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Alain A. Schweitzer, PhDAlain A. Schweitzer, PhDPCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 BâlePCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle
GMP, Paris, Février 2004 2
SommaireSommaire• Définitions• Historique• La méthode d’Ullberg• Détection de la radioactivité• Quantification des autoradiogrammes• Interprétation des résultats • Principales applications• Conclusions
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DéfinitionsDéfinitions• Ensemble de méthodes “photographiques” permettant
la détection et la localisation spatiale/géographique d’éléments radioactifs présents dans un échantillon solide• Macro- vs. Microautoradiographie• QWBAR, QWBAL et DNC
Historique Historique (méthode de Kalberer, 1966)(méthode de Kalberer, 1966)
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La méthodeLa méthoded‘Ullbergd‘Ullberg
• Congélation• Enrobage• “Trimming”• Obtention des coupes• Cryodessication
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Congélation des animauxCongélation des animaux
• Azote liquide ?? • Hexane-CO2 solide
– Souris 15-30 min (<pour males and fng <25 g)– Rat 30-60 min (<pour males and fng <180 g)– Lapin 2-4 h (<pour males and fng <2 kg)– Singe 2-4 h (<pour males and fng <1.5 kg)
• Congélation rapide = pas de diffusion
Curtis et al., 1981. Whole-Body Autoradiography. Academic Press, Inc., London)
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EnrobageEnrobage
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Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC
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Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC
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Atteinte du niveau de coupe (Atteinte du niveau de coupe (“trimming”)“trimming”)
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Obtention des coupesObtention des coupes
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La coupeLa coupe
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Détection de la radioactivitéDétection de la radioactivité
• Autoradiographie, à l‘aide de films (QWBAR)• Autoradioluminographie/imagerie phosphore,
à l‘aide d‘écrans-phosphore (QWBAL)• Comptage nucléaire direct, dans le compteur
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QWBA / Principe QWBARQWBA / Principe QWBAR
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QWBA / Principe QWBALQWBA / Principe QWBAL
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QWBAL / exemple de balayageQWBAL / exemple de balayage
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QWBAL / exemple de balayage /CycloneQWBAL / exemple de balayage /Cyclone
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QWBAL / exemple de balayage /BAS5000QWBAL / exemple de balayage /BAS5000
Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire
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Utilisation systématique indispensable des standards de calibration
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Quantification : DNC vs. LSCQuantification : DNC vs. LSC
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Quantification : QWBAL vs. DNCQuantification : QWBAL vs. DNC
100
1000
10000
100 1000 10000
Activity Phosphor-imager - 4 days (dpm/mg)
Ac
tiv
ity
Be
ta-i
ma
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r (d
pm
/mg
)
200x250 - 4 heures
200x250 - 12 heures
120x160 - 24 heures
75x100 - 24 heures
Beta-Imager acquisition :
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Interprétation des résultatsInterprétation des résultats
• vue d‘ensemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps• distribution régionale dans les tissus et structures • contrôle visuel de l‘absence de contamination• archivage permettant une re-lecture/contre-expertise• analyses complémentaires possibles
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Interprétation des résultats Interprétation des résultats
• macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!)• radioactivité totale, pas une structure chimique
donnée• pharmacocinétique!• importance des conditions expérimentales
– purité radiochimique de la substance testée– LOD, LOQ– doses nominales, doses radioactives – métabolites volatiles, 3H20
• „ouvrir les yeux, voir large“
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Principales applicationsPrincipales applications
• contribution à la sélection de molécules (PD,Tox)• contribution à la sélection de formulations (Galénique)• études ADME (PK)• safety assessment (ex: passage transplacentaire)
(Tox)• estimation de la radio-exposition (hADME)• dossiers d‘enregistrement• études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine,
résidus, „mottled pattern“ etc)
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Exemples d’application Exemples d’application
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Exemples d’application Exemples d’application
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Exemples d’application Exemples d’application
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Exemples d’application Exemples d’application
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Exemples d’application Exemples d’application
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Exemples d’application Exemples d’application
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ConclusionsConclusions informations spécifiques, importantes nombreuses applications en recherche &
développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc)