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UNIVERSITE PARIS-SUD 11 U.F.R. SCIENTIFIQUE DORSAY
THESE
prsente pour obtenir le grade de
DOCTEUR ES SCIENCES
DE LUNIVERSITE PARIS-SUD 11
Par
Guillaume Ne
Soutenue le 15 dcembre 2011
Etude de fonctions non-photosynthtiques pour les
thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana JURY : Pr S.
Nessler Prsidente du jury
Pr P. Geigenberger Examinateur
Dr F. Montrichard Rapporteur
Dr J.P. Reichheld Rapporteur
Dr E. Issakidis-Bourguet Responsable de la thse
-
Figure 70: Principle BIAcore sensor chips building with of strep
tag II fusion protein. Strep Mab-Immo antibody can be covalently
attached on CM-5 sensor chip. Then strep tagged protein can be
immobilized by the recognition and the binding of strep tag II at
the surface of the sensor chips for real time SPR analysis
-
Remerciements, Je tiens tout d'abord remercier en premier lieu
Didier Peltier de l'universit d'Angers qui, il y a 6 ans, m'a
permis de faire ma premire exprience de recherche en m'accueillant
dans son laboratoire. A l'poque, j'tais jardinier et ne savais mme
pas ce que signifiait PCR. Tu m'as fais confiance malgr mes trs
maigres connaissances en biologie cellulaire et tu m'as dmontr que
les jardiniers aussi pouvaient amplifier de l'ADN. La vue d'un
amplicon fluorescent sur un gel d'agarose a t pour moi "la"
rvlation, et j'ai compris cet instant que ma vie s'panouirait dans
un laboratoire bien plus vite que sous une serre. Ces quelques
semaines de stage ont suffi pour me faire reprendre de faon
dtermine les tudes universitaires. Par la suite, j'ai rencontr
l'universit Franoise Montrichard qui m'a donn le got de la
biochimie et surtout la passion pour cette famille de protines que
sont les thioredoxines. Merci Franoise d'avoir partag avec moi ta
passion, et de m'avoir form la biochimie. L'indpendance,
l'autonomie, la tnacit et l'efficacit sont aujourd'hui mes
principes fondamentaux et je te dois cet hritage. Merci galement de
m'avoir introduit au sein du laboratoire de signalisation redox o
j'ai effectu mon stage de M2, puis ma thse. Voila maintenant le
moment de remercier tous ceux qui m'ont accompagn au cours de ces
trois annes de thse et en premier lieu "ma chef ", Emmanuelle
Issakidiss. Merci de m'avoir donn ma chance dans ton labo il y a
quatre ans, et de m'avoir form. Tu m'as galement laiss beaucoup de
libert, ce qui m'a permis de donner une direction trs personnelle
ma thse. La confiance que tu as porte en moi et en mes hypothses
(parfois farfelues) ont t un facteur dterminant de ma russite.
Merci aussi Stphane Lemaire, avec qui j'ai beaucoup chang lors de
ma premire anne de thse. Les discussions scientifiques avec toi ont
t trs stimulantes. Merci aussi Myroslwa Miginiac-Maslow : vous
reprsentez pour moi la quintescence du chercheur accompli, votre
gentillesse, vos connaissances de la thmatique et de la biologie en
gnral m'impressionnent normment. Approcher (mme de loin) votre
niveau est devenu ma qute du Graal et j'ai pleinement conscience
que cet objectif est la frontire de l'impossible, mais votre
exemple est une source de motivation inpuisable. Merci galement
Hlne Vanacker. Nos discussions scientifiques ont t trs stimulantes,
et je n'oublierai pas que tu m'as beaucoup aid pour mes
enseignements, aussi bien d'un point de vue pdagogique
qu'administratif. Tu connais toutes les ficelles du milieu, et,
sans ton soutien et ton exprience d'enseignant-chercheur, j'aurais
eu beaucoup plus de mal grer ces deux activits. Merci galement
Mariette, Anne-Sophie, Xing Huang, Mirko, Gilles et Daniel. Avoir
partag des moments avec vous au labo et en dehors font de vous des
ami(e)s que je suis fier d'avoir. Merci Nathalie, Chantal,
Franoise, Martine, Laurine et Pierre. Vous avez t des collgues
formidables en qui j'ai pleine confiance, et qui m'avez normment
soutenu. Je vous dois beaucoup, et je ne serai jamais comment vous
remercier la hauteur de ce que vous m'avez donn. Merci aussi Mr
Jean pour sa joie, son enthousiasme, et sa culture (sans limite: Mr
Jean est une vraie encyclopdie vivante). Merci mon Thom Thom : sans
ton aide, c'tait foutu; je n'y serais pas arriv, tu m'as nourri
quand j'tais trop dbord ou dprim pour penser m'alimenter, ton sens
humain m'a souvent laisser pantois! Merci aussi Laure, ta future
femme qui en plus d'tre une source de bonne humeur, m'a toujours
prt son homme sans jamais se plaindre (jusqu' parfois pas d'heure),
quand face l'informatique capricieuse je ne suis souvent retrouv
bien dmuni.
-
Et merci tous ceux de l'Institut que j'aurais pu oublier et qui
m'ont aid (parfois beaucoup), je pense notamment Maryelle, Jean
Paul, Eric, Gilles Meeriam et Hoang. Merci mes trois brillantes
stagiaires Fanny, Sverine, et Roxane. Vous tes toutes trois trs
travailleuses et trs intelligentes, j'ai souvent t impressionn par
la pertinence de vos remarques et par votre assiduit au travail,
mme pour des tches pnibles (les innombrables semis agencs de
graines d'Arabidopsis...). Je suis profondment persuad que vous
irez loin. Votre prsence et votre soutien sans faille mes cots ont
t des bouffes d'oxygne sans lesquelles je me serais srement
asphyxi. Je tiens galement remercier toutes les personnes qui m'ont
accueilli dans leur laboratoire et qui ont pass du temps partager
leur comptence pour faire avancer mes travaux. Marielle Valerio
Lepiniec, Magali Aumont, vous m'avez initi la micro calorimtrie et
vous avez toujours gard espoir en mes manips, l o, moi-mme, je
perdais parfois confiance. Sylvie Nessler, comment te remercier de
m'avoir accueilli au LEBS, d'avoir pass beaucoup de temps m'couter,
m'aider pour faire avancer mon sujet ainsi que d'avoir investi
financirement dans mes manips. Grce toi j'ai dcouvert le monde des
structuralistes, et j'ai pu aller jusqu' l'obtention de petits
cristaux, et je n'en suis pas peu fier ! Christophe Bailly et
Patrice Meimoun, je vous dois une grosse partie de mon travail sur
la caractrisation de la physiologie de la germination, L aussi vous
avez cru en moi et en mes convictions. Je tiens finir en remerciant
mes amis, et surtout mes parents et ma soeur qui m'ont toujours
soutenu sans faille et normment aid pour les corrections
orthographiques de ce manuscrit. Vous avez toujours t l pour moi,
malgr mon comportement parfois la limite du manque de patience. Il
est temps de rendre Csar ce qui lui appartient, Maman, Papa cette
thse est aussi est la vtre!
-
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS
.........................................................................
1 INTRODUCTION
........................................................................
3 Les thiordoxines (TRX)
.................................................................
4
Systme de rduction des TRX
...........................................................................................................
5 Le systme NADP Thiordoxine rductase
....................................................................................................
5 Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes photosynthtiques
...................................................... 6 Rduction
des thiordoxines dans les plastes non photosynthtiques
............................................................ 7
Systme doxydation des TRX
...........................................................................................................
8 Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes
dArabidopsis thaliana .................... 9
TRX du type f
.................................................................................................................................................
9 TRX du type m
...............................................................................................................................................
9 TRX du type y
..............................................................................................................................................
10 TRX du type x
..............................................................................................................................................
10 TRX du type z
..............................................................................................................................................
10 Les glutardoxines (GRX)
............................................................................................................................
11
Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana
..................................................... 11 Les cibles
des thiordoxines
.............................................................................................................
11
Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme
photosynthtique ..................................... 12 Les cibles
de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme non
photosynthtique .............................. 12
Spcificits des TRX pour leurs cibles
.............................................................................................
13 Nature de la spcificit TRX cible
....................................................................................................
14 Phnotype des mutants pertes de fonction pour les
TRX..................................................................
15 Les TRX dans la physiologie des semences
.....................................................................................
16 Germination et formes actives de l'oxygne
.....................................................................................
16
Le cycle oxydatif des pentoses phosphate
.......................................... 18 La
glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PDH)
.........................................................................
19
Localisation subcellulaire des G6PDH dArabidopsis thaliana
...................................................................
19 Importance des G6PDH dans la physiologie des vgtaux
..........................................................................
20 Rgulation enzymatique des G6PDH
...........................................................................................................
20 Origine volutive de la rgulation redox des G6PDH
..................................................................................
21 Mcanisme catalytique des G6PDH
.............................................................................................................
22
La 6-phosphogluconate dshydrognase (6PGDH)
..........................................................................
23 Localisation subcellulaire des 6PGDH dArabidopsis thaliana
...................................................................
23 Mcanisme catalytique des 6PGDH
.............................................................................................................
24 Structure tridimensionnelle et sites catalytiques de 6PGDH
........................................................................
24 Modifications post traductionnelles des 6PDGH de plantes
suprieures .....................................................
25
Objectif de mon travail de thse
..................................................... 26 RESULTATS
.............................................................................
27 Premire partie
..........................................................................
28
Caractrisation biochimique de la rgulation post traductionnelle
des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate
................... 28
Etude biochimique des modifications post traductionnelles dune
6-phosphogluconate dshydrognase chloroplastique dA. thaliana
........... 29
Production et purification dune 6PGDH recombinante dArabidopsis
........................................... 29 Les modifications
post-traductionnelles de la 6PGDH1
...................................................................
29
Mise en vidence dune modification redox de lenzyme
............................................................................
29 Mise en vidence de la phosphorylation de lenzyme
..................................................................................
30 Analyse des squences primaires des 6PGDH dArabidopsis et
modlisation 3D de la 6PGDH1 .............. 31 Recherche de sites
dadressage aux organites
..............................................................................................
31 Identification de cystines candidates pour la modification redox
............................................................... 32
Recherche de sites de phosphorylation
.........................................................................................................
33
-
Etude de leffet des modifications post traductionnelles sur
lactivit de la 6PDH1 ........................ 33 Effet de la
modification redox sur lactivit de la
6PGDH...........................................................................
33 Effet de la phosphorylation de la 6PGDH sur lactivit
dshydrognase et interconnexion entre rgulation redox et
phosphorylation
..............................................................................................................................
34
Conclusion prliminaire sur la caractrisation biochimique de
lenzyme ........................................ 35 Rgulation redox
des glucose-6-phosphate dshydrognases plastidiales .. 37
Analyse des squences primaires des 4 G6PDH plastidiales
dArabidopsis .................................... 37 Production et
purification des G6PDH de type P1 (G6PDH1) et P2 (G6PDH2 et 3)
....................... 37 Toxicit de l'isoforme G6PDH4
dArabidopsis dans la bactrie E. coli
........................................... 39 Quantification des
thiols libres sur G6PDH1 native
.........................................................................
40 Caractrisation de la rgulation redox de l'activit des G6PDH
plastidiales .................................... 40 Validation des
rsidus cystine rgulatrices par mutagne dirige
................................................... 40 Spcificits
de rgulation redox des G6PDH plastidiales de type P1 et P2
...................................... 41 Rgulation de G6PDH1 par
dautres rdoxines plastidiales et par les mtabolites redox
................ 43
Dterminisme de la spcificit TRX / G6PDH
.................................... 45 Potentiel redox des
isoformes de G6PDH de type P1 et P2
.............................................................. 45
tude par calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) de linteraction
G6PDH1 / TRX ................... 46 Analyse des spcificits
dinteraction TRX / G6PDH par titration en microcalorimtrie
isotherme (ITC)
.................................................................................................................................................
47 Etude de linteraction TRX / G6PDH en rsonance plasmonique de
surface (RPS) BIAcore ......... 48
Etude des effets de la rgulation redox sur les proprits de la
G6PDH1 .. 51 Alignement des squences primaires des G6PDH
dArabidopsis avec les isoformes de structure connue et modlisation
structurale de G6PDH1
...............................................................................
51 Effet de la rgulation redox sur la structure quaternaire de la
G6PDH1 ........................................... 53 Dtermination
de la composition en structures secondaires des formes oxydes et
rduites de G6PDH1
............................................................................................................................................
54 Dtermination de constantes catalytiques pour les formes oxydes
et rduites ................................ 54 Mesure du
coefficient daffinit (Kd) pour le NADP des formes sauvage oxyde et
mutante de la G6PDH1 par Calorimtrie de Titration Isotherme (ITC)
..................................................................
55 Etude de laccessibilit des substrats au site actif
.............................................................................
56 Essai de cristallisation de la G6PDH1 et perspectives dtudes
structurales .................................... 57 Rgulation
TRX-dpendante de la G6PDH1 dans un systme Fd/TRX
reconstitu in vitro
.......................................................................
58 Deuxime partie
.........................................................................
60 Caractrisation de mutants perte de fonction pour les TRX du type
y .... 60
Profils dexpression des gnes des TRX plastidiales et des G6PDH
dans le contexte des mutants de TRX y
................................................................................................................................................
61
Validation de la perte de fonction des gnes muts par RT-PCR
semi-quantitative et quantitative ............. 61 Analyse de
lexpression des autres TRX plastidiales
...................................................................................
62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana
.....................................................................................
62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana dans un contexte
TRX y mutant .................................. 63
Etude in situ de lactivit G6PDH racinaire chez les doubles
mutants TRX y ................................. 64 Physiologie de
la germination des graines mutantes pour les TRX du type y
.................................. 65
Caractrisation de la qualit germinative des graines sauvages et
mutantes pour les TRX du type y .......... 66 Caractrisation de la
dormance chez Arabidopsis thaliana cotype Columbia
............................................ 67 Caractrisation de
la dormance des graines mutantes pour les TRX du type y
............................................ 68 Caractrisation de
la tolrance un stress thermique des graines mutantes pour les TRX
du type y .......... 69
Dosage et localisation in situ des formes actives de loxygne
dans les graines des mutants des TRX du type y
............................................................................................................................................
70
Production-diffusion du peroxyde dhydrogne et leve de dormance
........................................................ 70 Dosage
et localisation in situ de la production danion superoxyde dans les
graines des mutants de TRX y
......................................................................................................................................................................
71
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
............................. 73
-
Rgulation redox des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses
phosphate
.................................................................................
74
Mise en vidence de nouvelles fonctions pour les TRX des types f
et y et pour lisoforme m3 ...... 74 Coordination des cycles
rducteur (Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate par les TRX f
....... 75 Impact de la rgulation redox sur les proprits
catalytiques de la G6PDH1 ................................... 76
Rgulation post-traductionnelle dune 6PGDH chloroplastique
....................................................... 77 Nature
des spcificits TRX / cible dans la rgulation redox des G6PDH
plastidiales .................... 79 Mcanisme doxydation des TRX
.....................................................................................................
81
Etude in planta de fonctions pour les TRX y
...................................... 83 Impact de la perte de
fonction des TRX y sur lactivit G6PDH racinaire
....................................... 84 Rle des TRX y dans les
processus physiologiques de la germination
............................................ 84 Conclusion sur
lanalyse fonctionnelle in planta des TRX plastidiales dArabidopsis
.................... 85
MATERIELS ET METHODES
..................................................... 86 Matriel
vgtal et conditions de culture
.......................................... 87
Pisum sativum var. Nain merveille de Kelvedon
..............................................................................
87 Arabidopsis thaliana
.........................................................................................................................
87 Production des lots de graines dArabidopsis
...................................................................................
87 Culture in vitro
..................................................................................................................................
88 Les souches bactriennes dEscherichia coli
....................................................................................
88
La souche DH5F
.......................................................................................................................................
88 La souche BL21
(DE3).................................................................................................................................
88 Conditions de culture
...................................................................................................................................
88
Les plasmides
.............................................................................
89 Le vecteur pRARE 2 (Novagen)
.......................................................................................................
89 Les vecteurs pASK-G6PDH
.............................................................................................................
89 le vecteur pGENI
..............................................................................................................................
89
Mthodes relatives aux acides nucliques
......................................... 90 Mthodes gnrales
relatives lADN
.............................................................................................
90
Amplification de lADN par PCR
................................................................................................................
90 Dosage des acides nucliques
.......................................................................................................................
90 Electrophorse en gel dagarose
...................................................................................................................
91 Squenage
...................................................................................................................................................
91
Mthodes lies lARN
................................................................ 91
Extraction dARN totaux dorganes vgtaux
..................................................................................
91 Transcription
inverse.........................................................................................................................
92 PCR semi quantitative
.......................................................................................................................
92 PCR quantitative en temps rel
.........................................................................................................
92
Techniques relatives aux clonages
................................................... 93 Restriction
de lADN
........................................................................................................................
93 Purification des produits de restriction
.............................................................................................
93 Ligature
.............................................................................................................................................
93 Transformation dE. coli par lectroporation
....................................................................................
94
Prparation des cellules
................................................................................................................................
94 Electroporation
.............................................................................................................................................
94
Transformation dE. coli par le DMSO
.............................................................................................
94 Traitement de comptence des cellules
........................................................................................................
94 Transformation
.............................................................................................................................................
95
Criblage des transformants par PCR
.................................................................................................
95 Extraction et purification de lADN plasmidique
bactrien..............................................................
95 Construction du vecteur pGENI
........................................................................................................
95 Prparation de lADNc de 6PGDH1
.................................................................................................
96 Clonage de la 6PGDH1 dans pGENI
................................................................................................
97 Mutagense dirige
...........................................................................................................................
97
-
Technique lie la caractrisation phnotypique des mutants
dinsertion 98 Test de germination
...........................................................................................................................
98 Dosage de la production diffusion du peroxyde dhydrogne sur
graines ........................................ 98 Coloration in
situ des anions superoxydes (O2.-) par le NBT
............................................................ 99
Dtection de lactivit G6PDH in situ
..............................................................................................
99
Techniques lies a lanalyse des protines
........................................ 100 Mthodes biochimiques
..................................................................................................................
100
Dosage des protines
..................................................................................................................................
100 Electrophorse en conditions dnaturantes (SDS-PAGE)
..........................................................................
100 Transfert des protines sur membrane
........................................................................................................
101 Western-blot
...............................................................................................................................................
101 Production des protines recombinantes
....................................................................................................
101 Extraction des protines recombinantes
.....................................................................................................
102 Purification des protines recombinantes
...................................................................................................
102 Test de phosphorylation in vitro
.................................................................................................................
103 Mesure de lactivit G6PDH
......................................................................................................................
103 Mesure de lactivit 6PGDH
......................................................................................................................
103 Traitement doxydation et de rduction des protines recombinantes
........................................................ 104
Concentration de demi-activation de G6PDH1
..........................................................................................
105 Inactivation des G6PDH par la DEPC
........................................................................................................
105 Drivation au DTNB
..................................................................................................................................
106 Drivation chimique des thiols avec lacide
4-acetamido-4-maleimidylstilbene-2,2-disulfonique (AMS)
....................................................................................................................................................................
106 Dtermination des masses apparentes de G6PDH1 rduite et oxyde
par gel filtration ............................. 106 Dtermination
du potentiel redox du pont disulfure rgulateur
..................................................................
106 Systme Fd/ TRX reconstitu
.....................................................................................................................
107
Mthodes Biophysiques
..................................................................................................................
108 Calorimtrie diffrentiel balayage (DSC)
................................................................................................
108 Calorimtrie de titration isotherme (ITC)
...................................................................................................
108 Dichrosme circulaire (DC)
........................................................................................................................
109 Mesure dinteraction en rsonance plasmonique de surface (SPR)
............................................................
109
Cristallisation de G6PDH1
..............................................................................................................
110 PUBLICATION
........................................................................
112 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
......................................... 119 ANNEXES
...............................................................................
131
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UNIVERSITE PARIS-SUD 11 U.F.R. SCIENTIFIQUE DORSAY
THESE
prsente pour obtenir le grade de
DOCTEUR ES SCIENCES
DE LUNIVERSITE PARIS-SUD 11
Par
Guillaume Ne
Soutenue le 15 dcembre 2011
Etude de fonctions non-photosynthtiques pour les
thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana JURY : Pr S.
Nessler Prsidente du jury
Pr P. Geigenberger Examinateur
Dr F. Montrichard Rapporteur
Dr J.P. Reichheld Rapporteur
Dr E. Issakidis-Bourguet Responsable de la thse
-
Remerciements, Je tiens tout d'abord remercier en premier lieu
Didier Peltier de l'universit d'Angers qui, il y a 6 ans, m'a
permis de faire ma premire exprience de recherche en m'accueillant
dans son laboratoire. A l'poque, j'tais jardinier et ne savais mme
pas ce que signifiait PCR. Tu m'as fais confiance malgr mes trs
maigres connaissances en biologie cellulaire et tu m'as dmontr que
les jardiniers aussi pouvaient amplifier de l'ADN. La vue d'un
amplicon fluorescent sur un gel d'agarose a t pour moi "la"
rvlation, et j'ai compris cet instant que ma vie s'panouirait dans
un laboratoire bien plus vite que sous une serre. Ces quelques
semaines de stage ont suffi pour me faire reprendre de faon
dtermine les tudes universitaires. Par la suite, j'ai rencontr
l'universit Franoise Montrichard qui m'a donn le got de la
biochimie et surtout la passion pour cette famille de protines que
sont les thioredoxines. Merci Franoise d'avoir partag avec moi ta
passion, et de m'avoir form la biochimie. L'indpendance,
l'autonomie, la tnacit et l'efficacit sont aujourd'hui mes
principes fondamentaux et je te dois cet hritage. Merci galement de
m'avoir introduit au sein du laboratoire de signalisation redox o
j'ai effectu mon stage de M2, puis ma thse. Voila maintenant le
moment de remercier tous ceux qui m'ont accompagn au cours de ces
trois annes de thse et en premier lieu "ma chef ", Emmanuelle
Issakidiss. Merci de m'avoir donn ma chance dans ton labo il y a
quatre ans, et de m'avoir form. Tu m'as galement laiss beaucoup de
libert, ce qui m'a permis de donner une direction trs personnelle
ma thse. La confiance que tu as porte en moi et en mes hypothses
(parfois farfelues) ont t un facteur dterminant de ma russite.
Merci aussi Stphane Lemaire, avec qui j'ai beaucoup chang lors de
ma premire anne de thse. Les discussions scientifiques avec toi ont
t trs stimulantes. Merci aussi Myroslwa Miginiac-Maslow : vous
reprsentez pour moi la quintescence du chercheur accompli, votre
gentillesse, vos connaissances de la thmatique et de la biologie en
gnral m'impressionnent normment. Approcher (mme de loin) votre
niveau est devenu ma qute du Graal et j'ai pleinement conscience
que cet objectif est la frontire de l'impossible, mais votre
exemple est une source de motivation inpuisable. Merci galement
Hlne Vanacker. Nos discussions scientifiques ont t trs stimulantes,
et je n'oublierai pas que tu m'as beaucoup aid pour mes
enseignements, aussi bien d'un point de vue pdagogique
qu'administratif. Tu connais toutes les ficelles du milieu, et,
sans ton soutien et ton exprience d'enseignant-chercheur, j'aurais
eu beaucoup plus de mal grer ces deux activits. Merci galement
Mariette, Anne-Sophie, Xing Huang, Mirko et Daniel. Avoir partag
des moments avec vous au labo et en dehors font de vous des ami(e)s
que je suis fier d'avoir. Merci Nathalie, Chantal, Franoise,
Martine, Laurine et Pierre. Vous avez t des collgues formidables en
qui j'ai pleine confiance, et qui m'avez normment soutenu. Je vous
dois beaucoup, et je ne serai jamais comment vous remercier la
hauteur de ce que vous m'avez donn. Merci aussi Mr Jean pour sa
joie, son enthousiasme, et sa culture (sans limite: Mr Jean est une
vraie encyclopdie vivante). Merci mon Thom Thom : sans ton aide,
c'tait foutu; je n'y serais pas arriv, tu m'as nourri quand j'tais
trop dbord ou dprim pour penser m'alimenter, ton sens humain m'a
souvent laisser pantois! Merci aussi Laure, ta future femme qui en
plus d'tre une source de bonne humeur, m'a toujours prt son homme
sans jamais se plaindre (jusqu' parfois pas d'heure), quand face
l'informatique capricieuse je ne suis souvent retrouv bien dmuni.
Et merci tous ceux de l'Institut que j'aurais pu oublier et qui
m'ont aid (parfois beaucoup), je pense notamment Maryelle, Jean
Paul, Eric, Meeriam et Hoang.
-
Merci mes trois brillantes stagiaires Fanny, Sverine, et Roxane.
Vous tes toutes trois trs travailleuses et trs intelligentes, j'ai
souvent t impressionn par la pertinence de vos remarques et par
votre assiduit au travail, mme pour des tches pnibles (les
innombrables semis agencs de graines d'Arabidopsis...). Je suis
profondment persuad que vous irez loin. Votre prsence et votre
soutien sans faille mes cots ont t des bouffes d'oxygne sans
lesquelles je me serais srement asphyxi. Je tiens galement
remercier toutes les personnes qui m'ont accueilli dans leur
laboratoire et qui ont pass du temps partager leur comptence pour
faire avancer mes travaux. Marielle Valerio Lepiniec, Magali
Aumont, vous m'avez initi la micro calorimtrie et vous avez
toujours gard espoir en mes manips, l o, moi-mme, je perdais
parfois confiance. Sylvie Nessler, comment te remercier de m'avoir
accueilli au LEBS, d'avoir pass beaucoup de temps m'couter, m'aider
pour faire avancer mon sujet ainsi que d'avoir investi
financirement dans mes manips. Grce toi j'ai dcouvert le monde des
structuralistes, et j'ai pu aller jusqu' l'obtention de petits
cristaux, et je n'en suis pas peu fier ! Christophe Bailly et
Patrice Meimoun, je vous dois une grosse partie de mon travail sur
la caractrisation de la physiologie de la germination, L aussi vous
avez cru en moi et en mes convictions. Je tiens finir en remerciant
mes amis, et surtout mes parents et ma soeur qui m'ont toujours
soutenu sans faille et normment aid pour les corrections
orthographiques de ce manuscrit. Vous avez toujours t l pour moi,
malgr mon comportement parfois la limite du manque de patience. Il
est temps de rendre Csar ce qui lui appartient, Maman, Papa cette
thse est aussi est la vtre!
-
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS
.........................................................................
1 INTRODUCTION
........................................................................
3 Les thiordoxines (TRX)
.................................................................
4
Systme de rduction des TRX
...........................................................................................................
5 Le systme NADP Thiordoxine rductase
....................................................................................................
5 Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes photosynthtiques
...................................................... 6 Rduction
des thiordoxines dans les plastes non photosynthtiques
............................................................ 7
Systme doxydation des TRX
...........................................................................................................
8 Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes
dArabidopsis thaliana .................... 9
TRX du type f
.................................................................................................................................................
9 TRX du type m
...............................................................................................................................................
9 TRX du type y
..............................................................................................................................................
10 TRX du type x
..............................................................................................................................................
10 TRX du type z
..............................................................................................................................................
10 Les glutardoxines (GRX)
............................................................................................................................
11
Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana
..................................................... 11 Les cibles
des thiordoxines
.............................................................................................................
11
Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme
photosynthtique ..................................... 12 Les cibles
de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme non
photosynthtique .............................. 12
Spcificits des TRX pour leurs cibles
.............................................................................................
13 Nature de la spcificit TRX cible
....................................................................................................
14 Phnotype des mutants pertes de fonction pour les
TRX..................................................................
15 Les TRX dans la physiologie des semences
.....................................................................................
16 Germination et formes actives de l'oxygne
.....................................................................................
16
Le cycle oxydatif des pentoses phosphate
.......................................... 18 La
glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PDH)
.........................................................................
19
Localisation subcellulaire des G6PDH dArabidopsis thaliana
...................................................................
19 Importance des G6PDH dans la physiologie des vgtaux
..........................................................................
20 Rgulation enzymatique des G6PDH
...........................................................................................................
20 Origine volutive de la rgulation redox des G6PDH
..................................................................................
21 Mcanisme catalytique des G6PDH
.............................................................................................................
22
La 6-phosphogluconate dshydrognase (6PGDH)
..........................................................................
23 Localisation subcellulaire des 6PGDH dArabidopsis thaliana
...................................................................
23 Mcanisme catalytique des 6PGDH
.............................................................................................................
24 Structure tridimensionnelle et sites catalytiques de 6PGDH
........................................................................
24 Modifications post traductionnelles des 6PDGH de plantes
suprieures .....................................................
25
Objectif de mon travail de thse
..................................................... 26 RESULTATS
.............................................................................
27 Premire partie
..........................................................................
28
Caractrisation biochimique de la rgulation post traductionnelle
des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate
................... 28
Etude biochimique des modifications post traductionnelles dune
6-phosphogluconate dshydrognase chloroplastique dA. thaliana
........... 29
Production et purification dune 6PGDH recombinante dArabidopsis
........................................... 29 Les modifications
post-traductionnelles de la 6PGDH1
...................................................................
29
Mise en vidence dune modification redox de lenzyme
............................................................................
29 Mise en vidence de la phosphorylation de lenzyme
..................................................................................
30 Analyse des squences primaires des 6PGDH dArabidopsis et
modlisation 3D de la 6PGDH1 .............. 31 Recherche de sites
dadressage aux organites
..............................................................................................
31 Identification de cystines candidates pour la modification redox
............................................................... 32
Recherche de sites de phosphorylation
.........................................................................................................
33
-
Etude de leffet des modifications post traductionnelles sur
lactivit de la 6PDH1 ........................ 33 Effet de la
modification redox sur lactivit de la
6PGDH...........................................................................
33 Effet de la phosphorylation de la 6PGDH sur lactivit
dshydrognase et interconnexion entre rgulation redox et
phosphorylation
..............................................................................................................................
34
Conclusion prliminaire sur la caractrisation biochimique de
lenzyme ........................................ 35 Rgulation redox
des glucose-6-phosphate dshydrognases plastidiales .. 37
Analyse des squences primaires des 4 G6PDH plastidiales
dArabidopsis .................................... 37 Production et
purification des G6PDH de type P1 (G6PDH1) et P2 (G6PDH2 et 3)
....................... 37 Toxicit de l'isoforme G6PDH4
dArabidopsis dans la bactrie E. coli
........................................... 39 Quantification des
thiols libres sur G6PDH1 native
.........................................................................
40 Caractrisation de la rgulation redox de l'activit des G6PDH
plastidiales .................................... 40 Validation des
rsidus cystine rgulatrices par mutagne dirige
................................................... 40 Spcificits
de rgulation redox des G6PDH plastidiales de type P1 et P2
...................................... 41 Rgulation de G6PDH1 par
dautres rdoxines plastidiales et par les mtabolites redox
................ 43
Dterminisme de la spcificit TRX / G6PDH
.................................... 45 Potentiel redox des
isoformes de G6PDH de type P1 et P2
.............................................................. 45
tude par calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) de linteraction
G6PDH1 / TRX ................... 46 Analyse des spcificits
dinteraction TRX / G6PDH par titration en microcalorimtrie
isotherme (ITC)
.................................................................................................................................................
47 Etude de linteraction TRX / G6PDH en rsonance plasmonique de
surface (RPS) BIAcore ......... 48
Etude des effets de la rgulation redox sur les proprits de la
G6PDH1 .. 51 Alignement des squences primaires des G6PDH
dArabidopsis avec les isoformes de structure connue et modlisation
structurale de G6PDH1
...............................................................................
51 Effet de la rgulation redox sur la structure quaternaire de la
G6PDH1 ........................................... 53 Dtermination
de la composition en structures secondaires des formes oxydes et
rduites de G6PDH1
............................................................................................................................................
54 Dtermination de constantes catalytiques pour les formes oxydes
et rduites ................................ 54 Mesure du
coefficient daffinit (Kd) pour le NADP des formes sauvage oxyde et
mutante de la G6PDH1 par Calorimtrie de Titration Isotherme (ITC)
..................................................................
55 Etude de laccessibilit des substrats au site actif
.............................................................................
56 Essai de cristallisation de la G6PDH1 et perspectives dtudes
structurales .................................... 57 Rgulation
TRX-dpendante de la G6PDH1 dans un systme Fd/TRX
reconstitu in vitro
.......................................................................
58 Deuxime partie
.........................................................................
60 Caractrisation de mutants perte de fonction pour les TRX du type
y .... 60
Profils dexpression des gnes des TRX plastidiales et des G6PDH
dans le contexte des mutants de TRX y
................................................................................................................................................
61
Validation de la perte de fonction des gnes muts par RT-PCR
semi-quantitative et quantitative ............. 61 Analyse de
lexpression des autres TRX plastidiales
...................................................................................
62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana
.....................................................................................
62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana dans un contexte
TRX y mutant .................................. 63
Etude in situ de lactivit G6PDH racinaire chez les doubles
mutants TRX y ................................. 64 Physiologie de
la germination des graines mutantes pour les TRX du type y
.................................. 65
Caractrisation de la qualit germinative des graines sauvages et
mutantes pour les TRX du type y .......... 66 Caractrisation de la
dormance chez Arabidopsis thaliana cotype Columbia
............................................ 67 Caractrisation de
la dormance des graines mutantes pour les TRX du type y
............................................ 68 Caractrisation de
la tolrance un stress thermique des graines mutantes pour les TRX
du type y .......... 69
Dosage et localisation in situ des formes actives de loxygne
dans les graines des mutants des TRX du type y
............................................................................................................................................
70
Production-diffusion du peroxyde dhydrogne et leve de dormance
........................................................ 70 Dosage
et localisation in situ de la production danion superoxyde dans les
graines des mutants de TRX y
......................................................................................................................................................................
71
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
............................. 73
-
Rgulation redox des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses
phosphate
.................................................................................
74
Mise en vidence de nouvelles fonctions pour les TRX des types f
et y et pour lisoforme m3 ...... 74 Coordination des cycles
rducteur (Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate par les TRX f
....... 75 Impact de la rgulation redox sur les proprits
catalytiques de la G6PDH1 ................................... 76
Rgulation post-traductionnelle dune 6PGDH chloroplastique
....................................................... 77 Nature
des spcificits TRX / cible dans la rgulation redox des G6PDH
plastidiales .................... 79 Mcanisme doxydation des TRX
.....................................................................................................
81
Etude in planta de fonctions pour les TRX y
...................................... 83 Impact de la perte de
fonction des TRX y sur lactivit G6PDH racinaire
....................................... 84 Rle des TRX y dans les
processus physiologiques de la germination
............................................ 84 Conclusion sur
lanalyse fonctionnelle in planta des TRX plastidiales dArabidopsis
.................... 85
MATERIELS ET METHODES
..................................................... 86 Matriel
vgtal et conditions de culture
.......................................... 87
Pisum sativum var. Nain merveille de Kelvedon
..............................................................................
87 Arabidopsis thaliana
.........................................................................................................................
87 Production des lots de graines dArabidopsis
...................................................................................
87 Culture in vitro
..................................................................................................................................
88 Les souches bactriennes dEscherichia coli
....................................................................................
88
La souche DH5F
.......................................................................................................................................
88 La souche BL21
(DE3).................................................................................................................................
88 Conditions de culture
...................................................................................................................................
88
Les plasmides
.............................................................................
89 Le vecteur pRARE 2 (Novagen)
.......................................................................................................
89 Les vecteurs pASK-G6PDH
.............................................................................................................
89 le vecteur pGENI
..............................................................................................................................
89
Mthodes relatives aux acides nucliques
......................................... 90 Mthodes gnrales
relatives lADN
.............................................................................................
90
Amplification de lADN par PCR
................................................................................................................
90 Dosage des acides nucliques
.......................................................................................................................
90 Electrophorse en gel dagarose
...................................................................................................................
91 Squenage
...................................................................................................................................................
91
Mthodes lies lARN
................................................................ 91
Extraction dARN totaux dorganes vgtaux
..................................................................................
91 Transcription
inverse.........................................................................................................................
92 PCR semi quantitative
.......................................................................................................................
92 PCR quantitative en temps rel
.........................................................................................................
92
Techniques relatives aux clonages
................................................... 93 Restriction
de lADN
........................................................................................................................
93 Purification des produits de restriction
.............................................................................................
93 Ligature
.............................................................................................................................................
93 Transformation dE. coli par lectroporation
....................................................................................
94
Prparation des cellules
................................................................................................................................
94 Electroporation
.............................................................................................................................................
94
Transformation dE. coli par le DMSO
.............................................................................................
94 Traitement de comptence des cellules
........................................................................................................
94 Transformation
.............................................................................................................................................
95
Criblage des transformants par PCR
.................................................................................................
95 Extraction et purification de lADN plasmidique
bactrien..............................................................
95 Construction du vecteur pGENI
........................................................................................................
95 Prparation de lADNc de 6PGDH1
.................................................................................................
96 Clonage de la 6PGDH1 dans pGENI
................................................................................................
97 Mutagense dirige
...........................................................................................................................
97
-
Technique lie la caractrisation phnotypique des mutants
dinsertion 98 Test de germination
...........................................................................................................................
98 Dosage de la production diffusion du peroxyde dhydrogne sur
graines ........................................ 98 Coloration in
situ des anions superoxydes (O2.-) par le NBT
............................................................ 99
Dtection de lactivit G6PDH in situ
..............................................................................................
99
Techniques lies a lanalyse des protines
........................................ 100 Mthodes biochimiques
..................................................................................................................
100
Dosage des protines
..................................................................................................................................
100 Electrophorse en conditions dnaturantes (SDS-PAGE)
..........................................................................
100 Transfert des protines sur membrane
........................................................................................................
101 Western-blot
...............................................................................................................................................
101 Production des protines recombinantes
....................................................................................................
101 Extraction des protines recombinantes
.....................................................................................................
102 Purification des protines recombinantes
...................................................................................................
102 Test de phosphorylation in vitro
.................................................................................................................
103 Mesure de lactivit G6PDH
......................................................................................................................
103 Mesure de lactivit 6PGDH
......................................................................................................................
103 Traitement doxydation et de rduction des protines recombinantes
........................................................ 104
Concentration de demi-activation de G6PDH1
..........................................................................................
105 Inactivation des G6PDH par la DEPC
........................................................................................................
105 Drivation au DTNB
..................................................................................................................................
106 Drivation chimique des thiols avec lacide
4-acetamido-4-maleimidylstilbene-2,2-disulfonique (AMS)
....................................................................................................................................................................
106 Dtermination des masses apparentes de G6PDH1 rduite et oxyde
par gel filtration ............................. 106 Dtermination
du potentiel redox du pont disulfure rgulateur
..................................................................
106 Systme Fd/ TRX reconstitu
.....................................................................................................................
107
Mthodes Biophysiques
..................................................................................................................
108 Calorimtrie diffrentiel balayage (DSC)
................................................................................................
108 Calorimtrie de titration isotherme (ITC)
...................................................................................................
108 Dichrosme circulaire (DC)
........................................................................................................................
109 Mesure dinteraction en rsonance plasmonique de surface (SPR)
............................................................
109
Cristallisation de G6PDH1
..............................................................................................................
110 PUBLICATION
........................................................................
112 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
......................................... 119 ANNEXES
...............................................................................
131
-
1
ABREVIATIONS
A ADN acide dsoxyribonuclique ADNc ADN complmentaire Amp
ampicilline APS ammonium persulfate ARN acide ribonuclique ARNm ARN
messager ATP Adnosine TriPhosphate B BCA acide bicinchoninique BET
bromure dthydium BSA albumine de srum bovin D DMSO dimthyl
sulfoxide DO densit optique DTNB acide 5,5
dithiobis-(2-nitrobenzoque) DTT dithiothritol E ECL Enhanced
ChemiLuminescence EDTA acide thylnediaminottraactique F FBPase
fructose-1,6-bisphosphate phosphatase Fd ferrdoxine FNR
ferrdoxine-NADP rductase FTR ferrdoxine-thiordoxine rductase G
GAPDH glycraldhyde-3-phosphate
dshydrognase GPX glutathion peroxydase GR glutathion rductase
GRX glutardoxine GSH glutathion rduit GSSG glutathion oxyd GST
glutathion S-transfrase I IPTG isopropyl--D-thiogalactopyranoside L
LB Luria Bertani M MSR Mthionine Sulfoxide Rductase
N NADP Nicotinamide Adenine
Dinucleotide Phosphate NADP-MDH NADP malate dshydrognase NTR
NADPH-Thiordoxine Rductase NTS NADPH-Thiordoxine Systme P p/v
poids/volume PCD Programmed Cell Death/mort
cellulaire programme PCR Polymerase Chain
Reaction/raction de polymrisation en chane
PDI Protine Disulfure Isomrase PGM PhosphoGluconMutase PKA
Protine Kinase A PRK phosphoribulokinase PRX peroxyrdoxine PSI
photosystme I PVDF PolyVinyliDne Fluorure R RNAse ribonuclase RNR
ribonuclotide rductase ROS Reactive Oxygen Species/espces
ractives de loxygne RT-PCR Reverse Transcription - PCR RU
Response Unit S SBPase sdoheptulose-1,7-bisphosphate
phosphatase SDS Sodium Dodcyl Sulfate SDS-PAGE SDS -
polyacrylamide gel
electrophoresis T TAE Tris Acetate EDTA TCA acide
trichloroactique TE Tris EDTA TEMED N,N,N',N'-
ttramthylthylnediamine Tris tris (hydroxymthyl)-
aminomthane TRX thiordoxine V v/v volume /volume
-
2
Note pralable la lecture de ce manuscrit
Pour la simplicit de lecture, les molcules : oxygne molculaire,
oxygne singulet, anion superoxyde, radical hydroxyle ainsi que les
peroxydes varies (peroxyde dhydrogne, peroxyde lipidique) sont
mentionnes dans ce manuscrit sous le terme gnrique de formes
actives de loxygne en utilisant lacronyme anglais ROS pour Reactive
Oxygen Species
-
3
INTRODUCTION
-
Figure 8: Expression of plastidial TRXs in Arabidopsis tissues.
RT-qPCR analyses were performed in leaves, flowers, young and
mature siliques, seedlings, roots and seeds. Data were normalized
to the housekeeping protein phosphatase 2A gene (PP2A) and
represented using the level of the TRX f1 transcripts in leaves as
reference. Means SD of triplicates experiments are shown.
Reproduced from V. Massot thesis manuscript.
-
4
Quils soient procaryotes ou eucaryotes, autotrophes ou
htrotrophes, les organismes
vivants sont soumis diffrentes contraintes environnementales et
doivent sadapter. Au
niveau cellulaire, ladaptation du mtabolisme des stimuli
environnementaux fait intervenir
des cascades de signalisation, dont les mieux connues sont les
cascades de phosphorylation.
La signalisation redox est une autre voie de signalisation qui
est base sur loxydorduction
de cystines structurales ou catalytiques de protines ou
polypeptides. Les principales
protines impliques dans cette voie de signalisation sont les
protines disulfures isomrases,
les thiordoxines, les glutardoxines et les
glutathion-S-transfrases. Parmi ces protines, les
thiordoxines sont les plus anciennement dcouvertes et les mieux
caractrises.
Les thiordoxines (TRX)
La premire thiordoxine (TRX) a initialement t identifie chez la
bactrie
Escherichia coli comme tant l'enzyme responsable de la rduction
de la ribonuclide
rductase (Laurent et al., 1964). Depuis, la prsence de ces
protines a t mise en vidence
chez tous les organismes vivants libres (Holmgren, 1989).
Les thiordoxines (TRX) sont de petites protines d'environ 12 kDa
qui possdent une
activit d'oxydorductase de pont disulfure sur leurs protines
cibles (Cf. figure 1). Le site
actif des TRX est compos de cinq rsidus formant la squence
WCG/PPC. Cette squence a
t conserve au cours de l'volution pour toutes les isoformes de
TRX. Elle est considre
comme la signature des TRX. Les TRX sont capables de rduire, par
une raction
squentielle, les ponts disulfure de leurs protines dites cibles
. L'activit d'oxydorductase
de ces protines est lie aux deux rsidus cystine vicinaux prsents
dans la squence de leur
site actif. La premire cystine de ce site actif est responsable
de lattaque nuclophile
primaire du pont disulfure de la cible. Un pont disulfure
intermolculaire transitoire est form
entre la TRX et sa cible. Le complexe est ensuite dissoci grce
lattaque du disulfure mixte
par la deuxime cystine du site actif. Suite cette raction la
cible est rduite et la TRX est
oxyde (Cf. figure 2). Deux fonctions lies lactivit oxydorductase
de ces protines ont t
mises en vidence. La premire consiste servir de substrat de
rduction pour des
peroxydases thiols. Lautre fonction des TRX est de rguler
lactivit enzymatique de leurs
cibles.
-
Figure 3: Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana Trx members.
Red dashes show different sub cellular compartments.
Figure 4: The NADP dependent thioredoxin system (NTS). The
reduction of thioredoxin disulfide is achieved by the NADP
thioredoxin reductase (NTR) that uses NADPH as electron donor.
Trx f
Trx m
Trx x
Trx h
Trx y
AtTRXm3
AtTRXm4
AtTRXm1
AtTRXm2
AtTRXx
AtTRXy2AtTRXy1
AtTRXf1
AtTRXf2
AtTRXh1AtTRXh4
AtTRXh3
AtTRXh5AtTRXh2
AtTRXh7
AtTRXh8
AtTRXh9
Trx oAtTRXo1
AtTRXo2
MitochondriaCytosol
AtTRXz
Plastids
Trx f
Trx m
Trx x
Trx h
Trx y
AtTRXm3
AtTRXm4
AtTRXm1
AtTRXm2
AtTRXx
AtTRXy2AtTRXy1
AtTRXf1
AtTRXf2
AtTRXh1AtTRXh4
AtTRXh3
AtTRXh5AtTRXh2
AtTRXh7
AtTRXh8
AtTRXh9
Trx oAtTRXo1
AtTRXo2
MitochondriaCytosol
AtTRXz
Plastids
-
5
Chez les organismes photosynthtiques, les TRX ont t initialement
identifies
comme des activateurs la lumire denzymes du cycle de Calvin
(Buchanan et Wolosiuk,
1976 ; Homlgren et al., 1976).
Le squenage complet du gnome d'Arabidopsis thaliana, a permis de
mettre en
vidence de nombreuses isoformes de TRX vgtales, ce qui nest pas
le cas chez les
mammifres o deux isoformes seulement sont prsentes. Chez les
vgtaux, les TRX sont
codes par le gnome nuclaire et peuvent tre regroupes en 7 types
selon leur homologie de
squence et la structure des gnes qui les codent (Cf. figure 3).
Deux isoformes sont localises
dans les mitochondries (TRX du type o), 8 dans le cytosol (TRX
du type h) et 10 dans les
plastes (TRX du type m : 4 isoformes, du type f : 2 isoformes,
du type y : 2 isoformes du type
x : 1 isoforme, du type z : 1 isoforme). La prsence dune
multitude disoformes de TRX chez
les vgtaux suprieurs soulve la question dune spcialisation ou
dune redondance
fonctionnelle pour cette famille de protines pour ce taxon. En
plus de leur activit
doxydorductase, les TRX possdent galement une activit chaperon
(Kern et al., 2003). Ce
type dactivit a souvent t relat pour des protines de type
disulfure isomrase (PDI) qui
sont des protines proches des TRX (Quan et al., 1995). Une
activit chaperon a galement
t mise en vidence pour les TRX plastidiales du type f et m (Ruth
Sanz-Barrio et al., 2011).
Systme de rduction des TRX
Le premier systme de rduction a avoir t dcouvert est le
systme
NADPH/Thiordoxine (NTS). Il s'agit du systme de rduction des TRX
des procaryotes, des
eucaryotes non photosynthtiques et du cytoplasme (cytosol et
mitochondries) des cellules
vgtales (Cf. figure 4). Au sein de ce systme de rduction, une
enzyme, la NADPH-
thiordoxine-rductase (NTR), peut transfrer le pouvoir rducteur
du NADPH aux TRX. La
NTR est une flavoprotine homodimrique dont chaque sous-unit a un
domaine FAD, un
domaine de liaison au NADPH et un domaine portant un pont
disulfure redox actif. Trois
types de NTR ont t distingus ce jour.
Le systme NADP Thiordoxine rductase
Le premier type est une NTR dite de faible poids molculaire avec
une masse de
35kDa. Ce type de NTR est prsent chez les procaryotes, les
archaebactries et les eucaryotes
infrieurs. Lorsque le NADPH interagit avec son site de fixation,
ce dernier effectue un
-
Figure 5: The ferredoxin thioredoxin system (Fd/Trx). Continuous
electron flow provided by photosystem I allows the reduction of
ferredoxin. Once reduced, ferredoxin can transfer electrons to
ferredoxin thioredoxin reductase that in a final step allows the
reduction of thioredoxin.
Target enzymesTarget enzymes
-
6
mouvement pour le rapprocher du domaine FAD et permettre la
rduction de ce cofacteur.
Ce mouvement a galement pour consquence dexposer une boucle
portant le site redox actif
permettant ainsi la fixation et la rduction de la TRX (Lennon et
al., 2000).
Le deuxime type de NTR possde une masse molculaire denviron 55
kDa par sous-unit et
est prsent dans le cytosol et les mitochondries des eucaryotes
suprieurs. En plus des trois
domaines dcrits ci-dessus, ce type de NTR possde un autre site
redox actif contenant 2
cystines (lune pouvant tre une slnocystine) vicinales. Ce
deuxime site redox actif
reoit les lectrons du premier, puis est extrioris pour permettre
la rduction de la TRX
(Williams et al., 2000).
Enfin, il a t identifi plus rcemment, un troisime type de NTR
spcifique des
chloroplastes de plantes suprieures, nomm NTRC. Cette NTR
atypique correspond une
protine avec un domaine NTR de haut poids molculaire fusionn une
TRX (Serrato et al.,
2002). Cette protine correspond donc une TRX avec un systme de
rduction de type NTR
intgr. Il a t montr que la NTRC tait un systme de rduction
efficace pour la
peroxyrdoxine 2 cystines plastidiale (2Cys-PRX) et que celle-ci
tait implique dans les
mcanismes de rponse au stress oxydatif (Perez-Ruiz et al., 2006
; Moon et al., 2006 ;
Spinola et al., 2008 ; Stenbaek et al., 2008).
Chez les organismes photosynthtiques, un autre systme de
rduction des TRX est
prsent. Il sagit du systme ferrdoxine thiordoxine (Fd/TRX). Ce
systme est prsent chez
les cyanobactries et les chloroplastes des vgtaux. Il utilise
comme source de pouvoir
rducteur les lectrons de la chane de transfert photosynthtique
(Cf. figure 5). Le pouvoir
rducteur de cette chaine de transfert est transmis du
photosystme I (PSI) la ferrdoxine.
Cette dernire transmet le pouvoir rducteur aux TRX grce la
ferrdoxine TRX rductase
(FTR).
Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes
photosynthtiques
La ferrdoxine (Fd)
La ferrdoxine des vgtaux suprieurs est une petite protine
stromatique centre fer-
soufre 2Fe-2S. Ce centre fer-soufre est li la protine par
lintermdiaire de 4 cystines trs
conserves chez toutes les espces de ce phylum. Cette protine
accepte les lectrons du PSI
pour rduire ensuite un grand nombre de protines dont la
ferrdoxine NADP rductase
(FNR), la nitrite rductase, la glutamate synthase ferrdoxine
dpendante, la sulfite rductase,
et bien sr la FTR. Cette protine est considre comme un carrefour
de redistribution des
-
7
lectrons partir du PSI. Chez la plante modle Arabidopsis
thaliana, il existe 4 isoformes de
Fd. Les Fd 1 et 2 sont exprimes dans les feuilles tandis que les
Fd 3 et 4 sont exprimes dans
les organes non photosynthtiques comme les racines.
La ferrdoxine thiordoxine rductase (FTR)
La ferrdoxine thiordoxine rductase, (FTR) est un htrodimre en
forme de disque
compos dune sous-unit catalytique (sous-unit B), de 12-13 kDa
(Chow et al., 1995) et
dune sous-unit rgulatrice (sous-unit A) de taille variable entre
les espces (8-13 kDa)
(Iwadate et al., 1994). La sous-unit A est peu conserve, elle
est indispensable pour la
stabilit de la sous-unit catalytique et la bonne interaction
avec la ferrdoxine (Gaymard et al
2000 ; Hishiya et al., 2008). La sous-unit catalytique porte un
centre fer-soufre 4Fe 4S et un
pont disulfure. Le centre fer-soufre est li par 4 cystines et
localis sur une des faces du
disque tandis que le pont disulfure permettant la rduction des
TRX est localis sur lautre
face (Glauser et al., 2004 ; Dai et al., 2007). Cette
conformation confre la FTR la capacit
de recevoir les lectrons de la ferrdoxine et de les transfrer
immdiatement aux TRX.
Importance du systme ferrdoxine thiordoxine pour la coordination
lumineuse des mtabolismes chez les organismes photosynthtiques
Le systme Fd /TRX assure dans les chloroplastes la lumire une
rduction efficace
des TRX. Cette rduction lumino-dpendante permet la rgulation de
lactivit des
mtabolismes photosynthtiques en fonction de lintensit lumineuse
via lactivation par
rduction denzymes redox rgules comme certaines enzymes du cycle
de Calvin (Buchanan
et Wolosiuk, 1976 ; Holmgren et al., 1976).
Ce systme permet galement dassurer la transition mtabolique
jour/nuit des plastes
photosynthtiques. En effet, contrairement aux enzymes du cycle
de Calvin, la rduction
lumineuse des TRX conduit linactivation de la premire tape du
cycle de pentoses
phosphate (Scheibe et Anderson, 1981) vitant ainsi le
fonctionnement concomitant dune
voie de synthse (Cycle de Calvin) et de dgradation de squelettes
carbons (Cycle oxydatif
des pentoses phosphate).
Initialement, le systme de rduction Fd/TRX tait considr comme
uniquement
prsent dans les chloroplastes car dpendant de la fourniture en
pouvoir rducteur du PSI.
Rduction des thiordoxines dans les plastes non
photosynthtiques
-
Figure 6: Reduction of plastidial thioredoxins under
non-photosynthetic condition. Sucrose from starch degradation or
import from leaves by sink tissues is broken down to
glucose-6-phosphate, generating NADPH via glucose-6-phosphate
dehydrogenase (G6PDH) and 6 phosphogluconate dehydrogenase. The
NADPH is used to reduce Trx via ferredoxin:NADP reductase (FNR),
ferredoxin (Fd), and FTR, similar to the mechanism identified in
cyanobacterial heterocysts. Once reduced, Trx activates target
enzymes as in chloroplasts. Reproduced from Balmer et al.,
2006.
-
8
Plus rcemment, des tudes protomiques ont mis en vidence la
prsence disoformes de
FNR, de ferrdoxine et de FTR dans des amyloplastes dalbumen de
bl permettant ainsi de
proposer un systme de rduction des TRX de type Fd/TRX dans des
plastes non
photosynthtiques. Au sein de ce systme, la ferrdoxine est rduite
dune faon alternative
la rduction par la lumire grce la production mtabolique de
NADPH. Laugmentation du
ratio NADPH/NADP+ lie lactivit enzymatique de deux dshydrognases
du cycle des
pentoses phosphate (la glucose 6-phosphate dshydrognase et la
phosphogluconate
dshydrognase) permettrait la rduction de la ferrdoxine via la
FNR. Une fois rduite, la
ferrdoxine permettrait le fonctionnement du systme Fd/FTR comme
dans les chloroplastes,
aboutissant la rduction des TRX (Cf. figure 6).
Dans les chloroplastes lobscurit, loxydation des enzymes redox
rgules du
mtabolisme photosynthtique conduit linhibition de leur activit
(Schrmann et Buchanan,
2008). Cependant, les mcanismes par lesquels ces enzymes
soxydent sont mal connus.
Systme doxydation des TRX
Des tudes ont montr que, mme en condition anarobie, le maintien
de ltat rduit de
la ferrdoxine est critique pour conserver lactivit de la FBPase
(Leegood et Walker, 1980).
Lajout doxydant ou lexposition du systme Fd/TRX loxygne ambiant
conduit
galement une diminution de lactivit redox dpendante de cette
cible (Schrmann et
Buchanan, 2008). Ces rsultats suggrent que le maintien constant
ltat rduit de
lensemble des composants du systme Fd/TRX est essentiel pour
conserver lactivit redox
dpendante des enzymes du cycle de Calvin. Lorsque la pression de
rduction exerce par
le PSI sur les composants du systme Fd/TRX sarrte, les
constituants du systme deviennent
particulirement sensibles loxydation. La sensibilit leve des
enzymes centre fer-soufre
vis--vis des formes actives de loxygne a souvent t constate.
Loxydation rapide du
centre fer-soufre de la ferrdoxine pourrait conduire un
fonctionnement invers du systme
Fd/TRX, conduisant ainsi loxydation des TRX et de leurs
cibles.
Par ailleurs, il est notoirement connu, daprs la littrature, que
dans un tampon pH
physiologique et en labsence de rducteur chimique (par exemple
le DTT), les prparations
de TRX recombinantes se trouvent dans un tat majoritairement
oxyd. Cette constatation
suggre une oxydation spontane du site catalytique par loxygne
dissous.
-
Figure 7: Schematic representation of hypothesis by which
thioredoxin becomes oxidized. (1) When the PSI electron flow is
stopped, the iron sulphur cluster enzymes become highly susceptible
to ROS oxidation allowing the reversion of the electron flow within
the Fd/Trx system. (2) ROS directly trigger Trx and/or target
reactive cysteines and allow the formation of the intra molecular
disulfide bond. (3) Reduced thioredoxins are oxidized by thiol
specific peroxidases for ROS and peculiarly H2O2 scavenging.
Numbers following the electron refer to the corresponding scenario.
Question marks remind that the direct action of ROS on iron sulphur
cluster enzymes and on targets or Trx exposed cysteines remain
uncertain in vivo.
ROS
Fd FTR Trx
e - (1)
Oxidative regulation of
targets enzymes
PSI reductive pressure
e - (1;2;3) ROS
ROS H 2 O 2
H 2 O Thiols specific
peroxidase
(1)
(2)
(3)
e - (3) ?
?
?
?
ROS
Fd FTR Trx
e - (1)
Oxidative regulation of
target enzymes
PSI reductive pressure
e - (1;2;3) ROS
ROS H 2 O 2
H 2 O Thiol specific
peroxidase
(1)
(2)
(3)
e - (3) ?
?
?
?
-
9
Cependant, aucune donne prcise concernant une oxydation directe
du site actif des TRX en
pont disulfure par les formes actives de loxygne nest disponible
dans la littrature. Une
oxydation directe par les formes actives de loxygne de thiols
ractifs et exposs la surface
a t rapporte pour de nombreuses protines cependant lorsque cette
raction non catalyse
est possible, elle semble de faible efficacit compare la
ractivit de thiol-peroxydases
avec le peroxyde hydrogne (Floh, 2010).
Ainsi in vivo, lhypothse la plus probable serait celle dun
mcanisme li lactivit
de peroxydases chloroplastiques utilisant les TRX comme substrat
de rduction. Ce
mcanisme permettrait de catalyser rapidement loxydation du site
actif des TRX plastidiales,
et contribuerait au rajustement du mtabolisme redox rgul dans
les plastes. Un schma
reprenant les diffrentes hypothses est propos en figure 7.
Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes
dArabidopsis thaliana
Chez A. thaliana il existe deux isoformes de TRX f : f1 et f2.
Ces thiordoxines ont
t les premires isoles chez les vgtaux avec les thiordoxines de
type m. Elles possdent
dans leur partie C-terminale une troisime cystine (Cys 60). Il a
t montr que la
glutathionylation (pont disulfure mixte entre une molcule de
glutathion et une protine) de
cette troisime cystine, rduisait la capacit de ces isoformes tre
rduites in vitro par leur
rductase en amont (Michelet et al., 2005 ; 2006). Ces
thiordoxines de type f sont connues
pour rguler lactivit de certaines enzymes du cycle de Calvin,
avec une spcificit stricte
pour certaines dentre elles (voir plus loin). Le pont disulfure
du site actif de ce type de
thiordoxines du type f est denviron -351 mV pH 7,9 (Hirasawa et
al., 1999).
TRX du type f
Chez A. thaliana, il existe quatre isoformes de TRX du type m
(Meyer et al., 2005).
Elles ont une origine procaryote la diffrence des thiordoxines
de type f. Ces thiordoxines
sont souvent considres comme thiordoxines de type bactrien cause
de leur forte
homologie avec la thiordoxine dE. coli, ainsi que par leur
possibilit de substituer cette
dernire dans des tests in vitro. Des analyses protomiques ont
montr que ces isoformes
taient associes la surface des thylacodes au contact du stroma
(Pelletier et Lucy, 2002 ;
Friso et al., 2004). Parmi ce type de TRX, lisoforme m3 se
distingue des autres TRX m. Elle
TRX du type m
-
10
possde une cystine additionnelle dans sa rgion N-terminale et
beaucoup de charges
positives proximit de son site actif (Collin et al., 2003).
Aucune cible pour cette isoforme
na t mise en vidence avant le dbut de ma thse. Le potentiel
redox du pont disulfure du
site actif pour les thiordoxines du type m est compris entre
-368 et -357 mV pH 7,9 (Collin
et al., 2003).
Le type y a t plus rcemment identifi grce au squenage complet du
gnome
dArabidopsis. Chez cette espce, il existe deux isoformes pour ce
type de thiordoxines,
nommes y1 et y2. Ces thiordoxines semblent tre plus impliques
dans la rponse au stress
oxydant que dans la rgulation de voies mtaboliques,
contrairement au type m et f. Le
potentiel redox du pont disulfure du site actif pour ces
thiordoxines, denviron -330 mV pH
7,9, est moins ngatif que celui des thiordoxines du type m et f
(Collin et al., 2004).
Lisoforme y1 possde dans sa partie C-terminale une cystine
additionnelle conserve,
comme la thiordoxine f. Par homologie avec lisoforme f1, cette
cystine additionnelle est
suppose tre soumise des modifications post-traductionnelles de
type glutathionylation.
TRX du type y
Le gnome dA. thaliana code pour une seule isoforme de
thiordoxine de type x dont
les transcrits sont accumuls dans les organes verts
(Mestres-Ortega et Meyer, 1999). Comme
pour le type y, cette thiordoxine est un rgulateur peu efficace
denzymes du mtabolisme
carbon et semble plus implique dans la lutte contre les stress
oxydants. A pH 7,9, le
potentiel redox du pont disulfure de son site actif est de -336
mV (Collin et al., 2003).
TRX du type x
Trs rcemment, un nouveau type de thiordoxine adress aux plastes,
nomm type z,
a t identifi. Peu de choses sont connues sur les fonctions de ce
nouveau type de
thiordoxine. Cependant, il semble que cette thiordoxine soit
implique dans la rponse aux
attaques pathognes (Rivas et al., 2004) et dans la rgulation
dune polymrase plastidiale, la
Plastid Encoded mRNA Polymerase (Arsova et al., 2010). A pH 7,9
le pont disulfure de cette
isoforme est de -310 mV (Chibani et al., 2011).
TRX du type z
-
Figure 8: Expression of plastidial TRXs in Arabidopsis tissues.
RT-qPCR analyses were performed in leaves, flowers, young and
mature siliques, seedlings, roots and seeds. Data were normalized
to the housekeeping protein phosphatase 2A gene (PP2A) and
represented using the level of the TRX f1 transcripts in leaves as
reference. Means SD of triplicates experiments are shown.
Reproduced from V. Massot thesis manuscript.
-
11
Les glutardoxines sont des homologues structuraux des
thiordoxines identifies
initialement en tant que donneurs alternatifs dlectrons la
ribonuclotide rductase dE. coli
(Holmgren, 1976). Chez Arabidopsis, il existe 31 isoformes de
GRX, (rparties en 3 types :
CPYC ; CC et CGFS) dont 4 seraient potentiellement adresses aux
plastes. Leur potentiel
redox est moins ngatif que celui des thiordoxines et est
gnralement compris entre -250 et
-280 mV pH 7,9. Ces protines sont impliques dans la rduction de
ponts disulfures ou
dans la dglutathionylation de leurs protines cibles. Chez les
vgtaux, le type CC est connu
pour protger les cellules de dgt oxydatif (Hirschi et al., 2006)
tandis que le type CGFS et
impliqu entre autre dans le transfert du centre fer souffre
lapoferrdoxine (Bandyopadhyay
et al 2008) et le devellopement floral (Li et al., 2009)
Les glutardoxines (GRX)
Les informations disponibles dans les bases de donnes de puces
ADN, ainsi que de
nombreuses autres tudes transcriptomiques, montrent que les TRX
plastidiales sont
exprimes de manires diffrentes selon les tissus. Lexpression
spcifique des diffrentes
TRX plastidiales a t tudie en dtail au laboratoire (Thse V.
Massot). Les rsultats (Cf.
figure 8) montrent que la prsence de transcrits pour 9 isoformes
plastidiales est dtecte dans
tous les organes de la plante. Globalement, les gnes codant les
TRX du type m (
lexception de m3) et x sont les plus abondamment exprims dans
les feuilles et les jeunes
plantules. En accord avec une prcdente tude (Mestres-Ortega et
Meyer, 1999), lARN de la
thiordoxine m3 est faiblement exprim dans tous les organes,
lexception des boutons
floraux. Ces rsultats prcisent galement la trs forte expression
de lisoforme y1 par rapport
aux autres TRX plastidiales dans les graines (Collin et al.,
2004).
Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis
thaliana
Parmi les nombreuses cibles des thiordoxines plastidiales mises
en vidence au cours
des dcennies passes, plusieurs sont impliques dans le mtabolisme
photosynthtique. Cest
dailleurs dans la fonction de rgulateur denzyme du cycle de
Calvin que les TRX
plastidiales ont t la premire fois identifies (Buchanan et
Wolosiuk, 1976 ; Homlgren et
al., 1977). Aujourd'hui, grce aux avances en gnomique et en
protomique, plus de 300
nouvelles cibles potentielles de TRX ont t identifies (Buchanan
et Balmer, 2005 ; Hisabori
et al., 2005 ; Michelet et al., 2006). La dcouverte de ces 300
cibles potentielles indique que
Les cibles des thiordoxines
-
12
les TRX jouent un rle gnralis dans la rgulation du mtabolisme
des organismes
vgtaux. Pour les TRX chloroplastiques, plus de 100 cibles
potentielles ont t identifies
ce jour (Lemaire et al., 2007 ; Marchand et al., 2010).
Les premires cibles de TRX plastidiales ont t dcouvertes par des
approches
biochimiques, il sagit de la fructose-1,6-bisphosphatase
(FBPase) et de la glycraldhyde-3-
phosphate dshydrognase (GAPDH). Par la suite, des approches
protomiques utilisant le
principe des colonnes daffinit de thiordoxines monocystiniques
ont permis didentifier
dautres cibles, impliques dans le mtabolisme carbon
photosynthtique, telles que la
sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase), la
phosphoribulokinase (PRK) ou la rubisco
activase. Ces cibles de TRX sont actives la lumire par rduction
via lactivation du
systme Fd/TRX.
Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme
photosynthtique
En plus de nombreuses enzymes du cycle de Calvin, dautres cibles
des TRX ont t
identifies comme la sous-unit CF1 du complexe ATPase
chloroplastique, la malate
dshydrognase (MDH) NADP qui permet lexport de pouvoir rducteur
partir du
chloroplaste vers le cytosol sous forme de malate, ainsi que des
protines impliques dans le
transfert photosynthtique dlectrons comme la sous-unit de
lantenne collectrice LHCIIb
(Lemaire at al., 2007).
En plus des cibles de TRX impliques dans le mtabolisme
photosynthtique, les
approches biochimiques et protomiques ont rvl des cibles
plastidiales valides ou
putatives impliques dans des fonctions biologiques varies du
mtabolisme primaire et
secondaire dont entre autres, le mtabolisme de lamidon, la
biosynthse des lipides, et les
systmes antioxydants, notamment des peroxydases thiols. La
fonc