h cre mikrocerrahi y ntem(trk).pdf463.61 KB

Hücre Üzerine Mikrocerrahi

Uygulamaları

Hücrenin altbirimlerine

ayrılması

Moleküllerin analizi

Prof. Dr. Müjgan Cengiz

Canlı Hücrelerdeki Moleküllerin

İzlenmesi

Mikroskopla inceleme hücrede belli

düzeyde araştırma sağlar.

Hücre sabit bir yapıda değildir. Stabil görünen yapılar bile birleşir ayrılır yeniden organize olur.

Bu dinamik yapının izlenmesinde optik mikroskop kullanılır. Görüntüleme için radyoaktif bileşikler, floresan boyalar(aequorin) kullanılır .

Balık yumurtasına lüminesan protein

olan aquorin verilince serbest Ca

varlığında floresan ışık yayılır.

Spermle birleşen yumurtanın Ca ları

10 saniyede değişir.

Serebellumdaki purkinje

hücrelerindeki kalsiyum değişimi

floresan bir boya ile görünür hale

getirilir.

Hücreye Membrandan geçemeyen maddelerin yerleştirilmeleri.

A) Maddeler hücreye bir mikropipet yardımıyla basınç uyulayarak veya eğer madde elektrik yüklüyse voltaj ugulayarak yerleştirilebilir. Uygulanan voltaj iyonik yük nedeniyle maddeyi hücre içine geçirir. Bu yönteme iontophoresis denir.

B) Hücre zarı kısa ama yoğun bir elektrik şokuna tabi tutularak membran yapısı bozulur ve made membrandan kolayca geçecek hale getirilir.

C) Membranla kaplı veziküller istenilen madde ile yüklenir ve hedef hücreye entegre olarak maddeyi hücre içine geçirir.

D) DNA ile kaplanmış altın partikülleri farklı bir geni çekirdeğe sokar.

Hücrenin Altbirimlerine Ayrılması

Biyokimyasal analizlerin yapılabilmesi için hücrenin doğal yapısının bozulması gereklidir.

Çeşitli hücre altbirimlerinin ayrılması için zarar verici olmayan ayırma yöntlemleri gereklidir.

Bu işlem organellerin kendi fonksiyonlarının korunması için gereklidir.

Doku önce kendisini oluşturan hücre tiplerine ayrılır.

Daha sonra fonksiyon gören organellerine ve makromoleküllerine ayrılır.

Organeller ve Makromoleküller

Ultrasantrifüjleme Yoluyla Ayrılır

Hücreler çeşitli yollarla parçalanabilirler.

A) osmotik şok uygulanabilir

B) Ultrasonik titreşim veya

C) Küçük bir kapta ona uygun bir kolla

ezilebilir veya

D) Blendırda parçalanabilir(kesici

bıçakla).

Bu işlemler hücrenin pek çok zarını

parçalayarak (plazma membranı ve

endoplazmik retikulum membranı)

bazı zarlarda küçük kapalı veziküller

oluşturur.

Bu parçalama işlemi dikkatlice

uygulanırsa, çekirdek, mitokondri,

golgi aygıtı, lizozomlar ve

peroksizomlar gibi organeller zarar

görmeden izole edilebilirler.

Hücrelerin bu süspansiyonu yoğun bir

karışımdır (buna homojenat veya ekstrakt

denir) ve çeşitli membranla çevrili

organelleri içerir. Bu organellerin her biri

farklı büyüklük, yük ve yoğunluğa sahiptir.

Kullanılan homojenizasyon ortamı

dikkatlice seçilmelidir (her organel için

ardarda yapılan deneme yöntemi ile

bulunmuştur).

Homojenatın farklı bileşenleri ayrılacaktır.

Bu şekilde hücre organellerinin ayrılması preparatif ultrasantrifüjleme yoluyla yapılır. Hücre içeriğinin bulunduğu karışım yüksek hızlarda santrifüjlenir.

Preparatif Ultrasantrifüjleme

Bu yöntem hücre komponentlerini

büyüklük ve yoğunluklarına göre

ayırmaktadır:

Genellikle, ayrılacak olan en büyük

birimler en hızlı çöker.

Düşük hızlarda çekirdek sedimenti gibi

büyük bileşenler santrifüj tüpünün

dibinde bir tortu oluştururlar;

Daha yüksek hızlarda mitokondri

pelleti çöker;

Daha yüksek hızlarda ve daha uzun

santrifüjleme işlemlerinde önce küçük

kapalı veziküller daha sonrada

ribozomlar çöker.

Santrifüjleme adımlarının tipik değerleri

şunlardır:

Düşük hız santrifüjleme 1000 g’de 10

dakika

Orta hız santrifüjleme 20,000 g’de 20

dakika

Yüksek hız santrifüjleme 80,000 g’de 1

saat

Çok yüksek hız santrifüjleme 150,000

g’de 3 saat

Bütün bu bileşenler kirlidir, bulaşanların

temizlenmesi için pellet birkaç kez

kullanılan tamponla yıkanıp tekrar

santrifüjlenir.

Yoğunluk Garadienti Santrifüjlemesi

Yoğunluk gradiyenti santrifüjlemesi olarak

adlandırılan diğer bir santrifüjleme yöntemi de

vardır.

Bu işlem santrifüj tüpünün sukroz gibi bir

çözeltinin farklı yoğunluklarda doldurulmasıyla

uygulanır.

Oluşturulan yoğunluk gradienti (en yoğun

bölümü tüpün en altındadır)aşağıdan yukarıya

doğru azalan yoğunluklarda hazırlanır ve

ayırma işlemi sırasında bu bantlar birbirine

karışmaz.

Daha iyi bir ayırım yapabilmek için

homojenat yoğun olmayan bir tuz

çözeltisi içinde santrifüj tüpünün

üzerine ince bir pipet yardımıyla

uygulanır (santrifüj tüpü %5 ile %20

arasında tabakalandırılmış sukroz

çözeltisiyle hazırlanmıştır).

Santrifüjleme yapıldığı zaman,

karışımdaki çeşitli bileşenler gradient

boyunca farklı bantlara hareket ederler,

her bir bileşen hız sedimentasyonu

denilen bir işlemle farklı hızda çöker.

Bunu izleyen santrifüjlemede farklı

bileşenler tek tek toplanır, basitçe bu

işlem santrifüj tüpünün tabanının

delinmesiyle gerçekleştirilir.

Parçalanmış hücrelerde kompleks

işlemlerin moleküler ayrıntılarının

incelenmesi

Ultrasantrifüjle izole edilmiş olan organellerin

ve diğer büyük hücresel alt birimlerin

çalışılması farklı hücresel bileşenlerin

anlaşılmasına çok büyük katkılar yapmıştır.

Santrifüjleme ile saflaştırılmış

mitokondri ve kloroplastlarla yapılan

deneylerde bu organellerin temel

fonksiyonları ve enerjiyi hücrelerin

kullanabileceği şekle nasıl

dönüştürdüğü gösterilmiştir.

Benzer şekilde, düz ve granüllü

endoplazmik retikulumdan

(mikrozomlar) oluşan salgı vezikülleri

birbirinden ayrılarak hücrelerde bu

kompartmanların fonksiyonları

incelenmiştir.

Proteinler kromatografi yöntemi ile

ayrılırlar

Proteinler kolon kromatografisi ile

ayrılabilirler. Bu yöntemde çözeltideki

protein karışımı geçirgen katı bir

matriks ile doldurulmuş kolondan

geçirilir.

Farklı proteinler matriks ile

etkileşimlerine bağlı olarak farklı

zamanlarda kolondan ayrılırlar ve akış

zamanına göre kolonun ucundan

toplanırlar (şekil).

Örnek (farklı moleküllerin karışımı) kolonun üstüne uygulanır.

Matriks, sellüloz gibi geçirgen bir maddedir.

Büyük miktarda sıvı kolondan geçirilir.

Moleküller tabandan toplanır.

Farklı örnek bileşenleri farklı hızlarda hareket ederler.

Ve ayrı tüplerde toplanırlar.

Kromatografide üç tip matriks

kullanılmaktadır.

İyon-değişim kromatografisi (A)

kullanılan matriksin taşıdığı yük, ters

yükteki moleküllerin geçişini engeller.

Kullanılan matriks tipleri;

Dietillaminoetilselüloz (DEAE-cellulose)

pozitif yük taşır ve karboksimetilselüloz

(CM-cellulose) negatif yük taşır.

Jel filtrasyon kromatografisi (B) matriks

inert ama geçirgendir. Moleküller

matriksten geçecek kadar küçüktür fakat

kolondan yavaş geçerler.

Matriks materyallerinden olan

polisakkaridin por büyüklüğüne göre

farklı tipleri vardır (dekstran, agroz veya

akrilamid). Bu özelliğinden dolayı çeşitli

molekül ağırlığındaki moleküllerin

ayrılmasında kullanılır.

Affinite kromatografisi (C) özel bir

liganda kovalent olarak bağlanmış suda

çözünmez bir matriks içerir. Bu ligand bir

antikor molekülü veya özel bir proteini

bağlayan bir enzimin substratı olabilir.

• Bu substrat özel bir proteini bağlayabilir.

•Enzim molekülü immobilize substrata bağlanır.

•Bu enzim tutulmuş olur. Sıvının kalan kısmı akar.

•Daha sonra bu immobilize enzim diğer bir çözeltiyle bu bölgeden uzaklaştırılır.

• Bu çözelti antijen-antikor kompleksi oluşturabilir veya ayrılacak bileşiğe uygun yüksek tuz içeren bir çözelti veya farklı pH’da bir bileşik olabilir.

•Aranan bileşik saf olarak ayrılır.

Elektroforez

Bir proteinin büyüklüğü ve altbirim kompozisyonu SDS poliakrilamid jel elektroforezi tarafından saptanabilir.

Proteinler net negatif veya net pozitif yük taşırlar.

Protein içeren bir çözeltiye elektrik yükü uygulandığında proteinler büyüklük, yük ve şekline bağlı olarak göç ederler.

Bu teknik nişasta gibi geçirgen bir matriks içine uygulanan proteinleri ayırmak için kullanılır.

Her protein molekülü çok sayıda negatif yüklü

SDS molekülü bağlar.

Bu işlem proteinin yükünü maskeler.

Proteinin pozitif elektroda göç etmesini

sağlar.

Daha sonra voltaj uygulanır.

Poliakrilamid jel moleküler elek olarak

davranır.

Büyük moleküller küçüklerden sonra göç

eder.

Protein karışımı ayrı protein bantları olarak

görülür.

Referanslar

1- 1-Molecular Biology of the

Cell.Alberts B.,Johnson A.,Lewis

J.,Raff M.,Roberts K.,Walter P.4.

Edition. Garland Science 2002.

2-The Cell Molecular Approach.

Cooper M.G. Hausman R.E. 3

Edition.ASM Press.2004.