-
KEJURUTERAAN GENETIK TUMBUHAN
1.0 Pengenalan kejuruteraan genetik tumbuhan
Kejuruteraan genetik tumbuhan adalah satu proses yang melibatkan
pemindahan gen
yang membawa maklumat genetik daripada satu orgamisma kepada
organisma sasaran
yang lain dengan menggunakan kaedah teknologi DNA rekombinan.
Proses ini
melibatkan kemasukan, pengubahsuaian atau pembuangan fragmen DNA
yang
mengandungi satu atau lebih gen yang diminati ke dalam tanaman
untuk mendapatkan
ciri fenotip yang diminati. Organisma yang menerima gen baru ini
dikenali sebagai
organisma terubahsuai secara genetik (GMO) atau organisma
transgenik.
Tempoh penghasilan tanaman transgenik mengambil masa yang lama
bergantung
kepada jenis tanaman serta pengesahan biokeselamatan tanaman
transgenik yang
ingin dipasarkan. Lazimnya proses penghasilan tanaman transgenik
mengambil masa
10 15 tahun daripada peringkat makmal hingga ke peringkat
komersial.
1.1 Langkah-langkah dalam penyelidikan kejuruteraan genetik
tumbuhan
Kejuruteraan genetik tumbuhan melibatkan beberapa aktiviti
berikut iaitu;
1. Mengenalpasti dan memencilkan gen yang mempunyai ciri-ciri
yang
dikehendaki,
2. Pengeklonan gen yang diminati ke dalam vektor transformasi
tumbuhan
yang mengandungi promoter dan terminater contohnya pCAMBIA.
3. Membangunkan sistem kultur tisu, sistem transformasi dan
regenerasi yang
cekap. Sistem-sistem ini adalah penting untuk menentukan
kejayaan
transformasi sesuatu tanaman.
4. Transformasi atau pemindahan gen ke dalam tisu tanaman dengan
kaedah
yang sesuai seperti menggunakan kaedah Agrobakterium atau
kaedah
penembakan zarah (Biolistik).
5. Proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi untuk
memilih pokok-
pokok berpotensi yang mengandungi gen diminati.
6. Regenerasi tisu yang telah ditransformasi untuk mendapakan
plantlet.
-
7. Analisis pokok-pokok transgenik dengan menggunakan teknik
biologi molekul
seperti tindakbalas rantaian polimerase (PCR), pemblotan
Southern,
pemblotan Northern atau Real Time PCR.
8. Pemindahan pokok-pokok transgenik positif yang berakar ke
polibeg atau
pot bergantung kepada pokok yang ditransformasi.
9. Kajian tertutup, kajian lapangan terkawal diikuti kajian
lapangan terbuka
pokok-pokok transgenik.
10. Kelulusan Biokeselamatan untuk pengeluaran dan pemasaran
tumbuhan
transgenik.
Carta alir untuk proses yang terlibat dalam teknik kejuruteraan
genetik.
Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan
-
1.2 Teknik kejuruteraan genetik tumbuhan
Terdapat beberapa teknik yang boleh digunakan untuk proses
pemindahan gen asing
ke dalam tisu tumbuhan iaitu dengan menggunakan kaedah secara
langsung ataupun
secara tidak langsung. Teknik yang paling meluas digunakan iaitu
teknik secara tidak
langsung dengan berperantara Agrobakterium. Teknik kedua iaitu
teknik secara
langsung seperti kaedah penembakan zarah (biolistik), protoplas
dan mikroinjeksi.
Teknik-teknik tersebut dikenali sebagai teknik secara langsung
kerana proses
transformasi tidak melibatkan perantara.
1.2.1 Transformasi gen dengan Agrobakterium
Agrobakterium tumefaciens merupakan bakteria gram negatif yang
berbentuk rod.
Secara semulajadinya bakteria Agrobakterium ini boleh
menjangkiti tanaman dan
menyebabkan satu penyakit yang dikenali sebagai nodul-nodul.
Penyakit nodul-nodul
terhasil apabila Agrobakterium tadi memindahkan bahagian T-DNA
dari plasmid yang
ada pada Agrobakterium tersebut ke dalam nukleus sel dan
berintegrasi dengan
genom tumbuhan. Plasmid ini dikenali sebagai Tumour inducing
plamid (Plasmid Ti)
yang bersaiz lebih kurang 200 kb. Nodul-nodul yang terhasil ini
berkeupayaan
membekalkan sumber karbon kepada Agrobakterium. Keunikan sifat
inilah yang
membolehkan plasmid Ti pada Agrobakterium digunakan sebagai satu
alat
pemindahan gen iaitu dengan menyisipkan gen yang diminati ke
bahagian T-DNA
Agrobakterium tersebut.
Terdapat tiga komponen penting yang terlibat di dalam pemindahan
gen iaitu:
1. Gen virulen kromosom (chromosomal virulence, chv) yang
terdapat dalam
kromosom Agrobakterium terlibat dalam proses perlekatan
Agrobakterium
dengan sel tumbuhan.
2. Kelompok gen virulen (vir) yang terdapat pada Ti-plasmid
berperanan untuk
menginduksi permindahan dan juga integrasi T-DNA.
3. Kawasan T-DNA yang merangkumi daerah LB (left border) hingga
RB (right
border) pada Ti-plasmid mengandungi gen-gen penting untuk
Agrobakterium
berfungsi.
-
Teknik Agrobakterium merupakan sistem transformasi yang paling
meluas digunakan
dalam proses transformasi tumbuhan terutamanya terhadap tumbuhan
dikotiledon.
Teknik ini pada awalnya dipercayai hanya boleh digunakan untuk
pemindahan gen
terhadap tumbuhan dikotiledon sahaja, tetapi selepas kajian
intensif dilakukan
terhadap tumbuhan monokotiledon, membuktikan teknik
Agrobakterium ini boleh
juga digunakan untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Hiei
et al., (1994; 1997)
ialah saintis pertama yang melaporkan bahawa teknik
Agrobakterium boleh digunakan
untuk transformasi tumbuhan monokotiledon. Antara tanaman yang
berjaya
ditransformasi dengan teknik Agrobakterium seperti padi, jagung,
orkid dan asparagus
(Yu et. al., 2009; Ozawa, 2009; Shou et. al., 2004; Mishiba et.
al., 2005; Liau et. al.,
2003; Limanton-Grevet and Jullien, 2004 dan Delbreil et. al.,
1993).
Teknik berperantara Agrobakterium ini paling digemari dan
mempunyai kelebihan
kerana ianya berkeupayaan mengintegrasi dan memindahkan T-DNA ke
dalam genom
tanaman tanpa melibatkan penggunaan peralatan yang sofistikated
dan canggih
berbanding teknik pemindahan gen yang lain. Selain itu,
kelebihan lain teknik
berperantara Agrobakterium ini ialah jumlah salinan gen yang
terintegrasi pada
genom tanaman biasanya hanya satu salinan dan ini dapat
mengurangkan gangguan
terhadap fungsi gen-gen lain dalam tumbuhan tersebut.
Walau bagaimanapun keberkesanan teknik ini terbatas kepada
genotip tanaman dan
teknik ini juga melibatkan banyak penggunaan antibiotik.
Antibiotik diperlukan
samada untuk proses penyaringan tisu yang telah ditransformasi
dan juga untuk
mengawal lebihan pertumbuhan Agrobakterium.
1.2.1.1 Proses transformasi dengan Agrobakterium
i. Penyediaan kultur Agrobakterium
Strain Agrobakterium yang digunakan mestilah bersesuaian dengan
pokok yang
ditransformasikan. Pemilihan strain berdasar kepada keupayaan
strain tersebut
memindahkan gen yang dikehendaki ke dalam tisu tumbuhan.
Kebiasaanya strain yang
mempunyai kecekapan transformasi yang tinggi dipilih. Terdapat
banyak jenis strain
-
Agrobakterium, seperti LBA 4404, AGL1, EHA 101 dan EHA 105.
Selain pemilihan
strain, vektor transformasi tumbuhan yang digunakan juga
mestilah bersesuaian
berdasar kepada gen penanda pemilihan yang dimiliki oleh vektor
tersebut. Strain
Agrobakterium yang super virulen bergabung dengan vektor
transformasi tumbuhan
yang bersesuaian akan meningkatkan kecekapan proses
transformasi.
Gen konstruk yang ditransformasikan ke dalam Agrobakterium
kebiasaanya disimpan
dalam bentuk gliserol dan disimpan pada suhu -80C sebagai kultur
stok. Untuk tujuan
transformasi, stok gliserol tadi dilakar ke atas media pejal
Luria Bertani (LB) yang
mengandungi antibiotik untuk pemilihan Agrobakterium yang
mengandungi konstruk
yang betul dan dieram selama 3 hari pada suhu 28C. Koloni yang
tumbuh selepas 3
hari dikulturkan ke dalam media cecair LB yang mengandungi
antibiotik yang sama
dan digoncang dalam alat pengeraman selama 3 hari pada suhu yang
sama dengan
kelajuan 280 rpm.
Kultur bakteria yang terhasil akan dimendakkan dengan alat
pengempar pada kelajuan
6000 rpm selama 15 minit. Pellet yang terbentuk dilarutkan
semula ke dalam media
cecair dan digoncang pada suhu dan kelajuan yang sama sehingga
mencapai fasa aktif
pertumbuhan atau fasa logaritma dengan ketumpatan optik (OD)
0.2- 0.5. Pemilihan
Ketumpatan optik (OD) yang digunakan bergantung kepada kecekapan
sistem
transformasi sesuatu tumbuhan. Kebiasannya ketumpatan optik yang
digunakan antara
0.2-0.5. Walau bagaimanapun sesetengah tumbuhan menggunakan
ketumpatan optik
yang lebih tinggi iaitu 1.0.
Media cecair juga biasanya mempunyai nilai pH yang rendah antara
5.2-5.3 dan
ditambah dengan bahan kimia asetosiringone. Asetosiringone
berperanan memberi
isyarat kepada gen-gen virulen yang terlibat dalam mekanisma
pemindahan gen.
Adakalanya, tanpa penambahan asetosiringone, proses transformasi
gen tidak akan
berlaku di dalam sesetengah tumbuhan. Kepekatan asetosiringone
yang lazim
digunakan dalam transformasi Agrobakterium ialah 100 - 200
M.
-
ii. Transformasi tisu tumbuhan
Tisu yang hendak ditransformasi direndam dalam larutan
Agrobakterium selama 30-40
minit. Kemudian diletakkan di atas kerta turas selama 15-30
minit untuk
mengeringkan lebihan Agrobakterium sebelum dikulturkan ke media
ko-kultivasi.
Media ko-kultivasi juga mempunyai nilai pH yang rendah untuk
meningkatkan
kecekapan pengekpresan gen vir.
Jangkamasa ko-kultivasi yang optimum adalah penting untuk
penyerapan
Agrobakterium ke dalam sel tisu tumbuhan. Masa ko-kultivasi yang
terlalu singkat
boleh menjejaskan kecekapan transformasi. Tetapi sekiranya masa
ko-kultivasi terlalu
lama, ianya boleh menyebabkan pertumbuhan Agrobakterium tidak
dapat dikawal
walaupun selepas dipindahkan ke atas media yang mengandungi
antibiotik.
Ketidakkeberkesanan menghapuskan pertumbuhan Agrobakterium yang
berlebihan
merupakan masalah utama transformasi dengan Agrobakterium kerana
ia boleh
menjejas dan memusnahkan pokok-pokok yang berpotensi. Oleh itu,
penggunaan jenis
dan kepekatan antibioitik yang sesuai adalah penting untuk
mengawal pertumbuhan
Agrobakterium semasa proses transformasi. Antibiotik yang
biasanya digunakan untuk
mengawal pertumbuhan Agrobakterium seperti cefotaxime,
vancomycin dan
carbenicillin yang boleh menghalang pembentukan dinding sel
bakteria. Jenis dan
kepekatan yang digunakan hendaklah mampu menghalang
pertumbuhan
Agrobakterium dan juga tidak mempengaruhi pertumbuhan sel
tumbuhan.
iii. Penyaringan tisu yang ditransformasi
Proses penyaringan dilakukan di atas media yang mengandungi
antibiotik yang sesuai
untuk pemilihan tisu-tisu yang berjaya ditransformasi. Semasa
proses penyaringan
tersebut, hanya sel yang mengandungi gen penanda pemilihan
sahaja yang akan hidup
dan sel yang tidak mengandungi gen penanda pemilihan akan mati.
Oleh itu, putatif
transforman dapat dikenalpasti. Proses penyaringan peringkat
awal ini membantu
mengurangkan jumlah sampel yang perlu dianalisis secara biologi
molekul kelak.
Kepekatan antibiotik yang digunakan semasa proses penyaringan
mestilah
-
bersesuaian. Kepekatan antibioitk terlalu rendah akan
menyebabkan banyak pokok
terlepas semasa proses penyaringan dan sebaliknya kepekatan yang
terlalu tinggi
boleh merencat tumbesaran sel tumbuhan.
Antibiotik yang digunakan semasa proses penyaringan bergantung
kepada gen penanda
pemilihan (selectable marker gen) yang digunakan dalam
penyediaan konstruk.
Sebagai contoh, jika gen penanda pemilihan yang digunakan adalah
gen nptII yang
memberi kerintangan terhadap kanamycin, jadi antibiotik
kanamycin digunakan
semasa proses penyaringan tisu transformasi. Dengan itu hanya
sel tisu yang
mengandungi gen nptII sahaja akan rintang dan hidup dalam media
tersebut.
Kebiasaanya proses penyaringan dilakukan selama 4 bulan.
iv. Regenerasi sel transformasi
Selepas proses penyaringan, sel yang berjaya hidup akan
dipindahkan ke atas media
regenerasi untuk mendapatkan plantlet. Kecekapan sistem
transformasi banyak
bergantung kepada kecekapan sistem regenerasi kerana sistem
regenerasi yang cekap
membolehkan tisu tumbuh dengan cepat dan banyak.
v. Pengakaran pokok transformasi
Selepas platlet mencapai ketinggian lebih kurang 2 cm ianya
dipindahkan ke media
pengakaran. Biasanya proses pengakaran dilakukan di dalam media
yang mengandungi
hormon auksin seperti IBA, IAA atau NAA bergantung kepada
kesesuaian pokok yang
ditransformasikan. Pokok yang berakar dipindahkan pula ke
polibeg atau ke pot.
-
Gambahrajah berperingkat regenerasi tisu tumbuhan yang
ditransformasi. (a) Tisu tumbuhan (kalus) yang digunakan untuk
transformasi. (b) Proses penyaringan untuk pemilihan tisu-tisu yang
berjaya ditransformasi atas media antibiotik. (c) Tisu yang berjaya
hidup dalam media antibiotik dipindahkan ke media regenerasi untuk
mendapatkan plantlet. (d) Pembentukan plantlet atas media
regenerasi. (d) Pengakaran pokok transformasi dalam media
pengakaran.
a b
c d e
-
1.2.2 Teknik penembakan zarah (Biolistik)
Teknik transformasi tumbuhan kedua ialah teknik penembakan zarah
yang juga
dikenali sebagai teknik tembakan mikropeluru. Teknik ini
merupakan satu alternatif
untuk transformasi tumbuhan terutamanya tumbuhan monokotiledon
kerana kejayaan
transformasi gen menggunakan kaedah Agrobakterium terbatas
kepada tumbuhan
dikotiledon dan spesis monokotiledon tertentu.
Teknik transformasi penembakan zarah menggunakan satu alat khas
yang dikenali
sebagai biolistik. Melalui teknik ini, zarah tungsten atau emas
yang disalut dengan
DNA ditembak ke dalam sel tumbuhan dengan menggunakan gas
tekanan tinggi. Saiz
diameter zarah tungsten atau emas yang digunakan antara 0.5
hingga 5 mikron.
Teknik penembakan zarah juga melibatkan proses penyaringan sama
seperti teknik
Agrobakterium kerana tidak semua sel tumbuhan yang ditembak akan
menerima gen
tersebut. Proses penyaringan ini dilakukan dengan meletakkan sel
tumbuhan yang
ditembak ke atas media yang mengandungi antibiotik. Hanya sel
yang mengandungi
gen penanda pemilihan sahaja yang akan rintang dan hidup dalam
media yang
mengandungi antibiotik.
Seperti proses transformasi dengan menggunakan teknik
Agrobakterium, sel yang
berjaya hidup akan dipindahkan ke media regenerasi untuk proses
tumbesaran
mendapatkan plantlet diikuti dengan proses pengakaran dan
pemindahan ke polibeg
atau ke pot.
-
Alat biolistik yang digunakan untuk transformasi tumbuhan.
Sumber: Buku Bioteknologi Teknologi Wawasan
Gas helium
Zarah emas/tungsten disalut DNA
Tisu tumbuhan
-
1.3 Analisis biologi molekul pokok transgenik
Pokok transgenik yang diregenerasi dan berakar dalam in-vitro
boleh dianalisis secara
biologi molekul untuk memastikan integrasi gen dan fungsi gen
yang ditransformasi
dalam genom DNA tumbuhan sebelum ia dipindah dan ditanam. Proses
ini amat
penting untuk mengenalpasti pokok-pokok transgenik dengan gen
yang berfungsi untuk
memudahkan kerja-kerja analisis selanjutnya dan secara tidak
langsung akan
menjimatkan kos dan masa proses transformasi. Teknik-teknik yang
digunakan untuk
analisis biologi molekul, seperti Tindakbalas Rantaian
Polimerase (PCR), Pemblotan
Southern (Southern Blot) dan Pemblotan Northern (Northern
Blot).
1.3.1 Tindakbalas Rantaian Polimerase (PCR)
Genom DNA pokok transgenik perlu diekstrak untuk dijadikan
templat semasa analisis
PCR dan kebiasaanya daun muda dipilih untuk tujuan pengekstrakan
DNA tersebut.
Pengekstrakan genom DNA juga boleh dilakukan dengan menggunakan
bahagian yang
berlainan pada pokok transgenik yang sama untuk memastikan yang
pokok transgenik
tersebut tidak kimerik.
Analisis PCR dijalankan dengan menggunakan primer yang direka
spesifik untuk
mengenalpasti gen-gen yang ditransformasi. Analisis PCR boleh
dijalankan ke atas gen
pelapor, gen penanda pemilihan atau lebih tepat ke atas gen
tertentu yang telah
ditransformasikan. Jalur tunggal dengan berat molekul tertentu
akan didapati setelah
produk PCR dianalisis dengan gel elektroforesis.
1.3.2 Pemblotan Southern (Southern Blot)
Pemblotan Southern digunakan untuk menganalisis kehadiran
jujukan DNA spesifik,
lokasi dan menentukan jumlah salinan gen yang terintegrasi dalam
genom DNA
tumbuhan. Analisis biologi molekul secara Pemblotan Southern
memerlukan amaun
genom DNA yang lebih banyak berbanding dengan analisis PCR dan
genom DNA ini
perlu dicernakan dengan enzim pembatas tertentu sebelum gel
elektroforesis
dijalankan.
-
Tiga proses utama yang terlibat dalam Pemblotan Southern iaitu
pemblotan DNA ke
atas membran nilon, hibridisasi membran dengan prob dan
pencerapan prob.
Pemblotan DNA ke atas membran nilon boleh dilakukan secara
manual kapilari atau
dengan menggunakan mesin yang digelar Bloter. Prob yang biasa
digunakan untuk
hibridisasi adalah gen yang ditransformasi yang dilabelkan
dengan radioaktif atau
bukan radioaktif. Kaedah untuk pencerapan signal positif
bergantung kepada cara
perlabelan prob yang digunakan. Kaedah-kaedah yang boleh diguna
seperti
penggunaan filem X-ray, kaedah pencerapan Colourimetric atau
pencerapan
Chemiluminescent. Semasa proses pencerapan, prob berlebihan akan
dibilas keluar
dan prob yang berjaya berhibridisasi dengan genom DNA akan
menghasil signal positif.
1.3.3 Pemblotan Northern atau Real Time PCR
Teknik Pemblotan Northern digunakan untuk menganalisis
pengekspresan gen yang
terintegrasi ke dalam genom tumbuhan. Asid ribonukleik (RNA)
yang diekstrak akan
dipisahkan dengan elektroforesis dan diblot ke atas membran.
Seterusnya, membran
ini akan dihibridisasi dengan prob yang spesifik yang telah
dilabelkan. Real Time PCR
ialah teknik terkini yang digunakan untuk mengalisis
pengekspresan gen yang boleh
menggantikan pemblotan Northern.
1.4 Penanaman tumbuhan transgenik
Pokok transgenik positif yang dikenalpasti secara analisis
biologi molekul tidak boleh
ditanam terus di kawasan lapang seperti pokok biasa. Penanaman
tumbuhan
transgenik perlu dilakukan mengikut prosedur-prosedur tertentu
untuk mengelakkan
pendedahan Organisma Terubahsuai Secara Genetik (GMO) ke
persekitaran semulajadi
supaya sumber alam semulajadi tidak terganggu dan biokeselamatan
persekitaran
terjamin. Terdapat tiga peringkat penanaman tumbuhan transgenik
iaitu penanaman
tertutup (contained trial), penanaman kajian lapangan terkawal
(confined field trial)
dan penanaman lapangan terbuka (open field trial).
-
Penanaman peringkat awal perlu dijalankan dalam struktur
tertutup dengan
persekitaran terkawal. Struktur-struktur tertutup yang biasa
digunakan seperti Rumah
Kaca Transgenik, rumah teduh, Growth Chamber dan Incubators.
Tujuan utama
penanaman tertutup dijalankan untuk mengumpulkan data-data
kajian dan meneliti
kesan kemasukan gen ke atas pertumbuhan pokok transgenik sebelum
ia dikeluarkan
dan ditanam di persekitaran terbuka. Pada peringkat ini juga,
kajian pengurusan
risiko (risk managment) dijalankan untuk mengelakkan gangguan
terhadap
persekitaran ekosistem semulajadi atau kewujudan eskosistem yang
baru.
Selepas kajian peringkat tertutup, tanaman transgenik yang
berpotensi akan
dipindahkan keluar untuk penanaman kajian lapangan terkawal
(confined field trial)
dan penanaman lapangan terbuka (open field trial).
Aktiviti-aktiviti penanaman
tertutup selalunya perlu dilakukan menurut peraturan-peraturan
dan garis panduan
yang telah disedia dan dikuatkuasakan oleh Jawatankuasa
Biokeselamatan Institut
(IBC).
Struktur tertutup untuk penanaman tumbuhan transgenik.
-
1.4.1 Prosedur penanaman tumbuhan transgenik
1. Tumbuhan transgenik mesti dilabel dengan jelas dan dibezakan
dengan pokok
kawalan.
2. Setiap kelompok tumbuhan transgenik yang berlainan perlu
dilabel untuk
mengenalpasti jenis pokok dan modifikasi genetik yang dilakukan.
(Contohnya,
Betik ditransformasi gen rintang kepada PRSV).
3. Tumbuhan yang ditanam dalam struktur tertutup akan dianggap
dan dilayan
sebagai tumbuhan transgenik. Kajian yang tidak melibatkan GMO
dalam struktur
tertutup tidak digalakkan.
4. Tumbuhan atau tisu tumbuhan transgenik perlu dibawa dalam
bekas tertutup
untuk mengelak berlaku kehilangan atau pendedahan ke
persekitaran semasa
pemindahan masuk atau keluar dari struktur tertutup.
5. Tumbuhan transgenik yang berlainan perlu disimpan dalam bekas
tertutup secara
berasingan dan dilabel semasa proses pemindahan.
6. Pemantauan berterusan adalah penting untuk memastikan tiada
pertumbuhan
artropod, mites atau afid ke atas tumbuhan transgenik.
7. Alat-alat penanaman yang telah digunakan perlu dinyahkuman
dengan cara
autoklaf atau direndam dengan bahan nyahkuman seperti klorox
untuk
menghapuskan artropod yang mungkin terlekat pada peralatan
tersebut. Tanah
yang diguna juga perlu diautoklaf.
8. Selepas selesai kajian semua tumbuhan yang digunakan perlu
diautoklaf sebelum
dibuang.
9. Tangan hendaklah dibasuh dengan sabun selepas kerja-kerja
penanaman tumbuhan
transgenik selesai.
-
Rujukan
Delbreil B., Guerche P. and Jullien M. (1993).
Agrobacterium-mediated
transformation of Asparagus officinalis L. Long term embryogenic
callus and
regeneration of transgenic plants. Plant Cell Report 12:
129-132.
Hiei Y., Komari T. and Kubo T. (1997). Transformation of rice
mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology 35:
205218.
Hiei Y., Ohta S., Komari T. and Kumashiro T. (1994). Efficient
transformation of rice
[Oryza sativa L.] mediated by Agrobacterium and sequence
analysis of the boundaries
of the T-DNA. Plant Journal 6: 271282.
Liau C.H., You S.J., Prasad V., Hsiao H.H., Lu J.C., Yang N.S.
and Chan M.T. (2003).
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an Oncidium
orchid. Plant
Cell Report 21:993-998.
Limanton-Grevet A. and Jullien M. (2004). Agrobacterium-mediated
transformation of
Asparagus officinalis L.: molecular and genetic analysis of
transgenic plants.
Molecular Breeding 7(2): 141-150.
Mishiba K., Chin D.P. and Mii M. (2005). Agrobacterium-mediated
transformation of
Phalaenopsis by targeting protocorms at an early stage after
germination. Plant Cell
Report 24: 297-303.
Ozawa K. (2009). Establishment of a high efficiency
Agrobacterium-mediated
transformation system of rice (Oryza sativa L.). Plant Science
176: 522-527.
Shou H., Frame B.R., Whitham S.A., and Wang K. (2004).
Assessment of transgenic
maize events produced by particle bombardment or
Agrobacterium-mediated
transformation. Molecular Breeding 13(2): 201-208.
-
Yu H., Yao Q., Wang L., Zhao Z., Gong Z., Tang S., Liu Q., and
Gu M. (2009).
Generation of selectable marker-free transgenic rice resistant
to chewing insects
using two co-transformation systems. Natural Science 19:
1485-1492.
Penulis : Dr Wee Chien Yeong
Pn Rogayah Sekeli
Dr Khairun Hisam Nasir