Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen Animalviren Bakteriophagen Pflanzenviren Vektorvermittelt (Insekt) Mechanisch (Verletzung) Rezeptor Rezeptor nackte Nukleinsäure Nukleinsäure mit Proteinhülle Meist nackte Nukleinsäure (Hershey/Chase Experiment) Die Architektur der Viren aus den verschiedenen Reichen belebter Materie spiegelt den äußeren Aufbau fundamentaler zellulärer Strukturen Ihrer Wirtszellen wider
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Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen · Penetration und „uncoating“ an der Plasmamembran Mechanismus der retroviralen Fusion mit der Plasmamembran Kriterien
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Generelle Mechanismen des Viruseintritts in Wirtszellen
Definitionen:Virusrezeptor: Zelluläre Struktur die bei permissiven Zelleneine produktive Infektion vermitteln kann
Permissivität: Permissive Zellen ermöglichen die ReplikationViraler Genome. Suszeptibilität: Fähigkeit einer Zelle ein bestimmtes Virus über Rezeptoren zu binden und aufzunehmen. ⇒Rezeptoren sind nicht primär Virusrezeptoren, sondern haben wichtige zelluläre Funktionen. Viren „missbrauchen“ zelluläre Transport und Rezeptorproteine um sich Eingang in die Zelle zu verschaffen. Die hohe Spezifität dieser Erkennung ist auf eine enge Coevolution viralerRezeptorbindedomänen auf Strukturelemente zellulärer Oberflächenproteine zurückzuführen.
Beispiele zellulärer Virusrezeptoren
PVR
CD4 ICAM-1LDLR
VLA-2 Amin
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tidas
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Sial
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Kat.
Amin
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phat
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Strategien zur Identifikation zellulärer Virusrezeptoren
1. Generierung monoklonaler Antikörper gegen Zelloberflächenstrukturen
2. Kompetitionsanalyse mit löslichen viralen und zellulären Komponenten
4. Genetischer Ansatz: Transfektion permissiver, nicht-suszeptibler Zellenmit cDNA Bank aus einer infizierbaren Zelllinie
Experimenteller Rezeptornachweis: Transfektion des klonierten RezeptorsIn nicht infizierbare aber permissive Zielzelle unter Rekonstitution der Infizierbarkeit
z.B. CD4 in HeLa führt zur Infizierbarkeit mit HIV
Interaktion des Poliovirusrezeptors am Fuß des „Canyons“
Worin liegt der Vorteil der gewissermaßen versteckten Rezeptorinteraktion am Boden des Canyon???
Beispiele für Virus-Rezeptorinteraktionen: 2. Influenza A
Struktur des segmentierten (-) StrangOrthomyxovirus: Influenza A
Zellextrakte Poliovirus-infizierter Zellen enthalten eine enzymatische Aktivität die die„primer“ und „template“ abhängige Inkorporation von Ribonukleotiden katalysiert
Die Aktivität ist insensitiv gegenüber Actinomycin D
Die Aktivität konnte dem cytoplasmatischen viralen 3Dpol-Protein zugeschrieben werden
Vergleichbare Aktivitäten sind später in Partikeln von (-) Strang RNA Viren entdeckt worden
Die meisten RNA-abhängigen RNA Polymerasen (RdRPs) sind primerunabhängig(vergleichbar den zellulären DNA-abhängigen RNA Polymerasen)
Aufgrund der präferentiellen Membranlokalisation ist die Reinigung der meisten RdRPs schwierig
Primärsequenzvergleiche verschiedener zellulärer und viraler Polymerasen weisen aufeinen gemeinsamen „Vorfahren“ hin
Primärstrukturvergleich und Sequenzhomologie viralerund zellulärer Polymerasen
Funktionen akzessorischer Proteine bei derRNA-abhängigen RNA Synthese
1. Direktion der RNA-Polymerase zum korrekten zellulären Kompartiment
RNA-Synthese findet typischerweise nicht frei im Cytoplasma, sondern in bzw. an definierten zellulären Strukturen statt:(-) Strang Segmente von Influenza A Virus werden vermittels eines NLS im NP Proteinsin den Kern dirigiert.(+) Strang des Poliovirusgenoms wird vermittels der Interaktion von 3AB mit 3CD anein vesikuläres Kompartiment dirigiert.
2. Direktion der RNA-Polymerase zur korrekten Stelle der viralen Matrize
Die Matrizenspezifität viraler RdRP wird durch spezifische Interaktionen derPolymerase mit akzessorischen viralen oder zellullären Proteinen, die anspezifische Stellen in der Matrize binden (RNA-Sekundärstrukturen), vermittelt.Beispiel: Poliovirus 3CD/RNA Interaktion.
3. Stimulation der Polymeraseaktivität
4. Erleichterung der RNA-Synthese durch viruscodierte Helicasen
Basengepaarte Bereiche innerhalb der RNA werden durch Helicasen aufgeschmolzen.Dies stellt einen möglichen Angriffspunkt für therapeutische Intervention dar (HCV-Helicase)
Strategien der Replikation und mRNA Synthese von RNA Virusgenomen
Die Spezifität der Poliovirus RNA Synthese wird durch spezifische Interaktionenviraler und zellulärer Proteine an RNA-Sekundärstrukturelemente gewährleistet
Bindung von viralem 3CD und dem zellulären Poly (rC) Bindeprotein an „stem-loop“ D und B
Bindung von UTP und Anlagerung des Komplexesan Membrangebundenes 3AB Protein
„Priming“ und proteolytische Abspaltung von VPg aus 3AB durch die Protease 3C;Bindung von
3Dpol/VPg-primer an 3´-Ende; Erkennung des3´“pseudoknot“ durch 3Dpol bedingt Spezifität
Capping ist ein Prozess des Editings eukaryontischer mRNAs
Es involviert mehrere Transferasenkatalysierte Reaktionen
Es bildet sich u.a. ein 7N-methylguanosyl cap am 5´Ende
Cap-Struktur stabilisiert mRNA
Gecappte mRNAs sind monocistronisch und polyadenyliert
Capping ist notwendige Voraussetzung für die Initiation derTranslation. Cap bindet an den eukariontischen Initiations-Faktor eIF4F der die Bindung der RNA ans Ribosom vermittelt.
Aktivierung des Influenza A Virus Polymerasekomplexes
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1. Bindung der konservierten (-) Strang Segmentsequenz durch PB1 induziert Bindung gecappter zellullärer mRNA an PB2
2. Zur mRNA Synthese aktivierter Polymerasekomplex (Komplex ist inaktiv im freien Zustand)
3. Bindung des 3´-Endes an PB1 und Positionierung des hydrolysierten gecappten zellulären mRNA-Fragmentes zum 3´Ende
4. Templatespezifische Elongation des gecappten primers bis zu einer U7 Sequenz vor dem gebundenen 5´-Ende.Die RNA wird dabei durch den Polymerasekomplex gefädelt (Polymerase ist Fixpunkt, RNA wandert).
5. RNA blockiert eigene Elongation und reiterativer Einbau von As führt zur Polyadenylierung und Termination.
Die fehlende Akkuratesse von RNA-Polymerasen bedingt den Fehleinbau von Nukleotiden
RNA-abhängige RNA Polymerasen haben keine „proof-reading“ Aktivität (keine Exonuklease).Dies führt zu einem Fehleinbau von jedem 1.000sten bis 10.000sten Nukleotid.Für die Translation hat dies gegebenenfalls Aminosäureaustausche und Funktionsverlustdes Proteins zur Folge.Bezüglich der Replikation bedeuted dies, das typischerweise jedes neue synthetisierte Virion 1-10Mutationen in seinem Genom aufweist.Eine Population von RNA-Viren ist immer heterogen und bildet somit eine „Quasispezies“
Die Segmentierung viraler Genome (Influenza A) ermöglicht Neukombinationen
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten segmentierten Viren erlaubt eine Neuver-Teilung der viralen Gensegmente.Bei Influenza A Viren führt dies regelmäßig zur neuen Virussubtypen mit antigener Diversität.
RNA-Rekombination ermöglicht den Austausch von viralen und zellulären Gensegmenten
Koinfektion einer Wirtszelle mit zwei verwandten Viren erlaubt Rekombination durch SprungDer Polymerase auf den anderen Strang (Template-abhängig).Rekombination viraler und zellulärer RNAs kann zur Integration neuer gene führen(z.B. Eibau zellulärer Gene der Zellzyklusregulation).
Mechanismen der Ausbreitung von PflanzenvirenSpezifisches Problem bei Pflanzenviren: Undurchdringliche Zellwand.
Eintritt von Viren in die Pflanzenzelle erfolgt durch Verletzung, d.h.- Es findet keine spezifische Erkennung des Wirts statt (Planzenviren nutzen keine Virusrezeptoren)- Pflanzenviren codieren keine Hüllproteine, die am Import und Export beteiligt sind.
1. Ausbreitung über SamenÄußerliche Kontamination von Samen mit Virionen.Infektion des Embryos, bzw. einzelner Setzlinge.
2. Vegetative Verbreitung durch PfropfungPfropfung stellt eine billige und effiziente Methode der Vermehrung von Pflanzen dar und bildet gleichzeitig ideale Voraussetzungen für die vom Menschen bedingte Verbreitung von Viren. Überschreitung von Speziesgrenzen.
3. Natürliche Verbreitung durch VektorenBakterien: z.B. Agrobakterium tumefaciens (auch als Vektor für die Erzeugung transgener Pflanzen geeignet). Pilze, Nematoden, Arthropoden (Insekten, Blattläuse, Heuhüpfer, Käfer ..), Arachniden (Milben...)
4. Mechanische Wege der Verbreitung von Virenhauptsächliche Methode für experimentelle Infektionen (Einreiben von Viruspartikel in Blätter)natürlicherweise durch starke Winde, Regen.
Zwei Formen der vektorvermittelten Verbreitung können unterschieden werden:a. Nicht propagative Übertragung von Viren durch Insekten: Das Insekt ist ausschließlich Träger des Virus.b. Propagative Übertragung: Vektor vermehrt sich im Insekt, was zu einer Virusamplifikation führt (z.B. Rhabdoviren).
Symptome pflanzlicher Virusinfektionen
-Zunächst lokale Nekrosen, danach erfolgt vektorunabhängige Ausbreitung a.) von Zelle zu Zelleb.) „long distance“ über das Gefäßsystem der Pflanze (systemisch).
- Ausbreitungsprozeß ist effektiv und führt über Plasmodemata:Plasmodemata (Cytoplasmabrücken) sind natürliche Verbindungen zwischen Pflanzenzellen. „Symplasma“. Struktur: pro Plasmodesmum 10-20 aus Zellproteinen gebildete Einzelkanäle von ca. 1,5 nm Durchmesser. Ausschlußgrenze: etwa 1000 Da.Funktion: Versorgung mit Aminosäuren, Kohlehydraten, Salzen. Signaltransduktion.