28/03/2014 1 Genética da Conservação: Estudos de casos com a Biodiversidade Neotropical Professor Fabrício R Santos [email protected]Departamento de Biologia Geral, UFMG 2014 Genética da Conservação Aves Mamíferos Herpetofauna Que tipo de perguntas podemos tentar responder? Dispersão/estrutura Impacto da mudança de habitat Origem de organismos / rotas de colonização Hibridização/ introgressão Parentesco/ sistemas de acasalamento Níveis de diversidade Metodologia Molecular Extração de ADN, armazenamento, catalogação Coleção de tecido/espécime PCR Dados de sequenciamento/genotipagem Análise dos dados Bioinformática DNA Mitocondrial ~17 Kb Região hipervariável 1 aatcctactt aaactactcc ctgtacggct 31 atgtaattcg tgcattatgt gctcctcccc 61 atatagtact atctatgttt tatcttacat 91 acaccatcct atgtataatc gtacattaca 121 ttatataccc catgcttaca agcaagtaca 151 gtataaataa tgcttctaga cagtatatac 181 cttccactgc aaattcccaa ccacatggat 211 attcttcagt ccattcacct cttaatattg 241 cataatacat tacactcctt aatcgtacat 271 agcacatcac ttgaaatcat tctcgccaac 301 atgcttatca cctccattag gcagtccata 331 actaccaagc gccgagaaac cagcaacccg 361 ccctcatttt gtccctcttc tcgctccggg 391 cccataactt gtgggggtgt Sequência de DNA (400 pb) da região hipervariável I (HVSI) do DNA mitocondrial. Uma sequência específica de um indivíduo é denominada haplótipo. Microssatélites Pol Pol Alelle 7 Alelle 8 Alelle 9 Alelle 10 Population diversity kinship, gene flow, hybridization etc = di, tri or tetranucleotide repeat (CA, TAC, GATA etc) 10 -3 – 10 -4 mut/locus
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Genética da Conservação Genética da Conservação: Estudos ...labs.icb.ufmg.br/lbem/aulas/grad/biolcons/aula7-estudosdecasos2014.pdf · PCR Dados de sequenciamento ... Fundamentos
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Genética da Conservação Aves Mamíferos Herpetofauna
Que tipo de perguntas podemos tentar responder?
Dispersão/estrutura
Impacto da
mudança de habitat
Origem de organismos
/ rotas de colonização Hibridização/
introgressão
Parentesco/ sistemas de
acasalamento Níveis de diversidade
Metodologia Molecular
Extração de ADN,
armazenamento,
catalogação
Coleção de
tecido/espécime PCR
Dados de
sequenciamento/genotipagem
Análise dos dados
Bioinformática
DNA Mitocondrial
~17 Kb
Região hipervariável 1 aatcctactt aaactactcc ctgtacggct
31 atgtaattcg tgcattatgt gctcctcccc
61 atatagtact atctatgttt tatcttacat
91 acaccatcct atgtataatc gtacattaca
121 ttatataccc catgcttaca agcaagtaca
151 gtataaataa tgcttctaga cagtatatac
181 cttccactgc aaattcccaa ccacatggat
211 attcttcagt ccattcacct cttaatattg
241 cataatacat tacactcctt aatcgtacat
271 agcacatcac ttgaaatcat tctcgccaac
301 atgcttatca cctccattag gcagtccata
331 actaccaagc gccgagaaac cagcaacccg
361 ccctcatttt gtccctcttc tcgctccggg
391 cccataactt gtgggggtgt
Sequência de DNA (400 pb) da região hipervariável I (HVSI) do DNA mitocondrial. Uma sequência específica de um indivíduo é denominada haplótipo.
Microssatélites
Pol
Pol
Alelle 7
Alelle 8
Alelle 9
Alelle 10
Population diversity kinship, gene flow, hybridization etc
= di, tri or tetranucleotide repeat (CA, TAC, GATA etc)
10-3 – 10-4 mut/locus
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Marcadores Autossômicos
10-8 mut/nucleotide site
Reconstruções paleodemográficas
Redes filogeográficas
Estruturação populacional
Datações de divisões populacionais
Árvores filogenéticas
Sistemática Descrição de novas espécies
neotropicais
Cinclodes espinhacensis
Freitas et al. 2012
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Cinclodes espinhacensis
Em 2010, no relatório “Amazônia Viva” da WWF foi divulgado que durante a década de 1999-2009 foram descritas cientificamente mais de 1200 espécies, uma a cada três dias (sem mencionar os invertebrados!)
637 espécies de plantas, 257 peixes, 216 anfíbios, 55 répteis, 16 pássaros e 39 mamíferos
Uma nova espécie de anta – Tapirus kabomani Cozzuol et al. Journal of Mammalogy. 2013
Uma nova espécie de anta Cozzuol et al. J. Mammalogy 2013
Filogenia cladística de caracteres cranianos
Uma nova espécie de anta Cozzuol et al. J. Mammalogy 2013
Parentesco no bando G : Rio São Francisco Conservação de populações da preguiça-de-coleira Bradypus torquatus – vulnerável Lara-Ruiz et al. Biol. Cons. 2008
LOCALIDADES E POPULAÇÕES DE ESTUDO
Lara-Ruiz et al. 2008. Cons.Biol.
Altíssima estruturação geográfica dos haplótipos
Fonte da variação % da variação
total
Entre estados 96,4 Entre populações do ES 0,16 Entre indivíduos dentro
das 4 populações 3,44
AMOVA
ФST = 0,966
Índice de diferenciação das
populações
Lara-Ruiz et al. 2008. Cons.Biol.
O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla)
Fonseca & Aguiar, 2004.
Família Myrmecophagidae
Vermilingua – língua fina e alongada
Adaptações para a mirmecofagia
Ocupa grande variedade de hábitats
Distribuída desde o Panamá até sul do Brasil
Cerrado de Minas Gerais (CEMG) - 21
Cerrado de Goiás (CEGO) - 28
Cerrado de São Paulo (CESP) - 6
Cerrado de Mato Grosso (CEMT) - 4
Cerrado de Paraná (CEPR) - 5
Pantanal (PT) - 5
Floresta Amazônica (AM) - 7
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Marcadores
X
PLP
Y
AMELY
mtDNA – HVI e CytB nDNA – RAG2, iAMELY e iPLP
Pro-L
BrDi-L
BrDi-H
CytB-L
CytB-H
XL14733
H16498
Pro-L
BrDi-L
BrDi-H
CytB-L
CytB-H
XL14733
H16498
CytB-L
CytB-H
XL14733
H16498
RAG2
CE+PT/AM CE+AM/PT CE/PT/AM
Estruturação populacional em M. tridactyla
AMOVA
Agrupamentos
Testes de Neutralidade (conjunto HVI+CytB)
D de Tajima: - 2,02108 (p<0,05)
D de Fu e Li: - 3,33370 (p<0,02)
Fs de Fu e Li: - 26,340 (p<0,05)
Expansão populacional na espécie
Formato de “estrela” da rede de haplótipos
Excesso de alelos raros
Expansão recente
A
B C
Presença de haplótipo mais freqüente, predominante, provavelmente relacionado ao ancestral.
Cerrado de Minas Gerais (CEMG)
Cerrado de Goiás (CEGO)
Cerrado de São Paulo (CESP)
Cerrado de Mato Grosso (CEMT)
Cerrado de Paraná (CEPR)
Pantanal (PT)
Floresta Amazônica (AM)
Diversidade do Pantanal
Indício de estruturação entre CE e AM
CytB CE 12
CytB PT 8
CytB PT 9
CytB CE 7
CytB CE 2
CytB1
CytB CE 11
CytB AM 3
CytB PT 6
CytB CE 5
CytB CE 4
CytB CE 10 *
T.tetradactyla
330
252
248
0.002
Evidência filogenética para derivação de indivíduos das populações de Cerrado a partir das UCs
Mudanças climáticas e preservação de
populações naturais
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Vários campos estão restritos aos frios topos de montanha do leste brasileiro: apresentam grande endemismo e são muito sensíveis ao aquecimento global.
Campos de altitude do Brasil
Parque Nacional da Serra do Cipó – Cadeia do Espinhaço
Glaciações Hoje <12.000 anos atrás
Filogeografia e genética da paisagem
Filogenia
Hipóteses Biogeográficas
Análises Populacionais e Paleodemográficas
Genética da Paisagem
Modelagens Preditivas
Fundamentos para conservação de espécies
/habitats
Asthenes luizae
Aves de campos de altitude do Brasil
Asthenes moreirae
Polystictus superciliaris
Embernagra longicauda
Formicivora grantsaui
Augastes lumachella e A. scutatus
Cinclodes espinhacensis
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Polystictus superciliaris Populações estão restritas a áreas entre 1000 a 1600 m sobre o nível do mar em MG, BA e SP, nas serras do Espinhaço e da Mantiqueira
Estrutura populacional de Polystictus superciliaris
MJ Network COI_ND2
Polystictus superciliaris Gray-backed Tachuri
Chapada do Catuni
Serra Resplandescente
Serra do Barro Preto
PE do Rio Preto
Serra do Cipó
BH
Serra da Gandarela Serra da Piedade
Serra do Caraça Serra do Mascate
ESPINHAÇO RANGE MG
GENELAND • Dois agrupamentos macrogeográficos emergem CSN: Cipó - Serras do Norte QF: Quadrilátero Ferrífero
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Chapada do Catuni
Serra Resplandescente
Serra do Barro Preto
PE do Rio Preto
Serra do Cipó
BH
Serra da Gandarela Serra da Piedade
Serra do Caraça Serra do Mascate
ESPINHAÇO RANGE MG
SN
CD
QF
Uma depressão de 600 m de altitude é uma barreira efetiva atualmente
mtDNA: ND2 (962bp)
root
Chapada Diamantina, BA
Espinhaço Meridional, MG
Serra do Caraça
Quadrilátero Ferrífero
Serra da Canastra
Serra do Mar
Serra da Mantiqueira
Serra do Caparaó
P. superciliaris A
B
A B Introns BF7-G3PDH
mtDNA
A
B
C
D
A
B C D
Estrutura populacional de Augastes lumachella e Augastes scutatus
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66 substitutions
Augastes lumachella
Augastes scutatus
Augastes lumachella
Augastes scutatus
45 substitutions
ND2
mtDNA
CytB
Chapada Diamantina-BA
Espinhaço Meridional-MG
Serra do Caraça
Quadrilátero Ferrífero
BF7
Augastes lumachella
Augastes scutatus
Augastes scutatus
3
substitutions
Augastes lumachella
Augastes scutatus
G3PDH
Estrutura populacional de Embernagra longicauda
70 substitutions
root
mtDNA: (ND2+CytB)
Chapada Diamantina, BA
Espinhaço Meridional, MG
Serra do Caraça
Quadrilátero Ferrífero
Embernagra longicauda
Polystictus superciliaris
Augastes scutatus e A. lumachela
Plioceno-Pleistoceno Inferior 5.3 Mya – 20 kya
Holoceno 20 kya -> recente
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Campylopterus largipennis
Lopes & Chaves (in prep)
C. l. equatorialis
C. l. obscurus
C. l. largipennis
C. l. diamantinensis
Matas secas
Campos rupestres
Amazônia
Bokermannohyla saxicola
• Família Hylidae
• Hyla saxicola (Bokermann, 1964)
• 2005- Bokermannohyla saxicola Grupo B. pseudopseudis
Distribuição e conservação • Espinhaço mineiro
• Acima de 1000m de altitude
• Campos rupestres e matas de galeria
• Riachos permanentes ou temporários
• Estado de girino por ao menos 5 meses ocupando de 5 a 45cm de profundidade.
• IUCN – Least concearn Cipó
Barão de Cocais
Lapinha Conceição do Mato Dentro
Serro
Congonhas do Norte Fechados
Itamarandiba
Parque do Rio Preto
Ambrósio Buenópolis Serra do Cabral
Botumirim Itacambira
Serranópolis Rio Pardo de Minas
Santo Antônio do Retiro
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Descontinuidades
Hibridização entre espécies
Diagnóstico do processo e identificação das causas
T. senegalensis
T. inunguis
T. manatus
Peixes-bois
Peixe-boi da Flórida (Trichechus manatus latirostris)
Programa de conservação do peixe-boi da Flórida
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Distribuição dos peixes-bois na Flórida
Status de conservação
Em setembro de 2007 foi alterado o status (ESA*) do peixe-boi da Flórida: de em perigo para ameaçado
* ESA -U.S. Endangered Species Act (1973)
Em 2007 o censo de peixes-bois da Flórida registrou 2.812 indivíduos. Em 1991, primeiro ano de um censo detalhado, 1267 peixes-bois foram contados.
“Having originated in the warmer waters of the Caribbean, West Indian manatees, for example, specifically adapted over a period of many years to the colder water temperatures of the Florida peninsula, making them hardier than their Caribbean or Central and South American counterparts“
Florida manatee (Trichechus manatus latirostris)
Bob Bonde
Refúgios de inverno do peixe-boi da Flórida
$T
%U
Ft. Myers
Gulf of Mexico
Ten
Mile C
an
al
Mullock Creek
San CarlosBay
Edison
Bridge
EsteroBay
Ft. Myers
Power Plant
Sanibel Island
Pine Islan
d
Figure 36
Cal
oosa
hatc
hee
Riv
er
Franklin
Lock
Matlacha
Pass
CHARLOTTE CO
LEE C O
Legend
2 0 2 Miles
2 0 2 4 Km
N
Manatee Relative
Abundance Classes (Winter Season)
Mean and Below
0 - 1 Std. Dev.
1 - 2 Std. Dev.
2 - 3 Std. Dev.> 3 Std. Dev.
Matlatcha
Isles
DeepLagoon
Little P
ine Isla
nd
Shell
Point
EightLakes Redfish
PointChiquitaCanal
IonaCove
Cape Coral
Beautiful
Island
$T Ft. Myers
Pow er P la nt
Orange River
Mullock Creek
Peixes-bois da Flórida no canal da usina nuclear Filogeografia y filogenia de
• Tartarugas-de-pente (E. imbricata) apresentam bicos curvos e afiados (de águia) e possuem o corpo achatado com caparaça serrilhada.
• Elas são onívoras, mas se alimentam principalmente de esponjas e celenterados. • São migratórias e geralmente
viajam sozinhas. frequente ocasional
Desova: frequente ocasional
Distribuição de E. imbricata
Habitat:
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Nosso grupo mostrou que 43% das tartarugas-de-pente em desova na Bahia eram híbridas (mtDNA - Lara-Ruiz et al. 2006) – 41% com C.caretta e 2% com L. olivacea.
NJ tree mtDNA control region Lara-Ruiz et al. (2006)
E. imbricata x C. caretta E. imbricata x C. caretta
Hawksbill (tartaruga de pente) Inhabits tropical oceans (Atlantic, Indian and Pacific) •Omnivorous: sponges and coelenterates •Biggest nesting population in Brazil is located in Bahia (600-800/year)
Loggerhead (tartaruga cabeçuda) Inhabits tropical and subtropical oceans (Atlantic, Indian, Pacific and Mediterranean) •Carnivorous: mollusks, crabs and other crustaceans, fishes etc •Higher number of nests in Brazil (4000/year), ~90% in Bahia and Sergipe
Intercruzamento ótimo
0
10
20
30
40
50
60
Sucesso reprodutivo
Diferenciação genética
Depressão
endogâmica Depressão
exogâmica
Pouca ou muita diversidade?
A B
A B
a b
a b
Táxon 1 Táxon 2
F1 A B
a b
A B
a b
Hibridização
a B
A b
F2
Depressão exogâmica
A depressão exogâmica surge com o aparecimento de barreiras reprodutivas geralmente pós-zigóticas (incompatibilidade de cariótipos ou de padrões do desenvolvimento, rompimento de adaptações locais e complexos gênicos coadaptados etc).
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DNA nuclear é herdado de todos
ancestrais
mtDNA é herdado apenas da
linhagem materna
1st crossing
F1 = mtDNA C. caretta and E. imbricata morphology
Hibridization E. imbricata x C. caretta
Cc Ei
♂ ♀ X
Hibridization E. imbricata x C. caretta
Cc Ei
♂ ♀ X
X X
♀♂?
♀♂?
Cc Ei
Cc Ei
♂ ♀ X
X X
♀♂?
♀♂?
Cc Ei
?
Samples for autosomal analyses
397 samples of Brazilian sea turtles 332 “pure” individuals of the species E. imbricata, C. caretta, L. olivacea and C. mydas (nesting and feeding areas with mtDNA of the same species) 65 known hybrid individuals previously identified by mtDNA: 50 E. imbricata x C. caretta and 2 E. imbricata x L. olivacea, 15 L. olivacea x C. caretta A clutch of four individuals bearing a C. caretta mtDNA but morphology indicating hybridization between E. imbricata and C. mydas.
Autosomal microsatellites
Four dinucleotide loci • OR1, OR3 (Aggarwal et al. 2004) • Cc1G02 and Cc1G03 (Shamblin et al. 2007)
Autosomal PCR-RFLP loci
Three anonymous loci CM-12, CM-14 and CM-28 (Karl & Avise 1993; Karl et al. 1995)
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Autosomal haplotype markers
Four exons (~550 bp each) • Brain-derived neurotrophic factor – BDNF • Oocyte maturation factor Mos – Cmos • Recombination ativating gene 1 - RAG1 • Recombination ativating gene 2 - RAG2 One intron (439 bp) • RNA fingerprint protein 35 gene - R35
[#] The data presented in brackets consider sequences of E. imbricata, C. caretta, L. olivacea and C. mydas published elsewhere (Naro-Maciel et al. 2008) combined with the sequences obtained in this study.
Sequence and genotype raw data: MegaBACE, ABI3130XL
High quality sequences and genotypes: Genetic profiler,
Introgression analysis (admixture) using five haplotypes and four msat loci
Clutch of four individuals presenting a mixture of E. imbricata x C. caretta x C. mydas
A previously “pure” E. imbricata individual presenting sign of introgression
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Introgression estimates for E. imbricata x C. caretta hybrids
NewHybrids software
*previously labeled “pure” E. imbricata individual identified as a hybrid/introgressed in our analysis
RFLPs* Sequences Microsatellites
R0025 1 2
R0061 1
R0069 * 3 1
R0078 1
R0080 1 (Cc)
R0084 1
R0088 1
R0153 2 (Cc)
R0177 1
R0196 2 2
R0217 1 2 (Cc)
R0260 1
R0264 1
R0265 1
R0267 3 1
R0268 1 1
UERJTCC75 1 (Lo)
Summary of introgressed (>F1) individuals (n=17) Each number in the columns represents the number of loci showing a sign of introgression.
Ei x Cc Cc x Lo Ei x Lo total
F1 hybrids 33 14 2 49
> F1 x Ei 13 13
> F1 x Cc 3 3
> F1 x Lo 1* 1
Summary of hybrid individuals (n=66)
F1 (Ei x Cc)
F1 (Lo x Cc)* F1 (Lo x Ei)
F1 (Ei x Cc)x Ei
F1 (Ei x Cc)x Cc
♀
♂
~100%
~67%
~25%
~6%
~2%
Telemetria* de 6 indivíduos híbridos E. imbricata:
1 migrou para a área de alimentação do sul (junto com outras E. imbricata)
3 migraram para a área de alimentação do norte (junto com outras C. caretta)
Todos são híbridos F1
* fonte: Marcovaldi et al. 2012 2:49
Unidades de manejo
Estruturação geográfica, diferenciação ecológica
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Diversidade do Boto-Rosa na Amazônia brasileira
Vulnerável à extinção de acordo com a IUCN
Distribuição do Boto-Rosa
GROMS, after Ridgway SH Harrisson SR (1989),
Copyright: GROMS/BfN
Filogeografia do Boto-Rosa
Amazônia boliviana
Amazônia colombiana
Orinoco colombiano
Orinoco colombiano
Amazônia colombiana
Amazônia brasileira
Filogeografia do Boto-Rosa
Amazônia brasileira
C
D
A
F
E
B
Filogeografia do Boto-Rosa
Amazônia brasileira
D
A
F
E
B
C
Mamirauá (N=9)
Tefé (N=11)
Género Artibeus
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A. planirostris
A. amplus
A. obscurus
A. lituratus
A. jamaicensis sp2 A. obscurus sp2
A. jamaicensis
A. fimbriatus
A. inopinatus A. fraterculus A. hirsutus A. concolor
A. watsoni A. aztecus
A. phaeotis A. toltecus
A. phaeotis A. cinereus sp2
A. gnomus A. glaucus
A. anderseni A. cinereus
Enchisthenes hartii
100
98
93
99
80
77
89
99
83
55
95
97
100
77
100
99 73
95
86
100
100
100
99
96 97
68
100
67
85
99
88
98
98
93
100
0.05
Filogenia do
gênero
Artibeus
Cyt-B + COI
Artibeus lituratus
Larga distribuición neotropical
Artibeus lituratus Artibeus obscurus
55 indivíduos
37 haplótipos
28 localidades
AMOVA
Biomas: 54,9% da variação
Divisão Amazônica: 63,68%
h = 0,978
= 0,0255
Divergência entre os grupos
2%/milhão de anos
2,5% a 3,9% ----------> 1,5 a 1,9 m.a.a
Artibeus obscurus
História natural de espécies e dos ecossistemas
Estudos do processo de
dispersão para novos ambientes
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B. culicivorus B. hypoleucus
Foto: Andrei L. Roos Foto: Sibelle T. Vilaça
História natural do complexo Basileuterus culicivorus
Vilaça et al. 2010 Mol. Phyl. Evol.
B. culicivorus B. hypoleucus
Basileuterus rivularis
Brasil
Paraguai
Argentina
Mexico N.
Mexico S. / El Salvador Colombia Venezuela
B.hypoleucus
ML/Bayesian Cyt-b tree
MEX 4 exclusive BF5 haplotypes MES 10 exclusive BF5 haplotypes BAP 36 exclusive BF5 haplotypes and presents relatively lower He in STRs
Cyt-b overall fst = 0.51 BF5 overall fst = 0.33
BAP Mexico_Norte Mexico_El Salvador Venezuela
n 71 4 3 4
h 67 4 3 3
D Tajima 0,39197 -0,31054 0,00000 0,17969
Fs Fu -24,095*** 0,561 0,901 0,888
φst 0,558*** 0,611*** 0,619*** 0,626***
Número de indivíduos (n), número de haplótipos (h), D de Tajima e Fs de Fu, φst par-a-par – sequências do gene mitocondrial Cyt-b
*** p<0,0001
Testes de expansão populacional
BF5 e microssatélites não significante
2:49 PM
Bayesian Skyline Plot produzido no programa Beast. O eixo X representa o tempo passado em milhões de anos; o eixo Y representa o parâmetro Neτ da população.
Reconstrução paleodemográfica
~400 mil anos atrás
2:49
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Todas regiões MEX
MES VEN
BAP Bayesian skyline Plots
Datas de divergência e tempos de coalescência com o Cyt-b