Page 1
1
Uji Aktivitas Antiproliferasi Ekstrak Alga Merah Gelidium sp Terhadap Pertumbuhan Sel
Kanker Caco-2 Secara in Vitro
Selamet Kurniawan Riandinata, Sunarpi, Eka S. Prasedya, dan Sri Puji Astuti
[email protected]
Program Studi Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Mataram
Jl. Majapahit No. 62 Mataram
ABSTRAK
Kanker adalah penyakit yang timbul akibat pertumbuhan sel atau jaringan tubuh yang tidak
normal. Penyakit ini sangat berbahaya bagi manusia dan menjadi penyakit tidak menular penyebab
kematian no 3 (tiga) setelah penyakit kardiovaskuler dan infeksi. Departemen Kesehatan RI
melaporkan sekitar 8,2 juta kematian disebabkan oleh kanker. Pengobatan kanker saat ini masih
tergolong mahal dan memberikan efek samping bagi penderita. Hal tersebut mendorong para
peneliti untuk mengeksplorasi senyawa-senyawa bioaktif antikanker dari bahan-bahan alam.
Rumput laut dilaporkan memiliki senyawa bioaktif yang dapat menghambat proliferasi sel kanker.
Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiproliferasi ekstrak alga
merah Gelidium sp terhadap pertumbuhan sel kanker Caco-2 secara in vitro. Hasil penelitian
didapatkan berat rendemen ekstrak Gelidium sp sebesar 5,3337%. Dari uji Fitokimia menggunakan
Gass Chromatography – Mass Spectrometry didapatkan 40 peak senyawa bioaktif dan beberapa
diantaranya memiliki sifat toksik, antioksidan, dan antiinflamasi. Hasil uji aktivitas antiproliferasi
ektrak alga merah Gelidium sp terhadap pertumbuhan sel kanker Caco-2 dengan waktu inkubasi
selama 72 jam terbukti memiliki aktivitas antiproliferasi terhadap sel kanker Caco-2 dengan nilai
IC50 sebesar 138,76 µg/mL. Alga merah Gelidium sp juga memiliki aktivitas antioksidan.
Penelitian ini dapat digunakan sebagai informasi awal maupun acuan bagi penelitian selanjutnya
dalam pengembangan makroalga khususnya Gelidium di bidang pengobatan kanker berbasis
rumput laut.
Kata kunci: Gelidium sp, sel kanker Caco-2, ekstraksi maserasi, Gass Chromatography – Mass
Spectrometry, direct counting
ABSTRACT
Cancer is a disease arising from the growth of cells or tissues that are not normal. This
disease is very dangerous for humans and become non infectious disease cause of death no 3 (three)
after cardiovascular disease and infection. The Ministry of Health reported about 8.2 million deaths
caused by cancer. Cancer treatment is still relatively expensive and provide side effects for
patients. This prompted (Cause of that/ it is pushed) researchers to explore the anticancer bioactive
compounds from natural materials. Seaweed is reported to have bioactive compounds that can
inhibit the proliferation of cancer cells. Therefore, this study aims to determine the antiproliferation
Page 2
2
activity of red algae Gelidium sp extract on the growth of Caco-2 cancer cells in vitro. The result
showed that Gelidium sp extract rendemen weight was 5,3337%. Phytochemical tests using Gass
Chromatography - Mass Spectrometry found 40 peak bioactive compounds and some of them have
toxic, antioxidant, and anti-inflammatory properties. The results of the antiproliferation activity
of red algae Gelidium sp extract on the growth of Caco-2 cancer cells with 72 hours incubation
period proved to have antiproliferation activity against Caco-2 cancer cells with IC value of 138.76
μg/mL. Red alga Gelidium sp also has antioxidant activity. This research can be used as initial
information and reference for further research in macroalga development especially Gelidium in
the (sector) field of cancer treatment based on seaweed.
Key words: Gelidium sp, Caco-2 cancer cell, maseration extraction, Gass Chromatography –
Mass Spectrometry, direct counting
A. Pendahuluan
Kanker adalah penyakit yang timbul akibat pertumbuhan sel atau jaringan tubuh yang
tidak normal. Kanker ditandai dengan mekanisme tidak normal dan tidak terkontrol pada
pengaturan kelangsungan hidup, proliferasi dan diferensiasi sel. Jika penyebaran kanker tidak
terkontrol maka dapat menyebabkan kematian (Hondermarck, 2003). Kanker menjadi salah
satu penyakit yang berbahaya dan mematikan di dunia, menurut World Health Organization
(WHO) pada tahun 2012 menyebutkan bahwa kanker merupakan penyakit tidak menular
penyebab kematian nomor 2 (dua) setelah penyakit kardiovaskuler. Pada tahun 2012, sekitar
8,2 juta kematian disebabkan oleh kanker. Sampai saat ini belum ditemukan obat kanker yang
ideal yang dapat menghancurkan sel kanker tanpa menciderai sel-sel yang normal.
Penanganan kanker pada umumnya menggabungkan pembedahan dan radiasi dengan
pengobatan kemoterapi (Abeloff et.al., 2004; dalam Sukmarianti et. al., 2013). Namun, obat-
obat tersebut memberikan efek samping berupa mual, muntah, rambut rontok, berkurangnya
kadar sel darah putih dalam darah, dan iritasi kandungan kemih (sistitis) disertai terdapatnya
darah dalam air kemih. Hal ini mendorong para ilmuan untuk mengeksplorasi senyawa-
senyawa bioaktif antikanker dari bahan-bahan alam sehingga efek sampingnya bisa lebih kecil
dan harganya dapat lebih terjangakau.
Beberapa obat herbal di Indonesia yang dikonsumsi oleh penderita kanker adalah
tanaman mahkota dewa (Phaleria macrocarpa), kunyit putih (Curcuma zedoaria), dan buah
merah (Pandanus conoideus) (Radji et al., 2010). Hasanah dan Widowati (2016) melaporkan
beberapa jenis tanaman terrestrial yang digunakan sebagai obat herbal diantaranya kunyit
putih, rumput mutiara, bidara upas, sambiloto, keladi tikus, temu mangga, temulawak, benalu,
Page 3
3
daun sirsak, dan daun dewa. Penelitian uji aktivitas antitumor dan antikanker dari tanaman
terrestrial sangat berkembang dengan pesatnya. Beberapa penelitian tersebut diantaranya
pada tanaman keladi tikus (Aryanti, 2004; Da’i et al., 2007), daun sirih merah (Atmaningsih,
2008), daun pandan wangi (Sukandar et al., 2009), daun sirsak (Wijaya, 2012), pacar air
(Rahmawati et al., 2013), tumbuhan paku (Risky, 2014), rumput bambu (A’ilah, 2015;
Rohmah, 2016), dan daun rosemary (Liana, 2017).
Selain tumbuhan terrestrial, sumber senyawa bahan aktif juga banyak dikembangkan
dari biota laut. Beberapa penelitian tentang bioaktivitas antikanker dari biota laut telah banyak
dilaporkan. Beberapa biota laut yang memiliki aktivitas antikanker diantaranya spons (Puji et
al., 2005; Rasyid, 2009; Sukmarianti et al., 2013), terumbu karang (Cooper et al. 2014), lamun
(Hamdy et al., 2012), abalon dan landak laut (Federov et al. 2013), dan mikroalga (Shanab et
al. 2012; Samarakoon, 2013; Gupta et al. 2014; Zaid et al. 2015; Jayshree et al., 2016; dan
Somasekharam et al., 2016). Selain itu, penelitian antikanker terhadap makroalga juga mulai
dikembangkan.
Salah satu sumber senyawa bioaktif yang juga berasal dari alga merah adalah Gelidium
yang memiliki komponen senyawa bioaktif berupa alkaloid, saponin, phytosterol, phenolic
compounds, dan flavonoid (Elsie dan Dhanarajan, 2010), selain itu juga memiliki Polyphenol
(Alghazeer et. al., 2016). Menurut Zakaria et. al., (2011) senyawa flavonoid, tannin, saponin,
dan triterpenoid telah dilaporkan memiliki aktivitas antikanker. Penelitian terhadap alga
Gelidium oleh Metidji et. al., 2015; Elsie dan Dhanarajan (2010) memiliki potensi antibakteri.
Menurut Boujaber et. al., (2016) ekstrak diklorometana dan methanol Gelidium
memiliki aktivitas antiinflamasi dan sitotoksisitas pada sel HeLa. Metidji et. al., (2015)
melaporkan bahwa ekstrak methanol Gelidium memiliki aktivitas sitotoksisitas yang baik pada
hewan uji udang. Aktivitas antitumor dan antioksidan juga ditemukan pada ekstrak Gelidium
yang diuji pada sel HeLa dan sel Leukimia kronis (K562) (Grozdanic et. al., 2012). Alghazeer
et al., (2016) melaporkan bahwa ekstrak metanol Gelidium latifolium yang dikoleksi dari
perairan barat Libya pada tahun 2013 memiliki aktivitas antikanker pada pengujian terhadap
sel kanker human colorectal carcinoma (Caco2) dan human corneal ephithelial cell (ATCC).
Ekstrak metanol 50% dan 100% Gelidium pulchrum yang dikoleksi dari perairan Mesir pada
2014 memiliki aktivitas antikanker dan antiinflamasi (Abou-Elella and Ahmed, 2015). Tujuan
penelitian ini adalah untuk mengetahui daya hambat ekstrak etanol alga merah Gelidium sp
Page 4
4
terhadap pertumbuhan sel kanker Caco-2. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
tambahan informasi terhadap khasanah ilmu pengetahuan dan memberikan kontribusi terhadap
upaya perkembangan obat kanker berbasis rumput laut.
B. Metode Penelitian
1. Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui pengujian eksperimental di laboratorium.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari – Juni 2018. Pengambilan sampel
dilakukan pada bulan Februai 2018 di Pantai Pojok, Dusun Lendang Luar, Desa Malaka,
Kecamatan Pemenang, Kabupaten Lombok Utara. Preparasi dan perlakuan sampel
dilakukan di Laboratorium Pusat Unggulan Biosains dan Bioteknologi, dan Uji Fitokimia
menggunakan GC-MS dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Mataram.
2. Alat dan Bahan Penelitian
a. Alat-alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan yaitu alat tulis, kamera, kamera underwater, dan
kantong plastik besar, kertas koran, kertas label, GPS Waypoint, ember, blender,
Erlenmeyer, corong plastic, gelas kimia, gelas ukur, ayakan, timbangan, tisu, kertas
label, plastic klip, kertas saring, evaporator, oven, vortex, kertas saring, aspirator,
magnetic stirrer, spiritus, kapas, mikropipet 1000 µL, 100 µL, dan 10 µL, blue tip,
yellow tip, mikro tip, inverted mikroskop, Eppendorf 1 mL, sentrifuge, Mesin Gas
Chromatografi-Mass Spectrometry (GC-MS), timer, inkubator CO2, pH meter, flask
T25, dish 60 mm dan dish 35 mm, lemari es, falcon tube 50 ml, falcon tube 15 mL,
haemocytometer, spektrofotometer UV-vis, gloves, masker, tangki liquid nitrogen dan
laminar air flow.
b. Bahan-bahan Penelitian
Tahapan awal yang dilakukan yaitu sampel yang diambil dari alga merah
(Gelidium sp), dicuci dengan air mengalir, ditiriskan, ditimbang, dan dikeringanginkan.
Lalu sampel dioven, dihaluskan dengan blender. Serbuk yang diperoleh diekstraksi
maserasi dengan perbandingan 1:5 menggunakan pelarut etanol 96 %, perlakuan ini
dilakukan berulang sebanyak 3 kali, lalu dipekatkan dengan rotary evaporator vaccum.
Page 5
5
Ekstrak pekat dipisahkan senyawa metabolit sekundernya berdasarkan sifat
kepolarannya dengan ekstraksi cair-cair dengan pelarut n-heksana lalu masing-masing
hasil ekstrak diuapkan menggunakan rotary evaporator vaccum sehingga diperoleh
ekstrak pekat. Setelah itu, diuji fitokimia golongan senyawa aktifnya dengan
Kromatografi gas (GC-MS).
c. Prosedur Penelitian
a) Pengambilan Sampel
Pengambilan Sampel alga merah Gelidium sp dilakukan pada bulan
Februari 2018 di Pantai Pojok, Lendang Luar, Desa Malaka, Kabupaten
Lombok Utara (Titik koordinat: 116,0360o - 8,4627o).
b) Preparasi Sampel
Sampel yang diambil dibawa ke Pusat Unggulan Biosains dan
Bioteknologi, Fakultas MIPA, Universitas Mataram untuk dipreparasi. Sampel
dipisahkan dari kotoran dan alga lain dan dicuci dengan air mengalir sebanyak
3 kali. Sampel yang sudah bersih dikering anginkan di atas kertas koran. Setelah
airnya habis, ditimbang sampel untuk mengetahui berat basah sampel alga
Gelidium sp.
Sampel dikering anginkan selama 14 hari lalu ditimbang berat
keringnya, kemudian dioven 1 hari dalam suhu 60 oC dan ditimbang kembali
berat keringnya. Diblender sampel kering hingga menjadi serbuk kecil
kemudian ditimbang lagi beratnya. Serbuk merupakan sampel penelitian yang
kemudian diekstraksi kandungan bioaktifnya.
c) Ekstraksi Komponen Aktif dengan Maserasi
Metode ekstraksi maserasi dilakukan berdasarkan penelitian yang
dilakukan Rohmah (2016). Sampel yang telah dipreparasi dilakukan tahap
selanjutnya, yaitu tahap ekstraksi. Langkah awal yang dilakukan yaitu
ditimbang serbuk alga merah Gelidium sp, dimasukkan ke dalam wadah
(Toples kaca atau Erlenmeyer 2000 mL), lalu diekstraksi dengan perendaman
menggunakan pelarut etanol 96 % dengan perbandingan 1:5 selama 72 jam,
Page 6
6
bersama dengan itu diaduk selama 3 atau 6 jam pada suhu ruang. Filtrat
dipekatkan dengan rotary evaporator vaccum dengan suhu 45 °C dan
dihentikan ketika ekstrak cukup kental dan ditandai dengan berhentinya
penetesan pelarut pada labu alas bulat. Selanjutnya ekstrak kental dapat
disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4 ºC agar ekstrak tersebut tidak
menjadi rusak.
Dihitung berat rendemen dari alga merah Gelidium sp. Rendemen
adalah jumlah total atau masa total maserat atau filtrate yang merupakan sisa
hasil ekstraksi. Jumlah total rendemen dapat dihitung dengan menggunakan
rumus sebagai berikut (Yanuarti et al., 2017):
% Rendemen = Berat ekstrak
Berat sampel𝑥 100%
d) Uji Fitokimia dengan Gas Chromatography-Mass Spectrometry
Ditimbang ekstrak kental Gelidium sp sebanyak 5 mg dan dilarutkan ke
dalam 1 ml etanol absolut. Ditimbang pula 5 mg ekstrak Gelidium sp yang telah
dipurifikasi dan dilarutkan dalam 1 ml etanol absolut dalam wadah terpisah.
Dihomogenkan larutan dengan menggunakan vortex. Selanjutnya kedua
ekstrak (purified dan unpurified) dianalisis dengan menggunakan GC-MS di
Laboratorium Kimia Analitik, FMIPA, Universitas Mataram.
Mengacu pada Riyanto (2013) analisis GC-MS dimulai dengan
pembuatan seri baku larutan menggunakan etanol dengan penambahan standar
internal n-butanol. Selanjutnya, sebanyak 1 µl larutan baku dari masing-masing
konsentrasi disuntikkan kedalam kolom melalui tempat injeksi ke alat
kromatografi gas untuk di analisis. Hasil pembacaan dari kromatografi gas
(kromatogram) kemudian dihitung luas area etanol dan n-butanolnya.
Nilai Area Under Curve (AUC) yang didapatkan kemudian dimasukkan
ke dalam persamaan kurva baku etanol. Uap cuplikan ini kemudian dibawa oleh
gas pembawa masuk ke dalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-
komponen bioaktif sehingga dapat dideteksi oleh detektor dan dihasilkan suatu
kromatogram. Kemudian library software akan meneampilkan senyawa yang
Page 7
7
mirip atau sesuai antara hasil analisis GC-MS dengan senyawa yang terdapat di
library software NIST dan WILEY pada GC-MS.
e) Uji Sitoksisitas Sel Kanker Caco-2 secara in Vitro
Tahapan pengujian aktivitas antikanker secara in vitro antara lain
adalah: 1) penyiapan sel kanker, 2) panen sel, 3) uji sitotoksitas, 4) perhitungan
sel, dan 5) observasi mikroskop. Pelaksanaan penelitian ini dilakukan dalam
Laminar Air Flow dengan menggunakan teknik aseptis. Sterilitas merupakan
hal yang sangat penting untuk diperhatikan karena kontaminasi kultur akan
mengganggu pertumbuhan sel yang dapat mengakibatkan kematian sel. Sel
kanker yang digunakan pada penelitian ini adalah sel kolon (Caco-2).
Pada penelitian ini, pertama dilakukan penambahan sampel ekstrak
Gelidium sp dengan 4 konsentrasi yang berbeda dengan tiga kali replikasi yaitu
200, 150, 100 dan 50 µg/mL dan kontrol dengan menggunakan media DMEM.
Kemudian dilakukan inkubasi selama 72 jam di inkubator CO2 dan penambahan
pewarna trypan blue untuk menentukan viabilitas sel.
Perhitungan uji sitotoksisitas untuk melihat viability dengan
menggunakan rumus (Prasedya et. al., 2016):
% Viabilitas = Jumlah Sel Hidup−Sel Mati (Tercat Trypan blue)
Jumlah Total Sel× 100%
Dari data persentase tersebut, dibuat persamaan regresi linear dengan
menggunakan software Kaleidagraph. Dari persamaan regresi tersebut maka nilai
konsentrasi efektif ekstrak Gelidium sp dapat dihitung.
f) Uji Aktivitas Antioksidan
Uji aktivitas antioksidan mengacu pada penelitian yang dilakukan oleh
Suhaling (2010) dengan beberapa modifikasi. Dibuat stok sampel 1 % (10
mg/10 ml dalam etanol 96%). Kemudian dibuat 3 konsentrasi 50, 150, dan 200
μg/mL (ppm). Ditambahkan 1 ml etanol DPPH 0,15 mM ke dalam 2,5 mL
larutan sampel. Dihitung aktivitas antioksidan dan setiap perlakuan dibuat triplo
pengulangan. Untuk kontrol positif menggunakan asam askorbat dan kontrol
Page 8
8
negatif menggunakan aquades. Didiamkan dalam suhu ruang 30 menit. Setelah
itu dilakukan Uji absorbansi pada panjang gelombang 518 nM.
Rumus Persentase Absorbansi (Suhaling, 2010):
AA% = (Absorbansi Blanko – Absorbansi Sampel) x 100%
Absorbansi Blanko
C. Hasil Penelitian
1. Ekstraksi dan Maserasi
Tabel 1. Data ekstraksui senyawa aktif Gelidium sp dengan Maserasi
Berat
Basah
Berat
Kering
Berat
Maserat
Berat
Ekstrak
Berat
Rendemen
Warna
Ekstrak
Bentuk
Ekstrak
3.372,6
gram
833,4
gram
539,4
gram
28,77
gram
5,3337
gram
Hijau
Kehitaman
Pasta
agak cair
2. Uji Fitokimia dengan Gass Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS)
Kromatogram hasil pemisahan fraksi senyawa kimia dari ekstrak etanol dan n-
heksan Gelidium sp dengan GC-MS disajikan dalam gambar 1 dan gambar 2.
Gambar 1. Kromatogram Pemisahan Kromatografi GC-MS Sampel Ekstrak Pekat etanol
Alga Merah Gelidium sp.
Hasil kromatogram pemisahan kromatografi GC-MS didapatkan 40 peak senyawa
bioaktif yang berasal dari ekstrak pekat etanol Gelidium sp dengan 1 puncak tertinggi yaitu
pada peak senyawa no 40. Puncak no 39 memiliki presentase luas area di atas 5% pada
Puncak 1
Page 9
9
kedua ekstrak yang diuji. Sedangkan 39 puncak yang lain memiliki presentase luas area di
bawah 5%, sehingga puncak tersebut diabaikan. Puncak no 39 dengan R. Time 15.557
menit dan presentase luas area sebesar 53,74%.
Gambar 1. Kromatogram Pemisahan Kromatografi GC-MS Sampel Ekstrak n-heksan
Alga Merah Gelidium sp.
Hasil analisis ekstrak n-heksan alga merah Gelidium sp juga terdapat 40 peak
dengan puncak tertinggi juga terdapat pada peak senyawa no 39. Puncak no 27, 39, dan 40
memiliki presentase luas area di atas 5%. Sedangkan 37 puncak yang lain memiliki
presentase luas area di bawah 5%, sehingga puncak tersebut diabaikan. Puncak 27 dengan
R. Time 12.933 menit dan presentase luas area sebesar 7,75%. Puncak 39 dengan R. Time
15.557 menit dan presentase luas area sebesar 53,74%. Puncak 40 dengan R. Time 15.663
menit dan presentase luas area sebesar 6,66%. Berdasarkan penelusuran library, tidak
ditemukan adanya kesamaan senyawa dengan spektra puncak 27 dan 39. Spektra massa
senyawa no 27, 39, dan 40 dapat dilihat pada lampiran 4.5.
Berdasarkan penelusuran library, tidak ditemukan adanya kesamaan senyawa
dengan spektra puncak no 39. Senyawa pada peak no 39 dan beberapa senyawa lainnya
tidak dapat diidentifikasi atau tidak ditemukan senyawa yang serupa pada library software
NIST dan WILEY pada GC-MS. Sehingga perlu dilakukan identifikasi tingkat lanjut untuk
mengetahui jenis senyawa tersebut. Beberapa senyawa yang dapat diindentifikasi dan
memiliki efek penting dan juga toksik dari hasil GC-MS terhadap ekstrak pekat alga merah
Gelidium sp disajikan dalam tabel l.
Puncak I
Page 10
10
Tabel 4.1 Senyawa Penting dari Ekstrak Pekat Gelidium sp
No Nama Senyawa Formula Puncak Luas Area
1 Pentadecane (CAS) n-Pentadecane C15H32 Puncak 6 0,64 %
2 Heptadecae (CAS) n-Heptadecane C17H36 Puncak 10 1,11 %
3 Tetradecanoic acid (CAS) Myristic
Acid
C14H28O2 Puncak 12 0,43 %
4 1-Octadecanol (CAS) Stenol C18H38O Puncak 15 0,36 %
5 Hexadecanoic acid (CAS) Palmitic
Acid)
C16H32O2 Puncak 18 3,80 %
6 Hexadecanoic acid (CAS) Dioctyl ester C22H42O4 Puncak 32 0,56 %
7 1,2-Benzenedicarboxylic acid,
diisooctyl ester (CAS)
C24H38O4 Puncak 35 1,19 %
Senyawa n-Pentadecane memiliki efek toksik, Essien et al., 2012 melaporkan
bahwa Pentadecane dan beberapa senyawa lain dalam Solanum erianthum dan Solanum
macranthum memiliki aktivitas antibakteri dan antitumor yang diuji pada sel 578T dan PC-
3. Selain itu, n-Pentadecane termasuk dalam senyawa toksik yang dapat menghambat
pertumbuhan sel Caco-2 dan beberapa bakteri (Lin et al., 2012); n-Heptadecane memiliki
aktivitas antioksidan dan antiinflamasi (Kim et al., 2013) selain itu juga memeiliki efek
toksik pada pengujian terhadap Aedes aegypti (Park et al., 2010); Tetradecanoic acid
termasuk ke dalam asam miristrat yaitu asam lemak jenuh yang dapat digunakan sebagai
bahan untuk mensintesis rasa dan sebagai bahan dalam pembuatan sabun dan kosmetik
(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), memiliki aktivitas antikanker (Patra et. al., 2012) dan
memiliki efek toksik (Zhu dan Smart, 2005); 1-Octadecanol merupakan lemak alkohol
yang berperan dalam mendeteksi SLS carrier pada gangguan sindrom Zellweger dan
Sindrom Sjorgren-Larsoon (pubchem.ncbi.nlm.nih.gov); Hexadecanoic acid merupakan
kelompok asam palmitat atau asam heksadekanoat dan memiliki kemampuan menginduksi
apoptosis pada pengujian terhadap sel kanker HepG2 (Zhang et al., 2004).
Hexadecanoic acid merupakan kelompok Dioctyl ester yang memiliki sifat toksik
dengan memiliki radioktivitas yang tinggi pada pengujian terhadap mencit jantan. Gumani
Page 11
11
et al., (2016) melaporkan bahwa beberapa kandungan bioaktif pada tanaman cabai
(Capsicum frutescens) termasuk asam hexadecanoid memiliki aktivitas antimikroba dan
antioksidan pada uji in vitro-nya; dan 1,2-Benzenedicarboxylic acid termasuk ke dalam
kelompok Diisooctyl ester yang digunakan dalam produksi polyvinyl chloride (PVC) dan
memiliki efek toksisitas yang tingggi (Silva et al., 2006).
3. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Gelidium sp Terhadap Sel Kanker Caco-2
Pada penelitian ini, pertama dilakukan penambahan sampel ekstrak Gelidium sp
dengan 4 konsentrasi yang berbeda dengan tiga kali replikasi yaitu 200, 150, 100 dan 50
µg/mL dan kontrol dengan menggunakan media DMEM. Kemudian dilakukan inkubasi
selama 72 jam di inkubator CO2 dan penambahan pewarna trypan blue untuk menentukan
viabilitas sel. Kelemahan dari metode penghitungan langsung adalah subyektivitasnya
yang tinggi dan membutuhkan waktu penghitungan yang lama. Untuk mengurangi
subyektivitas, penghitungan diulang minimal 3 kali dan pengamatan bentuk sel yang hidup
dan mati harus konsisten. Pemaparan sel dengan trypan blue yang terlalu lama dapat
menyebabkan sel yang hidup juga menyerap trypan blue dan lama–kelamaan sel dapat mati
karena trypan blue. Untuk mengatasi hal ini maka penambahan trypan blue ke dalam
sumuran tidak dilakukan secara serempak namun satu persatu tiap sumuran ditambah
trypan blue, dihomogenkan kemudian langsung dihitung dengan haemaocytometer di
mikroskop inverted.
Media yang digunakan banyak mengandung protein dimana protein-protein serum
dalam media juga memiliki afinitas terhadap trypan blue. Hal ini juga dapat mempengaruhi
pengamatan karena akan mempengaruhi bidang pandang, yaitu saat pengamatan akan
terlihat gelap dan kotor sehingga menyulitkan pengamatan sel hidup. Penghitungan secara
langsung membutuhkan waktu yang cukup lama. Hal ini dapat berpengaruh pada stabilitas
sel karena sel berada di suhu penyimpanan dengan suhu dan aliran CO2 yang berbeda.
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas dengan metode direct counting ini berupa data
jumlah sel yang hidup dari tiap perlakuan dengan pemberian ekstrak alga merah Gelidium sp
dengan berbagai konsentrasi. Dari data jumlah sel yang hidup tersebut ditentukan persentase
kematian sel. Pengamatan morfologi sel setelah di treatment dilakukan dibawah mikroskop
inverted pada setiap sampel ekstrak dengan konsentrasi 200, 150, 100 dan 50 µg/mL. Gambar hasil
Page 12
12
perlakuan pada jam ke-0 dan dapat dilihat pada gambar 3 sedangkan hasil perlakuan pada jam ke-
72 dapat dilihat pada gambar 4.
(C) Konsentrasi 200 µg/mL
Gambar 4.6 Perlakuan ekstrak Gelidium sp terhadap sel Caco-2 dalam waktu 72 jam
4. Uji Antioksidan Ekstrak Gelidium sp
Pada penelitian ini hanya menetukan besarnya persentase nilai absorbansi dari
ekstrak alga merah Gelidium sp. Uji antioksidan menggunkan beberapa konsentrasi yaitu
50 µg/mL, 150 µg/mL, dan 200 µg/mL. Warna larutan pada masing-masing perlakuan
berbeda-beda, Kontrol negatif berwarna ungu tua karena banyak mengandung DPPH
sedangkan kontrol positif berwarna bening karena mengandung asam askorbat yang
(A) Kontrol
(B) Konsentrasi 50 µg/mL
(C) Konsentrasi 100 µg/mL
(D) Konsentrasi 150 µg/mL
Page 13
13
memiliki aktivitas antioksidan tinggi, perbedaan tersebut disajikan pada lampiran 4.8.
Untuk kontrol positif menggunakan asam aksorbat dengan konsentrasi 100 µg/mL.
Pembacaan dilakukan dipanjang gelombang 518 nm menggunakan UV-vis. Berdasarkan
hasil penelitian didapatkan persentase nilai absorbansi untuk konsentrasi 50 µg/mL, 150
µg/mL, dan 200 µg/mL secara berturut-turut 7,92 %, 26,73 %, dan 11,88 % (Tabel 4.1 dan
Lampiran 4.9). Sedangkan persentase nilai absorbansi dari asam askorbat konsentrasi 100
µg/ml sebesar 79,20 % (Lampiran 4.10). Dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa ekstrak
Gelidium sp memiliki aktivitas antioksidan meskipun lebih rendah dibandingkan dengan
aktivitas antioksidan asam askorbat (vitamin C).
Tabel 4.2 Hasil Pembacaan Spektro UV-VIS 518 nM
No Konsentrasi Hasil % Absorbansi
1 50 µg/mL 0,093 7,92 %
2 150 µg/mL 0,074 26,73 %
3 200 µg/mL 0,089 11,88 %
4 Kontrol Positif (Asam Askorbat) 100 µg/mL 0,021 79,20 %
5 Kontrol Negatif (Akuades) 0,101 0 %
D. Diskusi
1. Uji Fitokimia dengan Gass Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS)
Berdasarkan hasil kromatogram dari ekstrak Gelidium sp diketahui terdapat
senyawa senyawa yang bersifat toksik hal tersebut sesuai dengan penelitian yang
dilakukan oleh Elsie dan Dhanarajan (2010) dan Alghazeera et. al. (2016) bahwa alga
Gelidium sp memiliki komponen senyawa bioaktif berupa alkaloid, saponin, phytosterol,
phenolic compounds, dan flavonoid (Elsie dan Dhanarajan, 2010; Alghazeera et. al.,
2016), antosianin, tannin, dan C-heterosids (Metidji et. al., 2015) selain itu juga
mengandung phystosterol (Elsie dan Dhanarajan, 2010). Menurut Ye et. al. (2007) dalam
Zakaria et. al., (2011) senyawa flavonoid, tannin, saponin, dan triterpenoid telah
dilaporkan memiliki aktivitas antitumor. Senyawa metabolit sekunder tersebut memiliki
potensi sebagai antioksidan, antijamur, antikoagulan, antibakteri, dan antikanker.
Page 14
14
2. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Gelidium sp Terhadap Sel Kanker Caco-2
Berdasarkan Gambar 4.6 dapat diketahui sel yang mati berbentuk bulat, mengapung
dan tersebar. Sel hidup berbentuk lonjong seperti jarum yang saling berdempet dengan sel
lainnya yang ada disekitarnya dan menempel pada dasar wadah kultur. Pada konsentrasi
50 µg/mL tidak terlihat adanya pengaruh pemberian ekstrak terhadap pertumbuhan sel
Caco-2 karena memiliki kesamaan dengan kontrol. Pada konsentrasi 150 µg/mL memiliki
jumlah sel mati lebih banyak dibandingkan dengan jumlah sel yang mati pada konsentrasi
100 µg/mL. Konsentrasi 200 µg/mL kondisi sel Caco-2 tidak dapat membelah dan hanya
mengambang di permukaan media dengan bentuk bulat dan terdapat beberapa sel yang
mengalami kerusakan. Adanya proses pengahambatan pertumbuhan sel disebabkan oleh
beberapa cara diantaranya secara apoptosis dan nekrosis.
Menurut Zakaria et al (2011) bahwa beberapa senyawa yang diduga mampu
menghambat pertumbuhan sel adalah dari kelompok flavonoid, tannin, saponin dan
triterpenoid. Mekanisme kerja dari dari kelompok senyawa flavonoid adalah dengan
memodulasi penahanan siklus sel pada fase G1 menuju fase S. Adapun mekanisme kerja
saponin dan triterpenoid dengan cara merusak permeabilitas membran mitokondria pada
sel atau menyebabkan sel mengalami nekrosis dan kematian.
Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Alghazeer et al.,
(2016) yang melakukan uji antiproliferasi beberapa ekstrak alga pada sel Caco-2 secara in
vitro diantaranya Gelidium latifolium. Pada konsentrasi 200 µg/mL memiliki kemampuan
menghambat sebesar 85% dan persentasi populasi sel tertinggi terjadi pada fase G0 dan
terendah pada fase Sub G (Alghazeer et al., 2016). Namun pada penilitian ini, pada
konsentrasi 200 µg/mL sel Caco-2 sudah tidak dapat lagi hidup dan berkembang melainkan
hanya mengambang dipermukaan dan tidak dapat menempel di dasar dish.
Berdasarkan hasil penelitian setelah dilakukan perhitungan nilai viabilitas untuk
melihat konsentrasi yang optimum dari ulangan 1 dan 2 didapatkan nilai IC50 masing-
masing 141,38 µg/ml dan 136,14 µg/ml. Dari dua data tersebut jika dirata-ratakan
didapatkan nilai IC50 sebesar 138,76 µg/mL. Semakin kecil harga IC50 maka senyawa
semakin bersifat toksik, sebaliknya semakin besar harga IC50 maka semakin bersifat tidak
Page 15
15
toksik (Meyer et al, 1982). Berdasarkan hasil tersebut, ekstrak alga merah Gelidium sp
masih belum dapat dikatakan sebagai calon agen antikanker karena memiliki IC50 di atas
100 µg/mL. menurut Meiyanto (2008) nilai IC50 < 100 µg/mL pada senyawa campuran
menunjukkan aktivitas antikanker yang dapat menghambat proliferasi sel serta sangat
potensial sebagai agen kemoprevensi, yaitu senyawa yang dapat mencegah proses
karsinogenesis yang memicu kanker. Disamping itu, nilai IC50 tersebut cukup menarik
untuk dikembangkan sebagai agen kemoprevensi.
Beberapa faktor yang menyebabkan nilai IC50 bernilai lebih besar dari 100 µg/mL
diantaranya pelarut yang digunakan bukan pelarut yang optimal dalam menarik senyawa
bioaktif Gelidium sp terutama yang besifat toksik. Faktor lainnya adalah sel Caco-2
mempunyai dinding sel yang tebal. Tiap sel kanker memiliki karakteristik yang berbeda
seperti struktur sel dan permeabilitas membrane sel sehingga berpengaruh terhadap
kemampuan atau efek sitotoksisitas senyawa terhadap sel kanker. Semakin tinggi
permeabilitas membrane sel, maka ekstrak Gelidium sp akan lebih mudah masuk ke dalam
sel kanker (Atmaningsih, 2008).
Penelitian ini adalah penilitian awal untuk mengungkapkan aktivitas antiproliferasi
dari alga merah Gelidium sp. Oleh karena itu, variasi pelarut polar, semipolar, dan nonpolar
yang digunakan penting dilakukan untuk mengetahui pelarut yang terbaik untuk
digunakan. Sehingga nantinya didapatkan hasil ekstraksi yang maksimal dan mendapatkan
senyawa yang lebih maksimal. Selain itu, untuk memastikan mekanisme kerja
antiproliferasi pada alga merah Gelidium sp serta mengetahui senyawa bioaktif yang
bersifat antikanker perlu dilakukan pada penelitian lanjutan, mengingat sangat beragamnya
karakteristik sel-sel kanker dan sangat beragam pula mekanisme kerja senyawa antikanker
tersebut.
3. Uji Antioksidan Ekstrak Gelidium sp
Hasil uji aktivitas antioksidan terhadap ekstrak Gelidium sp yang rendah sesuai
dengan penelitian yang dilakukan oleh Alghazeer et al., (2016) yang melakukan uji
aktivitas antioksidan pada beberapa alga hijau (Ulva lactuca dan Codium tomentosum),
alga cokelat (Cystoseira crinita, Cystoseira stricta, dan Sargassum vulgare), dan alga
merah (Gelidium latifolium, Hypnea musciformis, dan Jania rubens) yang berasal dari
Page 16
16
perairan Libya. Didapatkan hasil bahwa Gelidium latifolium dan Codium tomentosum
memiliki aktivitas antioksidan yang rendah dibanding beberapa alga yang diuji dengan
nilai IC50 sebesar 300 µg/mL. Adapun aktivitas tertinggi berasal dari alga cokelat
Cystoseira crinite dengan nilai IC50 sebesar 300 µg/mL.
Rendahnya aktivitas antioksidan ini kemungkinan disebabkan oleh berbagai faktor,
diantaranya karena metode ekstraksi yang digunakan kemungkinan tidak cukup menarik
komponen kimia yang bersifat antioksidan dalam Gelidium sp. Selain itu karena vitamin C
merupakan senyawa murni sedangkan ekstrak alga merah Gelidium sp masih merupakan
senyawa campuran dan belum diketahui kandung senyawanya yang bersifat antioksidan,
dimana adanya senyawa yang tidak bersifat antioksidan kemungkinan bisa mempengaruhi
aktivitas antioksidan ekstrak alga merah Gelidium sp itu sendiri.
E. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian uji aktivitas antiproliferasi ektrak alga merah Gelidium sp
terhadap pertumbuhan sel kanker Caco-2 dengan waktu inkubasi selama 72 jam memiliki
aktivitas antiproliferasi terhadap sel kanker Caco-2 dengan nilai konsentrasi efektif sebesar
138,76 µg/mL.
F. Ucapan Terima Kasih
Ucapan terima kasih kami sampaikan kepada seluruh staff Pusat Unggulan Bisains dan
Bioteknologi, FMIPA, Universitas Mataram yang telah membantu terlaksanya penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Abeloff, M., Arnitage J., Niederhuber J., Kastan M., dan McKenna W., 2004, Clinical Oncology
3rd ed, Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia.
Abou-Elella, Faten dan Mahgoub M. A., 2015, Enteromorpha compressa, Gelidium pulchrum,
Macroalgae Exhibit Potent Anticancer, Antioxidant and Anti-inflammatory Activities,
Phytomedidicine, 7, 35-45.
A’ilah, A. F., 2015, Uji Aktivitas Antikanker Terhadap Sel Kanker Payudara T47D dan
Identifikasi Golongan Senyawa Aktif dari Ekstrak dan Fraksi Akar Rumput Bambu
(Lophatherum gracile Brongn), [Skripsi], Universitas Islam Negeri Malang, Malang.
Alghazheer, R., Mahboba N., dan Nazlin K. H., 2016, Anticancer and Antioxidant Activities of
Some Alga from Western Libyan Coast, http,//www.preprints.org.
Page 17
17
Aryanti, 2004, Isolasi Senyawa Antikanker dari Tanaman Keladi Tikus (Typhonium divaricatum
L.), Jurnal Bahan Alam Indonesia, 3(2), 188-190.
Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum
Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, [Skripsi], Universitas Sanata Dharma.
Boujaber, N., Khadija O., Fatima L., Omar A., dan Samira E., 2016, Potential Targets for
Antiinflamation and Anticancer Activities of Marine Algae Gelidium sesquipedale and
Laminaria ochroleuca, Int. J. Adv. Res., 5(1), 2302-2309.
Cooper, E. L., Hirabayashi, K., Strychar, K. B., dan Sammarco, W., 2014, Corals and Their
Potential Applications to Integrative Medicine, Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, Hindawi Pubhlising Corporation, hal, 1-9. Dari
http,//dx.doi.org/10.1155/2014/184959.
Da’i, M., Fiveri, A., dan Meiyanto, E., 2007, Efek Sitotoksik Ekstrak Tanaman Keladi Tikus
(Typhonium divericatum L.) Terhadap Sel HeLa, J. Farmasi Indonesia, 3(4), 163-167.
Departemen Kesehatan RI, 2015, Mediakom, Kanker Pembunuh Papan Atas, Dari
http,//www.depkes.go.id diakses pada Maret 2018.
Elsie, B. H., dan M. S. Dhanarajan, 2010, Evolution of Antimicrobial Activity and Phytochemical
Screening of Gelidium acerosa, Research and Development Centre, Bharathiar University,
India.
Federov, S. N., Ermakova, S. P., Zvyagintseva T. N., dan Stonik, V. A., 2013, Anticancer and
Cancer Preventive Properties of Marine Polysaccharides, Some Results and Prospects,
Marine Drugs, 11, 4876-4901.
Grozdanic, N., T. P. Stanojkovic, Z. Kljajic, S. Etahiri, O. Assobhei, A. Konic-Ristic, T. Srdic-
Rajic, N. Kardum, S. Backovic, 2012, In Vitro Evaluation of Antioxidant and Antitumoral
Activities of Marine Algae Gelidium sesquipedale and Fucus spiralis, European Journal
of Cancer, Suppl, 5, S25-S28.
Gupta, P., Sinha, D., dan Bandopadhyay, R., 2014, Isolation and Screening of Marine Microalgae
Chlorella sp_PR1 for Anticancer Activity, J. Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,
6(10), 817-819.
Hasanah, S. N., dan Widowati, L., 2016, Jamu Pada Pasien Tumor/Kanker sebagai Terapi
Komplementer, J. Kefarmasian Indonesia, 6(1), 49-59.
Hondermarck, H., 2003, Breast Cancer. Molecular & Cellular Proteomics 2.5, The American
Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. pp. 281-291.
Hamdy, A. H. A., Mettwally, W. S. A., dan Fotouh, M. A., 2012, Bioactive Phenolic Compounds
from the Egyptian Red Sea Seagrass Thalassodendron ciliatum, Zeitschrift für
Naturforsching 67. Dari http,//znaturforsch.com.
Jayshree, A., Jayashree, S., dan Thangaraju, N., 2016, Chlorella vulgaris and Chlamydomonas
reinhardtii, Effective Antioxidant, Antibacterial and Anticancer Mediators,
Pharmaceutical Sciences, 78(5), 575-581.
Page 18
18
Liana, L. F. A., 2017, Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) Sebagai
Agen Kemopreventif Terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) Melalui Regulasi Bcl-2,
[Skripsi], Universitas Sanata Dharma.
Metidji, H., Tahar D., Mohamed T., Soumia K., Aicha K., Ahmed N., 2015, In Vitro Screening of
Secondary Metabolites and Evaluation of Antioxidant, Antimicrobial and Cytotoxic
Properties of Gelidium sesquipedale Thret et Bornet Red Seaweed from Algeria, J Mater.
Environ. Sci., 6(11), 3184-3196.
Meiyanto, E., Susidarti, R. A., Handayani, S., dan Rahmi, F., 2008, Ekstrak Etanolik Biji Buah
Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel
MCF-7, Majalah Farmasi Indonesia, 19(1), 12-19.
Meyer, B. N., Ferrigni, Putnam, J. E. Jacobsen, L. B. Nichols, dan McLaughlin, 1982, Brine
Shrimp: A Covenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Planta Medica, 45:
31-34.
Prasedya, E. K., Miyake, M., Kobayashi, D., dan Hazama, A., 2016, Carrageenan Delays Cell
Cycle Progression in Human Cancer Cells in Vitro Demonstrated by FUCCI Imaging,
BMC Complementary and Alternative Medicine, 16, 270.
Puji, A., Gemini, A., Mae S. H. W., dan Subagus, W., 2005, Uji Sitotoksik Senyawa Alkaloid dari
Spons Petrosia sp, Potensial Pengembangan Sebagai Antikanker, Majalah Farmasi
Indonesia, 16(1), 58-62.
Radji, M., Aldrat, H., Harahap, Y., dan Irawan, C., 2010, Penggunaan Obat Herbal pada Pasien
Kanker Serviks, J. Ilmu Kefarmasian Indonesia, 8(1), 33-39.
Rahmawati, E., 2013, Uji Aktivitas Antikanker Herba Pacar Air (Impatients balsamina Linn.)
Terhadap Sel Kanker Payudara T47D, J. Ilmu Farmasi, 10(2), 47-55.
Rasyid, A., 2009, Senyawa-senyawa Bioaktif dari Spons, J. Oseana, XXXIV (2).
Risky, A., 2014, Aktivitas Antioksidan dan Antikanker Ekstrak Metanol Tumbuhan Paku
Adiantum phillippensis L., UNESA J. Chemistry, 3(1), 89-95.
Riyanto, F. D., 2013, Penetapan Kadar Etanol dan Profil Senyawa yang Terdapat Dalam Hasil
Produksi “CIU” Rumah Dusun Sentul Desa Bekonang Kabupaten Sukoharjo Dengan
Metode Kromatografi Gas, [Skripsi], Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
Yogyakarta.
Rohmah, N. N., 2016, Uji Efektivitas Antikanker Ekstrak Akar Rumput Bambu ((Lophatherum
gracile B.) yang Diembankan pada Zeolit NaX Terhadap Sel Kanker Payudara (T47D),
[Skripsi], Universitas Islam Negeri Malang.
Shanab, S. M. M., Mostafa, S. S. M., Shalaby, E. A., dan Mahmoud, G. I., 2012, Aqueous Extracts
of Microalgae Exhibit Antioxidant and Anticancer Activity, J. Tropical Biomedicine, 2(8),
608-615.
Somasekharam, S. P., El-Naggar, A., Sorensen, P. H., Wang, Y., dan Cheng, H., 2016, An
Aqueous Extract of Marine Microalgae Exhibits Antimetastatic Activity through
Preferential Killing of Suspended Cancer Cells and Anticolony Forming Activity,
Page 19
19
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Hindawi Pubhlising
Corporation.
Suhaling, S., 2010, Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Metanol Kacang Merah (Phaseolus vulgaris
L.) dengan Metode DPPH, [Skripsi], Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar.
Sukandar, D., Hermanto, S., dan Lestari, E., 2009, Uji Potensi Aktivitas Antikanker Ekstrak Daun
Pandan Wangi (Pandanus amaryllifolius Roxb.) dengan Metode Brine Shrimp Lethality
Test (BSLT), J. Kimia Terapan Indonesia, 11(1), 32-39.
Sukmarianti, N. W. S., Suaniti, N. M., dan Swantara, I. M. D., 2013. Identifikasi dan Uji Aktivitas
Antikanker Ekstrak Spons Lanthella basta terhadap larva Artemia salina L., Indonesia E-
Journal of Applied Chemistry, 1(1), 14-19.
Sumarakoon, K. W., Ko, J. Y., Shah, M. M. R., Lee, J. H., Kang, M. C., Nam, K. O., Lee, J. B.,
dan Jeon, Y. J., 2013, In Vitro Studies of Anti-Inflammatory and Anticancer Activity of
Organic Solvent Extracts from Cultured Marine Microalgae, ALGAE, 28(1), 111-119.
Wijaya, M., 2012, Ekstrak Annonaceous Acetogenin dari Daun Sirsak, Annona muricata sebagai
Senyawa Bioaktif Antikanker, [Skripsi], Universitas Indonesia.
World Health Organization, 2012, Cancer, http,//www.who.int/cancer/en/index.html Diakses
Maret 2018.
Zaid, A. A. A., Hammad, D. M., dan Sharaf, E. M., 2015, Antioxidant and Anticancer Activity of
Spirulina platensis Water Extracts, J. Pharmacology, 11(7), 846-851.
Zakaria, Z. A., A. M. Muhamed, Jamil, M. N. S., Rofiee, M. S., Somchit, M. N., Zuraini, A.,
Arifah, A. K., dan Sulaiman, M. R., 2011, In Vitro Cytotoxic and Antioxidant Properties
of the Aqueous, Chloroform and Methanol Extracts of Dicranopteris linearis, African
Journal of Biotechnology, 10(2), 273-282.