RNA or DNA

Gel Membran

Transferierte DNA/RNA

ElektrophoreseElektrophorese

Hybridisierung mit spezifischer Hybridisierung mit spezifischer radioaktiven Sonderadioaktiven Sonde

TransferTransfer

Exponieren mit Exponieren mit RöntgenfilmRöntgenfilm

Filter imGefrierbeutel

Gel

Puffer

Schwamm

Membran

Filterpapier

Autoradio-gramm

Migration

Markierung Markierung der Sondeder Sonde

Gewicht

Übersicht: Southern-Blot-Analysen


Proteinase K/Phenol-Methode

Zellen bzw. Gewebe in SDS-Puffer lysieren

Verdau der RNAmit RNAse A/T1

Extraktion des Lysats mit Phenol und

Phenol/Chloroform

Verdau der Proteine mit Proteinase K/SDS

Präzipitation der DNA mit Na-Acetat und EtOHauf Eis oder -200C/12 hrs

Lösen der DNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /

1mM EDTA)

DNA

Phenol

DNA-Isolierung und -Quantifizierung


Ionenaustauschchromatographie nach Qiagen

St - HindIII Sau3A

Lyse cells in SDS buffer with

ProtK and RNAse

Apply to Resin

Elute

0

0

0

0

0

0

+

+


Quelle DNA (mg)

1 Säugetierzelle: 510-12 (= 5 pg)

106 kultivierte Zellen : 2.5-10

10 mg Maus-Leber: 10-15

300ml Blut: 1-10

Ausbeuten


µg/ml Nukleinsäure = OD260 x Umrechnungsfaktor

Umrechnungsfaktoren (für Küvette mit d = 1cm):ds-DNA: 1 OD260 Unit = 50µg/ml ssDNA: 1 OD260 Unit = 35µg/ml

ssRNA: 1 OD260 Unit = 40µg/ml

ss Oligonukleotide: 1 OD260 Unit = 20µg/ml

Quantifizierung und Reinheit isolierter Nukleinsäuren

Gute DNA: OD260 / OD280 = 1.7 - 1.9

Gute RNA: OD260 / OD280 = 2.0 - 2.2.

Photometrische Konzentrationsbestimmung

Reinheit


Entdeckung und Eigenschaften

Erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden entweder innerhalb (Typ II) oder außerhalb der Erkennungsstelle (Typ I)

Ca. 3,000 Restriktionsenzyme mit ca. 230 Sequenzspezifitäten

Hauptsächlich in Bakterien, aber auch in einigen Viren und Eukaryonten

Host-controlled restriction modification bei Bakteriophagen (Luria, 1950) ,

Erste Sequenz-spezifische Typ I Endonuklease (Arber and Linn sowie Meselson and Yuan, 1968)

Erstes Typ II-Restriktionsenzym Hind II (Smith und Kollegen, 1970)

Nobelpreis für Medzin an Werner Arber, Hamilton Smith und Daniel Nathans (1978)

Mit Entdeckung der RE begann der Start der Molekuarbiologie

Restriktionsenzyme


KpnI

5´-GGTNACC G GTNACC3´-CCANTGG CCANTC-5´ G

5´-GGTACC GGTAC-3´ C3´-CCATGG C CATGG

5´-CCCGGG CCC GGG3´-GGGCCC GGG CCC

XmaI

BstEII

Asp718I

SmaI

5´-CCCGGG C CCGGG3´-GGGCCC GGGCC-5´ C

5´-GGTACC G GTACC3´-CCATGG CCATG-5´ G

3´ Überhang3´ Überhang

BluntBlunt




Isos

chiz

omer

eIs

osch

izom

ere

Einige Beispiele von Typ II-Restriktionsenzymen


Enzymatische Aktivität von Restriktionsenzymen

Die Aktivität von RE wird in Units [U] angegeben

1U entpricht der Menge an Enzym, das

1 ug Phagen-DNA (ca. 45kb) in 1 Stunde unter optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen

verdaut


Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung

Interkaliert zw. Basen Bindung ist proportional zur

Fragmentlänge EtBr löst Fluoreszenz-

löschung von eingestrahl-tem UV-Licht aus Fragmente orangerot

(Empfindlichkeit: 1-2ng DNA)

EtBr-Färbung elektrophorestisch aufgetrennter genomische DNA

Agarose-Gelelektrophorese


Glasplatte

Nylon Membran

PapiertücherWhatman Papier

Gewicht: ~250 g

Gel

10 x SSC

Whatman Papier-Brücke

Poröser Stein20xSSC

Wahl der Membran

Kapillar-Transfer

Aufbau

Nitro-zellulose

Nylon

Bindung hydrophob(backen)

Kovalent(UV)

Fragmente Denaturiert > 300bp

denaturiert > 50bp

Transfer Kapillar KapillarElektro

Sonden Alle v.a radioaktiv markierte Sonden

Bindungs-kapazität

Hoch gering


Fragmentierung durch Säure- und Alkalibehandlung

(modifiziert aus: Knippers, Molekulare Genetik)

Probleme Nur Einzelstrand-DNA bindet

an Membran Große DNA-Fragmente

(> 10kb) transferieren schlecht

1. Fragmentieren2. Denaturieren

OH

H+

AdeninDepurinierungdurch Säure

Spaltung der N-Glykosid-Bindung

-OHDenaturierung und Spaltung durch Lauge

Spaltung der Phospho-Diesterbindung)


Sonden

Doppelsträngige (ds) DNA

Einzelsträngige (ss) DNA

Einzelsträngige (ss) RNA

Oligonukleotide (20 - 50 Basen)

Verwendung markierter Desoxynukleotide während der Synthese bzw.

Markierung fertig synthetisierter DNA und RNA-Fragmente sowie Oligos

Prinzip

Markierung der Sonde


Markierte Desoxynukleotide

2

Digoxigenin-dUTP

Biotin-7-dATP

Biotin

[32P]-dATP

Digoxigenin

(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm)

α γ


* * * 5‘ 3‘

5‘ 3‘

‚Nick-Translation‘‚Random-Prime‘

Markierungsmethoden

3‘ 5‘dsDNA-Sonde

5‘ 3‘3‘ 5‘

dsDNA-Sonde

5‘ 3‘

5‘ 3‘

Klenow + P*dNTP

1. 950C2. Hexa-dNTP-Gemisch 5‘ 3‘

3‘ 5‘

Dnase I

Kornberg Pol (3‘-5‘ Exo)

* * *

3‘ 5‘

Markierung

5‘ 3‘3‘ 5‘

Kornberg Pol (Pol) + P*dNTP


***3‘ 5‘

5‘-EndmarkierungIn vitro Transkription 3‘ Tailing

Vektor mit Sondensequenz+ T7-Promoter

* * * *

* * * *

* * * ** * * *

T7RNA-Pol+ P*NTP

5‘ 3‘3‘ 5‘

dsDNA-Sonde

5‘ 3‘3‘ 5‘

* 5‘ 3‘3‘ 5‘*

5‘-Kinase+ P*dNTP

TdT+ P*dNTP

5‘ 3‘***

dsDNA-Sonde

* Markierung


Spezifische Aktivität und chemische Konzentration

Spezifische Aktivität

z.B. 3000 mCi pro mMol

Chemische Konzentration

mMol pro liter

Konsequenz:

Setzt man 100 mCi eines 32P-markierten Fragments mit 3000mCi/mmol bzw. 300 mCi/mmol ein, so ist die chemische Konzentration des Fragments mit der höheren spezifischen Aktivität um das 10-fache geringer

(Beispiel: Über Random-prime bzw. Nick-translation markierte Sonden)


Fixieren der transferierten

Nukleinsäure (UV oder 800C)

Gel Membran

Transferierte DNA/RNA

1. Prähybdridisierung2. Hybridisierung3. Waschen

HybridisierofenEinfrierbeutel

Markierte Sonde

Hybridisierung


Nachweis radioaktiv-markierter Sonden

Belichten eines Röntgenfilms mit Verstärkerfolie Bei –700C

VerstärkerfolieMembran

Röntgenfilm

Autoradiogramm

23

9.4

6.6

4.4

kb

Nachweis der Hybridisierung


Photon

Ag+ Ag* Ag *•Ag*

t½=1sec

Zur Entwicklung von aktivierten Silber-atomen (Ag * ) während der Filment-wicklung benötigt man mindestens zwei aktivierte Silberatome. Bei niedrigen Temperaturen ist die Halbwertszeit des ersten aktivierten Silveratoms größer. Dadurch erhöht sich die Wahr-scheinlichkeit, dass ein zweites aktivier-tes Ag-Atom entsteht, bevor das erste Silberatom wieder reduziert wird

Einfluß der Temperatur Einfluß der Verstärkerfolie

Membran

Röntgenfilm

Verstärkerfolie

-Strahlung


Markierte Sonde

Nachweis nicht-radioaktiv markierter Sonden

Kolorimetrisch

Immobilisiertes Fragment

AP

Avidin

AP

Ak

BiotinDigoxigeninRedoxreaktion mit reduziertem farblosen P-Substrat(z.B. NTB/BCIP-Reaktion)


Schematic of the NBT/BCIP reaction: when alkaline phosphatase (AP) removes the phosphate group of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) the resulting molecules dimerizes under oxidating conditions to give the blue precipitate (5, 5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo). During the reaction with BCIP, NBT (nitroblue tetrazolium) is reduced to its colored form to give an enhanced color reaction

(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen,


Chemilumineszenz

Schematic of the CSPD reaction: Enzymatic dephosphorylation of the dioxetane CSPD by alkaline phosphatase leads to the metastable phenolate anion, which decomposes and emits light at 477 nm.

(adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen, Gößl et al., Zentrum für Angewandte Genetik)


Verfizierung der Identität eines PCR Produktes bzw. DNA-Fragmentes

Kartierung isolierter DNA-Fragmente

Analyse von Intronsequenzen

Nachweis von Genmutationen

Nachweis von Genumlagerungen

Nachweis der homologer Rekombinationen (gezielte Mutationen z.B. bei Mäusen)

Anwendungen


Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgen-Umlagerungen

Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgene werden durch Umlagerung von Gen-segmenten während der Reifung von B- und T-Zellen aus Blutstammzellen ge-bildet


Beispiel: Genumlagerung am Schwerkettengen-Lokus

Kb

6 -

5-

4 -

3 -

2 -

1 -

S B+/- B+/+

Sonde

Eco-Verdau + SondeSonde


J C

5’ J

Pst I Pst I

7-kb wildtype fragment

(JkW)

Pst I Pst I

5.7-kb targeted fragment

(JkT)

neo

Pst I digest5’ J probe

JW (7.0)

JT (5.7)

5 6 7 8

+/-

+/- +/+

Wild

type

Beispiel: Nachweis gezielter Mutationen in transgenen Mäusen

Wildtypelocus

Targetedlocus

Aus: Kline et al, JI 1998


Gendiagnostik

Dia entnommen aus www.????


Methode zum qualitativen (z.B. Größe !!!!) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter RNA-Sequenzen

RNA-Isolierung

Denaturierung

Agarosegelelektrophorese

Transfer

Hybridisierung

Signalentwicklung

Northern-Blot-Analyse


Eine eukaryontische Zelle enthält etwa 10 pg Gesamt-RNA

ca 80 - 85% ribosomale RNA

ca. 15 - 20% tRNA and snRNA ca. 1-5% mRNA

Typische Ausbeuten (g)

106 Hela : 15

106 COS-7 35

106 NIH/3T3 10

10 mg Milz 35

10 mg Hirn 8

RNA-Isolierung


Vorsichtsmaßnahmen

Handschuhe tragen (Haut ist kontaminiert mir RNAsen)

RNAse-freie Reagentien separat im Labor lagern

Verwendung steriler Einwegmaterialien (Zellkultur)

Glasswaren sollten bei 2000C gebacken werden

Behandlung von deionisiertem Wasser mit 0.1% Diethylpyrocarbonat (DEPC, von Sigma)

Gelkammern und andere Materielen für RNA-Arbeit reservieren

Verwendung von RNase-Inhibitoren (Rnasin von Promega)


Erfolgreiche RNA-Isolierung (4-Punkte-Regel)

1. Inaktivierung der RNAse-Aktivität

2. Effektiver Zellaufschluß

3. Denaturierung der Nukleoproteinkomplexe

4. Entfernung von Protein und DNA

OH + CHCl3 S-C N2HN C NH2

NH2+-

Guanidinium-Isothiocyanat (GIT)

Phenol / Chloroform

o Inaktiviert RNAsen

o Guter Zellaufschluß

o Zerstört Nukleoprotein-komplexe

o Zerstört Nukleoprotein-komplexes

o Extrahiert DNA und denaturierte Proteine


Isolierung von Gesamt-RNA

Lyse der Zellen bzw. Gewebe

mit GIT/-ME lysieren

Extraktion des Lysats mit Phenol und

Phenol/Chloroform

Präzipitation der RNA mit Na-Acetat und EtOHauf Eis oder -200C/12 hrs

Lösen der RNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /

1mM EDTA)

DNA

RNA

CsCl-Dichte-zentrifugation

Lösen der RNA in TE(10mM Tris pH=8.0 /

1mM EDTA)

Reinigen der RNA über Ionenaustauscher-Matrix

(Qiagen, Promega)

1

3

2

Reinheit:OD260/280 = 2.0 - 2.2


Isolierung zytosolischer RNA

Zellen bzw. Gewebe werden in nicht-ionischem Detergenz

(NP-40, Triton X-100) lysiert

RNA wird mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder bei -200C/12 hrs präzipitiert

RNA wird in TE gelöst(10mM Tris pH=8.0 /

1mM EDTA)

Reinheit:OD260/280 = 1.8 - 2.0

Kerne werden abzentrifugiert(Eppendorf, 13000g)

Postnukleärer Überstand wird mit Phenol/Chloroform extrahiert


Isolierung von Kern-RNA mRNA-Isolierung

-TTTTTT

AAAAAA cap

mRNA

Oligo-dT

Zellen mit nicht-ionischen Detergenz aufschließen

Kerne über Sucrose-gradienten aufreinigen

RNA über GIT-Methode und CsCl-Gradienten aufreinigen

Zellen mit GIT aufschließen

Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Matrix

Sepharose, Cellulose oder Magnet. Partikel


Einzelsträngige, isolierte RNA-Transkripte besitzen viele, thermodynamisch-stabile

Sekundärstruktur

Analog Southern-Methode, RNA muss aber denaturiert werden

Schmier im Agarosegel

Elektophorese und Transfer

Formaldehyd

Verhindert Wasserstoffbrücken-bindungen zwischen Basen und somit die

Ausbildung einer Sekundärstruktur

Denaturierte RNA-Fragmente haben keine Sekundärstruktur

Scharfe Bande im Agarosegel


Beispiel: Formaldehyd-Agarose-Elektrophorese verschiedener RNA-Fraktionen aus Hybridomzellen

HC+/-

Hybridom

HC-Sonde

Aktin-SondeEtBr

Gesamt-RNA = G

Kern-RNA = K

Zytoplasma-RNA = Z

Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie Medizinische Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Southern- und Northern- Blot-Analysen Gk-Methodenseminar.

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