Graduação em Biotecnologia Disciplina de Proteômica · Precipitação de proteínas Diálise Filtração Concentração Eliminação da maior parte dos contaminantes e substâncias

Graduação em Biotecnologia

Disciplina de ProteômicaCaroline Rizzi

Doutoranda em Biotecnologia -UFPel

PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS

Propriedades de proteínas

Ponto isoelétrico

É no ponto isoelétrico que a proteína apresenta-se com menor solubilidade!!!!

Importância do cálculo do pI

1. Vector NTI

2. Expasy

Focalização isoelétrica

Solubilidade

Purificação: Proteínas ácidas:

pH>pI: troca iônica

Proteínas básicas:

pH<pI: troca catiônica

Calculado através de todos os NH e COOH livres

Importância do cálculo do pI

Com o uso de tampõesanfólitos, um gradiente de

pH é formado sob ação de um campo elétrico!

Focalização isoelétrica

Massa Molecular

Unidades de massa atômica “Atomic MassUnit” (amu ou u ou Da): utilizada para

expressar a massa molecular ou peso atômico

1 Da: 1/12 da massa do 12C

1 átomo de Hidrogênio possui cerca de 1 Da

Massa Molecular

Cálculo atráves de programas: Vector e Expasy

Importância:Gel 2D

Concentração de proteínas por filtraçãoGel filtração

Estimativa: Calculado através da soma da massa média dos isótopos

Determinação:Espectrometria de massas

Gel filtração

Eletroforese de proteínas

Teoria da eletroforese: as proteínas com carga elétrica em virtude da

ionização movem-se para o catódo (pólo negativo) ou ânodo (pólo

positivo), dependendo do tipo de carga que apresentam;

As proteínas são separadas conforme sua

carga, estrutura 3D e sua massa

Separação de proteínas através da sua

movimentação em um campo elétrico

São quase sempre realizadas em géis que

servem como peneira molecular

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel eletrophoresis

SDS: desnatura

e carrega

todas as

proteínas

negativamente

Migração para o

ânodo

Separação pelo

tamanho

Malha de

acrilamida-

bisacrilamida

Gel 2D

Solubilidade de Proteínas

Fatores intrínsecosDepende da quantidade de pontes de H que os seus grupos polares

podem formar com a água

Solubilidade de Proteínas

Fatores extrínsecos: perturbação das interações solvente-proteínaConcentração de eletrólitos no meio

[sal] interação íons salinos e cargas das

proteínas

solubilidade

(SALTING IN)

[sal] competição entre íons salinos e

cargas das proteínas pela água

solubilidade (ppt)

(SALTING OUT)

Solubilidade de Proteínas

Fatores extrínsecospH do meio

próximo do pI solubilidade

solubilidade (ppt)

Diminuem as forças repulsivas entre

as moléculas das proteínas

Agregados= precipitação

Solventes orgânicos

Anfipáticos: acetona, etanol...

Infiltram-se no interior e

superfície das proteínas

Competição pela água, alteração do

do interior hidrofóbico, diminuição

da [água]

Precipitação

Desnaturação de proteínas

Agentes desnaturantes:

Agentes redutores

Uréia, guanidina

Altas temperaturas

pH

Detergentes

OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO

Preparação do extrato bruto para purificação

Questões?

• Qual é a fonte de proteínas?

• Tecido, bactérias, intra ou

extracelular?

• Quais são os equipamentos

disponíveis?

• Qual é a escala de purificação?

• Quais serão os procedimentos de

purificação a serem utilizados?

• Qual é o grau de pureza e

atividade biológica desejados?

Condições básicas de obtenção

• Realização rápida;

• Temperaturas baixas;

• Presença de tampão adequado e

capaz de manter o pH e de força

iônica que estabilize a amostra;

• Amostras limpas e livres de

partículas insolúveis.

Escolha do tampão

Características do tampão• Concentração: quanto maior, maior

tamponamento, mas não maior que 0,1M

• Tampões desejáveis:

1. pKa do tampão deve ser próximo ao pHfinal da solução e não exceder o limitede 1;

2. O pH do tampão não pode ser afetadopelas pequenas variações detemperatura, diluições e adição de saisneutros;

3. O tampão não deve ser reativoquimicamente;

4. Não pode absorver luz a 280 nm;

5. Para cromatografias de troca iônica,usar tampão iônico;

6. Tampões não podem interagir comcomponentes da mistura (ex; ácidobórico e glicoproteínas).

• Good’s buffers*:

• MES,ADA, PIPES,ACES, BES, MOPS, HEPES, TAPS, CHES, CAPS: quimicamente não reativos, não absorvem a 280 nm, o valor de pH não varia com temperatura e sais

• Muito mais caros

• Variações pequenas no pH (0,05 u): concentrações de 0,1 a 0,2 mM

• Variações bruscas no pH (> 0,1 u): concentrações acima de 50mM

• Reações enzimáticas: cuidar a liberação oucaptação de prótons

*N. E. Good. G. D. Winget, W. Winter, T. N. Connolly, S. Izawa, and R. M. M. Singh, Biochernisrry 5, 467 (1966)

Aditivos ao tampão

NaCl;

EDTA;

Detergentes;

Inibidores de proteases;

Agentes redutores;

DNAses e RNAses;

Estabilizantes;

Conservantes.

Detergentes

Compostos anfifílicos;

Formação de micelas;

Agentes solubilizantes e

desagregantes;

A maioria não absorve a 280

nm;

Estabilidade, funcionalidade,

estrutura e solubilidade da

proteína: não garantidas;

Concentração final de 0,01 a

5%.

CMC: concentração onde há o

início da formação das

micelas

Proteínas

integrais da

membrana

detergente micelas

Complexos

não micelares

Dependendo da concentraçãoDetergentes: iônicos e não

iônicos

Detergentes

não iônicos

Triton X-100

(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)

SDS

Dodecil sulfato de

sódio

Cetab

Cetyltrimethylammonium

bromide

Deoxicolato de sódio

Detergentes iônicos

Octilglicosídeo

(octyl-b-D-glucopyranoside)

Sarcosil

Uréia

Desnaturação e solubilização de proteínas;

Barata e de fácil remoção;

Eleva a solubilidade de grupos da proteína na solução aquosa, através da acomodação dos grupos apolares;

Guanidina e tiouréia;

A tiouréia é um agente mais eficiente que a uréia, mas pouco solúvel em água;

A mistura uréia- tiouréia é bastante eficiente;

Concentrações de 6 a 8 M.

Corpos de Inclusão

• E. coli: a proteína superexpressapode acumular-se no interior dacélula como uma forma insolúvel(corpos de inclusão);

• Facilita a purificação;

• Forma ativa?

• Desnaturadas e reduzidas;

• Dímeros e multímeros;

• Purificação de corpos de inclusão:– Lise celular

– Isolamento dos corpos de inclusão

– Solubilização

– Purificação

– Refolding

Lise celular e obtenção do extrato bruto

Suaves

• Choque osmótico: hemácias

• Digestão enzimática com lisozima:– 0.2 mg/ml, 30 min, 4 C

– Bactérias gram negativas e proteínas

intracelulares

– Expõe a membrana citoplasmática pela

degradação dos peptídeos da parede

celular

– Minimiza desnaturação e é

independente da escala

– pH ótimo: 6,7 a 8,6

• Trituração, moagem

• Método Freeze-Thaw

Vigorosas• Sonicação:

– Suspensão celular: proteínas intracelulares, periplasma, corpos de inclusão

• Prensa Francesa:– Bactéria, tecidos de plantas

• Fracionamento por precipitação:– Proteínas extracelulares:secretadas,

anticorpos monoclonais, lisadoscelulares

– Baixo custo, grandes volumes

• Agitação com abrasivos:– Pérolas de vidro

• Liquefação:– Potter

tecidos

células

Homogeneização

(para romper tecidos e células)

por pressão(prensa francesa)

liquefação(Potter)

Homogenado

ou

Extrato bruto

Material

de

partida

Material na

fonte

por ultra-som comdetergente

Lise Celular

Sonicação Ultrasons que rompem as amostras

Mistura com esferas de vidro para

estruturas mais resistentes

(micobactérias, estafilococos..)

Aumenta a temperatura da amostra

Formação de bolhas

Preparação do extrato bruto

Centrifugação

Remoção de ácidos

nucléicos

Precipitação de proteínas

Diálise

Filtração

Concentração

Eliminação da maior parte dos contaminantes e substâncias

insolúveis

Centrifugação

• Peletilização:

– Separação por densidade

– Útil após lise, precipitação

de DNA e proteínas,

concentração e diálise.

A centrífuga

Câmara blindadaAmostra sedimentando

refrigeração vácuo

rotorângulo

fixo

fração

citoplasmática

Remoção de ácidos nucléicos

RNAses

DNAses

Sulfato de estreptomicina: ajuda a

precipitar proteínas

contaminantes.

Fracionamento por precipitação

A precipitação de proteínas pode ser induzida por:

- adição de sais (Precipitação salina)

- adição de solventes

- variação de pH (Precipitação isoelétrica)

So

lub

ilid

ad

e d

a h

em

og

lob

ina

(S

/S’)

KCl

NaCl

MgSO4

(NH4)2SO4

K2SO4

Concentração do Sal,, Molar

Salting-in X Salting-out

Baixa concentração: solubilidade↑(íons do sal ajudam a reforçar a

camada de solvatação)

Alta concentração: solubilidade↓

(competição pelas moléculas de

água disponíveis)

Sais com ânions divalentes são mais

eficientes do que os monovalentes

na precipitação de proteínas.

Efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da

hemoglobina.

Precipitação por sais

So

lub

ilid

ad

e,

log

FibrinogênioPseudoglobulina

MioglobinaAlbumina

Hemoglobina

Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar

Proteínas apresentam diferentes sensibilidades

para a precipitação salina.

- precipitam primeiro:

proteínas maiores

proteínas mais hidrofóbicas

.

Sulfato de amônia: estabiliza as proteínas, não é desnaturante,

sobrenadante pode ir à cromatografia, preservação de proteínas

Sulfato de amônia: preparação da solução saturada

Adição a concentrações crescentes

Volume para 1 litro de solução: 1000(C2-C1) / 100 – C2

C1= concentração inicial sulfato de amônia(%)C2 = concentração final sulfato de amônia (%)

20%, 35%, 45%, 60%, 75%....

Solventes miscíveis com a água diminuem a

constante dielétrica do meio e diminuem sua

interação com a água.

Água

Dimetilformamida

Metanol

Etanol

Acetona

78.5

48.9

32.6

24.3

20.7

Solvente Constante

Dielétrica

Proteína P.I.

Pepsina <1,0

Ovalbumina galinha 4,6

Albumina sérica humana 4,9

Tropomiosina 5,1

Insulina bovina 5,4

Fibrinogênio humano 5,8

Gama-globulina 6,6

Colágeno 6,6

Mioglobina equina 7,0

Hemoglobina humana 7,1

Ribonuclease A bovina 7,8

Citocromo C equino 10,6

Histona bovina 10,8

Lisozima, galinha 11,0

Salmina, salmão 12,1

Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu pI tendem

a precipitar

Precipitação por solventes e pI

Diálise

Usos:

Troca de tampão

Remoção de sais

Remoção de

detergentes

Princípios:

Membrana de

celofane com poros

de até 10.000 Da

Imersão no solvente

Trocas

solvente/amostra

Volume

solvente/amostra

Concentração

Ultrafiltração:

• Uso de membranas

semipermeáveis e

pressão;

• Separação de proteínas

por tamanho e remoção

de solventes;

• Remoção do excesso de

sais ou troca de tampões

(concentrações repetidas);

Concentração

Membranas:

• Cut off: 5, 8, 10, 30, 50,100,

300, 500 e 1000 kDa;

• Níveis de redução da ligação

não específica de proteínas;

• Resistência à pressão;

Microconcentrador:

• Volumes de 0,5 a 15 mL;

• Centrifugação;

Exemplos de Estratégias

Extratos de E. coli

Lise por lisozima

Lise por sonicação

Centrifugação

Precipitação de ácidos nucléicos

Centrifugação

Precipitação de proteínas

Centrifugação

Proteínas secretadas

Centrifugação

Precipitação de proteínas

Centrifugação

Solubilização

Diálise

Conservação

Congelamento a -20°C ou -70°C

Glicerol (5%) ou sacarose

Congelamento em nitrogênio

Saturação com sulfato de amônio

Liofilização