Gassensorische Untersuchungen mikrobiell kontaminierter ...

Gassensorische Untersuchungen mikrobiell kontaminierter Materialoberflächen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

vorgelegt dem Fachbereich 2 (Biologie / Chemie) der Universität Bremen

von

Ina Dorothea Cording

Bremen 2008

Titelbild: Elektronenmikroskopische Aufnahme von Penicillium sp. auf der Oberfläche einer Kalluskultur von Taxus baccata. Die Länge der unteren Bildkante entspricht 90 μm. (Foto: A. Tolz).

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1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Heyser 2. Gutachterin: Dr. habil. Andrea Ruf

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Ein Mensch sitzt kummervoll und stiert vor einem weißen Blatt Papier.

Jedoch vergeblich ist das Sitzen - Auch wiederholtes Bleistift spitzen,

schärft statt des Geistes nur den Stift. Selbst der Zigarre bittres Gift,

Kaffee gar, kannenvoll geschlürft, Den Geist nicht aus den Tiefen schürft.

Darinnen er, gemein verbockt, höchst unzulänglich einsam hockt.

Dem Menschen kann es nicht gelingen, ihn auf das leere Blatt zu bringen.

Der Mensch erkennt, daß es nichts nützt, wenn er den Geist an sich besitzt.

Weil Geist uns ja erst Freude macht, sobald er zu Papier gebracht!

Eugen Roth

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Kurzfassung

Mikrobielle Kontaminationen in Raumstationen stellen ein großes Risiko für die Besatzung und verwendete Baumaterialien dar. Um die Grundlagen für einen gassensorischen Nachweis solcher mikrobiellen Kontaminationen zu ermitteln, wurden raumfahrttechnische Baumateria-lien (Werkstoffe) mit Mikroorganismen besiedelt und mit der Elektronischen Nase ENO 1 untersucht. Die Elektronische Nase ENO 1 enthält ein Array aus zehn Metalloxidsensoren (MOS), die sich v. a. zum Nachweis reduzierbarer und oxidierbarer Gase eignen. Bei den un-tersuchten Mikroorganismen handelte es sich um Aspergillus niger, Bacillus polymyxa (bzw. Paenibacillus polymyxa), Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens sowie zwei verschieden zusammengesetzte Mischpopulationen. Zur Auswertung der multivariaten Daten wurden die PCA (Principle Component Analysis / Hauptkomponentenanalyse) und die LDA (Lineare Diskriminanzanalyse) eingesetzt. Anhand der gassensorischen Untersuchungen unter Laborbedingungen konnten spezifische Emissionen aufgrund der Organismenart, des besie-delten Substrats (Werkstoff) und der Zusammensetzung einer Mischkultur ermittelt werden. Die Emissionen setzen sich aus den Eigenausgasungen des Substrats und den gasförmigen Stoffwechselprodukten der Mikroorganismen zusammen, zu denen auch die MVOC (Micro-bial Volatile Organic Compounds) zählen. Weitere Einflüsse auf die Emissionen stellen das Alter einer Kultur und Wechselwirkungen in Mischkulturen dar. Aus der Vielzahl der beein-flussenden Faktoren ergibt sich eine hohe Variabilität der Emissionen bei einer mikrobiellen Kontamination, die einen korrekten Nachweis erschwert. Sich verändernde Hintergrundbe-dingungen und geringe Konzentrationen mikrobieller Emissionen setzen gassensorischen Kontrollen mikrobieller Kontaminationen in Raumstationen zusätzliche Grenzen. Die Umset-zung und Überprüfung verschiedener Maßnahmen zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit und die Entwicklung eines hierarchischen Bestimmungssystems stehen noch aus.

Schlüsselbegriffe

Aluminium, Aspergillus niger, Bacillus polymyxa, Bakterien, Baumaterial, Biodeterioration, Biofilm, Elektronische Nase, Emission, Gassensorik, Innenraumluft, LDA, Materialschädi-gung, mikrobielle Kontamination, Mikroorganismen, Mischkultur, MOS, MVOC, Oberfläche, Paenibacillus polymyxa, PCA, Penicillium expansum, Polycarbonat, Polyurethan, Pseudomo-nas fluorescens, Raumstation, Schimmelpilze, Sensor, Werkstoff

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Abstract

Microbial contaminations in space stations present a major risk for the crew and the construc-tion materials. In order to set guidelines for using gas-sensing to verify these microbial con-taminations, spaceship components were contaminated with micro-organisms and investi-gated using the Electronic nose ENO-1. The Electronic nose ENO-1 contains an array of ten Metal Oxide Sensors (MOS), which are suitable for the detection of reducible and oxidisable gases. The micro-organisms investigated were Aspergillus niger, Bacillus polymyxa (also Paenibacillus polymyxa), Penicillium expansum and Pseudomonas fluorescens, as well as two different mixed populations. PCA (Principle Component Analysis) and LDA (Linear Dis-criminant Analysis) were used to analyse the multivariate data. Under laboratory conditions the gas sensing experiment to identify the species, the kind of substrate or material, and the composition of a mixed population as influencing factors for variance in the microbial emis-sions was successful. The emissions are composed of the outgassing from substrate or mate-rial and the gaseous products of the microbial metabolism, which include the MVOC (Micro-bial Volatile Organic Compounds). Microbial emissions are further affected by the age or physiological state of a culture and interactions in mixed populations. The many influencing factors lead to high variability of the emissions from a microbial contamination and hinder the correct classification. Additionally, changing background conditions and low concentrations of microbial emissions complicate gas-sensing monitoring for microbial contamination in space stations. Electronic noses are therefore not suited to detect microbial contamination in manned space stations at the current technological level. The realisation of measures to en-hance the reproducibility and their verification as well as the development of a hierarchical identification system are ideas for further delving into this topic.

Keywords

Aluminium, Aspergillus niger, Bacillus polymyxa, bacteria, biodeterioration, biofilm, con-struction materials, electronic nose, emission, gas sensing, indoor air, LDA, microbial con-tamination, microorganism, mixed population, mold, MOS, MVOC, Paenibacillus polymyxa, PCA, Penicillium expansum, polycarbonate, polyurethane, Pseudomonas fluorescens, sensor, space station, surface

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Inhalt

Kurzfassung .............................................................................................................................. 6

Abstract ..................................................................................................................................... 7

Abkürzungen .......................................................................................................................... 11

1 Einleitung .................................................................................................................... 13 1.1 Oberflächenbesiedelnde Mikroorganismen auf Raumstationen.................................. 14 1.2 Biofilme und mikrobielle Materialschäden .................................................................. 15 1.3 Gassensorische Identifizierung von Mikroorganismen ................................................ 18 1.4 Gassensorik .................................................................................................................. 24 1.5 Fragestellungen und Kriterien dieser Arbeit ................................................................ 31

2 Material und Methoden ............................................................................................. 35 2.1 Gassensorik .................................................................................................................. 36 2.2 Aceton-Standard ........................................................................................................... 45 2.3 Untersuchung unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe ............................................. 46 2.4 Literaturrecherche......................................................................................................... 51

3 Ergebnisse ................................................................................................................... 53 3.1 Messgenauigkeit ........................................................................................................... 54 3.2 Vergleich unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe.................................................... 65 3.3 Vergleich der Mikroorganismen-Arten ........................................................................ 73 3.4 Vergleich der Werkstoffe ............................................................................................. 79 3.5 Vergleich von Reinkulturen und Mischkulturen .......................................................... 86 3.6 Vergleich der Mischkulturen........................................................................................ 90 3.7 Kernaussagen der Ergebnisse ....................................................................................... 91

4 Diskussion.................................................................................................................... 93 4.1 Prolog ........................................................................................................................... 94 4.2 Grenzen von Messmethode und Datenauswertung ...................................................... 94 4.3 Unbewachsene Kontrollen und bewachsene Werkstoffe ........................................... 104 4.4 Gassensorische Unterschiede der Mikroorganismenarten.......................................... 108 4.5 Einfluss des Werkstoffes auf die gassensorische Messung........................................ 115 4.6 Gassensorische Untersuchung von Mischkulturen..................................................... 123 4.7 Fazit und Ausblick...................................................................................................... 128

5 Zusammenfassung .................................................................................................... 131

6 Literatur .................................................................................................................... 135

Abbildungen.......................................................................................................................... 149

Tabellen ................................................................................................................................. 155

Danksagung........................................................................................................................... 157 Anhang ..................................................................................................................................A-1

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Abkürzungen

An Aspergillus niger

ANN Artificial Neural Network (Künstliches Neuronales Netz)

AS Aceton-Standard

Bp Bacillus polymyxa

EPS Extrazelluläre polymere Substanz

G Symbol des Elektrischen Leitwerts

G0 Elektrischer Leitwert bei der Messung von Nullgas bei gassensorischen Messungen

G0/G Verhältnis des Leitwerts von Nullgas zum Leitwert von Messgas bei gassensorischen Messungen; in dieser Arbeit bezeichnet als relativer Leitwert

GC Gaschromatographie

ISS International Space Station (Internationale Raumstation)

LDA Linear Discriminant Analysis (Lineare Diskriminanzanalyse)

MB Bakteriendominierte Mischprobe

MIC Microbial induced corrosion (Mikrobiell induzierte Korrosion)

MOS Metal Oxide Semiconductor (Metalloxid-Sensoren)

MOSFET Metal Oxide Semiconductor Field Effect Transistor

MP Pilzdominierte Mischprobe

MS Massenspektrometrie

MVOC Microbial volatile organic compounds

PCA Principal Component Analysis (Hauptkomponentenanalyse)

Pe Penicillium expansum

Pf Pseudomonas fluorescens

R Symbol des Elektrischen Widerstands

VOC Volatile organic compounds

W1 Werkstoff 1 – beschichtetes Aluminium

W4 Werkstoff 4 – anodisiertes Aluminium

W5 Werkstoff 5 – Polycarbonat

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Einleitung 13

1 Einleitung

1.1 Oberflächenbesiedelnde Mikroorganismen auf Raumstationen................................... 14 1.2 Biofilme und mikrobielle Materialschäden .................................................................. 15

1.2.1 Biofilme ....................................................................................................... 15 1.2.2 Biodeterioration oder mikrobielle Materialschädigung............................... 16

1.3 Gassensorische Identifizierung von Mikroorganismen ................................................ 18 1.3.1 Klassische Differenzierung von Mikroorganismen ..................................... 18 1.3.2 MVOC als Indikator mikrobiellen Wachstums ........................................... 19 1.3.3 Physiologie der Bildung flüchtiger Stoffwechselprodukte .......................... 19 1.3.4 Prozessspezifische MVOC........................................................................... 20 1.3.5 Artübergreifende und artspezifische MVOC ............................................... 21 1.3.6 Nachweis mikrobieller Stoffwechselprodukte mit Gassensoren ................. 21 1.3.7 Einfluss der Werkstoffe auf die gassensorischen Messungen ..................... 23

1.4 Gassensorik .................................................................................................................. 24 1.4.1 Elektronische Nasen..................................................................................... 24 1.4.2 Metalloxid-Sensoren .................................................................................... 25 1.4.3 Wichtige Einflussfaktoren gassensorischer Messungen .............................. 27 1.4.3.1 Sensorendrift ................................................................................................ 27 1.4.3.2 Spezifität der Sensoren ................................................................................ 28 1.4.3.3 Messbereiche der Sensoren.......................................................................... 29 1.4.3.4 Die Sensorantwort auf Gasgemische und Luftfeuchte................................. 29 1.4.4 Die Datenauswertung mit der PCA und LDA ............................................. 30

1.5 Fragestellungen und Kriterien dieser Arbeit ................................................................ 31

14 Einleitung

1.1 Oberflächenbesiedelnde Mikroorganismen auf Raumstationen

Ein Wachstum von Pilzen und Bakterien in Innenräumen kann zu gesundheitlichen Proble-men bei den Bewohnern und zu Schädigungen der Baumaterialien führen. In halbgeschlosse-nen Systemen wie bemannten Raumstationen stellt die mikrobielle Kontamination von Mate-rialoberflächen ein besonders schwerwiegendes Sicherheitsproblem dar. Einerseits können Oberflächen besiedelnde Mikroorganismen ernstzunehmende Materialschäden verursachen, andererseits bilden sie eine diffuse Quelle für gesundheitliche Beeinträchtigungen der Besat-zung.

Auf der sowjetrussischen Raumstation MIR wurden in Biofilmen organisiert 58 Bakterien-arten und 36 Pilzarten nachgewiesen. Die Biofilme bildeten sich vorzugsweise an Orten mit kalten Materialoberflächen, an denen durch Kondensation ausreichend Wasser zur Verfügung stand. Aufgrund der Bedingungen unter geringer Schwerkraft bildeten sich an manchen Kon-densationspunkten freischwebende Wasseransammlungen von beachtlicher Größe (Ott et al., 2004).

Auf MIR- und SALJUT-Missionen gab es über 100 Schadensfälle durch Mikroorganismen. Dabei wurden im Zusammenhang mit diesen mikrobiellen Materialschädigungen über 100 Bakterien- und Pilzarten identifiziert. Geschädigte Bereiche waren z. B. Rohrleitungen, Kontrollsysteme, Kabelisolierungen und Navigationsfenster (Klintworth et al., 2000). Bei Untersuchungen von Oberflächen des Skylab wurden Schimmelpilzsporen in bedenklichen Konzentrationen nachgewiesen, darunter Arten der Gattungen Aspergillus und Penicillium (Reiß, 1998).

Sichtbares Pilzwachstum gab es auf der Raumstation MIR u. a. auf Kabelnetzen, auf Teilen der Klimaanlagen und an Systemen zur Wasserrückgewinnung. Schäden an einem Naviga-tionsfenster auf der MIR-Station wurden in Zusammenhang mit dem Bewuchs mit Bacillus polymyxa, Penicillium chrysogenum und Aspergillus-Arten gebracht. Auf Kunststoffmateri-alien der MIR betrugen Zellkonzentrationen von Bakterien und Pilzen bis zu 109 pro 100 cm2. Darunter konnte auch die pathogene Bakterienspezies Staphylococcus aureus nachgewiesen werden (Klintworth et al., 1999; Gu et al., 1998) untersuchten Baustoffe für Raumstationen auf ihre Beständigkeit gegenüber mikrobieller Materialzerstörung. Sie wiesen dabei Schäden an Polyurethanbeschichtungen, wie sie auch auf der Internationalen Raumstation (ISS) ver-baut wurden, nach.

Da auch auf der Internationalen Raumstation Kontaminationen durch Oberflächen besiedeln-de Mikroorganismen zu befürchten waren, wurde das F&E-Vorhaben „Material für Langzeit-

Einleitung 15

anwendung im Weltraum MLA V – Mikrobiologie“ initiiert. Die Befürchtungen haben sich zwischenzeitlich bestätigt.

Die Ergebnisse des Projektes sollten zur Entwicklung eines Verfahrens beitragen, mit dem Oberflächen besiedelnde Mikroorganismen auf Materialien für die Raumfahrttechnik mittels einer Elektronischen Nase identifiziert werden. Die Idee zu dieser Nachweismethode fußt auf dem Wissen geübter Mikrobiologen, Mikroorganismen anhand ihres Geruchs zu erkennen (Gibson et al., 1997).

Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse und Schlussfolgerungen basieren auf Untersu-chungen, die im Rahmen des oben erläuterten F&E-Projektes von der Autorin durchgeführt wurden.

1.2 Biofilme und mikrobielle Materialschäden

1.2.1 Biofilme

Mikroorganismen können grundsätzlich frei suspendiert im Medium vorkommen oder Ober-flächen besiedeln. Unter natürlichen Bedingungen kommen Mikroorganismen überwiegend Oberflächen besiedelnd, bzw. als Biofilme vor (Costerton et al., 1994; van Loosdrecht et al., 1990; Watnick & Kolter, 2000). Die Ausbildung von Biofilmen hat für die Mikroorganismen eine Reihe von Vorteilen, wie z. B. den Schutz vor Fraß, bzw. Phagozytose, vor antibakteriel-len Reagenzien und vor Scherkräften sowie die Möglichkeit zur kooperativen Nutzung von Nährstoffen (Costerton et al., 1994; Jefferson, 2004).

Zur Ausbildung von Biofilmen scheiden die Mikroorganismen nach ihrer Adsorption an die Oberfläche extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) aus. Diese bestehen überwiegend aus Polysacchariden, enthalten aber auch Proteine, Nukleinsäuren, Lipide und 95-99 % Wasser (Flemming, 1994). Die EPS bietet den Mikroorganismen Schutz vor verschiedenen negativen Einflüssen wie Austrocknung (Flemming & Wingender, 2002) und toxischen Substanzen wie z. B. Desinfektionsmittel und Antibiotika (Costerton et al., 1987; Xu et al., 1996; Stewart et al., 1996). Außerdem reichert die EPS-Matrix Nährstoffe an, die den Mikroorganismen in oligotrophen Habitaten ein Überleben ermöglichen (Costerton et al., 1987; Flemming & Wingender, 2002). Die EPS bildet eine Diffusionsbarriere. Dadurch stellen sich in der EPS Gradienten ein, die ein Zusammenleben von Mikroorganismen mit ganz unterschiedlichen Umweltansprüchen nebeneinander auf engstem Raum bewirken. Dabei bilden die Mikro-organismen verschiedener Arten Konsortien, in denen sie in physiologischer Kooperation leben. So wird z. B. stellenweise der Sauerstoff von aeroben Mikroorganismen so weit aufge-zehrt, dass in ihrer direkten Nachbarschaft Anaerobier leben können. Primärproduzenten sind häufig umgeben von heterotrophen Organismen, die ihre Stoffwechselprodukte verwerten (Costerton et al., 1987). Dadurch kann sich in den Biofilmen eine komplexe Gemeinschaft von Mikroorganismen ausbilden, die sich abhängig von den äußeren Bedingungen jederzeit

16 Einleitung

verändern kann. Bei gleichbleibenden Umweltbedingungen wird die Population durch Kon-kurrenz stabil gehalten (Molin et al., 2004). In gemischten Biofilmen kooperieren die Mikro-organismen aufgrund ihrer verschiedenen physiologischen Ansprüche durch den Austausch von Substraten und erzielen so eine optimale Ausbeute der verfügbaren Nährstoffe (Costerton et al., 1994; Jefferson, 2004). Daher werden in gemischten Biofilmen häufig höhere Zellzah-len erreicht als in Biofilmen mit nur einer Art (Elvers et al., 1998). Aber auch in „Eine-Art-Biofilmen“ bilden sich durch Interaktionen unterschiedliche Nischen und Phänotypen aus (Molin et al., 2004).

In natürlichen Habitaten sind Biofilme durch ihre physiologischen Leistungen auf verschie-denste Weise an den Stoffkreisläufen beteiligt. Die Bedeutung der Biofilmbildung für den Menschen liegt u. a. im biotechnologischen, medizinischen und technischen Bereich. An die-ser Stelle soll auf die für diese Arbeit relevante mikrobielle Materialschädigung durch Bio-filmbildner eingegangen werden.

1.2.2 Biodeterioration oder mikrobielle Materialschädigung

In Biofilmen immobilisierte Mikroorganismen erzeugen Stoffwechselprodukte, die Schäden an ihrer Unterlage hervorrufen können. Häufig nutzen sie ihre Unterlage auch als Nährstoff-quelle (Flemming, 1994). Viele Materialien werden zunächst von Mikroorganismen besiedelt, die sie zumindest teilweise verwerten können (Costerton et al., 1987). Zu den erzeugten Schäden zählen z. B. die Biokorrosion von Metallen und die Schädigung von Kunststoffen, Gummi und mineralischen Baustoffen durch Mikroorganismen.

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Einfluss von Aluminium und Kunst-stoffen auf die gasförmigen Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen durchgeführt. Daher wird in den folgenden Abschnitten die Biokorrosion von Metallen und die mikrobielle Mate-rialschädigung von Kunststoffen erläutert.

Metalle

Bei der Biokorrosion oder mikrobiologisch induzierten Korrosion (MIC) von Metallen han-delt es sich um keine spezifisch mikrobielle Korrosionsform, sondern um eine Verstärkung von an der abiotischen Korrosion beteiligten Faktoren durch die mikrobielle Besiedlung (Heubner, 2000; Renner, 1996). Zu diesen Faktoren zählen Licht, Temperatur, Abrasion, Wasserverfügbarkeit und –bindung, pH-Wert, Redoxpotential, Sauerstoffkonzentration und Kohlendioxidkonzentration. Dünne Oxidschichten auf der Metalloberfläche (Passivschichten) schützen das Metall vor den genannten Einflüssen und bewirken eine höhere Korrosionsbe-ständigkeit des Metalls. Durch mikrobielle Einwirkung können sie jedoch lokal zerstört wer-den. Lokale Materialzerstörungen sind charakteristisch für Biokorrosionen und führen zu kleinflächigen Loch-, Mulden- und Spaltkorrosionen. Sie treten dort auf, wo Metallbauteile

Einleitung 17

zeitweise oder ständig in Kontakt mit Wasser kommen, z. B. an Bauteilen zur Trinkwasser-verteilung und an Schiffsrümpfen (Flemming, 1994; Heitz, 1989; Klintworth et al., 1999).

Bei Kontakt einer Metalloberfläche mit Wasser gehen positiv geladene Metallionen in Lö-sung, während die Elektronen zunächst im Metall verbleiben (Me0 Men+ + n e-). Dabei lädt sich die Metalloberfläche bis zu einem gewissen Grad der Polarisation negativ auf.

Redoxreaktionen in der Umgebung des aufgeladenen Metalls führen zur Depolarisierung des Metalls. Daran beteiligt sind in erster Linie Wasserstoff-Ionen und molekularer Sauerstoff. Wasserstoff-Ionen werden von den Elektronen aus dem Metall zu molekularem Wasserstoff reduziert (Säure-Korrosion: 2 H+ + 2 e- H2). Dieser Prozess erfolgt konsequenterweise vor allem in sauren Lösungen mit hohen H+-Konzentrationen, wie sie auch von verschiedenen Mikroorganismen erzeugt werden. Im gut belüfteten neutralen Milieu führt bevorzugt die Elektronenaufnahme durch Sauerstoff zur Korrosion des Metalls (Sauerstoff-Korrosion: O2 + 2 H2O + 4 e- 4 OH-).

Biofilme führen großflächig zu einer hohen Stromdichte an der Metalloberfläche und damit zu einer beschleunigten Korrosion. An der mikrobiellen Korrosion von Metallen sind zumeist verschiedene Mikroorganismenarten gleichzeitig beteiligt (Flemming, 1994).

Häufige an der Biokorrosion beteiligte Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen sind so-wohl organische und anorganische Säuren als auch Schwefelwasserstoff (Heubner, 2000). Die Stoffwechselprodukte werden durch die Biofilm-Matrix zurückgehalten und angereichert, da die Matrix die Diffusion einschränkt und so zu Heterogenitäten und zum Aufbau von Gra-dienten führt. An der Metalloberfläche induzieren die Säuren die Säurekorrosion und die Bil-dung von Sulfiden. Gebildete Sulfidschichten verstärken in der Folge die Sauerstoffkorrosion (Flemming, 1994; Heitz, 1989).

Zusätzlich bilden, abhängig von der Struktur der Polymere, die Bestandteile der EPS und organische Säuren mit den Metall-Ionen Komplexe aus, legen sie gebunden fest und entzie-hen sie so dem Metall (Flemming, 1994).

Auf die in der Biokorrosion sehr wichtigen Organismengruppen der sulfatreduzierenden und eisenoxidierenden Bakterien soll hier nicht näher eingegangen werden, da sie in dieser Arbeit nicht untersucht wurden.

Kunststoffe

Mikrobielle Schäden an Kunststoffen werden in feuchter Umgebung hauptsächlich durch Pil-ze verursacht, z. B. durch Arten von Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Chaetomium und Cladosporium. Bei starker Wasserexposition greifen vor allem Bakterien, u. a. Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, und Micrococcus-, Bacillus-, Streptomyces-Spezies die Kunststoffe an (Alexander, 1999; Flemming, 1994).

18 Einleitung

Die mikrobielle Schädigung von Kunststoffen erfolgt sowohl direkt durch Abbau der Unter-lage zur Nutzung als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle als auch indirekt durch Stoffwechsel-produkte (Radikale, Enzyme und Säuren) oder Verfärbungen. Direkt abgebaut werden vor allem Weichmacher und ähnliche Additive, die an die Kunststoffoberfläche diffundieren und dort durch mikrobielle Einwirkung zersetzt werden. Dadurch verspröden die Kunststoffe, ver-lieren ihre Funktionsfähigkeit, und es bilden sich Risse, Sprünge und Blasen (Flemming, 1998). Manche Kunststoffe können jedoch auch vollständig mikrobiell zersetzt und als Koh-lenstoffquelle verwendet werden (Lefèvre et al., 2002). Der Abbau von Polyethylen zu redu-zierenden Zuckern und Protein wurde bei Streptomyceten und den Schimmelpilzen Aspergillus flavus und Mucor rouxii beobachtet (El-Shafei et al., 1998).

Im Innenbereich wachsen biofilmbildende Schimmelpilze häufig in Feuchträumen auf Kunst-stoffmaterialien wie Duschvorhängen und Dichtungsmaterialien. Sie schädigen die Materialen und führen gleichzeitig zu einer Gesundheitsbeeinträchtigung der Bewohner durch die Abga-be allergieauslösender Sporen. In der Wassertechnologie greifen biofilmbildende Mikroorga-nismen u. a. Rohre, Dichtungen und Folien aus Kunststoff an (Flemming, 1994).

1.3 Gassensorische Identifizierung von Mikroorganismen

1.3.1 Klassische Differenzierung von Mikroorganismen

Die Systematik der Mikroorganismen beruhte lange Zeit überwiegend auf ihren phänotypi-schen Merkmalen. Erst mit der fortschreitenden Entwicklung der Molekularbiologie wurde zunehmend auch der Genotyp für die systematische Einordnung herangezogen (Cohan, 2002). Bei den phänotypischen Merkmalen handelt es sich um die Morphologie und die biochemi-schen Eigenschaften der Organismen, in die hier auch ihr Färbeverhalten einbezogen werden soll. Während bei vielen Pilzen eine morphologische Differenzierung aufgrund ihrer Größe häufig noch möglich ist, können kleinere Pilze und die meisten Bakterien aufgrund ihrer ge-ringen Größe morphologisch kaum oder gar nicht differenziert werden. Hier wurden und wer-den die biochemischen Eigenschaften zur Differenzierung und zur systematischen Einord-nung herangezogen. In der Regel werden für bestimmte Gruppierungen der Mikroorganismen typische Stoffwechselleistungen überprüft. Eine verbreitete Vorgehensweise ist dabei der Nachweis eines bestimmten Produktes aus einem entsprechenden Substrat, das besonders die-se Organismen zu verwerten in der Lage sind. Bei den genannten Produkten handelt es sich zum Teil um flüchtige Verbindungen (Stetter & Penrose, 2002), die für den Nachweis u. a. ausgefällt werden können. Ein üblicherweise eingesetztes Verfahren zum Nachweis der Bil-dung von Schwefelwasserstoff ist die Ausfällung mit Eisensalzen, die durch Schwarzfärbung

Einleitung 19

des Mediums deutlich erkennbar wird. Das Verfahren wird z. B. vielfach in der diagnosti-schen Identifizierung von Krankheitserregern wie Salmonella sp. und Clostridium perfringens eingesetzt (Gerten, 1993; Madigan et al., 1997). Laut McEntegart et al. (1999) handelt es sich bei den Abfallprodukten des mikrobiellen Stoffwechsels häufig um kleine flüchtige Moleküle. Es ist daher naheliegend, Mikroorganismen mit Hilfe einer geeigneten Technologie anhand ihrer spezifischen gasförmigen Stoffwechselprodukte zu identifizieren und voneinander zu differenzieren.

1.3.2 MVOC als Indikator mikrobiellen Wachstums

Die Bildung gasförmiger Stoffwechselprodukte ist eine grundsätzliche Eigenschaft von Mikroorganismen (und von allen übrigen Lebewesen). Die organischen gasförmigen Stoff-wechselprodukte werden bei Mikroorganismen als MVOC (Microbial Volatile Organic Compounds) bezeichnet und können als Indikatoren für mikrobielles Wachstum verwendet werden (Lorenz, 2001; Schiffmann et al., 2000). Ihre Bildung ist u. a. abhängig von der Orga-nismenart, dem physiologischen Alter der Mikroorganismen und den Wachstumsbedingungen wie Nährstoffangebot, Temperatur usw.

Bei MVOC handelt es sich überwiegend um Verbindungen aus den Stoffgruppen der Alde-hyde, Ketone, Alkohole, Furane, Ester und organischen Säuren (Schleibinger & Rüden, 1999). MVOC sind flüchtige Produkte des primären und sekundären Stoffwechsels mit sehr unterschiedlichen Funktionen für die Organismen. Eine umfangreiche Auflistung von MVOC, die von Mikroorganismen auf Baumaterialien gebildet werden, findet sich bei Claeson (2006). Anorganische Stoffwechselprodukte wie Ammoniak und Schwefelwasserstoff werden von vielen Mikroorganismen gebildet, sind aber weniger spezifisch als die MVOC (Claeson, 2006).

1.3.3 Physiologie der Bildung flüchtiger Stoffwechselprodukte

Gasförmige Stoffwechselprodukte werden während der Abbauwege u. a. in der Glycolyse, Proteolyse und der Lipolyse gebildet. Marilley & Casey (2004) beschreiben diese Vorgänge im Zusammenhang mit der Bildung von Aromastoffen in Käse. So wird Lactose über Pyruvat zu kurzkettigen Verbindungen wie Diacethyl, Acetoin, Acetat, Acetaldehyd, Ethanol usw. metabolisiert. Die Proteolyse verläuft über die Transamination, Dehydrogenierung, Decarbo-xylierung und Reduktion der Aminosäuren. Dabei entstehen Alkohole, Aldehyde, Ketone, Ester, Lakton, Schwefel- und Stickstoffverbindungen, Pyrazin, Furan, Fettsäuren und Pheno-le. Kurz- und mittelkettige Fettsäuren aus dem Milchfett werden u. a. zu Estern und Ethyl-acetat abgebaut.

Produkte des Fettsäureabbaus von Baumaterialien besiedelnden Schimmelpilzen sind Ketone, Alkohole und Isoprene. Stickstoffhaltige Verbindungen wurden vor allem bei einem Wachs-tum von Schimmelpilzen auf künstlichen Medien nachgewiesen (Claeson et al., 2002).

20 Einleitung

Ausgasungen von Kläranlagen enthalten als geruchsbildende Komponenten reduzierte Schwe-fel- und Stickstoffverbindungen, organische Säuren, Aldehyde und Ketone aus mikrobiellem Abbau. Schwefelwasserstoff entsteht durch die Reduktion von Sulfat und die Desulfuration organischer Schwefelverbindungen. Durch den Abbau von Aminosäuren werden Ammoniak, Amine, Indol und Skatol frei (Gostelow et al., 2001).

Grundsätzlich wird die Freisetzung von MVOC durch verschiedenste Faktoren beeinflusst: Dazu gehören Spezies, Substrat, Wachstumsphase, Temperatur, Feuchtigkeit, pH, Licht und Gehalt an O2 und CO2. Allgemein steigt der Stoffwechsel und damit auch die Bildung von MVOC bei gutem Nährstoffangebot an, während bei einem Wachstum unter Nährstoffmangel weniger MVOC freigesetzt werden. Die Produktion bestimmter MVOC, z. B. von Terpenen, kann durch einen Nährstoffmangel jedoch angeregt werden (Claeson, 2006).

1.3.4 Prozessspezifische MVOC

In technischen und nichttechnischen mikrobiologischen Prozessen wurden in verschiedenen Fällen für den jeweiligen Prozess typische VOC (Volatile Organic Compounds) gefunden. Als eine für die Kartoffelfäule typische flüchtige Verbindung identifizierten Lyew et al. (2001) Furan mittels SPME (solid phase microextraction) und GC/MS (Gaschroma-tographie/Massenspektrometrie). Bei der Kompostierung auftretende charakteristische VOC sind Alkohole, Ketone, Furane, Schwefelverbindungen und Terpene (Müller et al., 2004). Biofilmbildende Bakterien aus der Geflügelverarbeitung erzeugten vor allem Alkohole und Indol (Arnold & Senter, 1998). Gostelow et al. (2001) wiesen in der biologischen Abwasser-behandlung v. a. flüchtige Fettsäuren, Aldehyde und Ketone nach. Eine ganze Reihe spezifischer MVOC Innenräume besiedelnder Pilze sind bei Fischer & Dott (2003) aufge-listet: Es handelt sich dabei um bestimmte Furane, Alkohole, Aldehyde, Ester, Ether, Schwe-felverbindungen und Terpene. Die Konzentrationen der MVOC 2-Hexanon, 2-Heptanon und 1-Octen-3-ol korrelierten mit der Ausdehnung des Pilzwachstums in den Innenräumen (Dewey et al., 1995). An anderer Stelle wird neben zahlreichen MVOC Geosmin als bedeu-tende Verbindung bei mikrobieller Kontamination von Innenräumen genannt (Lorenz, 2001). Ethanol, 3-Pentanon und 2-Methyl-1-propanol wurden von Schiffmann et al. (2000) als Refe-renz-MVOC für den Nachweis verschiedener in Innenräumen vorkommender Bakterien und Pilze verwendet.

In Hausstaub werden Fettsäuren und wahrscheinlich auch Aldehyde zu Methylketonen und Alkoholen umgesetzt (Korpi et al., 1997). In Klimaanlagen wurden Aceton und Formaldehyd als wichtige MVOC identifiziert (Schleibinger & Rüden, 1999).

Anhand dieser Auflistung soll verdeutlicht werden, dass in mikrobiellen Prozessen typische VOC nachweisbar sind. Bei einem Teil der nachgewiesenen VOC handelt es sich um charak-teristische flüchtige Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen, die unter den im Prozess vorgegebenen Bedingungen gebildet werden, während die übrigen VOC vom Substrat freige-setzt werden.

Einleitung 21

1.3.5 Artübergreifende und artspezifische MVOC

Entsprechend ihrer physiologischen Charakteristika bilden bestimmte Gruppen und Spezies unter den Mikroorganismen artübergreifende und artspezifische MVOC. Der Nachweis art-spezifischer MVOC ermöglicht eine Differenzierung der Mikroorganismen, während artüber-greifende MVOC als Markersubstanzen für mikrobielle Kontaminationen genutzt werden können. Unabhängig vom Substrat und der Spezies wurde in einer Untersuchung von Borjesson et al. (1992) bei allen von ihnen aus Getreide isolierten Pilzen 3-Methyl-Furan ge-funden. Adamek et al. (1992) analysierten von Schimmelpilzen abgegebene MVOC nach einer Anreicherung in einer Kältefalle mit der GC/MS und fanden ebenfalls 3-Methyl-Furan und außerdem 2-Methyl-Propanol und 3-Methyl-Butanol. Bei Pilzen, die aus der Luft von Kompostierungsanlagen isoliert wurden, konnten die artübergreifenden MVOC 3-Methyl-1-Butanol, 1-Octen-3-ol und 2,3,5-Trimethyl-Furan nachgewiesen werden (Fischer et al., 1999). Streptomyces albidoflavus bildete unabhängig vom Medium die fünf MVOC 3-Methyl-2-Butanon, 3-Methyl-2-Pentanon, Geosmin und zwei Sesquiterpene (Sunesson et al., 1997). Viele der für das Bakterium Streptomyces albidoflavus ermittelten MVOC kommen auch bei Schimmelpilzen vor (Jelén et al., 2003).

Hohe Konzentrationen von H2, Methan und Schwefelverbindungen werteten Brandgård et al. (2001) als Indikatoren für das Wachstum von Methanobacterium formicicum.

Abhängig von ihren Stoffwechselleistungen bilden die genannten Organismen-Gruppen dem-zufolge typische MVOC, anhand derer sie nachgewiesen werden könnten.

1.3.6 Nachweis mikrobieller Stoffwechselprodukte mit Gassensoren

Für die Untersuchungen auf spezifische VOC mikrobieller Herkunft werden üblicherweise gaschromatische Verfahren eingesetzt. Sie geben Aufschluss über die qualitative und quanti-tative Zusammensetzung eines Gasgemisches, wie sie z. B. bei Untersuchungen artspezifi-scher Aromastoffe von Milchsäurebakterien für die Käseproduktion erwünscht und sinnvoll sind (Marilley & Casey, 2004). Bei Fragestellungen, die weniger auf die Ermittlung der exak-ten Zusammensetzung eines Gasgemisches, sondern auf den Gesamteindruck - eine „Ja/Nein-Antwort“ abzielen, können gassensorische Verfahren geeigneter sein. Nach einem geeigneten Training ist der gassensorische Nachweis eines Gasgemisches deutlich schneller und einfa-cher durchzuführen als der gaschromatische Nachweis, und es können Messwiederholungen in großem Umfang vorgenommen werden. Daher eignen sich Gassensoren besonders für On-line-Überwachungen von Prozessen oder für Anwendungen, in denen rasche Aussagen erfor-derlich sind.

Einsatzmöglichkeiten von Gassensoren, bzw. von Elektronischen Nasen zum Nachweis flüch-tiger mikrobieller Stoffwechselprodukte wurden von verschiedenen Autoren untersucht und beschrieben. Viele fokussieren auf medizinische Anwendungen, in denen eine rasche Diag-nose von Krankheitserregern entscheidend für den Behandlungserfolg sein kann. McEntegart

22 Einleitung

et al. (2000) wiesen Bakterienwachstum anhand der flüchtigen Stoffwechselprodukte mit Gassensoren nach, dabei ermittelten sie eine Zellzahl von 5 x 108 ml-1 als Nachweisgrenze für coliforme Bakterien. Zur Bestimmung des Tuberkulose-Erregers Mycobacterium tuberculosis setzten Pavlou et al. (2004) eine Elektronische Nase ein und maßen gleichzeitig deutliche Unterschiede zu anderen Erregern von Lungenkrankheiten. Andere Anwendungen zielen auf die optimierte Steuerung von Bioprozessen in der Lebensmittelproduktion oder in der Um-welttechnologie ab. Die industrielle Fermentation von Joghurt wurde mit einem gemischten Array aus mehreren Sensortypen verfolgt, um Abweichungen im Bioprozess rasch erkennen zu können (Navrátil et al., 2004). Das Wachstum von Pilzen auf Papier in Bibliotheken und der Verderb von Brot durch Schimmelpilze wurde anhand der gebildeten MVOC frühzeitig mit Gassensoren nachgewiesen (Canhoto et al., 2004; Keshri et al., 2002). Andere Autoren klassifizierten Mikroorganismen mit Hilfe von Gassensoren und nennen in ihren Veröffentli-chungen sowohl die eingesetzten Sensortypen als auch die chemischen Stoffgruppen, für die diese empfindlich sind. Einige Beispiele finden sich in Tabelle 1-1.

Tabelle 1-1: Beispiele für Arbeiten, in denen Mikroorganismen mit Gassensoren nachgewiesen wurden. Neben den Autoren sind auch die verwendeten Sensortypen mit ihren Selektivitäten aufgeführt.

Autoren Sensoren Empfindlichkeit Bachinger et al. (1998) Zehn MOSFET-Sensoren,

sechs MOS-Sensoren (Zinn-oxid), ein Infrarot-Sensor

Wasserstoff, Amine, Aldehy-de, Alkohole, Ester, Ketone, Aromaten, Kohlenwasserstof-fe, Methan, Erdgas, Luftquali-tät, organische Lösemittel, Benzinabgas, Aromen von Nahrungsmitteln, Kohlendi-oxid (Häufige Überschneidungen der Sensoren)

Brandgård et al. (2001) Zehn MOS-Sensoren (Zinn-oxid), zehn MOSFET-Sensoren

u. a. Methan, Wasserstoff, Sulfid und Essigsäure

Gardner et al. (1998) Sechs MOS-Sensoren, ein Temperatursensor, ein Feuch-tesensor

Kohlenwasserstoffe, Alkoho-le, Aldehyde/Heteroatome, polare Moleküle und unpolare Verbindungen

Schiffmann et al. (2000) 15 MOS-Sensoren Isopropylalkohol, Toluol, Schwefelwasserstoff, Stick-stoffdioxid, Chlor, Butan, Propan, Wasserstoff, Koh-lenmonoxid, Heptan, Ozon und allgemeine VOCs

Einleitung 23

Brandgård et al (2001) fokussieren mit einer Auswahl ihrer Sensoren speziell auf die flüchti-gen Verbindungen, die in hohen Konzentrationen von dem untersuchten Mikroorganismus Methanobacterium formicicum gebildet werden. Gardner et al. (1998) wählten das verwen-dete Sensorarray anhand der Stoffgruppen aus, die Mikroorganismen als sekundäre Metaboli-ten aus Nährstoffen freisetzen. In anderen Fällen wird die Auswahl der Sensoren nicht näher begründet: Für verschiedene Gruppen von MVOC lag aber eine Empfindlichkeit vor (Bachinger et al., 1998; Schiffmann et al., 2000).

In der Literatur wird bei gassensorischen Untersuchungen von Mikroorganismen überwiegend von der Untersuchung ihrer MVOC gesprochen. Tatsächlich werden mit Elektronischen Nasen je nach Art der verwendeten Sensoren auch andere Substanzen wie z. B. anorganische Produkte des mikrobiellen Stoffwechsels nachgewiesen. Es müsste daher korrekterweise die Bezeichnung „gasförmige mikrobielle Stoffwechselprodukte“ verwendet werden. Da der Begriff „MVOC“ im Zusammenhang mit gassensorischen Messungen aber allgemein gängig ist, wurde er in dieser Arbeit übernommen.

1.3.7 Einfluss der Werkstoffe auf die gassensorischen Messungen

Neben der Eigenausgasung kann das Material des Werkstoffes den gassensorischen „Fingerprint“ der besiedelten Proben auch indirekt über den Stoffwechsel der Mikroorganis-men beeinflussen. Die phänotypische Entwicklung Oberflächen besiedelnder Kulturen hängt maßgeblich von den verfügbaren Nährstoffen ab (Molin et al., 2004; Noguera et al., 1999). In dem speziellen Fall der MVOC-Bildung ist das bewachsene Medium oder Material neben der Organismen-Spezies ein entscheidender Einflussfaktor (Adamek et al., 1992; Borjesson et al., 1992; Claeson et al., 2002; Fiedler et al., 2001; Fischer et al., 1999; Meruva et al. 2004; Sunesson et al., 1997). Die Mikroorganismen verwerten Komponenten, die vom Material durch normale Alterung abgegeben werden oder durch die mikrobielle Materialzerstörung frei werden (Filip, 1989). Diese Vorgänge sind einerseits abhängig von den Materialeigenschaften und andererseits von den Stoffwechselleistungen der jeweiligen Mikroorganismen.

Die besiedelte Oberfläche kann sich somit entscheidend auf die Vitalität einer Population auswirken. Bakterien auf eisenhaltigen Oberflächen wuchsen besser und waren widerstands-fähiger gegen eine Chlordesinfektion als bei einem Wachstum auf Kunststoffen (Camper et al., 1996). Die Widerstandsfähigkeit synthetischer Polymere beruht aber nicht auf ihrer Toxi-zität wie bei vielen anderen Materialien, sondern auf ihren Struktureigenschaften (Alexander, 1999). Auch Auschill et al. (2002) beobachteten einen entscheidenden Einfluss der Material-art von Dental-Werkstoffen auf die Wachstumsstärke und Vitalität von Biofilmen.

24 Einleitung

1.4 Gassensorik

1.4.1 Elektronische Nasen

Gardner & Bartlett (1994) formulierten die folgende, häufig zitierte Definition Elektronischer Nasen: „An electronic nose is an instrument, which comprises an array of electronic chemical sensors with partial specificity and an appropriate pattern-recognition system, capable of recognising simple or complex odours.“

Stetter & Penrose (2001) ergänzten diese Definition um ein geeignetes Probenahmesystem, das dem Sensorarray vorgeschaltet ist (vgl. Abbildung 1-1).

Abbildung 1-1: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Elektronischen Nase (Arshak et al., 2004).

Bei den Messergebnissen handelt es sich um kombinierte Summensignale unterschiedlicher querempfindlicher Sensoren auf ganze Stoffgruppen. Diese Kombination von Summensigna-len ergibt einen „fingerprint“, der für das untersuchte Probengas typisch ist. Den Messungen schließt sich ein Lernen oder Training an, aufgrund dessen die trainierten Gase später wieder-erkannt werden sollen (Boeker, 2001; Heining, 1999; Stetter & Penrose, 2001).

Von uns wahrgenommene Gerüche sind meist komplexe Gasgemische aus geruchsgebenden und geruchslosen Komponenten verschiedener Stoffgruppen. Typischerweise sind geruchsge-bende Moleküle hydrophob und polar und haben eine Molekülmasse bis ungefähr 300 Dalton (Gardner & Bartlett, 1994). Für den im Laufe der Evolution entwickelten Geruchssinn haben die Gerüche Signalcharakter: Sie bieten z. B. Informationen zur Nahrungssuche (Reife), zu Feinden und zu Konkurrenten (Boeker, 2001; Stetter & Penrose, 2001). Für diese Signalmo-leküle hat sich in der Evolution eine hohe Empfindlichkeit entwickelt. So reagierte die menschliche Nase auf n-Butanol 10.000-fach empfindlicher als eine Elektronische Nase (Maricou et al., 1998). Geruchsgebende Komponenten in für uns riechbaren Gasgemischen sind häufig vergleichsweise gering konzentriert. Die für die menschliche Nase äußerst ge-ruchsintensive Abluft eines Mastschweinestalles enthielt maximal 3,2 % geruchsgebende An-teile, während die übrigen Gase geruchlos waren (Boeker, 2001).

Einleitung 25

Im Unterschied zur menschlichen Nase reagieren die Sensoren Elektronischer Nasen nicht auf einzelne Signalstoffe, sondern auf eine breite Palette von Stoffgruppen, ohne eine Unterschei-dung geruchsbildender und geruchsneutraler Komponenten (Boeker, 2001; Gardner & Bart-lett, 1994; Hatfield et al., 1994; Heining, 1999; Kuske et al., 2005). Die Reaktion Elektroni-scher Nasen auf geruchlose Gase ermöglicht dabei z. B. die Detektion von für uns nicht wahrnehmbarem, aber gefährlichem Kohlenmonoxid (Stetter & Penrose, 2001). Aufgrund des genannten Unterschiedes zum Geruchssinn, kann die Bezeichnung „Elektronische Nase“ irre-führend wirken, und es werden teilweise korrektere Begriffe wie „artificial olfaction“, „che-mical sensor arrays“, „elektronische Olfaktometrie“ oder „Chemosensorik“ vorgeschlagen (Boeker, 2001; Stetter & Penrose, 2001). Der Begriff „Elektronische Nase“ hat sich jedoch am weitesten durchgesetzt und wird deswegen auch in dieser Arbeit benutzt. Da Elektroni-sche Nasen die Gesamtheit der geruchsbildenden und geruchsneutralen Komponenten eines Gasgemisches messen und in der vorliegenden Arbeit keine Fokussierung auf geruchsbilden-de Substanzen vorlag, wird nicht der Begriff „Geruchsmessungen“, sondern „gassensorischen Messungen“ verwendet.

Es sind im Handel verschiedene Elektronische Nasen mit großen Variationen in der Bauart und in der Art und Kombination der Sensoren erhältlich. Verschiedene Autoren warnen vor der Vorstellung, es gäbe ein universelles Gerät für alle möglichen Anwendungen. Vielmehr sollte eine Elektronische Nase spezifisch auf die jeweilige Anwendung abgestimmt werden (Gardner & Bartlett, 1994; Haugen & Kvaal, 1998). Entscheidend ist dabei z. B. nicht eine möglichst hohe Sensorenzahl, sondern die Auswahl weniger und möglichst spezifischer Sen-soren (Boeker, 2004).

1.4.2 Metalloxid-Sensoren

Für Elektronische Nasen sind eine Vielzahl verschiedener Sensortypen verfügbar, von denen nur die in dieser Arbeit verwendeten Metalloxid-Sensoren (Metal Oxide Semiconductor – MOS) näher erläutert werden sollen.

Die für den Nachweis entscheidende dünne und poröse Metalloxidschicht wird auf eine kera-mische Basis aufgebracht, die temperierbar ist. Zwei Platinelektroden ermöglichen die Mes-sung von Leitfähigkeitsveränderungen bei Kontakt mit einem Probengas (Heinert, 2000; Jurs et al., 2000). Die Metalloxidschicht besteht z. B. aus Zinndioxid, Zinkoxid oder Wolframoxid und kann kleine Beimengungen katalytisch wirkender Metalle wie Platin und Palladium ent-halten (Heining, 1999; Jurs et al., 2000). Durch die Variabilität in der Zusammensetzung der Metalloxidschicht ist dieser Sensortyp vielseitig modifizierbar (Heinert, 2000).

Zu den Vorgängen, die die Messgase an der Sensoroberfläche hervorrufen, werden in der Literatur teilweise abweichende Angaben gemacht. Einigkeit herrscht darüber, dass sich zu-nächst elementarer Sauerstoff (O2) aus der als Trägergas verwendeten Luft reversibel an der Sensoroberfläche anlagert. Aufgrund seines elektronegativen Charakters entzieht der Sauer-stoff dem Halbleiter Elektronen und adsorbiert ionisch als O2

-, O- und seltener als O2- an der

26 Einleitung

Halbleiteroberfläche (Ionosorption). Durch den Entzug von Elektronen bildet sich an der Halbleiteroberfläche eine an Elektronen verarmte Schicht, und der elektrische Widerstand des Sensors steigt an (Albert et al., 2000; Eberheim, 2003; Jurs et al., 2000; Kohl, 1989). Für weitere Reaktionsmechanismen an der Sensoroberfläche existieren offenbar verschiedene Hypothesen (Albert et al., 2000). Die im Messgas enthaltenen Substanzen reagieren ihrem chemischen Charakter und Redoxzustand entsprechend mit der Sensoroberfläche und mit dem ionosorbierten Sauerstoff. Aufgrund der Vielfalt der Sensormaterialien und der Messgaskom-ponenten sind verschiedenste Reaktionsmechanismen möglich, die im Einzelfall der weiter-führenden Literatur entnommen werden können. Zum Verständnis sollen hier jedoch einige allgemeine Reaktionsmechanismen genannt werden. Oxidierende Verbindungen lagern sich mit Mechanismen an der Sensoroberfläche an, die der Ionosorption des Sauerstoffs vergleich-bar sind, und rufen eine Erhöhung des elektrischen Widerstands hervor. Neben reversiblen Adsorptionsvorgängen kann es auch zu irreversiblen Reaktionen der adsorbierten Verbindun-gen kommen.

Weniger elektronegative Substanzen mit reduzierendem Charakter können an der Sensorober-fläche adsorbieren, dabei durch Elektronenabgabe die Elektronendichte erhöhen und den elektrischen Widerstand verringern (Eberheim, 2003). Eine weitere Reaktion ist die Oxidation der Messgaskomponenten durch den ionosorbierten Sauerstoff an der Sensoroberfläche. Diese Reaktion führt zum Rückfluss von Elektronen in das Metalloxid und zu einer Verringerung des elektrischen Widerstands (Albert et al., 2000). Bei höheren Temperaturen sind über meh-rere Schritte verlaufende Reaktionen von Messgaskomponenten mit Sauerstoff aus dem Gitter des Metalloxids möglich. Auch diese Reaktionen führen zu einem verringerten elektrischen Widerstand (Eberheim, 2003).

Die für diese Arbeit wichtigen Kohlenwasserstoffe können je nach Art der Verbindung, des Sensormaterials und weiterer Bedingungen über verschiedene Redoxreaktionen bis zu CO2, H2O und CO oxidiert werden. Für Ethanol kann die Reaktion z. B. mit einer Zinnoxidober-fläche über die an das Metalloxid adsorbierte Ethoxy-Gruppe, Acetaldyd und Acetat verlau-fen. Dieser und weitere Reaktionswege verschiedener Verbindungen können der Arbeit von Kohl, 1989 entnommen werden.

Eine Übertragung von Literaturdaten auf die in dieser Arbeit verwendeten Sensoren ist nicht möglich, da die Materialien der Sensoren vom Hersteller nicht bekannt gegeben wurden.

Die Arbeitstemperatur der Metalloxid-Sensoren liegt zwischen 100°C und 600°C und wird über Erhitzen der keramischen Basis erzielt. Eine veränderte Arbeitstemperatur kann die Antwortcharakteristik eines Sensoren auf eine Verbindung entscheidend beeinflussen (Eberheim, 2003; Heinert, 2000; Heining, 1999; Jurs et al., 2000).

Aufgrund ihres oben beschriebenen Messprinzips sind Metalloxid-Sensoren generell empfind-lich für reduzierbare und oxidierbare Gase (Roth et al., 1996). Bei den für diese Arbeit wich-tigen Stoffgruppen der Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren und Akohole ist das Sensorsignal

Einleitung 27

abhängig von den funktionellen Gruppen, der Kettenlänge und der Anzahl ungesättigter Bin-dungen (Heinert, 2000).

Die Empfindlichkeit der meisten Sensoren liegt im ppm-Bereich, z. B. für NOX bei größer 0,1 ppm oder für Ammoniak und Alkohole bei größer 20 ppm (Hanrieder, 1997; Heining, 1999).

Die Angabe des Messergebnisses erfolgt üblicherweise als die Beziehung G0/G, in der G der Leitwert des Messgases und G0 der Leitwert des Nullgases (synthetische Luft, Raumluft usw.) ist (Heinert, 2000).

Nachteile von Metalloxid-Sensoren sind ihre Anfälligkeit für irreversible Bindungen an der Oberfläche und für Änderungen der Luftfeuchte (Heining, 1999; Jurs et al., 2000), auf die in den nachfolgenden Abschnitten eingegangen wird.

1.4.3 Wichtige Einflussfaktoren gassensorischer Messungen

1.4.3.1 Sensorendrift

Neben der Beschaffenheit des Sensormaterials und seiner Arbeitstemperatur können Driftef-fekte das Sensorsignal beeinflussen. Die Drift eines Messsystems ist die allmähliche Verände-rung von quantitativen Charakteristika, die für konstant gehalten werden. Die Drift sollte von „memory effects“, einer kurzzeitigen und reversiblen Veränderung der Sensorsignale durch den Einfluss zuvor gemessener Gaskomponenten, unterschieden werden. Bei Elektronischen Nasen ist die Drift des gesamten Systems von der Drift der Sensoren sehr schwer zu unter-scheiden: In den meisten Fällen beziehen sich die Autoren jedoch ausschließlich auf die Drift der Sensoren (Holmberg & Artursson, 2003). Verursacht wird die Sensordrift durch unbe-kannte Prozesse, zu denen eine nachhaltige Schädigung des Sensormaterials durch reaktive Substanzen in hohen Konzentrationen gehören kann, während bei geringen Konzentrationen schwach reaktiver Substanzen die Sensoren lange stabil arbeiten können. Reaktive Substan-zen können mit dem Sensormaterial chemische Reaktionen eingehen, die zu irreversiblen Bindungen an die Sensoroberfläche führen. Die betroffenen Bindungsstellen werden durch die Reaktion verblockt oder es werden neue Bindungsstellen mit veränderter Spezifität gebil-det. Auch eine Alterung des Sensormaterials durch abnutzungsbedingten Zerfall der chemi-schen Struktur und unbekannte Veränderungen von Umgebungsparametern (Temperatur, Druck usw.) können zur Sensorendrift beitragen (Holmberg & Artursson, 2003; Llobet, 2003).

Neben Maßnahmen zur Reduzierung von Drifteffekten wie der Regeneration der Sensoren (Holmberg & Artursson, 2003) und der Kalibrierung mit dem Trägergas (Delpha et al., 2001) können verschiedene Methoden zur Kompensation der Sensordrift eingesetzt werden, die Holmberg & Artursson (2003) erläutert haben. Messwerte von Referenzgasen oder Replikaten

28 Einleitung

der Proben werden verwendet, um Korrekturfaktoren zu ermitteln oder mit Hilfe von Model-lierungen den wahren Wert einer durch Drift veränderten Messung darzustellen.

In langfristigen Versuchsreihen können anhand der beobachteten Drift im gewählten System mathematische Modelle zur Vorhersage der Drift entwickelt werden (Stetter & Penrose, 2002).

1.4.3.2 Spezifität der Sensoren

Neben der Beschaffenheit der Sensoren und des Messsystems wird die Sensorantwort auf eine bestimmte Substanz durch ihre Parameter und Begleitparameter geprägt. Dazu zählen die Stoffmenge und die chemische Gruppierung der Substanz ebenso wie die Umgebungsgase und die Feuchte der Probe (Heinert, 2000). Um den Einfluss der Begleitparameter zu reduzie-ren, empfiehlt Heinert (2000) die Entwicklung von Sensoren mit möglichst hoher Selektivität für das Messgas und geringer Querempfindlichkeit für andere Gase. Können die Sensoreigen-schaften nicht exakt auf ein Messgas abgestimmt werden, ergeben sich durch Querempfind-lichkeiten der Sensoren unspezifische Sensorantworten. Diese bilden den „fingerprint“ eines Messgases, der aufgrund geeigneter Auswerteverfahren als Alternative zu sehr selektiven, wenig querempfindlichen Sensorsignalen durchaus erwünscht ist (Heining, 1999). Schema-tisch hat Boeker (2001) eine Summenantwort von sechs Sensoren auf ein Gemisch von fünf Gaskomponenten dargestellt. In dieser idealisierten Darstellung reagiert jeder Sensor auf die Konzentration einer einzelnen Komponente mit einem unterschiedlichen Signal (s. Abbildung 1-2).

Abbildung 1-2: Sensorreaktionen von sechs Sensoren S1 bis S6 auf verschiedene Komponenten (c1 bis c5) eines Gasgemisches (Boeker, 2001). Das Sensorsignal ist eine summierte Reaktion auf die einzelnen Messgaskompo-nenten, die entsprechend der Empfindlichkeit der Sensoren für jeden Sensor und jede Komponente unterschied-lich ist.

Einleitung 29

Die Sensorwerte können teilweise untereinander korrelieren, wenn aufgrund ihrer Queremp-findlichkeit zwei oder mehrere Sensoren auf die gleiche Substanz reagieren (Montag et al., 2001). Korrelierende Sensoren erhöhen den Informationsgehalt der Messungen nicht wesent-lich, können aber zu höheren Fehlern durch Aufsummieren des Hintergrundrauschens führen (Stetter & Penrose, 2002).

1.4.3.3 Messbereiche der Sensoren

Laut Boeker (2001) weisen reale Sensoren nicht-lineare Kennlinien auf. Diese Aussage bestä-tigen Ryan & Zhou (2003): Während bei niedrigen Konzentrationen von Einzelgasen die Da-ten verrauschen, sind die Messwerte bei hohen Konzentrationen nicht linear. Zu einem ande-ren Ergebnis kamen Delpha et al. (2001) bei Messungen von Forane R134a (1,1,1,2-Tetrafluorethan) als trockenem Gas. Hier stiegen die Ausschläge der Sensoren mit steigender Gaskonzentration annähernd linear an. In Untersuchungen verschiedener Gaskomponenten aus Milch wurden, als lineare Messbereiche der Sensoren, die Konzentrationen 5 bis 15 g/l in Wasser und 6 bis 690 ppm in Gasen ermittelt (Maricou et al., 1998).

Endgültig kann die Frage nach der Linearität der Sensorsignale mit steigenden Gaskonzentra-tionen somit nicht beantwortet werden. Für viele Gase gibt es vermutlich optimale Messberei-che, die linear verlaufen, aber für jedes Gas verschieden sind. Auch üben weitere Faktoren wie z. B. die Feuchte der Probe einen Einfluss auf die Linearität der Sensoren aus (Delpha et al., 2001).

Probleme bereiten nicht lineare Sensorsignale in der Auswertung, da Verfahren wie die PCA (Principle Component Analysis/Hauptkomponentenanalyse) oder LDA (Lineare Diskrimi-nanzanalyse) lineare Daten erfordern (Jurs et al., 2000) . Bei nicht linearen Beziehungen von Sensorsignalen und Gaskomponenten-Konzentration sind nicht lineare Auswertemethoden (z. B. Künstliche Neuronale Netze) besser geeignet (Di Francesco et al., 2001).

1.4.3.4 Die Sensorantwort auf Gasgemische und Luftfeuchte

Bei den meisten Messgasen handelt es sich um Gasgemische, in denen sich verschiedene Komponenten in ihren Sensorsignalen beeinflussen können. Zwar wird für ideale Gasgemi-sche angenommen, dass ihre Sensorantworten eine Summe der Einzelantworten sind (Boeker, 2001) und auch bei realen Sensoren gelten die Daten als schwach additiv (Heinert, 2000). Diese additiven Effekte konnten bisher aber nur für eine Reihe von Kombinationen bestätigt werden, während besonders bei Gasen in sehr verschiedenen Konzentrationen keine Auf-summierung der Einzelsignale bestätigt wurde (Ryan & Zhou, 2003). In Anwesenheit be-stimmter Komponenten wie Ethanol in Wein kann die Nachweisgrenze für andere Kompo-

30 Einleitung

nenten um das tausendfache steigen (Strike et al., 1999). In komplexen Gemischen kann es daher zu Wechselwirkungen der einzelnen Komponenten an der Sensoroberfläche kommen, die schwer zu identifizieren sind.

Auch die in dieser Arbeit untersuchten Proben unbeimpfter und beimpfter Werkstoffe zeich-neten sich durch die Abgabe komplexer Gemische aus, so dass es zu Wechselwirkungen an den Sensoroberflächen gekommen sein kann.

Eine wichtige Komponente vieler Gasgemische ist die enthaltene Feuchte. Die Feuchte wird häufig als beeinflussender Faktor der Sensorantwort auf ein Messgas genannt, wofür ver-schiedene Erklärungsansätze existieren. Heining (1999) und Strike et al. (1999) bestätigen für Metalloxid-Sensoren eine hohe Empfindlichkeit für Feuchte, bedingt durch die Querempfind-lichkeit für Luftfeuchte. González Martín et al. (1999) erklären den Einfluss der Feuchte auf die Sensoren mit der Konkurrenz von Wassermolekülen und Sauerstoff an der Sensoroberflä-che. Laut Zeppa & Gerbi (2001) werden Metalloxid-Sensoren stärker durch Feuchte im Messgas beeinflusst als die in Elektronischen Nasen ebenfalls häufig verwendeten MOSFET-Sensoren. Delpha et al. (2001) führten mit Metalloxid-Sensoren (auf Zinnoxid-Basis) verglei-chende Messungen der trockenen und feuchten Gase CO2 und Forane R134a (1,1,1,2-Tetrafluorethan) durch. Bei den Messgasen CO2 und Forane R134a veränderten sich die Sen-sorsignale durch Einleitung von Feuchte eklatant. Für trockenes CO2 wurden oxidierende Sensorantworten ermittelt, während sich feuchtes CO2 ähnlich einem reduzierendem Gas ver-hielt. Auf Forane R134a in Kombination mit Feuchtigkeit reagierten die Sensoren weniger sensitiv als auf das trockene Gas, bei niedrigen Gaskonzentrationen wurden die Sensorsignale durch die Feuchte maskiert. Auf reine feuchte Luft reagierten die Sensoren wie auf ein redu-zierendes Gas, die Sensorsignale stiegen mit steigender relativer Feuchte nichtlinear an.

Bei gassensorischen Aromamessungen unterbanden unterschiedliche Feuchtegrade die Wie-dererkennung der untersuchten Substanz, ein Training war nur bei gleicher Feuchte erfolg-reich (Roussel et al., 1999). Um den störenden Einfluss verschiedener Luftfeuchten zu mini-mieren, sollten vergleichende Untersuchungen daher bei konstanter Feuchte durchgeführt werden.

1.4.4 Die Datenauswertung mit der PCA und LDA

Messdaten Elektronischer Nasen können mit verschiedenen statistischen, multivariaten Me-thoden ausgewertet werden, die der Fragestellung und den Messbedingungen entsprechen sollten. Einen guten Überblick über diese Methoden bieten z. B. die Arbeiten von Hines et al. (2003) und Jurs et al. (2000).

In dieser Arbeit wurden zur Auswertung der Messdaten die Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis – PCA) und die Lineare Diskriminanzanalyse (Linear Discri-minant Analysis – LDA) eingesetzt. Beide Verfahren werden zur Analyse multivariater Daten

Einleitung 31

verwendet, sie setzen jedoch unterschiedliche Schwerpunkte. Die PCA ist aufgrund ihrer gra-phischen Darstellung ausgesprochen populär und anschaulich (Jurs et al., 2000). Sie dient in erster Linie einer Dimensionsreduzierung der Daten, um als Graph darstellbar zu sein (Stetter und Penrose, 2002). Dabei werden die Informationen einer mehrdimensionalen Matrix (bei Elektronischen Nasen die Signale der einzelnen Sensoren) auf ihre zwei oder drei Hauptkom-ponenten reduziert, die als 2D- oder maximal 3D-Graph abgebildet werden. Die erste Haupt-komponente enthält prozentual am meisten Information, die zweite Hauptkomponente den nächstniedrigeren Informationsgehalt und so weiter. Dabei geht man davon aus, dass die ers-ten drei Hauptkomponenten die wichtigsten Informationen des Datensatzes enthalten und die übrigen Informationen vernachlässigt werden können (Chen et al., 2000; Ingenbleek & Lemaire, 2006; Liden et al., 1998; Momol et al., 2004). Das beschriebene Verfahren führt zu einem gewissen Verlust an Information, der von Stetter & Penrose (2002) beanstandet wird.

Die PCA eignet sich vor allem zum Klassifizieren und Sortieren der Datensätze und zur Dar-stellung von Beziehungen, Verhältnissen und Zusammenhängen sowie der Trends von Daten (Jurs et al., 2000; Wold et al., 1987). Ein gutes Beispiel für die Darstellung von Trends ist der Verlauf einer Kultivierung, eines Prozesses oder einer Drift im Messsystem.

Die PCA ist in der Regel der erste Schritt einer multivariaten Datenanalyse und liefert einen Überblick über die Trends in den Daten (Wold et al., 1987).

Die anhand der PCA gewonnenen Erkenntnisse sollten zusätzlich durch weitere Auswerteme-thoden bestätigt werden (Di Francesco et al., 2001; Jurs et al., 2000).

In dieser Arbeit wurde als zusätzliche Auswertemethode die LDA ausgewählt. In der LDA wird die Distanz zwischen zwei Klassen relativ zur Variation innerhalb der Klassen berech-net. Sie liefert Auskünfte darüber, wie gut die analysierten Klassen trennbar sind. Ebenso wie die PCA sind für die LDA lineare Sensorantworten erforderlich und größere Probenanzahlen erhöhen die Sicherheit der Analyse (Jurs et al, 2000).

1.5 Fragestellungen und Kriterien dieser Arbeit

In der vorliegenden Arbeit wurden mit Mikroorganismen besiedelte Werkstoffe aus der Raumfahrttechnik mit einer Elektronischen Nase untersucht. Die Elektronische Nase war mit einem Array aus zehn Metalloxidsensoren ausgestattet, die Messdaten wurden mit der PCA (Principle Component Analysis/Hauptkomponentenanalyse) und der LDA (Lineare Diskrimi-nanzanalyse) ausgewertet.

Arbeiten anderer Autoren haben gezeigt, dass flüchtige Stoffwechselprodukte der Mikroorga-nismen sich als Indikator für eine mikrobielle Kontamination eignen können und gassenso-risch nachweisbar sind. Zur Überprüfung der Übertragbarkeit der genannten Angaben auf die in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen und Werkstoffe wurden zunächst die Mess-

32 Einleitung

ergebnisse der mikrobiell kontaminierten Werkstoffe mit denen der unkontaminierten Kon-trollen verglichen. Im folgenden Schritt wurde geprüft, ob bei den untersuchten Mikroorga-nismen artspezifische VOC nachweisbar waren wie sie bereits von anderen Autoren beschrie-ben wurden. Da der mikrobielle Stoffwechsel und die damit verbundene Abgabe flüchtiger Verbindungen entscheidend vom bewachsenen Substrat abhängen, wurden die Auswirkungen der verschiedenen Werkstoffe auf die Messergebnisse geprüft. Weitere Untersuchungen be-schäftigten sich mit Wiederfindung einzelner Arten in Mischkulturen anhand der gassensori-schen Messungen und den Auswirkungen einer veränderten Zusammensetzung einer Misch-kultur auf das VOC-Profil.

Zur Abschätzung von Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit der Elektronischen Nase wur-den Untersuchungen unbesiedelter Werkstoffkontrollen und eines Aceton-Standards durchge-führt. Die Auswahl von Aceton erfolgte aus dem Grund, dass es zu den MVOC gehört und von allen untersuchten Mikroorganismenarten gebildet wurde (EADS & UFT, 2005).

Für die Untersuchungen wurden zwei Schimmelpilzarten und zwei Bakterienarten aus einer größeren Vorauswahl von Mikroorganismen ausgewählt. Mikroorganismen für die Voraus-wahl wurden nach den folgenden Kriterien ausgewählt:

�� Nachweis an Bord von Weltraummissionen

�� Zusammenhang mit biogenen Materialschädigungen

�� Gefahr einer Einschleppung durch die Besatzung aufgrund ubiquitärer Verbreitung in der Umwelt oder Zugehörigkeit zur menschlichen Mikroflora

Die endgültige Entscheidung fiel auf die Bakterien Pseudomanas fluorescens und Bacillus polymyxa (bzw. Paenibacillus polymyxa) sowie die Schimmelpilze Penicillium expansum und Aspergillus niger. Bacillus polymyxa und Aspergillus niger sowie Pseudomanas sp. und Penicillium sp. wurden im Zusammenhang mit mikrobiellen Kontaminationen und Materialschäden auf der russi-schen Raumstation MIR nachgewiesen (Klintworth et al., 1999; Ott et al., 2004).

Pseudomanas fluorescens und Bacillus polymyxa wurden zudem aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung und ihrer Fähigkeit zu Biofilmbildung ausgewählt. Bei Bacillus polymyxa war ein weiterer ausschlaggebender Punkt die Fähigkeit zur Sporenbildung und die damit verbun-dene hohe Resistenz gegenüber dekontaminierenden Maßnahmen. Die Schimmelpilze Penicillium expansum und Aspergillus niger sind häufig an mikrobiellen Kontaminationen von Innenräumen beteiligt, können sich durch die Ausbildung von Sporen rasch ausbreiten und bei den Bewohnern Allergien auslösen.

Einleitung 33

Die Mikroorganismen wurden auf drei verschiedenen Baumaterialien bzw. Werkstoffen kulti-viert. Die Auswahl der Werkstoffe erfolgte nach den Kriterien:

�� Für die Verwendung im Innenbereich bemannter Raumstationen zugelassener Werk-stoff

�� Einsatz im Innenbereich der Internationalen Raumstation (ISS)

�� Verschiedenartige Materialeigenschaften

�� Hohe Wahrscheinlichkeit einer mikrobiellen Kontamination beim Einsatz auf der ISS

�� Relevanz für die Sicherheit an der ISS

Bei den ausgewählten Werkstoffen handelte es sich um beschichtetes Aluminium (Werk-stoff 1), Aluminium (Werkstoff 4) und durchsichtiges Polycarbonat (Werkstoff 5). Werk-stoff 1 ist auf der ISS an den Vorderseiten der eingebauten Schränke verbaut und kommt dort ständig in Kontakt mit der Besatzung und mit Nährstoffgrundlagen wie Staub. Unter ungüns-tigen Bedingungen kann es zu einem Wachstum von Mikroorganismen an den Kondensati-onspunkten der Feuchtigkeit aus der Luft kommen. Werkstoff 4 wurde für die Rückseiten der Schränke verwendet. In den geschlossenen Schränken herrscht eine geringe Luftzirkulation, bei der sich kondensierte Feuchtigkeit aus der Luft ansammeln kann. Kommt es zusätzlich zu Verunreinigungen mit Staub oder ähnli-chem ist die Ausbildung von Biofilmen auf dem Werkstoff möglich. Werkstoff 5 wurde u. a. für Aufbewahrungsbehälter und Navigationsfenster verwendet. Bei den Behältern kann eine mikrobielle Besiedlung ähnliche Ursachen haben, wie sie bereits für Werkstoff 4 beschrieben wurden, während bei den Navigationsfenstern die Gründe mit denen für Werkstoff 1 be-schriebenen vergleichbar sind.

Für die Messungen mit der elektronischen Nase wurde ein Messaufbau entwickelt, der die folgenden Kriterien erfüllte:

�� Ausschluss störender Umgebungsgase („Fremdgerüche“)

�� Inerte Materialien (keine Absorption und spätere Desorption von Fremdgasen)

�� Sterilisierbare, zur Kultivierung der Mikroorganismen auf den Werkstoffen geeignete Messkammer

�� Konstanz von Druck, Feuchte und Zusammensetzung des Trägergases (synthetische Luft)

Der aufgrund der genannten Kriterien entwickelte Messaufbau wird im Abschnitt XX vorge-stellt.

34 Einleitung

In der vorliegenden Arbeit wurde lediglich ein Teil der in dem F&E-Vorhaben „Material für Langzeitanwendung im Weltraum MLA V – Mikrobiologie“ von mir durchgeführten Unter-suchungen vorgestellt. Die Gründe für diese Auswahl liegen vor allem in größeren analyti-schen Problemen in der ersten von zwei Versuchsphasen, die in einem gesonderten Kapitel zu dem Projekt erläutert werden sollen (s. Anhang 1). Die in dieser Arbeit vorgelegten und dis-kutierten Erkenntnisse der zweiten Versuchsphase decken sich jedoch weitgehend mit denen der ersten, vernachlässigten Versuchsphase oder den Ergebnissen anderer Autoren. Die sehr gestraffte Darstellung der Ergebnisse aus der ersten Versuchsphase im Anhang führt daher nicht zu einem Verlust wichtiger Informationen.

Material und Methoden 35

2 Material und Methoden

2.1 Gassensorik .................................................................................................................. 36 2.1.1 Elektronische Nase....................................................................................... 36 2.1.1.1 Aufbau.......................................................................................................... 36 2.1.1.2 Steuerung ..................................................................................................... 37 2.1.1.3 Messsequenz ................................................................................................ 39 2.1.1.4 Software für die Verarbeitung von Text, Daten und Bildern....................... 40 2.1.2 Messaufbau .................................................................................................. 42 2.1.2.1 Material für den Messaufbau ....................................................................... 42 2.1.2.2 Beschreibung des Messaufbaus ................................................................... 43 2.1.3 Messkammern für die Inkubation und Messung.......................................... 44 2.1.3.1 Material zum Vorbereiten der Messkammern ............................................. 44 2.1.3.2 Vorbereitung der Messkammern.................................................................. 44

2.2 Aceton-Standard ........................................................................................................... 45 2.2.1 Material für Aceton-Standard ...................................................................... 45 2.2.2 Vorbereitung und Messung des Aceton-Standards...................................... 45

2.3 Untersuchung unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe ............................................. 46 2.3.1 Werkstoffe.................................................................................................... 46 2.3.1.1 Eigenschaften der Werkstoffe...................................................................... 46 2.3.1.2 Vorbereitung der Werkstoffe ....................................................................... 47 2.3.2 Besiedlung der Werkstoffe mit Mikroorganismen ...................................... 47 2.3.2.1 Material für die Besiedlung ......................................................................... 47 2.3.2.2 Besiedlung.................................................................................................... 48 2.3.3 Probenplan ................................................................................................... 50

2.4 Literaturrecherche......................................................................................................... 51


2.1 Gassensorik

2.1.1 Elektronische Nase

2.1.1.1 Aufbau

Die Elektronische Nase ENO-1 wurde konzipiert, zusammengestellt und geliefert von RST Rostock System-Technik GmbH, Rostock. Eine schematische Übersicht der Elektronischen Nase beinhaltet Abbildung 2-1. Das Gerät enthält als wesentliche Bestandteile eine Fluidik zur Gasleitung, eine Anreicherungseinheit und eine Sensorzelle.

Abbildung 2-1: Übersicht des Gesamtaufbaus und der Fluidik der Elektronischen Nase ENO-1 (RST, 2003). Linkes Modul mit Nullgaseingang und Sensorzelle, mittleres Modul mit der Anreicherungseinheit und rechtes Modul mit Referenz- und Probeneingang sowie Pumpen und Ventilen für eine mögliche Probenverdünnung.

Die Anreicherungseinheit kann bei sehr gering konzentrierten Gasgemischen verwendet wer-den. In den hier beschriebenen Versuchen wurde die Anreicherungseinheit nicht eingesetzt und soll daher nicht näher erläutert werden. Die Sensorzelle enthält zehn Sensoren, jeweils bestehend aus einem Keramikträger, einem Platinheizer und einer Halbleiterbeschichtung.


Die halbleitenden Beschichtungen setzen sich zusammen aus Zinndioxid, Wolframtrioxid oder Zinkoxid mit verschiedenen katalysierenden Zusätzen wie z. B. Platin oder Palladium. Bei einer Empfindlichkeit für ein bestimmtes Gasgemisch reagiert die Metalloxid-beschichtung mit einer Änderung des elektrischen Widerstandes, die als Messsignal verarbei-tet wird. Reduzierende Gase verringern den Widerstand der Sensoren, bei oxidierende Gasen erhöht sich ihr elektrischer Widerstand. Die für die Elektronische Nase ENO-1 verwendete Größe ist der elektrische Leitwert (G), der den reziproken Wert des elektrischen Widerstands (R) darstellt (� G = R-1). Den Nullwert eines Sensors bildet der elektrische Leitwert des Nullgases (G0), den Messwert der elektrische Leitwert des Messgases (G). Die Messergeb-nisse werden als das Verhältnis G0/G ausgedrückt und werden in dieser Arbeit als der „relative Leitwert“ bezeichnet. Für das Nullgas ergibt sich aus dem Verhältnis G0/G der Wert „1“, auf den die Sensoren vor jeder Messung kalibriert werden. Die Sensorreaktion auf redu-zierende Gase führt zu Werten G0/G < 1, die Sensorreaktion auf oxidierende Gase zu Werten G0/G > 1.

Abhängig von ihrer Zusammensetzung reagieren die einzelnen Metalloxid-Sensoren auf be-stimmte gasförmige Stoffe besonders empfindlich. Auch die Temperatur, mit der ein Sensor betrieben wird, kann die Empfindlichkeit eines Sensors beeinflussen. Die charakteristischen Eigenschaften der verwendeten Sensoren wie Hauptselektivität, Konzentrationsbereich und die eingesetzte Betriebstemperatur sind in Tabelle 2-1 aufgeführt.

2.1.1.2 Steuerung

Zur Steuerung wurde die Elektronische Nase ENO-1 durch einen Rechner (Intel Pentium 4) mit den üblichen Ein- und Ausgabegeräten, den Server SDMS 1.2.3 und die Software Benose (RST Rostock System-Technik GmbH) ergänzt. Der SDMS-Server ermöglicht die Verbin-dung zur Hardware und das Arbeiten in Netzwerken, die Software Benose dient der Steuerung der Elektronischen Nase ENO-1, der Aufnahme der Messdaten und der Datenauswertung. Die Bedienung von Server und Software erfolgte laut Handbuch (RST, 2003).


Tabelle 2-1: Charakteristische Eigenschaften der in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Metall-oxid-Sensoren (Infomaterial RST Rostock System-Technik GmbH), mit der Empfindlichkeit der einzelnen Sen-soren für bestimmte Verbindungen und Stoffgruppen, Konzentrationsbereichen und Betriebstemperaturen. Bei reduzierender Wirkung verringert sich durch die betreffende Verbindung der Sensorwiderstand bei oxidierender Wirkung erhöht sich der Sensorwiderstand (vgl. 1.4.2).

Sensor- nummer

Sensor-bezeich-

nung

Standard-betriebs-

temperatur [°C]

Haupt-selektivität

Konzen-trations-bereich

Querempfindlichkeit

1 C2-1 350 BTX-Aromate 10 ppm – 1 Vol-%

Lösungsmittel, z. B. Alkohole (reduzierend)

2 S5 350 Stickstoff-Oxide, Ozon (oxidier-end)

5 ppb – ppm –

Bereich

Kohlenwasserstoffe breitbandig (reduzierend); Blausäure, Ammoniak (oxidierend)

3 C2-3 400 Ammoniak 1 ppm – 1 Vol-%

BTX-Aromate (reduzierend)

4 S6 450 Wasserstoff 1 ppm – 1 Vol-%

Sehr selektiv, kaum querempfindlich

5 C2-5 450 Alkane, BTX-Aromate

10 ppm – 4 Vol-%

Spezielle nicht bekannt

6 S1 400 Methan, Propan usw.

10 ppm – 4 Vol-%

Breitbandig fast alle KW (reduzierend)

7 W1 400 Chlorverbin-dungen (oxidierend)

1 ppm – 1 Vol-%

Organische Schwefelverbindun-gen (reduzierend); Ozon, Stickstoff-Oxide (oxidierend)

8 S2 350 Kohlen-monoxid, Alkohole

1 ppm – 10 Vol-%

Aromatische Kohlenwasser-stoffe (BTX), Lösungsmittel, z. B. Aceton (reduzierend)

9 W2 500 Schwefel-wasserstoff

500 ppb – 100 ppm

BTX-Aromate (reduzierend)

10 S3 400 Alkane (Methan, Propan, Butan, Hexan)

10 ppm – 4 Vol-%

Schwefeldioxid (stark reduzie-rend); sonst sehr selektiv, kaum querempfindlich

Abbildung 2-2 bietet einen Gesamteindruck des Messplatzaufbaus mit Steuerungseinheiten, Elektronischer Nase ENO-1, Messkammern sowie der Geräte zur Vorbehandlung und Regu-lierung des Trägergases.


Abbildung 2-2: Kompletter Messplatz von rechts nach links: Druckregulierung und -kontrolle der syntheti-schen Luft mit einem Druckreduzierer und Digitalbarometer; Reinigung und Befeuchtung der synthetischen Luft mit Aktivkohle und A. bidest.; Messkammern für Nullwert und Probe; Elektronische Nase ENO-1; PC-Einheit zur Steuerung und Auswertung.

2.1.1.3 Messsequenz

Für alle in dieser Arbeit vorgenommenen Messungen wurde die in Tabelle 2-2 dargestellte Messsequenz verwendet. Sie umfasste drei Messungen und sechs Spülschritte jeweils mit anschließender Kalibrierung der Sensoren.

Tabelle 2-2: Für jeweils einen Messvorgang an der Elektronischen Nase ENO-1 vorgenommene Einstellun-gen.

Schritt Vorgang Zeit [s] Kalibrierung Gasfluss [ml/min] Gaseingang

1 Spülen 120 ja 200 Nullgas


3 Messung 1 60 nein 50 Referenzgas







Aus technischen Gründen wurde statt des Probeneingangs (s. Abbildung 2-1) der Referenz-eingang für die Messungen verwendet. Die Fluidik des Probeneingangs wurde vom Hersteller so eingerichtet, dass vor der Messung Spülgas aus dem Probeneingang in die Messkammer geblasen wird, das die Messung verfälschen würde. Diese Spülmethode ist nur für Messungen geeignet, bei denen kein geschlossenes Gefäß angeschlossen wird.


2.1.1.4 Software für die Verarbeitung von Text, Daten und Bildern

Die für diese Arbeit eingesetzten Microsoft-Programme gehören zu dem Windows Professio-nal 2000 Office Paket. Zur Textverarbeitung wurde MS Word verwendet. Die Messdaten wurden laut Herstellerangaben in Excel-Daten transformiert und mit MS Excel bearbeitet. Mittelwerte und Standardabweichungen wurden mit MS Excel ermittelt und graphisch darge-stellt. Weitere statistische Auswertungen (Varianzanalyse, Sequenzanalyse, Diskriminanz-analyse [LDA] und Hauptkomponentenanalyse [PCA]) wurden mit SPSS 12 und mit Benose offline (RST Rostock System-Technik GmbH) durchgeführt. Für die Auswertung wurde jeweils der Messwert der letzten Sekunde der Messungen eingesetzt (vgl. Abbildung 2-3).

[G0/G

]

Abbildung 2-3: Beispiel für ein Messprofil der Elektronischen Nase ENO-1. Die Messung von 1 ppm Aceton am Messtag A (vgl. 2.2.2) wurde mit der in Tabelle 2-2 dargestellten Messsequenz durchgeführt. Auf der x-Achse ist die Zeit in Sekunden aufgetragen, die y-Achse stellt den relativen Leitwert G0/G dar. Die verschie-den farbigen Linien stehen für die Messsignale der Sensoren 1 bis 10. Vor jeder Messung wurden die Sensoren auf den Wert „1“ kalibriert, nach der jeweiligen Messung wurde mit Nullgas gespült. Deutlich erkennbar ist der Anstieg der Sensorsignale bei jeder der drei Messungen des Aceton-Standards und ihr langsamer Rückgang in den anschließenden Spülphasen. Die senkrechte grüne und rote Linie markiert den ausgewerteten Messbereich der ersten Messung.

[s]

Für den Aceton-Standard und die unbeimpften Kontrollen von Werkstoff 1 wurde eine uni-variate Varianzanalyse in SPSS 12 (nach Bühl & Zöfel, 2005) vorgenommen. Als Maß für die Reproduzierbarkeit der Messdaten wurde die Signifikanz der Einzelmessung im Test der Zwischensubjekteffekte verwendet. Bei einem Wert kleiner als 0,05 wurde der Einfluss der Einzelmessung (des Messtages) als signifikant angesehen. „Ausreißer-Messtage“ beim Ace-ton-Standard wurden mit dem Post-Hoc-Test (Mehrfachvergleiche, Scheffé) ermittelt. Mess-tage mit signifikanten Abweichungen der Sensorwerte (Signifikanz < 0,05) von mehr als 75 % der gesamten Messtage wurden als Ausreißer angesehen.

Zur Überprüfung von zeitabhängigen, abgestuften Folgen in den Messdaten des Aceton-Standards wurde eine Sequenzanalyse in SPSS 12 nach Angaben von Bühl & Zöfel (2005) vorgenommen. Eine hohe asymptotische Signifikanz (Werte gegen 1) wurde als hohe Wahr-


scheinlichkeit einer zufälligen Reihenfolge von Ergebnissen der einzelnen Sensoren an den untersuchten Messtagen gewertet. Bei niedriger asymptotischer Signifikanz wurde davon aus-gegangen, dass die Reihenfolge der Ergebnisse nicht zufällig verteilt war und die Sensorwerte zeitabhängig beeinflusst waren. Diese Analyse wurde für die Kontrollen von Werkstoff 1 nicht durchgeführt, da die Anzahl der Messtage für diese Form der Auswertung nicht aus-reichte.

Die lineare und quadratische Diskriminanzanalyse (LDA und QDA) der Messdaten des Ace-ton-Standards und der Proben wurde in SPSS 12 vorgenommen. Die Diskriminanzanalyse wird als chemometrische Methode zur Bestimmung von Unterschieden multivariater Mess-daten verwendet. Sie wurde nach den Angaben von Bühl & Zöfel (2005) durchgeführt. Die Klassifikation wurde mit Fallauslassung vorgenommen. Um die Qualität der Klassifizierung zu überprüfen, wurden die Ergebnisse der Diskriminanzanalyse kreuzvalidiert. Für die LDA wurde die Kovarianzmatrix innerhalb der Gruppen gewählt, die QDA wurde mit gruppenspe-zifischer Kovarianzmatrix bestimmt. Da die Ergebnisse von LDA und QDA annähernd iden-tisch waren, wurde zur besseren Vergleichbarkeit ausschließlich die LDA im Ergebnisteil dargestellt und in der Diskussion erläutert.

Für die Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis - PCA) wurde die Soft-ware Benose offline (RST Rostock System-Technik GmbH) verwendet. Die Auswertung er-folgte nach den Vorgaben des Herstellers im Handbuch (RST, 2003). Dabei wurden im ersten Schritt Musterdateien aus den Messwerten erstellt, im zweiten Schritt aus den Musterdateien Klassen gebildet, die im dritten Schritt in der PCA ausgewertet wurden. Die Prozentangaben an den Achsen der PCA-Diagramme zeigen den Informationsgehalt der jeweiligen Haupt-komponente an. Die Software sieht keine automatische Überprüfung der Klassifizierungsergebnisse vor, wie sie für die LDA anhand der Kreuzvalidierung vorgenommen wurde. Daher wurde für den Aceton-Standard die Evaluierung der Daten mit der Hälfte der Datensätze per Hand durchge-führt. Die Datensätze der Kontrollen und Proben waren für eine Halbierung zu klein und konnten daher nicht auf die Qualität der Klassifizierungsergebnisse überprüft werden.

Die in Benose erstellten PCA-Diagramme wurden mit Paint (Windows / Zubehör) weiterver-arbeitet.

Fotos wurden mit einer Digitalkamera aufgenommen und mit Adobe Fotoshop Elements 2.0 bearbeitet.


2.1.2 Messaufbau

2.1.2.1 Material für den Messaufbau

1) Synthetische Luft (bestehend aus 79% Stickstoff und 21 % Sauerstoff) 2) Druckregler (Porter Instrument Co. Inc., Hartfield, PA, USA; Modell 8311) 3) Digitalbarometer (Greisinger electronic, Regenstauf; GDH 12 AN) 4) Kapillarschläuche (Teflon, WICOM GmbH, Heppenheim; WIC33106), gebördelt, ver-

schiedene Längen 5) Schlauchanschlüsse (PCTFE, Hamilton, Reno, Nevada, USA; 249986) mit Unterleg-

scheibe „Washer“ (Edelstahl, Hamilton, Reno, Nevada, USA; 400683) 6) Y-Verbindung (KEL-F, Hamilton, Reno, Nevada, USA; 32814) 7) Adapter Eigenentwicklung und Eigenbau aus PCTFE-Vollstab von Hofmeister & Mein-

cke, Bremen 8) Gerade Verschraubungen (Nylon, swagelok; NY-6M0-6) oder Schlauchverbinder

(PA/PP; Wille GmbH, Bremen; 140.01) 9) Gaswaschflaschen (DURAN-Glas, Rettberg GmbH, Göttingen; 112570201), modifizier-

te Anschlüsse mit angesetzten Glasrohren (6 x 1,5 mm) a) mit Aktivkohle (pelletiert; Bartels + Rieger, Köln; C 40/1, Art.-Nr. 000266) b) mit A. bidest.

10) Messkammern (Eigenentwicklung): a) Kristallisationsschalen (DURAN-Glas; Schott; 2131354; H: 75 mm, AD: 140 mm)

mit Planschliff an der oberen Öffnung und seitlich angesetzten Glasrohren (6 x 1,5 mm)

b) Glasperlen (Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe; Art. Nr. A557, 2,85 - 3,3 mm)

c) Glasblöcke (Sorvall, Newton, Connecticut, USA; Cat. 45457, 50 x 50 x 9 mm)

d) Deckel aus Spiegelglas (D: 5 mm) mit Bohrungen (Ausführung: H. Lorenz und Rettberg GmbH, Göttingen) für Schrauben (Nylon; H.C. Schmidt, Bremen; Zylin-derschrauben M4 x 20, Unterlegscheiben M4, Sechskantmuttern M4)

11) Jodzahlkolben (DURAN-Glas; Omnilab; 9.012014) und Gaswaschflaschenaufsatz (DURAN-Glas; Omnilab; 9.110348), modifizierte Anschlüsse mit angesetzten Glasroh-ren (6 x 1,5 mm), gekürztes Belüftungsrohr

12) Kupplungen (KEL-F; Hamilton; 32800 bzw. R88800) 13) Luer-Anschlüsse männlich (KEL-F; Hamilton; 32835) 14) Sterilfilter (PTFE; Millipore; SLFG025LS, Porengröße 0,2 μm) 15) Luer-Anschlüsse weiblich (KEL-F; Hamilton; 32834)


2.1.2.2 Beschreibung des Messaufbaus

Alle Bestandteile des Messaufbaus, die mit dem Null- und Probengas in Berührung kamen, waren aus inerten Materialien gefertigt. Dadurch sollte eine hohe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse erzielt werden. Ein Überblick des Messaufbaus ist in Abbildung 2-4 darge-stellt.

Abbildung 2-4: Messaufbau von rechts nach links: Die Zufuhr der synthetischen Luft wird mit einem Druck-regler (2) geregelt und mit einem Digitalbarometer (3) kontrolliert. Anschließend wird sie in einem Aktivkohle-filter (9a) gereinigt und mit A. bidest. (9b) befeuchtet. Eine der Messkammern (10) dient unbefüllt als Nullwert, während die zweite Messkammer mit A. bidest. und einer Probe beschickt wird. Von den Messkammern aus gelangt das Null- und Probengas zur Elektronischen Nase ENO-1. Die detaillierten Beschreibungen der numme-rierten Elemente befinden sich im Abschnitt 2.1.2.1.

Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Messungen wurde synthetische Luft als Nullgas und als Trägergas für die Proben eingesetzt. Die synthetische Luft (1) wurde mit einem Druck von 2,5 bar der Hausleitung entnommen und mit einem Druckreduzierer auf 50 bis 60 mbar Überdruck geregelt (2, 3). Da die synthetische Luft eine Verunreinigung mit Kohlenwasserstoffen enthielt, wurde sie über einen Aktivkohlefilter gereinigt (9). Im An-schluss wurde die vollkommen trockene synthetische Luft auf Empfehlung von RST Rostock System-Technik angefeuchtet (9). Die gereinigte und angefeuchtete synthetische Luft wurde durch die Messkammern zur Elektronischen Nase geleitet. Für das Nullgas wurde eine Mess-


kammer mit Glasperlen und Glasblock verwendet. Die Vorbereitung der Proben-Messkammer wird in den Abschnitten 2.1.3, 2.3.1.2 und 2.3.2 erläutert.

2.1.3 Messkammern für die Inkubation und Messung

2.1.3.1 Material zum Vorbereiten der Messkammern

�� Alufolie

�� Verschließbare Glasgefäße (Weckgläser oder Bechergläser mit Alufolie)

�� Pinzette

�� Messzylinder

�� A. bidest.

Aus Abschnitt 2.1.2.1:

�� 10) Messkammern mit Zubehör

�� 14) Sterilfilter

�� 13) und 15) Luer-Anschlüsse

2.1.3.2 Vorbereitung der Messkammern

Für die Inkubation der unbesiedelten und besiedelten Werkstoffproben wurden die Mess-kammern sowie Materialien und Geräte sterilisiert, die mit dem Gasinnenraum der Mess-kammern in Berührung kommen konnten. Hierfür wurden die Messkammern mit 150 ml Glasperlen und je einem Glasblock befüllt, an den seitlichen Glasrohren mit Alufolie ver-schlossen und mit dem Glasdeckel zugedeckt. Im Anschluss wurden die Messkammern min-destens drei Stunden bei 180°C in trockener Hitze sterilisiert.

Schlauchverbinder, Adapter und Luer-Anschlüsse wurden zusammengebaut, in verschlosse-nen Glasgefäßen bei 121°C autoclaviert und danach im Trockenschrank getrocknet.

Die nachfolgenden Arbeitsschritte wurden unter der Sterilarbeitsbank mit sterilen Gerätschaf-ten durchgeführt.

Schlauchverbinder mit Adapter und Luer-Anschlüssen wurden mit den Sterilfiltern zusam-mengesteckt und auf den Glasrohren der Messkammern befestigt. Die Messkammern wurden mit 50 ml A. bidest. befüllt und geschlossen für weitere Arbeitsschritte aufbewahrt (s. 2.3.1.2 und 2.3.2).


2.2 Aceton-Standard

2.2.1 Material für Aceton-Standard

�� A. bidest.

�� Aceton (puriss. p.a., Fluka 00570)

�� Glasstopfen

Aus Abschnitt 2.1.2.1:

�� 11) Jodzahlkolben mit Gaswaschflaschenaufsatz

2.2.2 Vorbereitung und Messung des Aceton-Standards

Für den Aceton-Standard wurde Aceton in Jodzahlkolben mit 50 ml A. bidest. auf Endkon-zentrationen von 1 ppm und 5 ppm verdünnt. Jeder Ansatz wurde verschlossen für 10 min äquilibriert und anschließend mit der Elektronischen Nase gemessen (s. 2.1.1.3). Je Konzent-ration wurden drei Parallelen gemessen. Die Messung der Aceton-Standards wurde nach den Messungen der Werkstoff-Mikroorganismen-Ansätze (s. 2.3) und einer 30minütigen Spülung der Elektronischen Nase durchgeführt.

Neben den in dieser Arbeit vorgestellten Proben wurden im selben Zeitraum weitere Proben und somit auch weitere Aceton-Standards gemessen. Die dadurch zusätzlich gewonnenen Daten für den Aceton-Standard wurden in die Auswertung einbezogen. Die Messtage wurden alphabetisch fortlaufend mit den Großbuchstaben A bis U bezeichnet.


2.3 Untersuchung unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe

2.3.1 Werkstoffe

2.3.1.1 Eigenschaften der Werkstoffe

Als zu besiedelnde Oberflächen wurden drei verschiedene Werkstoffe eingesetzt. Es handelt sich dabei um Baumaterialien für die Internationale Raumstation ISS, wie sie von EADS Space Transportation, Bremen verwendet werden. Aus anfangs sechs unterschiedlichen Werkstoffen wurden für die vorliegende Arbeit drei Werkstoffe ausgewählt, die in Tabelle 2-3 näher beschrieben werden.

Bei den Werkstoffen W1 und W4 handelte es sich um anodisiertes Aluminium, W1 wurde zusätzlich mit einem Korrosionsschutz und weißem Polyurethan beschichtet. Der Werkstoff W5 ist ein Plexiglas-ähnliches durchsichtiges Kunststoffmaterial aus Polycarbonat.

Proben der Werkstoffe wurden im Format 80 x 80 x 1,5-2 mm von EADS Space Transporta-tion, Bremen zur Verfügung gestellt.

Tabelle 2-3: Beschreibung der mikrobiell besiedelten und mit der Elektronischen Nase untersuchten Werk-stoffe W1, W4 und W5.

Werkstoff Kürzel Material Oberflächenbehandlung

1 W1 Aluminium anodisiert; Beschichtung mit chromhaltigem Korrosions-

schutz und Decklack aus weißem Polyurethan 4 W4 Aluminium anodisiert

5 W5 Polycarbonat keine


2.3.1.2 Vorbereitung der Werkstoffe

Material zum Vorbereiten der Werkstoffe

�� 2-Propanol, 60 %ig (vv) in A. bidest.

�� Ultraschallbad (Bandelin RK 106; 35 kHz)

�� Sterile Glaspetrischale

Durchführung

Für die Untersuchung mit der Elektronischen Nase und die Besiedlung mit Mikroorganismen wurden die Werkstoffe desinfiziert. Die Arbeiten erfolgten unter sterilen Bedingungen an der Sterilarbeitsbank. Die Werkstoffe wurden 5 min in 60 %igem 2-Propanol mit Ultraschall be-handelt, 5 min abgetropft und nochmals 5 min in Propanol mit Ultraschall behandelt. An-schließend trockneten sie mindestens zwei Stunden und wurden danach drei Tage in einer geschlossenen Petrischale aufbewahrt, um restliches Propanol abdampfen zu lassen.

Die desinfizierten und abgedampften Werkstoffe wurden in die vorbereiteten Messkammern auf die Glasblöcke (s. 2.1.3) gelegt. Der nächste Schritt war die Besiedlung der Werkstoffe (s. 2.3.2). Als Kontrollen vorgesehene Werkstoffe wurden nicht weiter behandelt und bis zur Messung mit der Elektronischen Nase parallel zu den besiedelten Proben drei Tage bei 23°C inkubiert.

2.3.2 Besiedlung der Werkstoffe mit Mikroorganismen

2.3.2.1 Material für die Besiedlung

1. Mikroorganismen (Bezugsquelle: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [DSM], Braunschweig)

�� Aspergillus niger (DSM 872)

�� Bacillus polymyxa (DSM 36) (neuere Bezeichnung: Paenibacillus polymyxa)

�� Penicillium expansum (DSM 1282)

�� Pseudomonas fluorescens (DSM 50090)


2. Medien und Lösungen

�� Nähragar (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH

[DSM], Braunschweig - Media: Nr. 1 – Nutrient Agar)

�� Kartoffel-Glucose-Agar (Fluka BioChemika - 70139)

�� Hefeextraktlösung 2% (w/v) mit 0,004 % Bromthymolblau, pH 7,0

�� Stammlösung Bromthymolblau 0,04 % (w/v) (Bast, 2001)

�� Citrat-Phosphat-Puffer nach McIlvaine, pH 6,4 (Bast, 2001)

�� Phosphat-Puffer nach Sörensen, pH 7,2 (Bast, 2001)

�� bidest.

�� 10 %-ige Tween 80-Lösung (w/v)

3. Labormaterial und -geräte

�� gestopfte Glaspipetten

�� gestopfte Pasteurpipetten

�� Glasspatel

�� Pinzetten

�� Erlenmeyerkolben (50 ml)

�� Messzylinder (20 ml)

�� Einmalküvetten, unsteril (Plastibrand, 2,5 ml, makro; Cat. No. 759005)

�� Photometer (Shimadzu; Spectrophotometer UV-120-02)

�� Zentrifuge (Beckman Avanti CentrifugeTM J-25; Rotor Ja 20)

�� Verschließbare, autoclavierbare Zentrifugenröhrchen (Nalgene)

2.3.2.2 Besiedlung

Alle Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen mit sterilisierten Geräten und Materialien an der Sterilarbeitsbank durchgeführt.

Als Vorkulturen wurden Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens auf Nähragar drei Tage bei 23°C kultiviert. Die Vorkulturen von Aspergillus niger und Penicillium expansum wurden auf Kartoffel-Glucose-Agar sieben Tage bei 23°C inkubiert.

Die vorkultivierten Bakterien wurden mit einem Spatel entnommen und in ca. 20 ml Phos-phat-Puffer suspendiert. Von den Vorkulturen der Schimmelpilze wurden mit 1 bis 2 ml Citrat-Phosphat-Puffer Sporen abgeschwemmt und in ca. 20 ml Citrat-Phosphat-Puffer sus-


pendiert. Bei stärkerer Aggregation der Zellen oder Sporen wurde Tween 80 in einer Endkon-zentration von 0,1-0,2 % zugegeben und die Suspension kräftig durchmischt.

Zur Bestimmung der Zellmasse wurde photometrisch bei 660 nm die Trübung der Zell- und Sporensuspensionen gegen Puffer als Nullwert ermittelt. Anhand von vorher erstellten und auf die Trockenmasse bezogenen Eichreihen (Bast, 2001) wurden Verdünnungen mit einer Trockenmasse von 1 x 10-5 g/ml hergestellt. Für die Mischkulturen wurden in Vorversuchen von Dipl.-Biol. Heide Grafe, UFT, geeignete Mischungsverhältnisse ermittelt. Die Trocken-massen der Animpfsuspensionen sind in Tabelle 2-4 dargestellt.

Tabelle 2-4: Trockenmassen der Animpfsuspensionen für die Bakterien- und Pilzdominierten Mischproben in g/ml.

Trockenmasse in der Animpfsuspension [g/ml]

Bakteriendominierte Mischprobe

Pilzdominierte Mischprobe

Aspergillus niger - 3,3 x 10-6

Bacillus polymyxa 3,3 x 10-6 1,5 x 10-6

Penicillium expansum 1,0 x 10-7 1,0 x 10-7

Pseudomonas fluorescens 3,3 x 10-9 -

Das für die Besiedlung benötigte Volumen wurde bei 13.000 RPM (20442 RCF) und 4°C für 10 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in dem gleichen Vo-lumen Hefeextraktlösung (2 %ig mit Bromthymolblau) resuspendiert. Mit einem Glasspatel wurde 1 ml der Suspension auf dem Werkstoff in der vorbereiteten Messkammer (s. 2.1.3.2 und 2.3.1.2) verteilt.

Die Mikroorganismen wurden bei 23°C kultiviert und nach drei Tagen mit der Elektronischen Nase untersucht. Der Farbumschlag des Indikators Bromthymolblau diente der Überprüfung des Zellwachstums. Bei Ansäuerung färbte sich das Medium gelb (v. a. bei den Schimmelpil-zen, zeitweise bei Bacillus polymyxa), eine pH-Verschiebung zum Alkalischen führte zu ei-nem blauen Farbumschlag (v. a. bei Pseudomonas fluorescens, zeitweise bei Bacillus polymy-xa).

Eine auf Werkstoff 1 gewachsene Kultur von Aspergillus niger zeigt Abbildung 2-5.


Abbildung 2-5: Messkammer mit Aspergillus niger auf Werkstoff 1.

2.3.3 Probenplan

Eine Übersicht der besiedelten Proben und der parallel dazu untersuchten Kontrollen ist in Tabelle 2-5 dargestellt. Die in dieser Arbeit verwendeten Kürzel für die Kombinationen der Werkstoffe und Mikroorganismen können der Tabelle 2-6 entnommen werden.


Tabelle 2-5: Untersuchte Kombinationen der Mikroorganismenkulturen mit den Werkstoffproben 1, 4 und 5 sowie dazu gehörige Kontrollen.

Werkstoff 1 Werkstoff 4 Werkstoff 5 Aspergillus niger X - - Kontrolle X - - Bacillus polymyxa X X X Kontrolle X X X Penicillium expansum X X X Kontrolle X X X Pseudomonas fluorescens X - - Kontrolle X - - Bakteriendominierte Mischprobe X - - Kontrolle X - - Pilzdominierte Mischprobe X - - Kontrolle X - -

Tabelle 2-6: Kürzel der untersuchten Kombinationen von Werkstoffen und Mikroorganismen.

Werkstoff 1 Werkstoff 4 Werkstoff 5 Aspergillus niger W1An - - Bacillus polymyxa W1Bp W4Bp W5Bp Penicillium expansum W1Pe W4Pe W5Pe Pseudomonas fluorescens W1Pf - - Bakteriendominierte Mischprobe W1MB - - Pilzdominierte Mischprobe W1MP - - Kontrolle W1K W4K W5K

2.4 Literaturrecherche

Ein Teil der verwendeten Literatur wurde in einer umfangreichen Recherche, die im Rahmen des F&E-Projektes „Material für Langzeitanwendung im Weltraum, MLA V – Mikrobiolo-gie“ durchgeführt wurde, gewonnen. Der Abschlussbericht des Projektes enthält eine ausführ-liche Dokumentation der verwendeten Schlagwörter und Schlagwortkombinationen sowie der durchsuchten Datenbanken und Fachzeitschriften (EADS & UFT, 2005).

Der überwiegende Teil der weiteren Literatur wurde ebenfalls durch Schlagwortsuche in der Datenbank BIOSIS, im Katalog der Staats- und Universitätsbibliothek Bremen und der Such-maschine GOOGLE recherchiert. Ein geringerer Anteil wurde aufgrund von Literaturverwei-sen gewonnen.


Ergebnisse 53

3 Ergebnisse

3.1 Messgenauigkeit ........................................................................................................... 54 3.1.1 Aceton-Standard .......................................................................................... 54 3.1.1.1 Reproduzierbarkeit der Sensorwerte............................................................ 54 3.1.1.2 Quantitative Bestimmung von Aceton......................................................... 56 3.1.1.3 Drift der Sensorwerte................................................................................... 60 3.1.2 Kontrollen von Werkstoff 1 ......................................................................... 63 3.1.3 Zusammenfassung........................................................................................ 64

3.2 Vergleich unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe.................................................... 65 3.2.1 Allgemeines ................................................................................................. 65 3.2.2 Werkstoff 1 (beschichtetes Aluminium)...................................................... 65 3.2.3 Werkstoff 4 (anodisiertes Alumium) ........................................................... 69 3.2.4 Werkstoff 5 (Polycarbonat).......................................................................... 70 3.2.5 Zusammenfassung........................................................................................ 71

3.3 Vergleich der Mikroorganismen-Arten ........................................................................ 73 3.3.1 Allgemeines ................................................................................................. 73 3.3.2 Vergleich der Arten...................................................................................... 73 3.3.3 Zusammenfassung........................................................................................ 78

3.4 Vergleich der Werkstoffe ............................................................................................. 79 3.4.1 Allgemeines ................................................................................................. 79 3.4.2 Unbesiedelte Kontrollen .............................................................................. 80 3.4.3 Besiedlung mit Bacillus polymyxa............................................................... 81 3.4.4 Besiedlung mit Penicillium expansum......................................................... 82 3.4.5 Zusammenfassung........................................................................................ 84

3.5 Vergleich von Reinkulturen und Mischkulturen .......................................................... 86 3.5.1 Allgemeines ................................................................................................. 86 3.5.2 Bakteriendominierte Mischkultur ................................................................ 87 3.5.3 Pilzdominierte Mischkultur ......................................................................... 88 3.5.4 Zusammenfassung........................................................................................ 89

3.6 Vergleich der Mischkulturen........................................................................................ 90 3.7 Kernaussagen der Ergebnisse ....................................................................................... 91

54 Ergebnisse

3.1 Messgenauigkeit

3.1.1 Aceton-Standard

3.1.1.1 Reproduzierbarkeit der Sensorwerte

Die Mittelwerte der über einen Zeitraum von 136 Tagen verteilten 21 Messtage wurden mit-einander verglichen und auf ihre signifikanten Unterschiede überprüft (vgl. Abbildung 3-1 und Abbildung 3-2). Die daraus errechnete Messgenauigkeit der einzelnen Sensoren ist in Tabelle 3-1 wiedergegeben. Die Verlaufsdiagramme für die Mittelwerte und Standardabwei-chungen der einzelnen Sensoren bei beiden Acetonkonzentrationen befinden sich im An-hang 2.

Tabelle 3-1: Messgenauigkeit der zehn in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Sensoren bei Mes-sung des Aceton–Standards (1 ppm und 5 ppm in A. bidest.). Bei den eingeklammerten Prozentzahlen lagen die Messwerte sehr nah am Nullwert der Sensoren.

Sensor Nr. Aceton- Standard 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 ppm 92 72 97 95 97 87 (85) 99 (53) (80) 5 ppm 89 65 89 100 100 89 (91) 98 (68) (83)

Messgenauigkeit [%]

beide 91 69 93 98 99 88 (88) 99 (61) (82)

Die Messgenauigkeit der Sensoren bei der Messung des Aceton-Standards mit 1 ppm Aceton in A. bidest. lag zwischen 53 % bei Sensor Nr. 9 und 99 % bei Sensor Nr. 8. Bei einer Aceton-Konzentration von 5 ppm bewegte sich die Messgenauigkeit zwischen 65 % bei Sen-sor Nr. 2 und 100 % bei Sensor Nr. 4 und 5. Im Durchschnitt beider Konzentrationen lag die Messgenauigkeit zwischen 61 % bei Sensor Nr. 9 und 99 % bei Sensor Nr. 5 und 8.

Die durchschnittliche Messgenauigkeit war bei den Sensoren 4, 5 und 8 höher als 95 %. Der Messfehler bewegte sich bei den Sensoren 4, 5 und 8 damit unter 5 %. Bei den Sensoren Nr. 1 und 3 lag die durchschnittliche Messgenauigkeit zwischen 90 und 95 %. Die durchschnittliche Messgenauigkeit der Sensoren Nr. 6, 7 und 10 lag zwischen 80 und 90 %. Mit Werten zwi-schen 60 und 70 % war die Messgenauigkeit der Sensoren Nr. 2 und 9 am niedrigsten.

Insgesamt betrug die durchschnittliche Messgenauigkeit aller Sensoren bei der Messung des Aceton-Standards in den Konzentrationen 1 ppm und 5 ppm in A. bidest. 87 %. Das bedeutet, dass im Durchschnitt 13 von 100 Messungen signifikant von ihrem Sollbereich abwichen.

Bei Sensor 8 handelt es sich um den einzigen Sensor des Arrays, für den ausdrücklich eine Querempfindlichkeit für Aceton angegeben wurde (vgl. Tabelle 2-1). Die vergleichsweise gute Messgenauigkeit von Sensor 8 kann daher in der Empfindlichkeit für Aceton begründet sein.

Ergebnisse 55

Aceton-Standard - 5 ppm - Sensor Nr. 2

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U

Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Abbildung 3-1: Exemplarische Darstellung eines Verlaufsdiagramms für den Aceton-Standard mit der Kon-zentration 5 ppm. Dargestellt sind als Beispiel für eine eher geringe Messgenauigkeit die Mittelwerte der 21 Messtage A bis U von Sensor Nr. 2 der Elektronischen Nase ENO-1. Die gesamten Verlaufsdiagramme für die Konzentrationen 1 und 5 ppm Aceton befinden sich im Anhang 2.


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Abbildung 3-2: Exemplarische Darstellung eines Verlaufsdiagramms für den Aceton-Standard mit der Kon-zentration 5 ppm. Dargestellt sind als Beispiel für eine hohe Messgenauigkeit die Mittelwerte der 21 Messtage A bis U von Sensor Nr. 8 der Elektronischen Nase ENO-1. Der Sensor 8 ist querempfindlich für Aceton, zeigt jedoch niedrigere Reaktionen auf Aceton als Sensor 2 (vgl. Abbildung 3-1).

56 Ergebnisse

Mit der univariaten Varianzanalyse wurden die Messdaten des Aceton-Standards auf eine signifikante Abweichung einzelner Messtage überprüft. Bei einer Konzentration von 1 ppm Aceton war der Einfluss des Messtages auf das Messergebnis bei allen Sensoren signifikant. Bei der Aceton-Konzentration 5 ppm übte der Messtag lediglich bei Sensor 4 keinen Einfluss auf das Messergebnis aus. Die durchgeführten Messungen des Aceton-Standards müssen da-her trotz standardisierter Bedingungen als nicht reproduzierbar angesehen werden.

Mit einer Auswertung des im Zuge der univariaten Varianzanalyse ebenfalls durchgeführten Post Hoc-Tests (Mehrfachvergleiche) sollten Ausreißer der Messwerte ermittelt werden. Eindeutige Ausreißer waren die Messtage D (Sensor 7), H (Sensor 2) und J (Sensor 9). Die Messtage H und J sind auch in der PCA als abweichende Werte deutlich erkennbar (vgl. Abbildung 3-8 und Abbildung 3-9).

Die oben beschriebene mangelhafte Reproduzierbarkeit ist damit nicht allein auf Ausreißer bei den Messwerten zurückzuführen, da auch die Sensoren betroffen waren, bei denen keine Ausreißer vorkamen. Auf verschiedene weitere Beeinträchtigungen der Reproduzierbarkeit von Messwerten Elektronischer Nasen wird in der Diskussion eingegangen.

3.1.1.2 Quantitative Bestimmung von Aceton

Die Unterscheidbarkeit zweier Aceton-Konzentrationen wurde überprüft, indem die Mittel-werte der Messungen des Aceton-Standards mit der Konzentration 1 ppm und 5 ppm ver-glichen wurden. Bei allen Sensoren außer Sensor Nr. 4, 7 und 10 waren die Mittelwerte des 1 ppm Aceton-Standards und des 5 ppm Aceton-Standards signifikant verschieden (Abbildung 3-3).

Die Messdaten des Aceton-Standards wurden mit der PCA ausgewertet. Die Klassifizierung durch die PCA wurde mit nicht einbezogenen Messdaten des Aceton-Standards überprüft, um die Richtigkeit und Zuverlässigkeit der Analyse zu bestätigen. Ohne eine solche Überprüfung kann es zu einer subjektiven, häufig zu positiven Interpretation des Ergebnisses kommen (Jurs et al., 2000). Näher wird auf wichtige Punkte in der Datenauswertung mit der PCA in der Diskussion eingegangen (s. 4.2.6).

Per Losverfahren wurde die Hälfte der Messdaten der jeweiligen Aceton-Konzentration für die Klassifizierung mit der PCA ausgewählt. Die verbleibende zweite Hälfte der Messdaten wurde für die Überprüfung der Analyse verwendet. Die genaue Auflistung der für die Klassi-fizierung und Evaluierung verwendeten Datensätze befindet sich im Anhang 3.

In der Analyse wurden die Aceton-Konzentrationen (1 ppm und 5 ppm) miteinander vergli-chen. Zusätzlich wurden die Messdaten der Kontrollen von Werkstoff 1 analysiert und über-prüft, um von dem Standard komplett verschiedene Proben in die Analyse einzubeziehen.

Ergebnisse 57

Aceton-Standard

0,1

1

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

1 ppm5 ppm

0,9

0,95

1

1,05

7 9 10

Abbildung 3-3: Deutliche Trennung der Konzentrationen 1 ppm und 5 ppm Aceton in A. bidest (Mittelwerte) durch die Sensoren 1, 2, 3, 5, 6 und 8 der Elektronischen Nase ENO-1. In der großen Abbildung ist der relative Leitwert in logarithmischer Skalierung dargestellt, während die kleine Abbildung die sehr niedrigen Messwerte bei Sensor 7, 9 und 10 in numerischer Skalierung zeigt.

Nach Auswertung der Messdaten mit der PCA waren die Cluster der zwei untersuchten Kon-zentrationen des Aceton-Standards deutlich unterscheidbar (Abbildung 3-4). In der Überprü-fung konnten für 1 ppm Aceton 81 % der ausgewählten Messdaten korrekt zugeordnet wer-den, für 5 ppm Aceton lag die Wiederfindung bei 86 %.

58 Ergebnisse

Aceton-Standard1 ppm


Kontrollen von Werkstoff 1

Abbildung 3-4: PCA zum Vergleich von Messdaten der Aceton-Standards (1 ppm und 5 ppm) mit Werkstoff 1. Die qualitative und quantitative Verschiedenheit der zwei untersuchten Acetonkonzentrationen und der Werk-stoffkontrollen ist erkennbar. Die Güte der Klassifizierung, bzw. Trennung wurde mit nicht klassifizierten Daten überprüft. Die rote Kugel signalisiert einen überprüften Messwert. Der überprüfte Messwert (W1, Kontrolle III) befindet sich außerhalb der Cluster – die Überprüfung der korrekten Klassifizierung ist damit negativ. Bei einer positiven Überprüfung liegt die rote Kugel in dem entsprechenden Cluster. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Aceton-Standard 1 ppm; �: Aceton-Standard 5 ppm)

Somit war eine Unterscheidung und eine Zuordnung der eingesetzten Aceton-Konzentratio-nen mit einer PCA möglich. Die Wiederfindung war bei der höheren Aceton-Konzentration geringfügig besser, parallel zu einer teilweise niedrigeren Standardabweichung bei 5 ppm Aceton (vgl. Abbildung 3-3). Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die Konzentration einer flüchtigen Verbindung die Zuverlässigkeit ihrer Klassifizierung beeinflusst.

Eine Standardreihe könnte hier Aufschluss darüber geben, wie die Sensoren auf verschiedene Konzentrationen der Substanz reagieren und ob die Reaktionen der einzelnen Sensoren auf die gewählte chemische Verbindung z. B. linear verlaufen oder nicht. Für derartige Aussagen reichen die hier beschriebenen Ergebnisse jedoch nicht aus.

Ergebnisse 59

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

12

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10

Funktion 1

Funk

tion

2

Kontrollen von Werkstoff 1


Aceton-Standard 5 ppm

Abbildung 3-5: LDA von Messwerten des Aceton-Standards (1 ppm und 5 ppm) und der Kontrollen von Werkstoff 1. Die qualitative und quantitative Trennbarkeit von Aceton-Standard (in 1 ppm und 5 ppm) und Kon-trollen des Werkstoffes 1 ist erkennbar an der Verteilung der Werte der Diskriminanzfunktion. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Aceton-Standard 1 ppm; �: Aceton-Standard 5 ppm)

Die quantitative Bestimmbarkeit von Aceton konnte zusätzlich durch eine lineare Diskrimi-nanzanalyse bestätigt werden. Wie bei der PCA wurde eine Diskriminanzanalyse von beiden Aceton-Konzentrationen im Vergleich zu den Kontrollen von Werkstoff 1 durchgeführt. SPSS bietet in der LDA die Möglichkeit zur Kreuzvalidierung der Ergebnisse. Dabei handelt es sich um die Überprüfung der Klassifizierungsergebnisse mit nicht analysierten Datensätzen wie weiter oben für die PCA beschrieben. Anders als bei der PCA wurde jeder Messwert einzeln in einer Klassifizierung mit allen übrigen Messwerten überprüft. Bei der linearen Diskrimi-nanzanalyse waren die drei Gruppen (Aceton-Standard 1 ppm und 5 ppm sowie Werkstoff 1) höchst signifikant voneinander trennbar, in der Kreuzvalidierung wurden 99,8 % der Werte (Fälle) der korrekten Gruppe zugeordnet.

Somit war anhand der Messdaten auch hier eine qualitative und quantitative Zuordnung des Aceton-Standards möglich (Abbildung 3-5).

60 Ergebnisse

3.1.1.3 Drift der Sensorwerte

Um eine häufig in der Literatur erwähnte alterungsbedingte Drift der Sensoren als Fehlerquel-le zu überprüfen, wurden Messungen des Aceton-Standards über einen längeren Zeitraum durchgeführt. Der Standard wurde in den Konzentrationen 1 ppm und 5 ppm in A. bidest. gemessen. Über einen Zeitraum von 136 Tagen wurden in unregelmäßigen Abständen 21 Messungen des Aceton-Standards durchgeführt. Die Messwerte der einzelnen Messtage wurden gemittelt und als Verlauf dargestellt (Abbildung 3-6 und Abbildung 3-7). Weder bei 1 ppm noch bei 5 ppm war eine eindeutige Drift der einzelnen Sensoren erkennbar.


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Messung

Aceton-Standard - 1 ppm

Sensor 1Sensor 2Sensor 3Sensor 4Sensor 5Sensor 6Sensor 7Sensor 8Sensor 9Sensor 10

Abbildung 3-6: Ergebnisse von Untersuchungen zum Driftverhalten der Sensoren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1 bei Messungen des Aceton-Standards (1 ppm). Die Untersuchungen wurden 21 mal wiederholt, die einzelnen Messtage wurden mit den Buchstaben A bis U gekennzeichnet.

Bei vielen Sensoren waren jedoch abgestufte Folgen von Werten zu beobachten. Daher wurde eine Sequenzanalyse der Daten durchgeführt, mit der die Zufälligkeit der Reihenfolge über-prüft werden kann. Die Sequenzanalyse ergab lediglich für die Sensoren 8 und 9 eine eher zufällige Reihenfolge der Messwerte. Die Schwankungen der Werte bei den übrigen Sensoren waren nach der Sequenzanalyse nicht zufällig verteilt und können trotz standardisierter Mess-bedingungen durch zeitabhängige unbekannte Faktoren beeinflusst gewesen sein.

Ergebnisse 61


0

0,5

1

1,5

2

2,5R

elat

iver

Lei

twer

t G0/G

Messtage

Aceton-Standard - 5 ppm

Sensor 1Sensor 2Sensor 3Sensor 4Sensor 5Sensor 6Sensor 7Sensor 8Sensor 9Sensor 10

Abbildung 3-7: Ergebnisse von Untersuchungen zum Driftverhalten der Sensoren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1 bei Messungen des Aceton-Standards (5 ppm). Die Untersuchungen wurden 21 mal wiederholt, die einzelnen Messtage wurden mit den Buchstaben A bis U gekennzeichnet.

Mit der für die Darstellung von Verläufen sehr gut geeigneten PCA lassen sich die Sequenzen der Messwerte zeigen. Dazu wurden in der PCA erkennbar zusammenhängende Folgen von Messtagen als Cluster (Phasen) zusammengefasst (Abbildung 3-8 und Abbildung 3-9). Bei 1 ppm Aceton konnten drei über den Messzeitraum verteilte Cluster ermittelt werden. Phase 1 beinhaltet die Messtage A bis G, Phase 2 die Messtage H bis P und Phase 3 die Messtage Q bis U. Währenddessen waren bei 5 ppm Aceton zwei Cluster zu unterscheiden. Die Messwer-te teilten sich auf in die Phase 1 mit den Messtagen A bis G und Phase 2 mit den Messtagen I bis U. Anhand des Aceton-Standards ließ sich damit eine vom Zeitpunkt abhängige Sequenz in den Messwerten nachweisen, eine eindeutig in eine Richtung weisende Drift ließ sich da-gegen nicht bestätigen.

62 Ergebnisse

Abbildung 3-8: PCA der Messtage A bis U von 1 ppm Aceton in A. bidest. Die Auswertung zeigt einen zeitab-hängigen Verlauf der Messwerte in drei Clustern (Phase 1 bis 3). Eine eindeutige Drift ist dagegen nicht erkenn-bar.

Abbildung 3-9: PCA der Messtage A bis U von 5 ppm Aceton in A. bidest. Die Auswertung zeigt einen zeitab-hängigen Verlauf der Messwerte in zwei Clustern (Phase 1 und 2). Eine eindeutige Drift ist wie bei 1 ppm Aceton nicht erkennbar. Die Messtage H und J wurden nicht berücksichtigt, da es sich um „Ausreißer“ handelt (vgl. 3.1.1.1).

Ergebnisse 63

3.1.2 Kontrollen von Werkstoff 1

Über den Zeitraum von 133 Tagen wurden in unregelmäßigen Abständen sechs Messungen der Kontrollen von Werkstoff 1 durchgeführt (Abbildung 3-10). Die Mittelwerte der einzel-nen Messtage wurden miteinander verglichen und auf ihre signifikanten Unterschiede über-prüft. Die daraus errechnete Messgenauigkeit der einzelnen Sensoren ist in Tabelle 3-2 darge-stellt. Die Messgenauigkeit bewegte sich zwischen 55 % bei den Sensoren 5, 6 und 8 und 100 % bei den Sensoren 1, 3, 4 und 10. Somit lagen alle Messungen der Sensoren 1, 3, 4 und 10 im Messbereich. Bei einer Messgenauigkeit von 78 % lagen die Sensoren 7 und 9, während die Messgenauigkeit von Sensor Nr. 2 61 % betrug.

Werkstoff 1

0,1

1

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor-Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Kontrolle I

0,9

0,92

0,94

0,96

0,98

1

1,02

7 9 10

Kontrolle IIKontrolle IIIKontrolle IVKontrolle VKontrolle VI

Abbildung 3-10: Die Messgenauigkeit der verschiedenen Sensoren zeigt erkennbare Unterschiede besonders bei den Sensoren 2, 5, 6 und 8. Vergleich der Sensorsignale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Kontrollen I bis VI von Werkstoff 1. In der großen Abbildung ist der relative Leitwert in logarithmischer Skalierung dargestellt, während die kleine Abbildung die sehr niedrigen Messwerte bei Sensor 7, 9 und 10 in numerischer Skalierung zeigt.

Die niedrigste Messgenauigkeit trat mit 55 % bei den Sensoren 5, 6 und 8 auf. Damit wären 45 von 100 Messungen signifikante Abweichungen vom Sollwert.

Im Durchschnitt betrug die Messgenauigkeit aller Sensoren 78 %. Damit würden 22 von 100 Messungen signifikant vom Sollbereich abweichen.

64 Ergebnisse

Tabelle 3-2: Messgenauigkeit der zehn in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Sensoren nach 6-maliger Messung der unbeimpften Kontrollen von Werkstoff 1. Bei den eingeklammerten Prozentzahlen lagen die Messwerte sehr nah am Nullwert der Sensoren.

Sensor Nr. Kontrollen von Werkstoff 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Messgenauigkeit [%]

100 61 100 (100) 55 55 (78) 55 (78) (100)

Die Messdaten der Kontrollen von Werkstoff 1 wurden mit der univariaten Varianzanalyse auf eine signifikante Abweichung einzelner Messtage überprüft. Der Einfluss des Messtages auf das Messergebnis erwies sich bei allen Sensoren außer Sensor 1 als signifikant. Die Mes-sungen der unbesiedelten Kontrollen von Werkstoff 1 müssen daher wie schon die Messungen des Aceton-Standards trotz standardisierter Bedingungen als nicht reproduzierbar angesehen werden.

Aufgrund der geringen Reproduzierbarkeit wurde die Wiederfindung der Kontrollen von Werkstoff 1 nach einer Auswertung mit der PCA überprüft. Die Überprüfung wurde vorge-nommen wie bereits in 3.1.1.2 erläutert. Eine Hälfte der Messdaten wurde für die PCA ver-wendet, während die zweite Hälfte zur Überprüfung verwendet wurde (vgl. Abbildung 3-4). Eine Auflistung der Aufteilung der Messdaten befindet sich im Anhang 3. Die Überprüfung ergab eine korrekte Klassifizierung von 70 % der nicht ausgewerteten und damit unbekannten Daten. Bei weitgehend standardisierten Messungen der unbesiedelten Proben von Werkstoff 1 konnten damit 30 % der mit der PCA analysierten Daten nicht wiedergefunden werden.

3.1.3 Zusammenfassung

In dem vorangegangenen Abschnitt wurde die Messgenauigkeit der Elektronischen Nase ENO-1 anhand der Reproduzierbarkeit wiederholter Messungen von Aceton-Standards und unbesiedelter Werkstoffkontrollen analysiert. Die Sensordrift als Einflussgröße auf die Re-produzierbarkeit und die Konzentrationsabhängigkeit der Sensorsignale wurde anhand der Aceton-Standards untersucht.

Die Auswertung der Messdaten von Aceton-Standards und unbesiedelter Kontrollen des Werkstoffs 1 ergab eine geringe Reproduzierbarkeit der Messmethodik trotz weitgehender Maßnahmen zur Standardisierung. Die in den nachstehenden Abschnitten dargestellten Er-gebnisse können aufgrund der für den Aceton-Standard und die Kontrollen von Werkstoff 1 erläuterten geringen Reproduzierbarkeit der Messungen lediglich als Trends angesehen wer-den. Die Reproduzierbarkeit der Messmethode kann durch die Drift der Sensorleitwerte beeinträchtigt werden. Messungen des Aceton-Standards ergaben zwar keine eindeutige Drift der Sensorwerte in eine bestimmte Richtung, es wurden jedoch Veränderungen der Messwerte

Ergebnisse 65

beobachtet, die auf zeitabhängige Variationen hinweisen. Die Konzentration des eingesetzten Aceton-Standards führte zu Unterschieden der Sensorsignale in ihrer Höhe und Genauigkeit.

Die hier untersuchten Einflüsse und weitere die Reproduzierbarkeit beeinflussende Faktoren werden in Abschnitt 4.2 näher beleuchtet.

3.2 Vergleich unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe

3.2.1 Allgemeines

Die unbesiedelten Kontrollen der Werkstoffe wurden mit den besiedelten Proben anhand ihrer Messwerte sowie ausgewertet als PCA verglichen (s. Tabelle 3-3 auf S. 72). Zur Auswertung wurden jeweils die letzten zwei Messpunkte der Messungen verwendet. Als Vergleichswerte dienten alle über den Versuchszeitraum gemessenen unbesiedelten Kontrollen des jeweiligen Werkstoffs. Außerdem wurde die Unterscheidbarkeit der besiedelten Proben von unbesiedel-ten Kontrollen mit der LDA geprüft (vgl. Bühl & Zöfel, 2005).

Die Grafiken zu Mittelwerten und Standardabweichungen können im Anhang 2 eingesehen werden.

3.2.2 Werkstoff 1 (beschichtetes Aluminium)

Aspergillus niger

Der Vergleich der Mittelwerte der Kontrollen von Werkstoff 1 und der mit dem Schimmelpilz Aspergillus niger besiedelten Proben ergab nur für die Sensoren Nr. 2 und Nr. 9 signifikant verschiedene Werte. Insgesamt unterschieden sich bei sieben der zehn Sensoren die Mittel-werte, diese Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Dennoch ließen sich mit der PCA die Daten in zwei Clustern teilen (Abbildung 3-11). Somit waren die Messwerte der Kontrol-len und der mit Aspergillus niger besiedelten Proben von Werkstoff 1 trotz geringer signifi-kanter Unterschiede mit Hilfe der PCA unterscheidbar.

Die Berechnung mit der LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für unbesiedelten und mit Aspergillus niger besiedelten Werkstoff 1. In der Kreuzvalidierung wurden 97,6 % der Datensätze korrekt eingruppiert.

66 Ergebnisse

Abbildung 3-11: Untersuchung einer mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) anhand von Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von unbesiedelten Kon-trollen und mit Aspergillus niger besiedelten Proben von Werkstoff 1 zeigt gut erkennbare Unterschiede zwi-schen nicht kontaminiertem und kontaminiertem Werkstoff. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Aspergillus niger auf Werkstoff 1)

Bacillus polymyxa

Beim Vergleich der Mittelwerte der unbesiedelten Kontrollen und der mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben von Werkstoff 1 unterschieden sich sieben Sensorwerte, drei Sensorwerte (Nr. 2, 7, 9) waren signifikant unterschiedlich. Hier ließen sich in der PCA Kontrollen und besiedelte Proben von Werkstoff 1 deutlich trennen (Abbildung 3-12).

Abbildung 3-12: Anhand von Messungen mit der elektronischen Nase nachgewiesene mikrobielle Kontamina-tion von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). Die PCA von Messdaten der unbesiedelten Kontrollen und mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben von Werkstoff 1 verdeutlicht die Unterschiede zwischen nicht konta-minierten und kontaminierten Werkstoffproben. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1)

Ergebnisse 67

Die LDA ergab ein gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen. Die Datensätze von unbesiedelten Kontrollen und mit Bacillus polymyxa besiedeltem Werk-stoff 1 wurden in der Kreuzvalidierung zu 100 % korrekt eingeordnet.

Penicillium expansum

Nach einer Besiedlung von Werkstoff 1 mit Penicillium expansum unterschieden sich acht der zehn Sensorsignale von den Kontrollen. Signifikant waren diese Differenzen bei den Senso-ren 2, 7 und 9. Mit der PCA ergab sich eine klare Trennung der unbesiedelten und besiedelten Proben (Abbildung 3-13).

In der LDA wurde ein gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für unbesiedelte Kon-trollen und mit Penicillium expansum besiedelte Proben von Werkstoff 1 ermittelt. 100 % der Datensätze wurden in der Kreuzvalidierung richtig klassifiziert.

Abbildung 3-13: Mikrobielle Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Penicillium expansum be-siedelter Proben von Werkstoff 1 zur Darstellung der Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontami-nierten Werkstoffen. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 1)

Pseudomonas fluorescens

Für mit Pseudomonas flourescens besiedelte Proben des Werkstoffs 1 ergaben sich sieben von den Kontrollen unterscheidbare Mittelwerte der Sensorsignale. Signifikant verschieden waren auch hier die Werte der Sensoren 2, 7 und 9. In der PCA waren die Cluster der Kontrollen und besiedelten Proben deutlich voneinander getrennt (Abbildung 3-14).

Die LDA ergab für die Datensätze der unbesiedelten Kontrollen und der mit Pseudomonas fluorescens besiedelten Proben von Werkstoff 1 eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanz-funktion und ein korrekte Klassifizierung von 100 % in der Kreuzvalidierung.

68 Ergebnisse

Abbildung 3-14: Untersuchung der mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mt die Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Pseudomonas fluorescens besiedelter Proben von Werkstoff 1 macht die Unterschiede zwischen unkontaminierten und konta-minierten Werkstoffen deutlich.(�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Pseudomonas fluorescens auf Werkstoff 1)

Bakteriendominierte Mischkultur

Kontrollen von Werkstoff 1 und mit der bakteriendominierten Mischkultur besiedelte Proben wiesen in Ihren Mittelwerten Unterschiede bei neun Sensoren auf. Signifikant waren diese Unterschiede bei den Sensoren 2, 6, 7 und 9. Auch hier waren die Cluster von Kontrollen und besiedelten Proben in der PCA klar trennbar (Abbildung 3-15).

Abbildung 3-15: Nachweis der mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit der bakteriendomi-nierten Mischkultur besiedelter Proben von Werkstoff 1 stellt die Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffen dar. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Bakteriendominierte Mischkultur auf Werkstoff 1)

Anhand der LDA wurde eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion und in der Kreuzvalidierung eine korrekte Zuordnung für 97,6 % der Datensätze unbesiedelter Kontrol-

Ergebnisse 69

len und der mit der bakteriendominierten Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1 ermittelt.

Pilzdominierte Mischkultur

Die Mittelwerte der Kontrollen und der mit der pilzdominierten Mischprobe besiedelten Pro-ben von Werkstoff 1 unterschieden sich bei sechs Sensoren. Die Werte von Sensor Nr. 2 und Nr. 9 waren signifikant verschieden. Dennoch waren sie in der PCA klar voneinander trenn-bar (Abbildung 3-16).

Abbildung 3-16: Mit der Elektronischen Nase ENO-1 untersuchte mikrobielle Kontamination von beschichte-tem Aluminium (Werkstoff 1). Die PCA der Messwerte der unbesiedelten Kontrollen 1 und der mit der pilzdo-minierten Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1 belegt die Unterschiede zwischen unkontaminierten und kontaminierten Werkstoffen. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Pilzdominierte Mischkultur auf Werk-stoff 1)

Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die unbesiedelten Kontrollen und die mit der pilzdominierten Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1. In der Kreuzvalidierung wurden 99,2 % der Datensätze korrekt klassifiziert.

3.2.3 Werkstoff 4 (anodisiertes Alumium)

Bacillus polymyxa

Die Mittelwerte der Kontrollen von Werkstoff 4 und der mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben waren bei neun Sensoren verschieden, nur bei Sensor Nr. 4 und Nr. 10 waren die Un-terschiede nicht signifikant. In der PCA waren die Cluster von Kontrollen und besiedelten Proben sehr deutlich voneinander unterscheidbar (Abbildung 3-17).

70 Ergebnisse

In der LDA ergab sich für die unbesiedelten Kontrollen und mit Bacillus polymyxa besiedelte Proben von Werkstoff 4 eine deutliche Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die bei-den Gruppen. In der Kreuzvalidierung wurden 100 % der Datensätze korrekt eingeordnet.

Abbildung 3-17: Mikrobielle Kontaminationen von anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA von Messwerten der unbesiedelten Kontrollen sowie der mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelten Proben des Werkstoffs 4 zeigt die Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffproben. (�: Kontrollen von Werkstoff 4; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 4; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 4)


Mit Penicillium expansum besiedelte Proben und Kontrollen von Werkstoff 4 waren bei acht Sensoren verschieden, bei den Sensoren 2, 7 und 9 waren diese Differenzen signifikant. Die Cluster besiedelter Proben und unbesiedelter Kontrollen waren in der PCA klar voneinander getrennt (Abbildung 3-17).

Die Auswertung mit der LDA ergab für die beiden Gruppen eine deutliche Trennfähigkeit und in der Kreuzvalidierung eine korrekte Klassifizierung von 100 % der Fälle.

3.2.4 Werkstoff 5 (Polycarbonat)

Bacillus polymyxa

Auf Werkstoff 5 unterschieden sich die Mittelwerte von Bacillus polymyxa und unbesiedelten Kontrollen bei allen Sensoren außer Nr. 10. Mit Ausnahme von Sensor 4 waren alle Unter-schiede signifikant. Mit Hilfe der PCA ließen sich die Cluster von besiedelten Proben und unbesiedelten Kontrollen sehr gut trennen (Abbildung 3-18).

Ergebnisse 71

In der LDA ergab sich eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden un-tersuchten Gruppen. Es wurden 100 % der Fälle in der Kreuzvalidierung korrekt zugeordnet.

Abbildung 3-18: Untersuchungen zum Nachweis mikrobieller Kontaminationen von Polycarbonat (Werk-stoff 5) mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte von unbesiedelten Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelten Proben des Werkstoffes 5 zur Darstellung der Unter-schiede zwischen unkontamierten und kontaminierten Werkstoffen. (�: Kontrollen von Werkstoff 5; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 5; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 5)


Die Kontrollen von Werkstoff 5 und die mit Penicillium expansum besiedelten Werkstoffe waren bei allen Sensoren außer Nr. 4 und Nr. 10 verschieden. Die Unterschiede waren nur bei Sensor Nr. 8 nicht signifikant. In der PCA ließen sich die Kontrollen und die besiedelten Pro-ben sehr eindeutig voneinander unterscheiden (Abbildung 3-18).

Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die zwei Gruppen sowie eine korrekte Klassifizierung von 100 % der Fälle in der Kreuzvalidierung.


In der Summe ließen sich alle besiedelten Werkstoffproben von den zugehörigen unbesiedel-ten Kontrollen nach einer Auswertung mit der PCA unterscheiden (vgl. Tabelle 3-3). Bei Werkstoff 1 war die Anzahl der signifikanten Unterschiede der Sensorsignale insgesamt ge-ringer als bei den Werkstoff 5 und mit Bacillus polymyxa besiedeltem Werkstoff 4. Dennoch waren besiedelte Proben und Kontrollen von Werkstoff 1 in der PCA gut trennbar.

Mit Penicillium expansum besiedelter Werkstoff 4 wies eine vergleichbare Anzahl signifikan-ter Unterschiede zur Kontrolle auf wie bei einer Besiedlung von Werkstoff 1. Die Unterschie-

72 Ergebnisse

de waren dagegen sowohl bei besiedeltem Werkstoff 5 als auch bei mit Bacillus polymyxa besiedeltem Werkstoff 4 deutlich höher.

Diese höhere Anzahl signifikanter Unterschiede spiegelte sich in der Trennbarkeit der Cluster in der PCA wider, die bei den letztgenannten Proben sehr gut war.

Tabelle 3-3: Übersicht der Unterscheidbarkeit von unbesiedelten Kontrollen und besiedelten Werkstoffpro-ben. Werkstoff 1 wurde mit allen in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen und Mischkulturen besiedelt, während auf den Werkstoffen 4 und 5 nur Bacillus polymyxa und Penicillium expansum kultiviert wurden. (W1: Werkstoff 1; W4: Werkstoff 4; W5: Werkstoff 5; K: Kontrollen; An: Aspergillus niger; Bp: Bacillus polymyxa; Pe: Penicillium expansum; Pf: Pseudomonas fluorescens; MB: Bakteriendominierte Mischkultur; MP: Pilzdominierte Mischkultur.)

unterscheidbare Sensoren signifikant unterscheidbare Sensoren

Trennbarkeit in der PCA

Vergleich Kontrollen / besiedelte

Proben 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr

gut gut

W1 K/An X X X X X X X X X X

K/Bp X X X X X X X X X X X

K/Pe X X X X X X X X X X X X

K/Pf X X X X X X X X X X X

K/MB X X X X X X X X X X X X X X

K/MP X X X X X X X X X

W4 K/Bp X X X X X X X X X X X X X X X X X X

K/Pe X X X X X X X X X X X X

W5 K/Bp X X X X X X X X X X X X X X X X X

K/Pe X X X X X X X X X X X X X X X X

In der Auswertung mit der LDA konnte für alle beschriebenen Kombinationen eine gute Trennung von unbesiedelten Kontrollen und besiedelten Werkstoffen nachgewiesen werden. Die Qualität der Klassifizierung in der LDA wurde anhand der Kreuzvalidierung überprüft und war in allen Fällen gut oder bestmöglich.

Einzelne Kombinationen von unbesiedelten und mit Mikroorganismen bewachsenen Werk-stoffen konnten anhand mit der PCA und der LDA ausgewerteter Messdaten der Elektroni-schen Nase ENO-1 in allen Fällen voneinander unterschieden werden. Grundsätzlich wären damit mikrobielle Kontaminationen auf den Werkstoffen im Laborversuch gassensorisch nachweisbar.

Ergebnisse 73

3.3 Vergleich der Mikroorganismen-Arten

3.3.1 Allgemeines

Die Geruchsprofile der untersuchten Mikroorganismen-Arten wurden anhand der Unterschie-de in ihren Sensorsignalen und nach der Auswertung mit der PCA miteinander verglichen (s. Tabelle 3-4 auf S. 79). Wie in Abschnitt 3.2 wurden die Mittelwerte der ausgewerteten Messpunkte betrachtet und dem Ergebnis der PCA gegenüber gestellt.

Die Ergebnisse der PCA wurden durch die der LDA ergänzt, um exaktere Angaben zur Ver-schiedenheit der verglichenen Gruppen machen zu können.

Alle hier verglichenen Mikroorganismen wurden auf Werkstoff 1 kultiviert. Von Bacillus polymyxa und Penicillium expansum wurde zusätzlich ein Vergleich auf Werkstoff 4 und 5 angestellt.

Die Grafiken mit Mittelwerten und Standardabweichungen der analysierten Proben befinden sich im Anhang 2.

3.3.2 Vergleich der Arten

Aspergillus niger und Bacillus polymyxa

Die Mittelwerte der Sensorsignale von Aspergillus niger und Bacillus polymyxa unterschieden sich in acht Fällen. Nur bei Sensor Nr. 9 waren diese Unterschiede signifikant. Nach Auswer-tung mit der PCA waren Aspergillus niger und Bacillus polymyxa sehr eindeutig unterscheid-bar (Abbildung 3-19).

Die LDA ergab für die verglichenen Gruppen eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunk-tion und eine korrekte Klassifizierung von 100 % in der Kreuzvalidierung.

74 Ergebnisse

Abbildung 3-19: Untersuchung durch verschiedene Mikroorganismen verursachter Kontaminationen von be-schichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Aspergillus niger und Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1 verdeutlicht die artspezifischen Unterschiede der Or-ganismen. (�: Aspergillus niger auf Werkstoff 1; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1)

Aspergillus niger und Penicillium expansum

Die Sensorsignale der Schimmelpilze Aspergillus niger und Penicillium expansum unter-schieden sich bei den Sensoren Nr. 3, 7 und 9. Bei Sensor Nr. 7 und 9 waren die Unterschiede signifikant. In der PCA war ein gute Auftrennung der beiden Arten möglich (Abbildung 3-20).

Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden untersuch-ten Gruppen. In der Kreuzvalidierung wurden 100 % der Datensätze korrekt eingruppiert.

Abbildung 3-20: Durch verschiedene Schimmelpilze verursachte Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA von Messwerten der Schimmelpilze Aspergillus niger und Penicillium expansum nach Kultivierung auf Werkstoff 1 demonstriert die artspezifischen Unterschiede der untersuchten Schimmelpilze. (�: Aspergillus niger auf Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 1)

Ergebnisse 75

Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens

Beim Vergleich der Mittelwerte der Sensorsignale von Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens ergaben sich Unterschiede bei sieben der zehn Sensoren. Die Unterschiede waren bei keinem der Sensoren signifikant. In der PCA ließen sich Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens dennoch sehr gut voneinander unterscheiden (Abbildung 3-21).

Die Auswertung mit der LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen und eine korrekte Klassifizierung von 100 % in der Kreuzvalidierung.

Abbildung 3-21: Untersuchung mit der Elektronischen Nase ENO-1 zur Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit verschiedenen Mikroorganismen. PCA der Messwerte von Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens nach Besiedlung von Werkstoff 1 zur Veranschaulichung der artspezifischen Unter-schiede der Mikroorganismen. (�: Aspergillus niger auf Werkstoff 1; �: Pseudomonas fluorescens auf Werk-stoff 1)

Bacillus polymyxa und Penicillium expansum

Auf Werkstoff 1 unterschieden sich Bacillus polymyxa und Penicillium expansum in sechs der zehn Sensorwerte, keiner der Unterschiede war jedoch signifikant. In der PCA ließen sich Bacillus polymyxa und Penicillium expansum auf Werkstoff 1 sehr gut trennen (Abbildung 3-22).

Nach einer Besiedlung von Werkstoff 4 waren bei Bacillus polymyxa und Penicillium expan-sum neun Mittelwerte der Sensorsignale verschieden, sechs der Unterschiede waren signifi-kant. In der PCA ließ sich Bacillus polymyxa auf Werkstoff 4 gut von Penicillium expansum trennen (Abbildung 3-23).

76 Ergebnisse

Abbildung 3-22: Nachweis durch verschiedene Bakterien verursachter Kontamination von beschichtetem Alu-minium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1 stellt die artspezifischen Unterschiede der Mikroorga-nismen dar.(�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 1)

Abbildung 3-23: Durch verschiedene Mikroorganismen verursachte Kontamination von anodisiertem Alumini-um (Werkstoff 4) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Penicillium expansum nach Besiedlung von Werkstoff 4 zur Verdeutlichung der artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen. (�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 4; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 4)

Auf Werkstoff 5 unterschieden sich Bacillus polymyxa und Penicillium expansum in sechs Sensorsignalen, bei Sensor Nr. 7 und 9 waren die Unterschiede signifikant. In der PCA war eine sehr gute Trennung von Bacillus polymyxa und Penicillium expansum auf Werkstoff 5 möglich (Abbildung 3-24).

Die Auswertung der Messwerte von mit der LDA ergab für die drei mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelten Werkstoffe 1, 4 und 5 jeweils eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktionen für die zwei Gruppen. In der Kreuzvalidierung wurden in allen drei Vergleichen 100 % der Datensätze korrekt klassifiziert.

Ergebnisse 77

Abbildung 3-24: Mit verschiedenen Mikroorganismen kontaminierte Proben von Polycarbonat (Werkstoff 5) untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Penicilllium expansum nach Kultivierung auf Werkstoff 5 demonstriert die artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen. (�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 5; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 5)

Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens

Die Bakterien-Arten Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens unterschieden sich in den Mittelwerten von fünf Sensorsignalen. Die Unterschiede waren nicht signifikant. In der PCA waren Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens sehr gut trennbar (Abbildung 3-25).

Die Auswertung mit der LDA ergab für die beiden Gruppen eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion und eine korrekte Eingruppierung in der Kreuzvalidierung von 100 %.

Abbildung 3-25: Nachweis durch verschiedene Bakterien ausgelöster Kontaminationen von beschichtetem Alumium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens nach Besiedlung von Werkstoff 1 zur Verdeutlichung der artspezifischen Unterschiede zwischen den Bakterien. (�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1; �: Pseudomonas fluorescens auf Werkstoff 1)

78 Ergebnisse

Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens

Auch Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens unterschieden sich in sechs der zehn Sensorsignale. Keiner der Unterschiede war signifikant. Die Unterscheidbarkeit in der PCA war sehr gut (Abbildung 3-26).

In der LDA wurde eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen ermittelt. Die Kreuzvalidierung ergab eine korrekte Klassifizierung von 100 %.

Abbildung 3-26: Mit verschiedenen Mikroorganismen kontaminierte Proben von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Penicilllium expansum und Pseudomonas fluorescens nach Kultivierung auf Werkstoff 1 stellt die artspezifischen Unter-schiede zwischen den Mikroorganismen dar. (�:Penicillium expansum auf Werkstoff 4; �: Pseudomonas fluorescens auf Werkstoff 1)


Die Messwerte aller untersuchten Mikroorganismen-Arten ließen sich in der PCA gut oder sehr gut trennen, obwohl sie in vielen Fällen nicht signifikant verschieden waren (Tabelle 3-4). So gab es auf Werkstoff 1 keine signifikanten Unterschiede zwischen den Organismen-paaren Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens, Bacillus polymyxa und Penicillium expansum, Bacillus polymxa und Pseudomonas fluorescens, sowie Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens. Dennoch ließen alle vier genannten Paare sich in der PCA sehr eindeutig voneinander unterscheiden.

Der Vergleich von Bacillus polymyxa und Penicillium expansum auf verschiedenen Werkstof-fen zeigt, dass es materialabhängige Unterschiede gab, auf die im folgenden Kapitel noch näher eingegangen wird.

Die Auswertung mit der LDA ergab in allen beschriebenen Vergleichen eine gute Trennbar-keit der Mikroorganismenpaare und eine bestmögliche Klassifizierungsrate bei der Überprü-fung anhand der Kreuzvalidierung.

Ergebnisse 79

Anhand mit der PCA und LDA analysierter Messdaten der Elektronischen Nase ENO-1 konn-ten alle verglichenen Kombinationen der Mikroorganismen voneinander unterschieden wer-den. Im Laborversuch war damit eine Unterscheidung der untersuchten Mikroorganismenar-ten anhand ihrer abgegebenen Stoffwechselprodukte möglich.

Tabelle 3-4: Vergleich der untersuchten Mikroorganismen anhand der Messwerte der einzelnen Sensoren der Elektronischen Nase ENO-1 und der Auswertung mit der PCA. Werkstoff 1 wurde mit allen in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen besiedelt, während auf den Werkstoffen 4 und 5 lediglich Bacillus polymyxa und Penicillium expansum kultiviert wurden. (W1: Werkstoff 1; W4: Werkstoff 4; W5: Werkstoff 5; An: Aspergillus niger; Bp: Bacillus polymyxa; Pe: Penicillium expansum; Pf: Pseudomonas fluorescens)



Vergleich der besiedelten

Proben (Reinkulturen)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr gut

gut

An/Bp X X X X X X X X X X An/Pe X X X X X X An/Pf X X X X X X X X Bp/Pe X X X X X X X Bp/Pf X X X X X X

W1

Pe/Pf X X X X X X X W4 Bp/Pe X X X X X X X X X X X X X X X X W5 Bp/Pe X X X X X X X X X

3.4 Vergleich der Werkstoffe

3.4.1 Allgemeines

Die unbesiedelten Kontrollen der Werkstoffe 1, 4 und 5 wurden miteinander verglichen, um Aussagen über den Einfluss des Werkstoffmaterials auf die Messergebnisse machen zu kön-nen. Im Anschluss wurden mit jeweils dem gleichen Organismus besiedelte Proben der drei Werkstoffe untersucht. Es sollte dabei herausgefunden werden, wie die Werkstoffunterlage das Geruchsmuster des jeweiligen Organismus beeinflusst. Die Mittelwerte der Sensorsignale und die in der PCA ausgewerteten Ergebnisse wurden miteinander verglichen.

Zur Bestätigung der Ergebnisse der PCA wurden die Messwerte zusätzlich mit der LDA aus-gewertet, die genauere Aussagen über die Unterschiede verglichener Gruppen zulässt.

Grafiken zu Mittelwerten und Standardabweichungen der verglichenen Proben befinden sich vollständig im Anhang 2.

80 Ergebnisse

3.4.2 Unbesiedelte Kontrollen

Die Messwerte der Kontrollen des Werkstoffs 1 unterschieden sich von denen des Werk-stoffs 4 in allen Fällen außer bei Sensor Nr. 10. Signifikant waren diese Unterschiede zwi-schen Werkstoff 1 und 4 bei allen Sensoren außer Nr. 4. Mit Hilfe der PCA waren die Cluster von Werkstoff 1 und 4 sehr gut unterscheidbar (Abbildung 3-27). Die Auswertung der Mess-daten mit der LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die Werk-stoffkontrollen W1 und W4 sowie eine korrekte Klassifizierung von 100 % in der Kreuzvali-dierung.

Ebenso ließen sich die Werte von Werkstoff 1 und 5 in der PCA sehr deutlich voneinander unterscheiden (Abbildung 3-27). Im direkten Vergleich der Sensorwerte der Werkstoffe 1 und 5 unterschieden sich alle Sensoren mit Ausnahme der Nr. 10. Bei den Sensoren 4, 7 und 9 waren die Unterschiede jedoch nicht signifikant. Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskrimanzfunktion und eine korrekte Klassifizierung der beiden Gruppen von 100 % in der Kreuzvalidierung.

Die Mittelwerte der Werkstoffe 4 und 5 unterschieden sich bei sechs Sensoren, signifikant waren die Unterschiede jedoch in keinem Fall. In der PCA war keine Trennung der Cluster der Werkstoffe 4 und 5 möglich (Abbildung 3-27). Auch die Ergebnisse der LDA waren weniger eindeutig: die Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion war mäßig, in der Kreuzvali-dierung wurden 83 % der Datensätze korrekt klassifiziert.

Abbildung 3-27: Eigenausgasungen von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA von Messwerten der unbesiedelten Kontrollen von Werkstoff 1, 4 und 5 zur Verdeutlichung der materialabhängigen Ausgasungen der verglichenen Werkstoffe. (�: Kontrollen von Werkstoff 1; �: Kontrollen von Werkstoff 4; �: Kontrollen von Werkstoff 5)

In Tabelle 3-5 sind die Ergebnisse der Mittelwertvergleiche der Sensorsignale und der PCA zusammengefasst. Bei Vergleichen der Kontrollen von Werkstoff 1 mit denen von Werk-stoff 4 und 5 korrelierte eine höhere Anzahl signifikant verschiedener Sensorsignale mit einer

Ergebnisse 81

besseren Unterscheidbarkeit in der PCA und auch in der LDA. Die Werkstoffe 4 und 5 unter-schieden sich nicht signifikant in ihren Sensorsignalen – ihre Trennbarkeit in der PCA und in der LDA waren nicht eindeutig.

Tabelle 3-5: Vergleich der unbesiedelten Kontrollen der verschiedenen Werkstoffmaterialien. (W1: Werkstoff 1; W4: Werkstoff 4; W5: Werkstoff 5)



Vergleich der unbesiedelten

Kontrollen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr gut

keine

W1/W4 X X X X X X X X X X X X X X X X X X W1/W5 X X X X X X X X X X X X X X X X W4/W5 X X X X X X X

3.4.3 Besiedlung mit Bacillus polymyxa

Mit Bacillus polymyxa besiedelte Proben des Werkstoffs 1 unterschieden sich von besiedelten Proben der Werkstoffe 4 und 5 in allen Sensorsignalen bis auf Sensor Nr. 10. Bei Sensor Nr. 4 waren diese Unterschiede nicht signifikant. In der PCA ließ sich der mit Bacillus polymyxa besiedelte Werkstoff 1 sehr eindeutig von den besiedelten Werkstoffen 4 und 5 trennen (Abbildung 3-28). Auch in der LDA wurde eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunk-tion bei einer zu 100 % korrekten Klassifizierung ermittelt.

Werkstoff 4 und 5 unterschied sich nach Besiedlung mit Bacillus polymyxa in acht Sensorsig-nalen, diese Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. In der PCA ließen sich die Cluster von Werkstoff 4 und 5 nicht trennen (Abbildung 3-28). Auch in der LDA war die Trennfähig-keit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen nicht eindeutig. Die Rate der korrekt eingruppierten Datensätze betrug 83 %.

82 Ergebnisse

Abbildung 3-28: Unterschiede zwischen beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nach einer Besiedlung mit dem gleichen Bakterium untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben der Werkstoffe 1, 4 und 5 verdeutlicht die im Zusammenhang mit einer gleichartigen mikrobiellen Kontamination messbaren materialabhängigen Unterschiede zwischen den Werkstoffen. (�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 4; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 5)

Die erläuterten Ergebnisse sind in der Tabelle 3-6 zusammengefasst. Sie decken sich mit den in 3.4.2 für die unbesiedelten Kontrollen vorgestellten Ergebnissen.

Tabelle 3-6: Vergleich der mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben der Werkstoffe 1, 4 und 5. (Bp: Bacillus polymyxa; W1: Werkstoff 1; W4: Werkstoff 4; W5: Werkstoff 5)



Vergleich der mit Bp besiedelten Werkstoffe

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr gut

keine

W1/W4 X X X X X X X X X X X X X X X X X X W1/W5 X X X X X X X X X X X X X X X X X X W4/W5 X X X X X X X X

3.4.4 Besiedlung mit Penicillium expansum

Nach einer Besiedlung mit Penicillium expansum unterschieden sich die Messsignale aller drei Werkstoffe bei allen Sensoren außer Sensor Nr. 10. Die Unterschiede zwischen Werk-stoff 1 und 4 waren bei den Sensoren Nr. 4 und 7 nicht signifikant.

In der PCA ließen sich Werkstoff 1 und 4 sehr eindeutig voneinander unterscheiden (Abbildung 3-29).

Beim Vergleich von Werkstoff 1 und 5 ergaben sich bei fünf Sensoren signifikante Unter-schiede. In der PCA ließen sich die Proben von Werkstoff 1 und 5 sehr gut voneinander tren-nen (Abbildung 3-29). Bei mit Penicillium expansum besiedelten Proben von Werkstoff 4

Ergebnisse 83

und 5 unterschieden sich sechs Sensoren signifikant, ihre Cluster ließen sich in der PCA gut voneinander trennen (Abbildung 3-29).

Abbildung 3-29: Unterschiede zwischen beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nach einer Besiedlung mit dem gleichen Schimmelpilz nachge-wiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA zum Vergleich der mit Penicillium expansum besiedelten Proben von Werkstoff 1, Werkstoff 4 und Werkstoff 5 zeigt die im Zusammenhang mit einer gleichartigen mikrobiellen Kontamination messbaren materialabhängigen Unterschiede zwischen den Werkstoffen. (�: Peni-cillium expansum auf Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 4; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 5)

Eine Übersicht der vorgestellten Ergebnisse von Mittelwertvergleichen und PCA bietet Tabelle 3-7. Bei allen drei verglichenen Werkstoffkombinationen wiesen in der LDA die Dis-kriminanzfunktionen eine gute Trennfähigkeit für die jeweiligen zwei Gruppen auf. In der Kreuzvalidierung wurde in allen drei Analysen eine korrekte Klassifizierung von 100 % er-reicht.

Tabelle 3-7: Vergleich der mit Penicillium expansum besiedelten Werkstoffe 1, 4 und 5. (Pe: Penicillium expansum; W1: Werkstoff 1; W4: Werkstoff 4; W5: Werkstoff 5)



Vergleich der mit Pe besiedelten Werkstoffe

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr gut

gut

W1/W4 X X X X X X X X X X X X X X X X X W1/W5 X X X X X X X X X X X X X X X W4/W5 X X X X X X X X X X X X X X X X

84 Ergebnisse


Im unbesiedelten Zustand unterschied sich Werkstoff 1 deutlich von den Werkstoffen 4 und 5. Für die Werkstoffe 4 und 5 waren die gassensorischen Ergebnisse der Kontrollen sehr ähn-lich. Dasselbe gilt für Proben der Werkstoffe 1, 4 und 5, die mit Bacillus polymyxa besiedelt waren. Im Fall einer Besiedlung mit Penicillium expansum ergaben sich dagegen zwischen allen Werkstoffen eindeutige Unterschiede.

Werkstoff 1

00,5

11,5

22,5

31

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Kontrolle Bacillus polymyxa Penicillium expansum

Abbildung 3-30: Messprofil von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Wie erläutert, kann das Werkstoffmaterial das Geruchsmuster der Probe deutlich beeinflus-sen, wie die klare Unterscheidbarkeit besiedelter Proben von Werkstoff 1 von den Werkstof-fen 4 und 5 zeigt. Die Werkstoffe 4 und 5 ähneln sich unbesiedelt sehr, sind nach einer Be-siedlung mit Penicillium expansum deutlich verschieden. Eine Besiedlung der Werkstoffe 4 und 5 mit Bacillus polymyxa führte dagegen nicht zu einer Unterscheidbarkeit. Der Einfluss des besiedelten Werkstoffmaterials auf die gassensorischen Messergebnisse kann offensicht-lich entscheidend durch die besiedelnde Mikroorganismenspezies und deren Wechselwirkun-gen mit dem Material mitbestimmt werden.

Ergebnisse 85

Werkstoff 4

00,5

11,5

22,5

31

2

3

4

5

6

7

8

9

10


Abbildung 3-31: Messprofil von anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 4. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Die Radarplots von Mittelwerten der Sensorsignale verdeutlichen die erläuterten Unterschiede und Gemeinsamkeiten der unbesiedelten und besiedelten Werkstoffe 1, 4 und 5 (Abbildung 3-30, Abbildung 3-31, Abbildung 3-32). Auffallend sind die vielen hohen Sensor-signale bei Werkstoff 1, die vermutlich die deutliche Unterscheidbarkeit dieses Werkstoffes von den Werkstoffen 4 und 5 bewirkt haben. In Abbildung 3-31 und Abbildung 3-32 sind die Ähnlichkeiten der Sensorsignale bei Werkstoff 4 und 5 als unbesiedelte Kontrollen oder be-siedelt mit Bacillus polymyxa zu erkennen. Auch die unterschiedlichen Sensorsignale bei einer Besiedlung der Werkstoffe 4 und 5 mit Penicillium expansum werden hier nochmals deutlich.

Anhand der Radarplots lässt sich außerdem erkennen, dass die Sensorsignale bei einer Besiedlung im Verhältnis zu den Kontrollen entweder gleich blieben oder verstärkt wurden. In keinem Fall kam es durch die Besiedlung zu einer Umkehrung des Signals von oxidierend zu reduzierend oder umgekehrt.

86 Ergebnisse

Werkstoff 5

00,5

11,5

22,5

31

2

3

4

5

6

7

8

9

10


Abbildung 3-32: Messprofil von Polycarbonat (Werkstoff 5) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 5. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

3.5 Vergleich von Reinkulturen und Mischkulturen

3.5.1 Allgemeines

Die Mischkulturen wurden mit Reinkulturen der Mikroorganismen verglichen, aus denen sie zusammengestellt wurden (vgl. Tabelle 3-8, S. 89). Bei der Bakteriendominierten Mischprobe handelte es sich um Bacillus polymyxa, Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens. Die Pilzdominierte Mischprobe setzte sich aus Aspergillus niger, Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens zusammen. Wie in den vorangegangen Abschnitten wurden die Sensorsignale miteinander verglichen und ihre Unterscheidbarkeit in der PCA bewertet. Zur Absicherung des Ergebnisses wurden die Daten mit der LDA analysiert.

Die Grafiken mit Mittelwerten und Standardabweichungen der einzelnen Sensoren befinden sich im Anhang 2.

Ergebnisse 87

3.5.2 Bakteriendominierte Mischkultur

Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa unterschied sich von der Bakteriendominierten Mischkultur in sechs Sen-sorsignalen, nur bei Sensor Nr. 6 war der Unterschied signifikant. In der PCA ließen sich die Cluster von Bacillus polymyxa und der Bakteriendominierten Mischkultur sehr deutlich tren-nen (Abbildung 3-33). Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen und eine korrekte Eingruppierung von 100 % in der Kreuzvalidierung.


Auch Penicillium expansum unterschied sich von der Bakteriendominierten Mischkultur in sechs Sensorsignalen. Keiner der Unterschiede war signifikant. In der PCA war eine sehr ein-deutige Trennung von Bakteriendominierter Mischkultur und Penicillium expansum möglich (Abbildung 3-33). Auch hier war in der LDA die Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion gut und 100 % der Datensätze wurden in der Kreuzvalidierung korrekt klassifiziert.

Abbildung 3-33: Keine Wiederfindung einzelner Arten in einer mikrobiellen Mischkultur nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). PCA zum Vergleich von Messwerten der Elektronischen Nase ENO-1 von der Bakteriendominierten Mischkultur und den Reinkulturen der Mikroorganismen, aus denen sie zusam-mengestellt wurde, nach Kultivierung auf Werkstoff 1. (�:Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 1; �: Pseudomonas fluorescens auf Werkstoff 1; �: Bakteriendominierte Mischkultur auf Werkstoff 1)

88 Ergebnisse

Pseudomonas fluorescens

Bei Pseudomonas fluorescens und Bakteriendominierter Mischkultur unterschieden sich sie-ben der 10 Sensoren, bei Sensor Nr. 6 war die Differenz signifikant. In der PCA waren Pseudomonas fluorescens und Bakteriendominierte Mischkultur sehr deutlich trennbar (Abbildung 3-33). Die beiden Gruppen waren in der LDA anhand der Diskriminanzfunktion gut trennbar und ließen sch in der Kreuzvalidierung zu 100 % korrekt klassifizieren.

3.5.3 Pilzdominierte Mischkultur

Aspergillus niger

Bei Aspergillus niger und Pilzdominierter Mischkultur waren die Mittelwerte von fünf Sen-sorsignalen verschieden. Die Unterschiede waren nicht signifikant. In der PCA ließen sich die Cluster von Aspergillus niger und Pilzdominierter Mischkultur sehr gut trennen (Abbildung 3-34). Auch die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die vergli-chenen Gruppen sowie eine korrekte Klassifizierung in der Kreuzvalidierung von 100 %.

Abbildung 3-34: Keine Wiederfindung einzelner Arten in einer mikrobiellen Mischkultur nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1).PCA von Messwerten der Elektronischen Nase ENO-1 von der Pilz-dominierten Mischkultur und den Reinkulturen der eingesetzten Mikroorganismen kultiviert auf Werkstoff 1. (�: Aspergillus niger auf Werkstoff 1; �: Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1; �: Penicillium expansum auf Werkstoff 1; �: Pilzdominierte Mischkultur auf Werkstoff 1)

Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa und Pilzdominierte Mischkultur unterschieden sich in fünf Sensorsignalen. Bei Sensor Nr. 1, 2 und 9 waren die Unterschiede signifikant. In der PCA ließen sich Bacillus polymyxa und Pilzdominierte Mischkultur sehr gut trennen (Abbildung 3-34). In der LDA war

Ergebnisse 89

die Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion ebenfalls gut und die Gruppierung in der Kreuz-validierung war zu 100 % korrekt.


Penicillium expansum unterschied sich von der Pilzdominierten Mischkultur in sieben Sen-sorsignalen. Bei den Sensoren 7 und 9 waren de Differenzen signifikant. Nach Auswertung mit der PCA war eine sehr gute Trennung von Pilzdominierter Mischkultur und Penicillium expansum möglich (Abbildung 3-34). Die LDA ergab auch hier eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen und eine korrekte Klassifizierung von 100 % in der Kreuzvaldierung.


Die Sensorsignale der Mischkulturen und der Reinkulturen, aus denen sich die Mischkulturen zusammensetzten, unterschieden sich vielfach, in den meisten Fällen waren die Unterschiede jedoch nicht signifikant (Tabelle 3-8). Zwischen Penicillium expansum und Bakteriendomi-nierter Mischkultur, sowie zwischen Aspergillus niger und Pilzdominierter Mischkultur gab es keine signifikanten Unterschiede der Sensorsignale. Dennoch waren alle untersuchten Reinkulturen und die Mischkulturen nach der Auswertung mit der PCA und der LDA deutlich verschieden. Eine Wiederfindung einzelner Arten in einer Mischkultur scheint somit anhand der gewählten Methodik nicht möglich zu sein.

Tabelle 3-8: Vergleich von Messergebnissen der Mischkulturen mit denen der Reinkulturen der Mikroorga-nismen, aus denen sie zusammengesetzt waren. (An: Aspergillus niger; Bp: Bacillus polymyxa; Pe: Penicillium expansum; Pf: Pseudomonas fluorescens; MB: Bakteriendominierte Mischkultur; MP: Pilzdominierte Mischkultur)



Vergleich von Rein- und

Misch-kulturen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 sehr gut

MB/Bp X X X X X X X X MB/Pe X X X X X X X MB/Pf X X X X X X X X X MP/An X X X X X X MP/Bp X X X X X X X X X MP/Pe X X X X X X X X X X

90 Ergebnisse

3.6 Vergleich der Mischkulturen

Wie in den vorangegangenen Abschnitten beschrieben, wurden die Mittelwerte der Sensor-signale der beiden unterschiedlich zusammengesetzten Mischkulturen miteinander verglichen. Nach der Auswertung mit der PCA und der LDA wurde die Unterscheidbarkeit der beiden Kulturen beurteilt. Die Grafiken mit Mittelwerten und Standardabweichungen der Sensorwer-te können im Anhang 2 eingesehen werden.

Die Bakteriendominierte Mischkultur unterschied sich von der Pilzdominierten Mischkultur in acht der zehn Sensorsignale. Bei Sensor Nr. 2, 6 und 9 waren die Unterschiede signifikant. In der PCA war die Trennung der Cluster der beiden Mischkulturen jedoch gering (Abbildung 3-35). Trotz der Unterscheidbarkeit der Sensorsignale von Bakteriendominierter Mischkultur und Pilzdominierter Mischkultur wurde somit in der PCA keine gute Trennbarkeit erzielt (vgl. Tabelle 3-9).

Die LDA ergab eine gute Trennfähigkeit der Diskriminanzfunktion für die beiden Gruppen. In der Kreuzvalidierung betrug die Rate der korrekt klassifizierten Datensätze 97 %.

Tabelle 3-9: Vergleich von Bakteriendominierter (MB) und Pilzdominierter Mischkultur (MP) im Über-blick. (MB: Bakteriendominierte Mischkultur; MP: Pilzdominierte Mischkultur)

unterscheidbare Sensoren signifikant unterscheidba-re Sensoren


Vergleich der Mischkulturen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mäßig

MB/MP X X X X X X X X X X X X

Abbildung 3-35: Unterschiede zweier Mischkulturen mit zwei gleichen und einer unterschiedlichen Art nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) gemessen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte mit Bakteriendominierter Mischkultur und Pilzdominierter Mischkultur besiedelter Proben von Werkstoff 1. (�: Bakteriendominierte Mischkultur auf Werkstoff 1; �: Pilzdominierte Mischkultur auf Werk-stoff 1)

Ergebnisse 91

3.7 Kernaussagen der Ergebnisse

Aus den dargestellten Ergebnissen lassen sich die folgenden Kernaussagen ziehen:

�� Die Reproduzierbarkeit der Messungen von Aceton-Standard und Kontrollen war gering. Die weiteren dargestellten Ergebnisse sind daher lediglich als Tendenzen zu verstehen.

�� Für Messreihen des Aceton-Standards wurden zeitabhängige Veränderungen von mehre-ren Sensorleitwerten ermittelt. Ergebnisse von Versuchswiederholungen können daher nach einem gewissen Zeitraum zu anderen Messergebnissen führen.

�� Im Laborversuch war eine mikrobielle Kontamination der Werkstoffe mit Rein- und Mischkulturen in allen Fällen gassensorisch nachweisbar.

�� Die untersuchten Mikroorganismenarten waren aufgrund ihrer artspezifischen gasförmi-gen Stoffwechselprodukte unterscheidbar.

�� Die Materialien der besiedelten Werkstoffe beeinflussten die Zusammensetzung der gas-förmigen Komponenten zum Teil entscheidend, in anderen Fällen ist der Einfluss des Werkstoffes eher gering. Bei Penicillium expansum weisen die Ergebnisse auf einen Ein-fluss des Werkstoffmaterials auf die Stoffwechselaktivität hin.

�� In Mischkulturen konnten die einzelnen beteiligten Mikroorganismen anhand der Mess-profile nicht wiedererkannt werden.

�� Die Messergebnisse für die zwei untersuchten Mischkulturen waren vergleichsweise ähn-lich.

92 Ergebnisse

Diskussion 93

4 Diskussion

4.1 Prolog ........................................................................................................................... 94 4.2 Grenzen von Messmethode und Datenauswertung ...................................................... 94

4.2.1 Messgenauigkeit und Reproduzierbarkeit.................................................... 94 4.2.2 Einfluss der Drift auf die Reproduzierbarkeit.............................................. 96 4.2.3 Selektivität und Querempfindlichkeit der Sensoren .................................... 97 4.2.4 Wirkung der Gaskonzentration und Gaszusammensetzung auf die

Sensorsignale ............................................................................................... 98 4.2.5 Einfluss der Feuchte auf die Messgenauigkeit............................................. 99 4.2.6 Datenauswertung mit der PCA und LDA .................................................. 101 4.2.7 Zusammenfassung...................................................................................... 103

4.3 Unbewachsene Kontrollen und bewachsene Werkstoffe ........................................... 104 4.3.1 Veränderungen der Sensorsignale bei einer Besiedlung............................ 104 4.3.2 Ursachen für veränderte Sensorsignale bei einer Besiedlung.................... 104 4.3.2.1 Emissionen aus dem Werkstoff und dem Medium.................................... 104 4.3.2.2 Gasförmige Stoffwechselprodukte der Organismen.................................. 106 4.3.2.3 Nachweis von mikrobiellem Wachstum mit Gassensoren......................... 106 4.3.2.4 Zusammenfassung...................................................................................... 108

4.4 Gassensorische Unterschiede der Mikroorganismenarten.......................................... 108 4.4.1 Differenzierung mikrobieller Gattungen und Gruppen.............................. 108 4.4.2 Differenzierung von Mikroorganismen-Arten........................................... 111 4.4.3 Zusammenfassung...................................................................................... 114

4.5 Einfluss des Werkstoffes auf die gassensorische Messung........................................ 115 4.5.1 Unterschiede der untersuchten Werkstoffen.............................................. 115 4.5.2 Einflussfaktoren der Werkstoffe ................................................................ 116 4.5.2.1 Eigenausgasung.......................................................................................... 116 4.5.2.2 Einfluss der Werkstoffe auf die Physiologie der Mikroorganismen.......... 117 4.5.2.3 Auswirkungen des Werkstoffes auf die Gassensorik................................. 121 4.5.2.4 Zusammenfassung...................................................................................... 122

4.6 Gassensorische Untersuchung von Mischkulturen..................................................... 123 4.6.1 Wiederfindung einzelner Arten in Mischkulturen ..................................... 123 4.6.2 Physiologische Abweichungen zwischen Rein- und Mischkulturen ......... 124 4.6.2.1 Zellkonzentration beim Animpfen............................................................. 124 4.6.2.2 Wechselwirkungen in Mischkulturen ........................................................ 125 4.6.3 Vergleich zweier Mischkulturen................................................................ 126 4.6.4 Zusammenfassung...................................................................................... 127

4.7 Fazit und Ausblick...................................................................................................... 128

94 Diskussion

4.1 Prolog

Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen sollten zur Entwicklung eines gassen-sorischen Nachweises mikrobiell kontaminierter Oberflächen in bemannten Raumstationen beitragen. Zu diesem Zweck wurden mikrobiell kontaminierte Werkstoffproben (Baumateria-lien) unter verschiedenen Gesichtspunkten mit einer Elektronischen Nase untersucht. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit von Messdaten der ausgewählten Elektronischen Nase ENO-1 wurden Messungen an Aceton-Standards und unkontaminierten Werkstoffpro-ben vorgenommen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden im ersten Teil dieses Kapi-tels im Zusammenhang mit den Arbeiten anderer Autoren diskutiert. Zusätzlich wurden die Möglichkeiten und Grenzen der eingesetzten Auswerteverfahren dargestellt.

In den nachfolgenden Abschnitten wird auf die Messungen der kontaminierten Oberflächen eingegangen. Die Veränderungen der Emissionen von Werkstoffen durch eine mikrobielle Kontamination und die Unterschiede zwischen verschiedenen Kontaminanten werden erörtert. Ein weiterer Diskussionspunkt ist der Einfluss des Werkstoffmaterials auf die Messergebnisse mikrobiell kontaminierter Proben. Die letzten Abschnitte der Diskussion behandeln die gassensorisch messbaren Unterschiede von Reinkulturen und Mischkulturen und deren Ursachen.

Die Perspektiven und Schwierigkeiten, die sich aus dem alternativen Ansatz des Nachweises mikrobieller Kontaminationen in Innenräumen mit Hilfe von Elektronsichen Nasen ergeben, werden dargestellt und beurteilt.

4.2 Grenzen von Messmethode und Datenauswertung

4.2.1 Messgenauigkeit und Reproduzierbarkeit

Ein häufig kritisiertes Problem gassensorischer Messungen ist ihre mangelnde Reproduzier-barkeit (Casalinuevo et al., 2006; Haugen & Kvaal, 1998; Roussel et al., 1998). In dieser Ar-beit wurden die Messdaten von Aceton-Standard und unbesiedelten Kontrollen des Werkstof-fes 1 auf Messgenauigkeit und Reproduzierbarkeit überprüft. Diese Überprüfung ergab eine unzuverlässige Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit. Die Messgenauigkeit beim Aceton-Standard war von Sensor zu Sensor sehr verschieden und lag zwischen 53 und 100 % (vgl. 3.1.1.1). Ausgewertet als PCA konnten in der Überprüfung der Analyse (vgl. 3.1.1.2) 68 bis 86 % der nicht ausgewerteten Datensätze richtig klassifiziert werden. In der LDA wur-den 100 % der Daten korrekt zugeordnet.

Die Durchschnittswerte für die Messgenauigkeit bei Messungen der unbesiedelten Kontrollen des Werkstoffs 1 ähnelten denen des Aceton-Standards.

Diskussion 95

Hier schwankten die Messgenauigkeiten zwischen 55 und 100 % für die 36 untersuchten Kontrollen von Werkstoff 1 (vgl. 3.1.2). Es wurden in der Überprüfung der PCA 70 % und der LDA 100 % der nicht ausgewerteten Datensätze korrekt zugeordnet.

Die erheblich korrektere Zuordnung in der LDA ist vermutlich in den verschiedenen Überprü-fungsverfahren bei PCA und LDA begründet (vgl. 3.1.1.2).

Diese Klassifizierungsergebnisse sind deutlich positiver als die Angaben von Boeker (2004), wonach die Wahrscheinlichkeit einer Fehlklassifikation bei Probenzahlen entsprechend einer doppelten Sensoranzahl bei 70 % liegen. Bei geringeren Probenzahlen gehe die Wahrschein-lichkeit einer Fehlklassifikation gegen 100 %. Mit drei Parallelen pro Messtag betrug die An-zahl der untersuchten Standard-Proben jeweils 63 für die Konzentrationen 1 ppm und 5 ppm Aceton und 36 für die Kontrollen von Werkstoff 1. Damit lag die Anzahl der untersuchten Proben deutlich über der doppelten Sensor-Anzahl von 2 x 10, die Boeker (2004) als Min-destanzahl nennt.

Es können auch bei höheren Probenanzahlen teilweise erhebliche Ungenauigkeiten bei Mes-sungen mit Elektronischen Nasen auftreten, wie sowohl die Erkenntnisse von Boeker (2004) als auch die dargestellten Ergebnisse zeigen. Verursacht werden Ungenauigkeiten bei Mes-sungen mit Elektronischen Nasen durch eine Vielzahl von Faktoren, die einerseits in der Pro-benahme andererseits in Aufbau und Beschaffenheit der Elektronischen Nase und besonders des Sensorarrays (Boeker, 2001; Heinert, 2000) begründet sind.

Nur durch eine möglichst geringe Anzahl äußerst sorgfältig auf die jeweilige Messaufgabe abgestimmter Sensoren kann nach Boeker (2004) die Messgenauigkeit bei angemessenen Probenzahlen entscheidend erhöht werden. Eine genaue Abstimmung des verwendeten Sen-sorarrays auf die hier beschriebenen Messaufgaben erfolgte aus herstellerabhängigen Gründen nur sehr bedingt. Augenscheinlich wird dies dadurch, dass die Sensoren 4 und 10 bei keiner der gemessenen Proben einen deutlichen Ausschlag zeigten. Die Messergebnisse dieser bei-den Sensoren wurden dennoch ausgewertet, da fast identische, niedrige Werte mit geringen Varianzen in der PCA keine deutlichen Veränderungen des Ergebnisses bewirken (mündl. Mitteilung von Herrn Constantin Hagemeier, Statistische Beratung, Universität Bremen).

Einige Einflussfaktoren auf die Messgenauigkeit von Elektronischen Nasen und auf die Re-produzierbarkeit der Messdaten sollen in den folgenden Abschnitten diskutiert werden.

Die Analyse mit der PCA und LDA kann trotz schlechter Reproduzierbarkeit der Datensätze zu guten Ergebnissen in der Klassifizierung führen. Möglichkeiten und Knackpunkte der Ana-lysemethoden werden in Abschnitt 4.2.6 diskutiert.

96 Diskussion

4.2.2 Einfluss der Drift auf die Reproduzierbarkeit

Die Sensorendrift beeinflusst die Reproduzierbarkeit von Messungen mit Elektronischen Na-sen (Holmberg & Artursson, 2003), sie wird durch konzentrierte, reaktive Substanzen in den Messgasen verursacht (Llobet, 2003). Metalloxid-Sensoren wie sie in der Elektronischen Na-se ENO-1 verwendet wurden, gelten als anfällig für schwefelhaltige Verbindungen, schwache Säuren und Chlor (Gardner & Bartlett, 1994; Strike et al., 1999). Insbesondere schwefelhalti-ge Verbindungen und organische Säuren werden von Mikroorganismen freigesetzt (vgl. 4.3). Es ist daher wahrscheinlich, dass auch die Sensoren der eingesetzten Elektronischen Nase ENO-1 im Verlauf der Messungen gedriftet sind. Unterstützt wird diese Annahme durch das Ergebnis der Sequenzanalyse, nach dem bei Messungen des Aceton-Standards über den ge-samten Untersuchungszeitraum die Signale aller Sensoren außer Nr. 8 und 9 nicht zufällig verteilt waren (vgl. 3.1.1.3). Nach dieser Bewertung lieferten also nur die Sensoren 8 und 9 über den gesamten Messzeitraum reproduzierbare Ergebnisse. Lediglich Sensor 8 lieferte auch gleichzeitig eine gute Messgenauigkeit (vgl. 3.1.1.1).

Nach Boeker (2004) wirken sich bereits kleine Veränderungen des Sensorleitwerts, z. B. durch Drifteffekte, auf die Erkennung des Geruchs aus. Er fordert daher sehr stabile Sensoren. Da diese Forderung nicht immer realisierbar ist und besonders die häufig in Elektronischen Nasen verwendeten Metalloxid-Sensoren zu Drifteffekten neigen, existieren verschiedene Verfahren zur Korrektur oder Reduzierung der Drifteffekte von Sensoren.

Eine Maßnahme, Drifteffekte von Sensoren zu reduzieren, ist eine regelmäßige Regeneration der Sensoren durch Ausglühen (Holmberg & Artursson, 2003). Reversible Veränderungen der Sensoren, die durch Reaktionen von Messgasen und Sensormaterial entstehen, können da-durch beseitigt werden. Aufgrund fehlender Einstellungsmöglichkeiten der Software Benose konnten die Sensoren der Elektronischen Nase ENO-1 nicht ausgeglüht werden.

Auch Delpha et al. (2001) ermittelten als eine Ursache für Fehlklassifizierungen die Sensor-drift und reduzierten den Effekt, indem sie den Sensorleitwert des Null-, bzw. Spülgases G0 von dem Sensorleitwert des Messgases G oder GS abzogen. Dieser Gedankenansatz wurde bei den hier vorgestellten Messungen direkt in den Messablauf integriert, indem nach jeder Spül-phase das Verhältnis G0/G der Sensoren auf „1“ gesetzt wurde (vgl. 2.1.1.3). Dieses Verfah-ren kann in ungünstigen Fällen jedoch die Empfindlichkeit der Sensoren herabsetzen. Die zur Kontrolle von Drifteffekten durchgeführten Messungen des Aceton-Standards zeigten keine erkennbaren Veränderungen der Sensorwerte in eine bestimmte Richtung. Eine mögli-che Erklärung für das Ausbleiben von klar erkennbaren Drifteffekten könnte das oben erklärte Verfahren sein.

Anstelle der in einer Richtung verlaufenden Drift waren bei einigen Sensoren zeitabhängige stufenförmige Veränderungen der Signale (Sequenzen) zu erkennen (vgl. 3.1.1.3). Mit der Sequenzanalyse konnte bestätigt werden, dass die Ergebnisse der meisten Sensoren nicht zu-

Diskussion 97

fällig (nicht zeitunabhängig) verteilt waren. In der PCA konnten diese zeitabhängigen Ergeb-nisse als Cluster dargestellt werden (vgl. Abbildung 3-8 und Abbildung 3-9). Aus dieser Be-obachtung ergibt sich eine Unsicherheit in der Reproduzierbarkeit der Messwerte, die so kaum zu beurteilen ist. Sie wird zusätzlich durch die Varianzanalyse von den Messdaten des Werkstoffs 1 (Kontrollen) bestätigt, die einen signifikanten Einfluss des Messzeitpunktes bzw. Messtages auf die Signale aller Sensoren außer Sensor 1 ergab (vgl. 3.1.2). Damit waren die Ergebnisse auch bei den Werkstoffkontrollen zeitabhängig und nicht zufällig verteilt.

Nur durch eine langfristige Beobachtung der Sensorwerte könnte beurteilt werden, ob es sich bei diesem Verhalten um eine voraussagbare Drift oder um einen einmaligen Vorgang handel-te. Es muss jedoch davon ausgegangen werden, dass Wiederholungen der hier vorgestellten Untersuchungen nicht zu vergleichbaren Ergebnissen führen.

4.2.3 Selektivität und Querempfindlichkeit der Sensoren

Gassensorische Messungen können sowohl auf einer oder auf wenigen hoch selektiven Sen-sorreaktionen auf das Messgas als auch auf einem „fingerprint“ mehrerer Sensoren basieren (Heinert, 2000; Heining, 1999). Dieser „fingerprint“ wird durch die Gesamtheit der selektiven und unspezifischen Sensorantworten gebildet.

Bei den Messungen des Aceton-Standards reagierten sechs der zehn Sensoren. Die Sensoren, die auf Aceton reagierten, sind laut Herstellerangaben selektiv oder querempfindlich für ver-schiedene Kohlenwasserstoffe, BTX-Aromate und Lösungsmittel (vgl. Tabelle 2-1). Nur für Sensor 8 ist explizit eine Querempfindlichkeit für Aceton angegeben. Das Messergebnis setzt sich also aus einer Reihe eher unspezifischer evtl. interkorrelierender Sensorantworten zu-sammen, die mit einem größeren Fehler durch aufsummiertes Hintergrundrauschen behaftet sein können (Montag et al., 2001; Stetter & Penrose, 2002).

Bei komplex zusammengesetzten Gemischen vollständig oder teilweise unbekannter Gase, wie sie in dieser Arbeit untersucht wurden, besteht einerseits die Möglichkeit, hohe Proben-zahlen zu messen oder andererseits Leitsubstanzen („Marker“) auszuwählen (Meruva et al., 2004; Wady et al., 2005). Für diese „Marker“ sollen dann besonders sensitive und selektive Sensoren entwickelt werden, wie von Heinert (2000) beschrieben.

Für MVOC erweist sich die Auswahl von Markern allerdings als außerordentlich schwierig (vgl. 4.3.2.3). Zusätzlich war aus finanziellen und zeitlichen Gründen die Auswahl und Ent-wicklung eines für bestimmte „Marker-MVOC“ hochselektiven Arrays nicht möglich. Aber auch eine Messung größerer Probenzahlen, über die Messfehler zu verringern gewesen wären, konnte nicht vorgenommen werden, da hierfür nicht ausreichend Werkstoffproben zur Verfü-gung gestellt worden waren. Zudem war der mit den festgelegten Messbedingungen verbun-dene Zeitaufwand erheblich, so dass größere Probenzahlen nicht untersucht werden konnten.

98 Diskussion

Daher mussten bei den hier erzielten Messergebnissen Fehler aufgrund interkorrelierender Sensorsignale in Kauf genommen werden.

4.2.4 Wirkung der Gaskonzentration und Gaszusammensetzung auf die Sensorsignale

Bei den Messungen des Aceton-Standards zeigte sich deutlich, dass die Sensoren konzentrati-onsabhängig auf das Messgas reagierten. Die Signale der für Aceton empfindlichen Sensoren waren bei der höheren Aceton-Konzentration signifikant erhöht. Da im Rahmen dieser Arbeit aus zeitlichen Gründen lediglich zwei verschiedene Aceton-Konzentrationen untersucht wer-den konnten, kann anhand der Ergebnisse keine Aussage über die Linearität der Konzentrati-onsabhängigkeit gemacht werden.

Nach Angaben verschiedener Autoren sind die Sensorreaktionen auf eine Substanz nicht line-ar oder weisen nur in bestimmten optimalen Messbereichen eine Linearität auf (Boeker, 2001; Maricou et al., 1998; Ryan & Zhou, 2003). Zudem kann die Linearität durch andere Faktoren wie die Feuchte beeinflusst sein (Delpha et al., 2001). Aus diesen Gründen ist davon auszu-gehen, dass verschiedene Komponenten der hier untersuchten Probengase in Konzentrationen außerhalb ihres linearen und optimalen Messbereiches vorlagen und ihre Bestimmung nicht exakt war. Dieser Umstand wirkt sich sowohl auf die Messgenauigkeit als auch auf die Aus-wertung aus, da Analysemethoden wie die PCA und die LDA möglichst lineare Analyseme-thoden erfordern (Jurs et al., 2000). Als Ausweg können bei hohen Probenzahlen Künstliche Neuronale Netze zur Auswertung eingesetzt werden (Di Francesco et al., 2001). Diese Mög-lichkeit schied für die vorliegende Arbeit aus, da nicht ausreichende Anzahlen an Werkstoff-proben zur Verfügung gestellt wurden und die Probenvorbereitung zu aufwendig war. Auf-grund der Komplexität in der Zusammensetzung der untersuchten Probengase konnte auch die von Maekawa et al. (2001) vorgeschlagene Methode nicht gewählt werden. Hiernach sollten Lerndaten einer großen Breite an Konzentrationen ermittelt und trainiert werden, um die Sub-stanzen unabhängig von ihrer Konzentration identifizieren zu können. Für Gemische wäre mit dieser Methode der Arbeitsaufwand extrem groß und eine Kalibrierung aufgrund überlappen-der Sensorsignale kaum möglich (Staples & Viswanathan, 2002). Bereits die Quantifizierung von Einzelkomponenten in Gemischen aus zwei von vier bekannten Gasen erfordert hohen rechnerischen Aufwand mit zwei hintereinander geschalteten Künstlichen Neuronalen Netzen (Negri & Reich, 2001). Mischungsverhältnisse einfacher Gemische aus zwei bekannten Kom-ponenten können bei entsprechendem Training der Daten auch mit der PCA erkannt werden (Jurs et al., 2000). Die Identifizierung von Einzelmustern in komplexen Gemischen stellt an-dererseits ein ungelöstes mathematisches Problem dar (Stetter & Penrose, 2002).

Maekawa et al. (2001) halten die PCA und Künstliche Neuronale Netze als Auswertemetho-den zur Beurteilung von gassensorisch gemessenen Gerüchen willkürlicher und wechselnder Konzentrationen sogar für ungeeignet.

Diskussion 99

Für Gasgemische ist es zudem umstritten, ob die Sensorreaktionen auf verschiedene Kompo-nenten sich additiv verhalten (Boeker, 2001; Heinert, 2000) oder ob sie interagieren und sich vollkommen anders verhalten als die Summe ihrer Einzelsignale (Ryan & Zhou, 2003; Strike et al., 1999). In den hier untersuchten Probengasen kann es folglich wegen ihrer komplexen Zusammensetzung zu Wechselwirkungen gekommen sein, die die Messgenauigkeit für ein-zelne vielleicht sehr charakteristische Komponenten erheblich reduziert haben können. Dies wäre z. B. der Fall, wenn wie bei Strike et al. (1999) durch eine im Wein vorkommende Etha-nolkonzentration die Nachweisgrenze für andere Komponenten sich um das tausendfache verschlechtert.

In den untersuchten Probengasen können somit wenig geeignete Konzentrationsbereiche und Wechselwirkungen der im Gasgemisch enthaltenen Komponenten zur Beeinträchtigung der Messgenauigkeit und der Auswertung geführt haben. Eine genaue Analyse der Gasgemische, der Konzentrationen und Wechselwirkungen ihrer Komponenten, wäre mit einem unrealisti-schen Aufwand verbunden gewesen. Der Ausweg wäre (auch hier) die Reduzierung des Vor-bereitungsaufwandes, eine Messung hoher Probenzahlen und eine Auswertung mit Künstli-chen Neuronalen Netzen, die weniger empfindlich auf nichtlineare Daten und auch auf Drifteffekte reagieren (Gardner & Bartlett, 1994). Diese Möglichkeit bestand für die hier vorgestellten Ergebnisse nicht, da weder die Anzahl der vorhandenen Werkstoffproben noch die Zeit für diese Anzahl von Untersuchungen ausge-reicht hätten. Auch konnte aufgrund der Vorgaben des Auftraggebers des F&E-Projektes nicht in entsprechender Weise in das Versuchsdesign eingegriffen werden. Die Datenanalyse erfolgte daher wie beschrieben mit der PCA und LDA.

4.2.5 Einfluss der Feuchte auf die Messgenauigkeit

Die relative Feuchte des Messgases beeinflusst die Messergebnisse entscheidend und kann die Wiederfindung einer Substanz erschweren oder verhindern (Delpha et al., 2001; González Martín et al., 1999; Heining, 1999; Rossel et al., 1999; Strike et al., 1999; Zeppa & Gerbi, 2001). Die hier diskutierten Messungen mussten bei hohen Luftfeuchten vorgenommen wer-den, da Kulturen aktiver Mikroorganismen nur bei hohen Luftfeuchten untersucht werden können (Claeson, 2006).

An der Elektronischen Nase ENO-1 wurden außerhalb der hier beschriebenen Arbeit Mes-sungen von reinem Wasser mit angefeuchteter synthetischer Luft als Null- und Trägergas durchgeführt (Abbildung 4-1). Die gemessenen Sensorsignale wichen nicht signifikant von den Nullwerten der Sensoren ab, vermutlich bedingt durch die Kalibrierung mit feuchter syn-thetischer Luft. Ein direkter Einfluss der Feuchte auf die Messergebnisse durch seinen Eigen-geruch bzw. als Komponente des Gasgemisches (vgl. Abbildung 1-2) scheidet damit für die in

100 Diskussion

dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen aus. Prinzipiell ist jedoch mit einer deutlichen Reaktion auch auf reines Wasser zu rechnen, wie sie von Gibson et al. (1997) beobachtet wurde.

A. bidest.

0,5

0,7

0,9

1,1

1,3

1,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Abbildung 4-1: Niedrige Messwerte von A. bidest. bei einer Kalibrierung mit angefeuchteter synthetischer Luft als Nullgas. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des relativen Leitwerts (G0/G) der Sen-soren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Ein indirekter Einfluss von Feuchte auf die Messergebnisse, bei dem sich die Sensorantwort auf eine Substanz durch die Feuchte verändert (Delpha et al., 2001), kann dagegen nicht aus-geschlossen werden. Bei den in dieser Arbeit untersuchten Messgasen handelte es sich um Gemische. Der Einfluss von Feuchte auf einzelne Gaskomponenten kann nach Delpha et al. (2001) verschieden sein. Dadurch wird die Frage nach dem Einfluss der Feuchte auf die Messergebnisse der Gasgemische sehr komplex. Bisher existieren lediglich Lösungsansätze, die den experimentellen Bereich betreffen. So sollte die Feuchte möglichst konstant gehalten werden (González Martín et al., 1999; Nagle et al., 2003) oder durch eine geeignete Vorbe-handlung entfernt werden (Nakamoto, 2003; Stetter & Penrose, 2002). Durch Vorbehandlun-gen, die aus dem Messgas die Feuchte entfernen, können aber auch entscheidende andere Gaskomponenten verloren gehen (Kuske et al., 2005). Durch die Befeuchtung der in dieser Arbeit als Null- und Trägergas verwendeten synthetischen Luft wurde die Feuchte auf hohem Niveau möglichst konstant gehalten, vollkommen einheitliche Feuchtewerte konnten aber

Diskussion 101

nicht garantiert werden. Ein gewisser Einfluss der Feuchte auf die Messgenauigkeit und Re-produzierbarkeit durch eine leicht schwankende Feuchte kann somit nicht ausgeschlossen werden.

4.2.6 Datenauswertung mit der PCA und LDA

Die zur Auswertung eingesetzte PCA dient der Dimensionsreduzierung multivariater Daten auf einen zwei- bzw. dreidimensionalen Graphen und bietet eine erste Übersicht der Messer-gebnisse (Stetter & Penrose, 2002; Wold et al. 1987). Die PCA ist in erster Linie ein Klassifi-zierungswerkzeug, ihre Eignung für quantitative Aussagen wird unterschiedlich bewertet. Nach Montag et al. (2001) ist mit der PCA keine quantitative Bestimmung durchführbar. Da-gegen räumen Jurs et al. (2000) eine Eignung der PCA zur quantitativen Bestimmung ein. In dieser Arbeit wurden zwei Konzentrationen von Aceton in Wasser untersucht und konnten mit der PCA klassifiziert und unterschieden werden. Die PCA ist aber nicht dazu geeignet, signifikante Unterschiede von Messdaten deutlich zu machen (Olafsdóttir et al., 2000). Eine Auswertung von Daten mit geringen signifikanten Differenzen kann in der PCA trotzdem zu klar voneinander getrennten Klassen führen. Erkennbar wurde dies besonders beim Vergleich der untersuchten Mikroorganismen auf Werkstoff 1. Trotz fehlender signifikanter Unterschie-de wurde mit der PCA eine exakte Klassifizierung und Trennbarkeit der verglichenen Daten-sätze erzielt (vgl. Tabelle 3-3).

Aufgrund ihrer Eigenschaft, lediglich die Verhältnisse der untersuchten Datensätze zueinan-der darstellen zu können, aber keine absoluten Ergebniswerte zu erzielen, gelten die mit einer PCA gewonnenen Aussagen ausschließlich für die untersuchte Fragestellung. Die gewonne-nen Aussagen können nicht auf andere Fragestellungen übertragen werden (Stetter & Penrose, 2002). Alle in dieser Arbeit untersuchten Reinkulturen und Mischkulturen ließen sich einzeln mit Hilfe der PCA deutlich von unbesiedelten Kontrollen unterscheiden. Eine PCA mit einer Klasse für die unbesiedelten Kontrollen aller Werkstoffe und einer Klasse für alle mit Rein-kulturen und Mischkulturen besiedelten Werkstoffe ergibt zwar getrennte Cluster, die aber sehr dicht beieinander liegen (Abbildung 4-2). Im Gegensatz zu den Einzelanalysen erzielte diese Gesamtanalyse eine weniger klare Trennung der Cluster unbesiedelter und besiedelter Proben.

Aufgrund des subjektiven Charakters der PCA sollte jede Analyse mit Datensätzen überprüft werden, die nicht zur Berechnung der PCA verwendet wurden. Eine solche Überprüfung der PCA wurde in dieser Arbeit nur für den Aceton-Standard und die Kontrollen von Werkstoff 1 durchgeführt. Für die übrigen Vergleiche waren zu wenig Datensätze vorhanden, um sie zu halbieren und jeweils eine Hälfte für die Klassifizierung und eine Hälfte für Überprüfung zu verwenden.

102 Diskussion

Abbildung 4-2: Geringe Trennbarkeit der nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffe. PCA aller in dieser Arbeit untersuchten unbesiedelten Kontrollen im Vergleich zu allen besiedelten Werkstoffen. Unbesiedel-te Kontrollen:�; Besiedelte Werkstoffproben: �.

Die LDA ist wie die PCA eine Methode zur Auswertung multivariater Daten, der Fokus der LDA liegt aber auf der Differenz der gebildeten Klassen (Jurs et al., 2000). Auch die Ergeb-nisse der LDA sollten mit nicht verwendeten Datensätzen überprüft werden (Jurs et al., 2000). Es gilt wie bei der PCA, dass die Ergebnisse der Analyse ausschließlich auf die untersuchten Klassen zutreffen und nicht auf andere Fragestellungen übertragbar oder extrapolierbar sind. Bei einer veränderten Fragestellung muss auch eine neue Analyse mit den entsprechenden Datensätzen durchgeführt werden.

Eine LDA des in Abbildung 4-2 dargestellten Vergleichs bestätigte das Ergebnis der PCA. Eine ausreichende Trennbarkeit der Klassen war gegeben, allerdings gab es auch in der LDA geringe Überschneidungen der Klassen, so dass in der Überprüfung einige Probenwerte (1,3 %) nicht korrekt zugeordnet werden konnten. Wie bei der PCA führten die Ergebnisse der LDA bei der Analyse der einzelnen Wertepaare unbesiedelte Kontrolle - Reinkultur oder unbesiedelte Kontrolle - Mischkultur dagegen fast durchgehend zu einer klareren Trennung.

Diskussion 103


In Hinblick auf Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit werden Elektronische Nasen häufig als unzuverlässig bemängelt. Auch die Überprüfung von Messergebnissen der Elektronischen Nase ENO-1 ergab eine nicht zufriedenstellende Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit, die durch die folgenden Faktoren verursacht sein kann:

�� Eine mangelnde Konstanz der Messsignale mehrerer Sensoren über längere Zeiträume führt wahrscheinlich zu nicht direkt vergleichbaren Ergebnissen bei Versuchswiederho-lungen.

�� Die Reaktion verschiedener nicht selektiver Sensoren auf die gleiche Komponente im Messgas führt zu interkorrelierenden Signalen und damit zu erhöhten Fehlern durch auf-summiertes Hintergrundrauschen.

�� Versuchsbedingte Schwankungen der Feuchte des Trägergases können zu Ungenauigkei-ten führen.

�� Nicht alle Messgaskomponenten liegen im linearen Messbereich der Sensoren vor. Die Folgen sind eine verringerte Messgenauigkeit für diese Komponenten und Schwierigkei-ten bei einer Auswertung mit der PCA und LDA.

�� Bei Gasgemischen kann durch die Einwirkung einer Komponente der Messbereich einer anderen Komponente stark beeinträchtigt werden. Im schlechtesten Fall werden dadurch charakteristische Substanzen durch wenig charakteristische Komponenten überlagert.

Da die Reproduzierbarkeit der mit der Elektronischen Nase ENO-1 erzielten Ergebnisse nicht als komplett gesichert angesehen werden kann, sollten die in dieser Arbeit gewonnenen Er-gebnisse eher als Tendenzen angesehen werden. Diese Tendenzen ließen sich jedoch teilweise durch die Arbeiten anderer Autoren bestätigen.

Die gewählten statistischen Methoden PCA (Hauptkomponentenanalyse) und LDA (Lineare Diskriminanzanalyse) werden zur Auswertung multivariater Daten, wie sie mit Sensorarrays Elektronischer Nasen gewonnen werden, genutzt. Die PCA dient der Darstellung von mög-lichst viel Informationen aus den analysierten Datensätzen und bietet einen Überblick über die Ergebnisse, während die LDA schwerpunktmäßig die Differenz der in Klassen zusammenge-fassten Datensätze ausdrückt.

Beide Methoden haben gemeinsam, dass die Ergebnisse einer Analyse ausschließlich für die untersuchte Fragestellung gelten und nicht übertragbar sind. Zudem sollten für beide Metho-den lineare Daten vorliegen. Daten aus nicht linearen Messbereichen wie sie in dieser Arbeit wahrscheinlich gemessen wurden (s. oben), bereiten in der Auswertung Schwierigkeiten. Trotz der geringen Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit waren die Ergebnisse der Über-prüfung von PCA und LDA mit nicht analysierten (also unbekannten) Datensätzen ver-gleichsweise gut.

104 Diskussion

4.3 Unbewachsene Kontrollen und bewachsene Werkstoffe

4.3.1 Veränderungen der Sensorsignale bei einer Besiedlung

Eine zentrale Fragestellung dieser Arbeit lautete, ob sich mit Mikroorganismen bewachsene Werkstoffe von unbewachsenen Kontrollen anhand ihrer VOC und damit anhand der Sensor-signale der Elektronischen Nase ENO-1 unterscheiden lassen. Bei allen Messungen kam es durch die Besiedlung der Werkstoffe zu einer Veränderung des Signalprofils der Sensoren. In Abhängigkeit von der Sensorempfindlichkeit und Organismenart stiegen die Signale der meis-ten Sensoren mit der Besiedlung an. Es war also in allen untersuchten Fällen eine Unterschei-dung der unbesiedelten Werkstoffkontrollen von den besiedelten Proben möglich. Auch Gib-son et al. (1997) beobachteten eine Veränderung der Sensorsignale einer Elektronischen Nase durch die Besiedlung von Medium mit verschiedenen Mikroorganismenarten. Keshri et al. (2002) wiesen frühzeitig das Wachstum von Schimmelpilzen in Brot anhand der veränderten VOC mit einer Elektronischen Nase nach. Dabei war der Zeitpunkt der Nachweisbarkeit von Schimmelpilzen im Brot gegenüber nicht schimmeligem Brot abhängig von der Art des Pilzes und seiner arttypischen Wachstumsgeschwindigkeit.

Die Ursachen für die Veränderung von VOC und die damit verbundene Veränderung der Sen-sorsignale einer Elektronischen Nase aufgrund von Mikroorganismenwachstum sollen in den nachfolgenden Abschnitten genauer erläutert werden.

4.3.2 Ursachen für veränderte Sensorsignale bei einer Besiedlung

4.3.2.1 Emissionen aus dem Werkstoff und dem Medium

Eine der möglichen Ursachen für den Anstieg der Sensorsignale durch das Wachstum von Mikroorganismen auf einem Medium oder einer anderen Unterlage ist die verstärkte Abgabe der darin bereits vorhandenen VOC (Korpi et al, 1998). Bei verschiedenen Baustoffen stieg alleine durch eine hohe Feuchte, wie sie in den hier dargestellten Untersuchungen auch erfor-derlich war, die Abgabe von VOC (Claeson et al., 2007). Lyew et al. (2001) beobachteten bei einem Befall von Kartoffeln mit Kartoffelfäule verursa-chenden Mikroorganismen einen Anstieg der VOC im Verlauf der Infektion. Die VOC erhöh-ten sich in ihrer Anzahl, aber auch bei gesunden Kartoffeln nachgewiesene VOC stiegen in ihrer Konzentration an. Als ein sicherer Marker für eine fortschreitende Kartoffelfäule wurde der Anstieg dieser auch bei gesunden Kartoffeln nachgewiesenen VOC gewertet. Dabei han-delte es sich z. B. um flüchtige Amine wie auch Ammoniak (de Lacy Costello et al., 2000). Für einen solchen Anstieg der VOC aus den Werkstoffen spricht die in dieser Arbeit gemach-

Diskussion 105

te Beobachtung, dass die Sensorsignale bei einer Besiedlung gleich blieben oder stiegen, sich aber nicht umkehrten (vgl. 3.4.5).

Es besteht aber auch die Möglichkeit, dass die Abgabe bestimmter VOC aus einem Material durch eine mikrobielle Besiedlung abnimmt. Dieser Fall wurde für die Emission von Aldehy-den aus Baumaterialien beschrieben. Die Ursache für die beschriebene Abnahme ist ungeklärt (Korpi et al., 1998).

Ein Anstieg der Eigenausgasung durch die Besiedlung der Werkstoffe als mögliche Ursache für die erhöhten Sensorsignale bestätigen Untersuchungen von Heide Grafe und Peter Beh-rendt (EADS & UFT, 2005). In den Untersuchungen wurden verschiedene von Werkstoff 1 abgegebene VOC gaschromatographisch analysiert. Dabei wurde bei einigen vom unbehan-delten Werkstoff ausgegasten VOC ein Anstieg durch eine Besiedlung mit Penicillium expansum nachgewiesen, der nicht allein durch das Hefeextraktmedium bedingt war, in dem die Mikroorganismen suspendiert wurden. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die zur Desinfektion des Werkstoffs eingesetzte Behandlung mit Propanol die Abgabe der VOC erhöhte, jedoch in einem geringeren Maße als die Besiedlung mit Penicillium expansum. Bei einer Kultivierung von Penicillium expansum auf einem anderen Medium und ohne Werkstoff 1 wurden einige dieser VOC nicht nachgewiesen. Da die Abgabe flüchtiger Stoffwechselprodukte durch Mikroorganismen medienabhängig ist (Chang et al., 1997; Claeson et al., 2002; Fiedler et al., 2001; Meruva et al. 2004), kann die verschiedene Zusam-mensetzung der VOC in dem andersartigen Medium begründet sein. Es ist aber auch möglich, dass die betreffenden VOC aus dem Werkstoff 1 ausgasten und die Emission durch die Be-siedlung mit Penicillium expansum verstärkt wurde. Die Ursache hierfür kann ein mikrobiel-ler Angriff auf das Material sein, der zu einer Diffusion von Bestandteilen an die Material-oberfläche führt (Flemming, 1994). Bei einigen dieser diffundierenden Bestandteile kann es sich um flüchtige Substanzen handeln. Die Besiedlung von Werkstoff 1 mit Penicillium expansum kann somit zu einer Steigerung der Emission von VOC aus dem Werkstoff geführt haben.

Auf das als Nährstoffgrundlage und Suspensionsmittel verwendete Hefeextraktmedium kön-nen diese Schlussfolgerungen zur Eigenausgasung nicht übertragen werden. Zwar emittierte mit Hefeextraktmedium überschichteter Werkstoff 1 VOC in größeren Konzentrationen, doch verringerte sich bei einigen VOC die Konzentration in Folge des Wachstums von Penicillium expansum (EADS & UFT, 2005). Während also möglicherweise durch einen Bewuchs einige VOC aus dem Hefeextraktmedium vermehrt emittiert wurden, könnte es andererseits auch zu einer Bildung dieser VOC durch die Mikroorganismen oder zu einer Umsetzung in andere Verbindungen gekommen sein.

106 Diskussion

4.3.2.2 Gasförmige Stoffwechselprodukte der Organismen

Mikroorganismen produzieren gasförmige Stoffwechselprodukte, zu denen die MVOC (Microbial Volatile Organic Compounds) gehören (Lorenz, 2001; Schiffmann et al., 2000; Schleibinger & Rüden, 1999). Die Art der gebildeten MVOC ist abhängig von der Spezies, ihrem Wachstumsstadium und den Umgebungsbedingungen wie z. B. dem bewachsenen Me-dium oder Material (Bachinger et al., 1998; Claeson & Sunesson, 2005; Kuske et al., 2005). Diese ausgeschiedenen flüchtigen Verbindungen tragen zu den gassensorischen Unterschie-den zwischen unbesiedelten und besiedelten Werkstoffen bei, wie sie in dieser Arbeit nach-gewiesen wurden.

Dies belegen gaschromatographische Untersuchungen des mit Penicillium expansum besiedelten Werkstoffes 1, in denen Dimethyldisulfid allein bei der besiedelten Probe gefunden wurde. Mit 2-Propanol und Wasserstoffperoxid behandelter sowie unbehandelter Werkstoff 1 gab kein Dimethyldisulfid ab. Auch die Überschichtung von Werkstoff mit Hefeextraktmedium führte zu keiner Dimethyldisulfid-Emission. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass es sich bei dieser Verbindung um ein echtes Stoffwechselprodukt von Penicillium expansum handelte und nicht um eine Ausgasung des Werkstoffes. Nach Lorenz (2001) fällt Dimethyldisulfid unter die typischen MVOC, die von Schimmelpilzen abgegeben werden. Dimethyldisulfid wurde in einer Untersuchung verschiedener Schimmelpilze auf zwei Nährmedien und zwei Holzarten bei Mucor sp. und bei Penicillium expansum als MVOC identifiziert (Fiedler et al., 2004). In einer Arbeit von Claeson et al. (2002) war Dimethyldisulfid die einzige Verbindung, die von Schimmelpilzen auf allen untersuchten Medien gebildet wurde. Neben den Eigenausgasungen der Werkstoffe trägt die Abgabe von flüchtigen Stoffwechsel-produkten damit zu den gassensorischen Unterschieden zwischen unbesiedelten und besiedel-ten Werkstoffen bei.

4.3.2.3 Nachweis von mikrobiellem Wachstum mit Gassensoren

In dieser Arbeit wurden mit der Elektronischen Nase ENO-1 in allen Fällen eindeutige Unter-schiede zwischen besiedelten Werkstoffen und unbesiedelten Kontrollen gemessen. Die Ursa-chen für diese Unterschiede können, wie in Abschnitt 4.3.2.1 und 4.3.2.2 erläutert, einerseits auf einer vermehrten Ausgasung der Werkstoffe selbst durch den mikrobiellen Bewuchs be-ruhen und andererseits auf der Abgabe von MVOC durch die Mikroorganismen.

Untersuchungen von MVOC mit Elektronischen Nasen wurden in verschiedensten Arbeiten und mit unterschiedlichen Zielsetzungen beschrieben (u. a. von: Brandgård, et al., 2001; Canhoto et al., 2004; Keshri et al., 2002; Kuske et al., 2005; McEntegart, 2000; Navrátil et al., 2004; Pavlou et al., 2004).

Diskussion 107

Nach gaschromatographischen Untersuchungen von Heide Grafe und Peter Behrendt (EADS & UFT, 2005) produzieren die in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen Verbindungen aus den folgenden Stoffgruppen: Alkohole, Aldehyde, Ketone, Ether, Heterocyclen, schwe-felhaltige Verbindungen, verschiedene Kohlenwasserstoffe und Terpene. Das in die Elektro-nische Nase ENO-1 eingebaute Sensorarray ist u. a. empfindlich für BTX-Aromate, Alkane und andere Kohlenwasserstoffe, organische Schwefelverbindungen, Alkohole, Aceton und weitere Lösungsmittel (vgl. Tabelle 2-1). Damit sind weite Bereiche der Stoffgruppen, die von den untersuchten Mikroorganismen gebildet werden, abgedeckt. Hinzu kommt eine Emp-findlichkeit der Sensoren für Ammoniak und Schwefelwasserstoff, die ebenfalls als unspezifi-schere Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen freigesetzt werden können (Claeson, 2006; Madigan et al., 1997). Die in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen wurden in Hefeextraktmedium auf die Werkstoffe aufgebracht, verfügten dadurch über eine gute Nährstoffversorgung und reagierten mit einer gut messbaren Bildung flüchtiger Stoffwechselprodukte. Auch andere erfolgreiche Untersuchungen mikrobiellen Wachstums mit Gassensoren erfolgten unter günstigen Wachs-tumsbedingungen für die Mikroorganismen. Die Mikroorganismen wurden auf Nährmedien inkubiert und anschließend gemessen (Pavlou et al., 2002; Schiffmann et al., 2000; Serneels et al., 2004). Andere viel versprechende Untersuchungen von Mikroorganismen unter nähr-stoffreichen Bedingungen fanden in der Herstellung von Milchprodukten statt (Cimander et al., 2002; Marilley & Casey, 2004; Navrátil et al., 2004). Mikrobielle Kontaminationen auf Papier waren nach einem Wachstum bei Luftfeuchten von 75 und 100 % gassensorisch er-kennbar (Canhoto et al., 2004). Eine völlig andere Situation stellt sich bei der Messung von MVOC in Innenräumen dar. Auf Baumaterialien stehen den Mikroorganismen andere Nährstoffe in anderer Zusammensetzung und häufig deutlich niedrigeren Konzentrationen zur Verfügung. Die günstigen Bedingungen auf den künstlichen Nährmedien führen zur Bildung hoher Mengen von VOC, die in ihrer Art und Konzentration nicht mit auf Baumaterialien gebildeten VOC zu vergleichen sind (Clae-son, 2006; Schleibinger et al., 2005). Die große Vielfalt der MVOC, ihre geringe Konzentra-tion in der Innenraumluft und chemische Quellen für vermeintliche MVOC lassen die Auto-ren zu dem Schluss kommen, dass die Messung von MVOC nicht als Anzeiger für Pilzbelastungen in Innenräumen geeignet ist. Auch der gassensorische Nachweis war auf-grund gering konzentrierter MVOC und dominierender VOC aus anderen Quellen bisher nicht erfolgreich. Anreicherungsmethoden mit adsorbierenden Stoffen könnten zwar zur Auf-konzentrierung spezifischer MVOC als Indikatorverbindungen genutzt werden, gleichzeitig würden aber auch unspezifische VOC angereichert (Kuske et al., 2005). Die Einzelmuster spezifischer MVOC können von den unspezifischen VOC in einem komplexen Gemisch bis-her jedoch nicht getrennt werden (Stetter & Penrose, 2002). Eine direkte Messung mikrobiel-ler Kontaminationen in Innenräumen mit einer Elektronischen Nase ist daher trotz der viel-versprechenden Laboruntersuchungen bisher nicht möglich. Bestimmte Bereiche im Innenraum der ISS verfügen über eine geringe Luftzirkulation, dazu gehören z. B. die Zwischenräume hinter den eingebauten Schränken (engl.: racks). Diese Be-

108 Diskussion

reiche sind schwer zugänglich und damit für eine visuelle Überprüfung auf mikrobielle Ver-unreinigungen kaum zu erschließen. Aufgrund der geringen Luftzirkulation könnten sich hier gasförmige Stoffwechselprodukte deutlich stärker anreichern und im Gegensatz zur normalen Innenraumsituation gassensorisch besser messbar sein. Der Nachweis dieser Annahme steht noch aus.

4.3.2.4 Zusammenfassung

Die Besiedlung der Werkstoffe führte zum Anstieg der Ausgasungen und war mit der Elekt-ronischen Nase ENO-1 eindeutig nachweisbar. Der Anstieg der abgegebenen gasförmigen Verbindungen wurde verursacht durch die Stoffwechselaktivität der Mikroorganismen. Einer-seits wurden flüchtige Stoffwechselprodukte freigesetzt, anderseits kann das mikrobielle Wachstum eine erhöhte Eigenausgasung von Werkstoffmaterial und Hefeextraktmedium her-vorrufen. Unter günstigen Wachstumsbedingungen bei ausreichender Nährstoffzufuhr können Mikroor-ganismen erfolgreich mit Gassensoren nachgewiesen werden. Unter weniger günstigen Be-dingungen wie bei einem Wachstum in Innenräumen sind gassensorische Messungen zum Nachweis mikrobieller Kontaminationen nach dem jetzigen Stand der Technik eher ungeeig-net. Bei abweichenden Situationen wie einer Anreicherung gasförmiger Stoffwechselprodukte in Bereichen der ISS mit geringem Luftaustausch könnte ein gassensorischer Nachweis dage-gen möglich sein.

4.4 Gassensorische Unterschiede der Mikroorganismenarten

4.4.1 Differenzierung mikrobieller Gattungen und Gruppen

In dieser Arbeit wurden vier verschiedene Mikroorganismen-Arten auf dem Werkstoff 1 kul-tiviert, mit zwei dieser Mikroorganismen-Arten wurden zusätzlich die Werkstoffe 4 und 5 besiedelt. Bei den untersuchten Arten handelte es sich um Organismen aus zwei Bakteriengat-tungen und aus zwei Schimmelpilzgattungen. Pseudomonas fluorescensens gehört der �-Gruppe der Proteobacteria an, während Bacillus polymyxa zu den grampositiven Bakterien zählt. Die Schimmelpilze Aspergillus niger und Penicillium expansum sind systematisch den Fungi imperfecti zugeordnet. Die Organismen gehören zu zwei verschiedenen Domänen in der Systematik, den Bacteria und den Eukarya. Vor allem die Bakterien und die Schimmelpil-ze sind damit taxonomisch sehr verschieden. Die Auswahl der Organismen für die vorgestellten Untersuchungen erfolgte allerdings weni-ger nach taxonomischen Gesichtspunkten als nach praxisrelevanten Aspekten, die bereits in Abschnitt 1.5 näher erläutert wurden. Die grundsätzliche Eignung der Organismen für gassen-sorische Messungen wurde in Voruntersuchungen bestätigt.

Diskussion 109

Nach einer Auswertung der Messdaten mit der PCA und der LDA waren bei gleichen Werk-stoffen die vier bzw. zwei untersuchten Gattungen eindeutig verschieden. Es existieren zahl-reiche Veröffentlichungen, die diese Ergebnisse bestätigen. Dabei waren bei gassensorischen Untersuchungen von Keshri et al. (2002) die Unterschiede zwischen Gattungen deutlicher als innerhalb der Gattungen, und diese Unterschiede traten im Verlauf der Kultivierung zwischen Gattungen früher auf als innerhalb der Gattungen. Schiffmann et al. (2000) und Serneels et al. (2004) differenzierten erfolgreich Bakterien und Schimmelpilze verschiedener Gattungen anhand der Messdaten einer Elektronischen Nase. Zwei Stämme der Spezies Escherichia coli erwiesen sich bei gassensorischen Messungen als sehr ähnlich, während ein Stamm der Gattung Enterobacter von ihnen deutlich verschieden war (McEntegart et al., 2002). Erreger von Lungenerkrankungen (Mycobacterium tuberculosis und Pseudomonas aeruginosa) ließen sich von Pavlou et al. (2004) gassensorisch nicht nur in Nährmedien sondern auch in vivo unterscheiden. In gaschromatischen Untersu-chungen einer Vielzahl von Milchsäurebakterien ließen sich diese anhand der Anzahl und Zusammensetzung ihrer gebildeten VOC eingruppieren (Mauriello et al., 2001).

Die in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen gehören taxonomisch unterschiedlichen Gruppen an. Entsprechend ihrer verschiedenartigen metabolischen Eigenschaften und Taxo-nomie setzten sie erwartungsgemäß voneinander abweichende Spektren flüchtiger Stoffwech-selprodukte frei. Heide Grafe und Peter Behrendt (Zentrum für Umweltforschung und Um-welttechnologie an der Universität Bremen - UFT) führten gaschromatische Untersuchungen zur MVOC-Bildung der in dieser Arbeit beschriebenen Mikroorganismen durch (EADS & UFT, 2005).

Auf den herkömmlichen Medien (Malz-Pepton-Agar für die Schimmelpilze und Nähragar für die Bakterien) wurde eine Vielzahl von VOC nachgewiesen. Dabei unterschieden sich die von den vier verschiedenen Mikroorganismenarten abgegebenen VOC erheblich in ihrer Zusam-mensetzung (vgl. Tabelle 4-1).

Lediglich Aceton und 2-Propanol waren bei allen vier Arten der Mikroorganismen nachweis-bar, die übrigen untersuchten Verbindungen wurden nicht von allen Arten freigesetzt. Die Bakterien bildeten insgesamt 8 identische und 21 verschiedene Verbindungen, die Schimmel-pilze gaben insgesamt 6 identische und 17 verschiedene Verbindungen ab. Damit ist die Klas-sifizierung der Bakterien und der Schimmelpilze untereinander anhand ihrer flüchtigen Stoff-wechselprodukte auf der Gattungs-Ebene vergleichsweise gut abgesichert. Schwierig zu beurteilen sind jedoch die Unterschiede, die durch die verschiedenen verwendeten Nährme-dien für Bakterien (Nähragar) und Schimmelpilze (Malz-Pepton-Agar) bedingt sind. Unter-schiede zwischen den Bakterien und Schimmelpilzen können daher auch in den verschiede-nen Substraten begründet sein (vgl. 4.5). Für die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen wurden aus diesem Grund alle Mikro-organismen in dem gleichen Medium (Hefeextraktmedium, vgl. 2.3.2) suspendiert und auf die Werkstoffe aufgebracht.

110 Diskussion

Tabelle 4-1: MVOC der in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen (EADS & UFT, 2005). Die Unter-suchungen erfolgten nach dreitägiger Kultivierung (3 d) auf Malz-Pepton-Agar bei den Schimmelpilzen und nach zweitägiger Kultivierung (2 d) auf Nähragar bei den Bakterien.

VOC Aspergillus niger (3 d)

Bacillus polymyxa

(2 d)


(3 d)

Pseudomomas fluorescens

(2 d) 1-Octen-3-ol X 2-Butanon X X 2-Me-Butanal X 2-Me-Butanol X X 2-Methylfuran X 2-Propanol X X X X 3-Me-Butanal X X 3-Me-Butanol X X 3-Octanol X Acetaldehyd X Aceton X X X X Acetyl-Pyrazin X Aminocaprolactam X X Benzaldehyd X X Bismethylthiomethan Butanal X C12 Alkan-Epoxid X Cresol X Di-Me-bicyclo-Oct-3-en-2-on

X

Di-Me-Bu-Pyrimidin X Di-Me-Et-Pyrazin X Di-Me-Pentanon X Di-Me-Propanthiol X Dimethyldisulfid X X Dimethyltrisulfid X Dodecenal X Ethanol X Ethylpropylether X Furan X X Hexadecan X X Hexan X Isobutylalkohol X Isobutylformiat X Me-Et-Me-Prop-Pyrazin X Me-Et-Phenol X Me-Propyl-Pyrazin X Methylanisol X Methylformiat X Methylfuran X Methylheptenon X Methylpropanol X Methylpropylformiat X Octanon X Pentadecan X X Phenol X ß-Bisabolen X ß-Farnesen X Tetradecanal X Tri-Me-Phenol X X Undecen X

Diskussion 111

Grundsätzlich eignen sich den Ergebnissen der GC/MS-Analyse zufolge gassensorische Mes-sungen, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurden, zur Unterscheidung von Mikroorga-nismen verschiedener Gattungen unter Laborbedingungen. Unter nährstoffarmen Bedingun-gen vieler natürlicher Standorte ist die MVOC-Bildung der Mikroorganismen jedoch gering und eine Differenzierung verschiedener Gruppen oder Arten nur bedingt oder gar nicht mög-lich (Claeson, 2006).

4.4.2 Differenzierung von Mikroorganismen-Arten

Auch Arten innerhalb von Gattungen ließen sich unter geeigneten Bedingungen anhand ihrer flüchtigen Stoffwechselprodukte differenzieren. In vorbereitenden Untersuchungen zu dieser Arbeit wurden jeweils zwei Arten einer Schimmelpilz-Gattung (Aspergillus niger und Aspergillus versicolor) sowie einer Bakterien-Gattung (Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas putida) gassensorisch untersucht. Diese zwei Arten der Gattungen Aspergillus bzw. Pseudomonas ließen sich nach einer Auswertung mit der PCA eindeutig voneinander unterscheiden (EADS & UFT, 2005). GC/MS-Analysen verschiedener Pseudomonas-Spezies ergaben bei gleicher Kultivierung unterschiedliche Spektren von freiwerdenden VOC (Miller et al., 1973 a; Miller et al., 1973 b; Miller et al., 1973 c). Auch vergleichende Untersuchungen von Pseudomonas aeruginosa mit weiteren Arten der Gattung Pseudomonas ergaben Unter-schiede in den gebildeten VOC (Labows et al., 1980). Adamek et al. (1992) konnten für die Schimmelpilz-Arten Aspergillus flavus und Aspergillus oryzae keine spezifischen Unterschie-de bei GC/MS-Analysen feststellen. Dagegen lieferten GC/MS-Analysen von Fiedler et al. (2001) und Fischer et al. (1999) positive Ergebnisse bei der Unterscheidung verschiedener Aspergillus-Spezies. Neben Spektren der von den einzelnen Arten freigesetzten VOC identifi-zierten Fischer et al. (1999) auch eine Reihe von VOC, die ausschließlich von einer der unter-suchten Arten gebildet wurden. Sowohl für die Aspergillus-Arten A. candidus, A. fumigatus und A. versicolor als auch für die Penicillium-Arten P. crustosum, P. clavigerum, P. cyclopium und P. expansum wurden arttypische VOC identifiziert.

Die gassensorisch nachweisbaren Unterschiede der Arten Aspergillus niger und Aspergillus versicolor sowie Pseudomonas fluorescens und Pseudomonas putida stehen somit im Ein-klang mit den Ergebnissen anderer Autoren. Sie bedeuten, dass eine exakte Differenzierbar-keit verschiedener Arten einer Gattung unter Laborbedingungen möglich ist.

Neben weit verbreiteten flüchtigen Stoffwechselprodukten, die von einer Vielzahl von Mik-roorganismen in unterschiedlicher Konzentration ausgeschieden werden, bilden somit Mikro-organismen entsprechend ihrer Physiologie artspezifische flüchtige Substanzen. Die gassenso-rische Detektierbarkeit der Gesamtheit dieser flüchtigen Stoffwechselprodukte und damit auch die Klassifizierbarkeit der Mikroorganismen hängt ab von der Eignung des Sensorarrays

112 Diskussion

und der Konzentration der Substanzen. Pavlou et al. (2004) differenzierten mit einem Array aus 14 CP-Sensoren (Conducting Polymer Sensors) verschiedene Arten der Bakteriengattung Mycobacterium sp. in vitro.

Noch vielschichtiger wird die Verschiedenheit artspezifischer MVOC durch den Sachverhalt, dass ihre Bildung bei vielen Mikroorganismen vom Alter der Kultur abhängig ist (Adamek et al., 1992; Bachinger & Mandenius, 2001; Bjurman et al., 1997; Cimander et al., 2002; Navratil et al., 2004; Sunesson et al., 1996). Das bedeutet, dass in den einzelnen Wachstums-phasen verschiedene MVOC-Spektren gebildet und bestimmte, evtl. sehr spezifische Verbin-dungen nicht zu jeder Zeit von den Mikroorganismen abgegeben werden (vgl. Anhang 1, Abbildung A-2).

Bei entsprechenden biochemischen Eigenschaften können auch verschiedene Stämme einer Art anhand ihrer flüchtigen Stoffwechselprodukte unterscheidbar sein. Es kann sich dabei um verschiedene Ökotypen einer Art handeln (Cohan, 2002), die an bestimmte Standortbedin-gungen angepasst sind. GC/MS-Analysen von in der Käseproduktion genutzten Bakterien ermöglichten eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Stämmen einer Spezies anhand ihrer gasförmigen Aromakomponenten (Marilley & Casey, 2004). Schleibinger et al. (2005) führten gaschromatographische Untersuchungen an vier Schimmelpilzarten durch, die Unter-schiede in der MVOC-Bildung bei verschiedenen Stämmen der einzelnen Arten ergaben. Wilkins et al. (2003) fanden Unterschiede in den MVOC verschiedener Stachybotrys-Stämme einer Spezies, sowie eine Parallele zwischen der Abgabe von Mycotoxinen und flüchtigem Trichodien. Mit einem Array aus 14 Gassensoren ließen sich vier Stämme von Fusarium moniliforme und drei Stämme von Fusarium proliferatum differenzieren und ebenfalls Ver-bindungen zur Produktion von Mycotoxinen herstellen (Keshri & Magan, 2000). Auch ver-schiedene Stämme von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa (Casalinuovo et al., 2006), Staphylococcus aureus (Dutta et al., 2005) sowie von Ralstonia solanacearum und Xanthomonas campestris (Momol et al., 2004) konnten gassensorisch differenziert werden. Für die Anwendung auf bemannten Raumstationen könnte diese sehr genaue Differenzierung innerhalb der Arten zur Identifizierung besonders gefährlicher Stämme einer Art von Nutzen sein. Ein Beispiel hierfür wären enterohämorrhagische Stämme von Escherichia coli (EHEC).

Trotz dieser vielversprechenden Arbeiten sollte berücksichtigt werden, dass die Systematik von Mikroorganismen auf weit mehr Merkmalen beruht als der Zusammensetzung ihrer gas-förmigen Stoffwechselprodukte und es daher in ungünstigen Fällen zu Fehlklassifizierungen kommen kann. Auf die enorme Diversität und Variabilität selbst innerhalb einer Spezies wei-sen Veröffentlichungen wie die von Feldgarden et al. (2003) und Maharjan & Ferenci (2005) hin.

Diskussion 113

Wie bereits in Abschnitt 4.3.2.3 beschrieben, wird der gassensorische Nachweis mikrobieller Kontaminationen in Innenräumen durch die ausgesprochene Vielfalt und Variabilität der gas-förmigen Stoffwechselprodukte erschwert. Schon die kleine Anzahl der in dieser Arbeit unter-suchten Mikroorganismen überschneidet sich in der Auswertung mit der PCA teilweise. Zwei Organismen sind also im direkten Vergleich unterscheidbar (vgl. Erg.), bei einer gemeinsa-men Auswertung mehrerer Geruchsprofile in einer PCA ist eine korrekte Zuordnung jedoch nicht in allen Fällen möglich (Abbildung 4-3).

Abbildung 4-3: Messsignale der Elektronischen Nase ENO-1 ausgewertet als PCA. Die spezifischen VOC der Werkstoffkontrollen, verschiedener Reinkulturen und der beiden Mischkulturen reichen bei einer gemeinsamen Auswertung in einer PCA nicht für eine Unterscheidbarkeit und korrekte Zuordnung aus. Ausgewertet wurden unbesiedelte und besiedelte Proben des Werkstoffes 1 (beschichtetes Aluminium). Kontrollen: �; Aspergillus niger: ; Bacillus polymyxa: ; Penicillium expansum: �; Pseudomonas fluorescens: �; Bakteriendominierte Mischkultur: �; Pilzdominierte Mischkultur: �.

In der Planungsphase dieser Arbeit wurde noch davon ausgegangen, dass in der Raumluft sogar einzelne Spezies mikrobieller Kontaminationen gassensorisch erkennbar sein könnten. Entsprechend dieser Annahme wurde das Versuchsdesign ausgelegt. Anhand der erzielten Ergebnisse und der aktuelleren Arbeiten anderer Autoren (Claeson, 2006; Kuske et al., 2005; Schleibinger et al., 2005) wird jedoch klar, dass die hohe Variabilität und große Spezifität mikrobieller Emissionen für gassensorische Untersuchungen von Raumluft eher ein beträcht-liches Hindernis darstellen. Die gassensorische Überprüfung mikrobieller Kontaminationen von bemannten Raumstationen sollte daher nicht, wie ursprünglich gefordert, auf die Identifi-zierung einzelner Arten abzielen. Vielmehr sollte versucht werden, aufgrund der gassensori-schen Messungen einen Bestimmungsschlüssel mit Fragestellungen zu entwickeln, die jeweils mit „Ja“ oder „Nein“ zu beantworten sind. Der erste Schritt könnte die einfache Unterschei-dung „kontaminiert – unkontaminiert“ sein, wie sie in Abbildung 4-2 (S. 102) dargestellt ist. Als darauffolgender Schritt könnte die Frage „Pilz oder Bakterium?“ gestellt werden. In den

114 Diskussion

anschließenden Schritten sollte versucht werden, sich mit weiteren „Ja/Nein“ Antworten an die untersuchte Mikroorganismenart anzunähern. Bei einem solchen Ansatz müssten bereits beim Training Maßnahmen zur Verbesserung der Klassifizierbarkeit getroffen werden, wie die Messung hoher Probenzahlen, die Verringerung von Drifteffekten und störenden Hinter-gründen (z. B. aus der Umgebungsluft). Zudem müssten die Organismen für das Training unter identischen Bedingungen wie in den untersuchten Räumen kultiviert werden. Bei wech-selnden Umgebungen und nicht vollständig abschätzbaren Bedingungen ist diese Forderung jedoch fraglich und im besten Fall ein gassensorischer Nachweis mikrobieller Kontaminatio-nen, nicht jedoch einzelner Mikroorganismenarten, möglich.


Die Ergebnisse anderer Autoren bestätigen, dass unter geeigneten Bedingungen Mikroorga-nismen gassensorisch bis auf die Stamm-Ebene differenziert werden können. Sie führten ihre Untersuchungen in Kulturmedien oder in Materialien, in denen diese Organismen üblicher-weise wachsen, durch. In dieser Arbeit wurden Mikroorganismen sehr verschiedener Gattun-gen untersucht, die mit Hefeextraktlösung auf Baumaterialien für Raumstationen kultiviert wurden. Die Mikroorganismen waren gassensorisch deutlich differenzierbar. Die gassensori-schen Unterschiede beruhten auf den physiologischen Eigenschaften der untersuchten Mikro-organismen und der Abgabe artspezifischer Stoffwechselprodukte. Dies Ergebnis steht im Einklang mit den Aussagen der hier vorgestellten Literatur.

Für die Anwendung in der Untersuchung von Raumluft wirkt sich die hohe Variabiltät der mikrobiellen VOC erschwerend aus, da sich bei einem Training aller relevanten Mikroorga-nismen in der Auswertung mittels PCA nicht alle spezifischen Profile korrekt zuordnen las-sen. Für gassensorische Untersuchung von Innenräumen, bzw. bemannten Raumstationen sollte zunächst die Fragestellung kontaminiert – unkontaminiert zu Grunde gelegt werden. Zudem müssten Maßnahmen zur Steigerung der Reproduzierbarkeit der Daten getroffen wer-den und die Trainingsdaten einwandfrei übertragbar auf Raumluftumgebung sein. Die letzt-genannte Forderung ist in der Realität nur ansatzweise mit einem unverhältnismäßig hohen Aufwand erfüllbar.

Diskussion 115

4.5 Einfluss des Werkstoffes auf die gassensorische Messung

4.5.1 Unterschiede der untersuchten Werkstoffen

Die Werkstoffe 1, 4 und 5 wurden sowohl als unbesiedelte Kontrollen als auch besiedelt mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum untersucht. Während die unbesiedelten Kontrol-len von Werkstoff 4 und 5 sich in Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1 sehr ähnel-ten, war die unbesiedelte Kontrolle von Werkstoff 1 deutlich verschieden von Werkstoff 4 und 5. Die gleiche Beobachtung wurde auch bei einer Besiedlung mit Bacillus polymyxa ge-macht. Die Messergebnisse von Werkstoff 4 und 5 waren sehr ähnlich, indessen unterschie-den sich die Messergebnisse von Werkstoff 1 sichtlich von Werkstoff 4 und 5. Eine Besied-lung der Werkstoffe mit Penicillium expansum führte zu klaren gassensorischen Unterschieden zwischen allen drei Werkstoffen.

Die Sensorsignale der Elektronischen Nase ENO-1 wurden bei den Werkstoffen 1, 4 und 5 durch die Besiedlung mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum höher oder blieben gleich (s. Abbildung 3-30, Abbildung 3-31 und Abbildung 3-32). Diese Beobachtung deutet auf eine Zunahme nachweisbarer VOC aufgrund der Besiedlung hin. Da es sich bei den Sig-nalen der MOS-Sensoren um Summenparameter handelt (vgl. Abbildung 1-2), ist eine Aussa-ge über die Zusammensetzung des Gasgemisches nicht möglich. Die Abgabe einzelner VOC kann angestiegen sein und zusätzliche VOC können gebildet oder freigesetzt worden sein, während andere VOC möglicherweise auch durch eine Verstoffwechselung abgenommen haben. So diffundieren Additive aus Kunststoffen an die Oberfläche und können dort von Mikroorganismen verwertet werden (Flemming, 1994).

Die verschiedenen Einflussfaktoren der Werkstoffmaterialien auf die Emission flüchtiger Substanzen bei einer Besiedlung sollen in den folgenden Abschnitten näher erläutert und dis-kutiert werden.

116 Diskussion

4.5.2 Einflussfaktoren der Werkstoffe

4.5.2.1 Eigenausgasung

Im Vergleich zu den Werkstoffen 4 und 5 wurde bei dem Werkstoff 1 eine offenkundig höhe-re Eigenausgasung gemessen (vgl. Abbildung 3-30, Abbildung 3-31 und Abbildung 3-32). Exemplarische GC/MS-Analysen von Heide Grafe und Peter Behrendt ergaben eine Eigen-ausgasung von Butanol, Toluol, Caprolactam, Pentadekan und Alkan aus unbehandeltem Werkstoff 1. Bei einer Vorbehandlung mit Propanol, wie sie in dieser Arbeit zur Desinfektion der Werkstoffe vorgenommen wurde, kamen Propanol und Essigsäure als VOC hinzu. Durch eine Überschichtung des Werkstoffes 1 mit Hefeextrakt, dem für die Kultivierung eingesetz-ten Medium, wurde außerdem Propanal nachweisbar (EADS & UFT, 2005). Auf die Stoff-gruppen, zu denen die genannten Verbindungen gehören, reagieren die Sensoren 1, 2, 5, 6 und 8 (vgl. Tabelle 2-1). Neben Sensor 3 wurden bei eben diesen Sensoren höhere Ausschläge gemessen. Das erhöhte Sensorsignal von Sensor 3 kann durch eine Ausgasung von Ammoni-ak verursacht worden sein, hierfür liegen jedoch keine Daten zur Validierung vor.

Viele Medien, Werkstoffe und Baumaterialien setzen typische flüchtige Verbindungen frei (Chang et al., 1997; Claeson et al., 2002; Hodgson et al., 2002; Körner & Stroh, 2003; Kwok et al., 2003; Sunesson et al. 1997; Won et al., 2003). Diese Freisetzung kann durch eine mikrobielle Besiedlung ansteigen (vgl. 4.3.2.1). Die Gesamtheit der vom Material abgegebe-nen VOC bildet die typischen „fingerprints“ der unbesiedelten Werkstoffe. Bei einer Besied-lung tragen die Eigenausgasungen zu der Gesamtheit der Sensorsignale bei. Die Werkstoffmaterialien haben daher aufgrund ihrer Eigenausgasung einen entscheidenden Einfluss auf die Messergebnisse.

Für Werkstoff 1 waren trotz guten Wachstums der Mikroorganismen nur bei wenigen Senso-ren signifikante Unterschiede zu den unbesiedelten Kontrollen erkennbar. Die Sensorsignale waren auch bei den unbesiedelten Kontrollen sehr hoch. Bei Artvergleichen und Vergleichen von Reinkulturen mit Mischkulturen wurden ebenfalls wenige signifikante Unterschiede nachgewiesen. Die Messwerte von Werkstoff 1 wurden demnach auch bei einer Besiedlung mit Mikroorganismen stark durch Eigenausgasungen dominiert. Hierbei handelt es sich um einen Umstand, der auch von Kuske et al. (2005) für Messungen in Innenräumen beschrieben wird. Diese Beobachtung ist entscheidend für den Vergleich verschiedener Organismenarten sowie der Mischkulturen mit den Reinkulturen.

Bei Werkstoff 4 und Werkstoff 5 war die Eigenausgasung deutlich geringer, hier waren signi-fikante Unterschiede stärker vertreten (vgl. Tabelle 3-3, Abbildung 3-31 und Abbildung 3-32). Lediglich für Penicillium expansum wurden auf Werkstoff 4 aus in Abschnitt 4.5.2.2

Diskussion 117

näher erläuterten Gründen geringe signifikante Unterschiede zu den unbesiedelten Kontrollen gemessen.

Da Werkstoff 1 in der Praxis besonders wichtig ist, wurde die Mehrzahl der Untersuchungen mit diesem Werkstoff vorgenommen, diese Vorgehensweise hat sich aus den oben genannten Gründen als nachteilig erwiesen.

4.5.2.2 Einfluss der Werkstoffe auf die Physiologie der Mikroorganismen

Das von Mikroorganismen bewachsene Medium oder Material beeinflusst ihre Physiologie und folglich auch die Art und Menge der gebildeten MVOC entscheidend (Adamek et al., 1992; Borjesson et al., 1992; Claeson et al., 2002; Fiedler et al., 2001; Fischer et al., 1999; Meruva et al. 2004; Sunesson et al., 1997). Auf Oberflächen von bewachsenen Metallen und Kunststoffen kann es durch einen mikrobiellen Angriff zu Materialzerstörungen kommen, bei denen Bestandteile des Materials freigesetzt und von den Mikroorganismen verwertet werden (Alexander, 1999; El-Shafei et al., 1998; Flemming, 1994; Filip, 1989).

Mikrobieller Angriff auf Polyurethan

Der in dieser Arbeit untersuchte Werkstoff 1 besteht aus einem anodisierten Aluminium mit chromhaltiger Schutzschicht und einem weißen Polyurethan-Decklack. Polyurethan-Beschichtungen gelten als kratzfest, mechanisch belastbar, wasserfest und un-empfindlich für Chemikalien (Baumann, 1993).

Während nach der Literatur zu allgemeinen Materialeigenschaften Polyurethane als wider-standsfähig gelten, wird ihre Beständigkeit gegen biogene Materialzerstörung differenzierter betrachtet. Danach sind vor allem die Polyurethane des Polyester-Typs empfindlich für den mikrobiellen Abbau insbesondere durch Pilze (Alexander, 1999; Barratt et al., 2003). Die Mikroorganismen bilden Esterasen, die die Esterbindung des Polymers hydrolysieren. Poly-urethane des Polyether-Typs sind dagegen vergleichsweise unempfindlich für den mikrobiel-len Abbau (Nakajima-Kambe et al., 1999). Der mikrobielle Angriff auf das Polyurethan hat Rissbildungen und Verfärbungen zur Folge. Als verursachende Mikroorganismen wurden z. B. Aspergillus niger und bei ausreichender Nährstoffversorgung verschiedene Bakterien nachgewiesen (Flemming, 1994).

Auf dem mit Polyurethan beschichteten Werkstoff 1 war ein gutes Wachstum der kultivierten Mikroorganismen zu beobachten. Durch die Suspension der Impforganismen in Hefeextrakt (vgl. 2.3.2) war ein ausreichendes Nährstoffangebot vorhanden, das die Materialzerstörung von Polyurethan durch Bakterien begünstigt (Flemming, 1994). Somit ist es möglich, dass die untersuchten Mikroorganismen eine beginnende Materialzerstörung des Decklacks aus Poly-urethan auslösten. Damit können sich die vergleichsweise hohen Sensorsignale besiedelter

118 Diskussion

Proben des Werkstoffs 1 aus den Eigenausgasungen des Werkstoffes und aus den artspezifi-schen Stoffwechselprodukten der Mikroorganismen zusammensetzen. Eigenausgasungen des Werkstoffs können gegenüber den unbesiedelten Kontrollen durch eine mikrobielle Material-zerstörung verändert sein. Diese Materialzerstörung kann abhängig von den physiologischen Eigenschaften der besiedelnden Organismen-Art sein. Auf die artspezifischen Stoffwechsel-produkte üben sowohl die Verwertung des Hefeextraktmediums als auch aus dem Werkstoff möglicherweise freigesetzter Substanzen ihren Einfluss aus. Daher waren die Messergebnisse der untersuchten Mikroorganismen auf Werkstoff 1 mit seiner hohen Eigenausgasung den-noch deutlich verschieden.

Mikrobielle Korrosion von anodisiertem Aluminium

Werkstoff 4 besteht aus anodisiertem Aluminium. Die Passivschicht von anodisiertem Alu-minium entsteht durch eine elektrochemische Behandlung, bei der die korrosionshemmende Oxidbildung an der Oberfläche technisch verstärkt wird. Je nach Art des gewählten Verfah-rens kann gleichzeitig die Porösität und damit die Haftfähigkeit für Beschichtungen erhöht werden (Borucki, 1995, S. 124).

Während für Bacillus polymyxa auf den Werkstoffen 4 und 5 annähernd identische Sensorsig-nale gemessen wurden, waren bei einem Wachstum von Penicillium expansum deutliche durch den Werkstoff bedingte Unterschiede zu beobachten. Auf anodisiertem Aluminium (W4) wurden für Penicillium expansum eindeutig schwächere Sensorsignale ermittelt als auf Polycarbonat (W5) (vgl. Abbildung 3-31 und Abbildung 3-32). Auch erschien - als subjekti-ver Eindruck - das Wachstum von Penicillium expansum auf dem anodisierten Aluminium geringer als auf den anderen Werkstoffen.

Die letztgenannte Beobachtung deckt sich mit Untersuchungen verschiedener Materialober-flächen in einer Hähnchenschlachterei, die einen geringeren mikrobiellen Bewuchs auf Metall als auf Plastik und Gummi ergaben (Lindsay, 1996 ). Payne et al. (1998) konnten in Getrei-demühlen von Aluminiumbauteilen keine Pilze isolieren, während auf Bauteilen aus anderen Materialien Pilze nachweisbar waren.

Die Ursache für das abgeschwächte Wachstum und die geringeren Sensorsignale von Penicillium expansum auf Werkstoff 4 kann in einer Freisetzung von toxischen Aluminium-Ionen aus der Werkstoffoberfläche durch die Stoffwechselaktivitäten der Mikroorganismen liegen. Dabei ist sowohl die Adhäsion von Mikroorganismen an die Oberfläche als auch die mikrobielle Entfernung von Ionen aus dem Oxidfilm eines Metalls von der Art seiner Vered-lung abhängig (Maruthamuthu et al., 1996); Valcarce et al., 2002). Die Oxidschicht schützt anodisiertes Aluminium zwar vor Korrosion, allgemein gilt Aluminium aber als empfindlich für organische Säuren (Krist, 1969). Zudem geht mit der Ausbildung passivierender Oxid-schichten eine erhöhte Empfindlichkeit der Metalle für lokale Korrosion durch Loch,- Spalt-

Diskussion 119

und Spannungsrisskorrosion einher (Heitz, 1989). Die Passivschicht des Aluminiums kann durch mikrobielle Synthese von organische Säuren wie Zitronensäure, Isozitronensäure und �-Ketoglutarsäure lokal korrodiert werden (Videla, 1996).

Schimmelpilze wie der hier untersuchte Penicillium expansum setzen organische Säuren frei, bestimmte Wachstumsbedingungen wie Zuckerüberschuss und Mangel bestimmter Substan-zen steigern ihre Säureproduktion (Reiß, 1998; Roehr et al., 1992; Schlegel, 1992). In den meisten Fällen handelt es sich um organische Säuren aus dem Citratzyklus wie beispielweise Oxalat, Citrat und Gluconat. Anhand des pH-Indikators im Hefeextraktmedium, in dem die Mikroorganismen auf die Werkstoffe aufgebracht wurden, war bei dem hier beschriebenen Schimmelpilz Penicillium expansum ein eindeutiger Umschlag in den sauren Bereich erkenn-bar. Es ist aufgrund der Angaben in der Literatur wahrscheinlich, dass die beschriebene An-säuerung überwiegend auf der Bildung organischer Säuren beruhte. Die Freisetzung der orga-nischen Säuren führt zu einer Korrosion von Aluminium und aluminiumhaltigen Materialien durch Säureangriff und Chelatbildung (Berner & Berner, 1996; Reiß, 1998; Scheffer et al., 1976). Eben eine solche Säurekorrosion von Aluminium wurde vermutlich durch die Besied-lung von Werkstoff 4 mit Penicillium expansum ausgelöst. Das schwache Wachstum von Penicillium expansum lässt weiter vermuten, dass Aluminium in toxischen Konzentrationen in Lösung ging und den Schimmelpilz in seinen physiologischen Abläufen hemmte.

Die Toxizität von freigesetztem Aluminium ist in vielfältiger Weise dokumentiert. In den meisten Fällen wird sie in einen direkten Zusammenhang mit niedrigen pH-Werten gebracht. Erhöhte Aluminium-Konzentrationen sind toxisch für viele Pflanzen und Fische und können das Wachstum von Mikroorganismen hemmen (Berner & Berner, 1996; Garciduenas-Pina & Cervantes, 1996; Illmer & Schinner, 1999; Scheffer et al., 1976; Schlesinger, 1991; Wild, 1995). Die Mechanismen toxischer Wirkungen von Aluminiumverbindungen sind sehr um-fangreich für Böden und Gewässer beschrieben und dienen daher hier als Erklärungsmodell für die Hemmung von Penicillium expansum durch den Werkstoff 4. In Abhängigkeit vom pH-Wert bildet Aluminium im Boden verschiedene ionische Formen mit unterschiedlicher Toxizität aus. Mit sinkendem pH herrschen im Boden nacheinander Al(OH)2

+, AlOH2+ und Al3+ vor (Owino-Gerroh & Keter, 1993; Wild, 1995). Hohe Aluminium-Konzentrationen ver-bunden mit niedrigen pH-Werten hemmen die Sporenkeimung und die Mycelbildung von Pilzen, sowie das Wachstum von E. coli und verschiedenen Mikroalgen. Die Hemmeffekte steigern sich mit abnehmendem pH-Wert (Dursun et al., 2002; Gamila, 2004; Guida et al., 1991; Husaini et al, 1996;Wargo & Carey, 2001). Erhöhte Aluminium-Konzentrationen wir-ken sich u. a. in verringerten Enzymaktivitäten von ATPasen und einer abgeschwächten Bil-dung von Pektinasen bei Mikroalgen und Wasserpilzen aus (Chamier & Tipping, 1997; Husaini et al., 1996). In Böden hemmen hohe Aluminiumkonzentrationen die Stickstoffmine-ralisierung durch Mikroorganismen (Illmer et al., 1995). Aluminium bindet an Zellwände, Membranen und DNA von Mikroorganismen und konkurriert mit Eisen und Magnesium um deren Bindungsstellen (Garciduenas-Pina & Cervantes, 1996). Zudem besteht der Verdacht, dass Aluminium in hohen Konzentrationen mutagen auf bestimmte Mikroorganismen (z. B.

120 Diskussion

Rhizobium) wirkt (Wood, 1995). Die Empfindlichkeit für toxische Wirkungen von erhöhten Aluminiumkonzentrationen ist artabhängig und kann unter entsprechenden Bedingungen zur Selektion Aluminium-toleranter Arten führen (Chamier & Tipping, 1997; Illmer & Schinner, 1999; Lesueur et al., 1993; Wargo & Carey, 2001). Auch können in Böden bakterielle Stoff-wechselprodukte den pH-Wert anheben und Aluminium neutralisieren (Wood, 1995). Ver-schiedene Verbindungen wie z. B. Phosphate entgiften Aluminium-Ionen durch die Bildung stabiler Komplexe (Illmer & Schinner, 1999).

Die erläuterten Literaturstellen zeigen, dass durch mikrobielle Synthese organischer Säuren anodisiertes Aluminium korrodiert werden kann. Dadurch werden höhere Konzentrationen toxischer Aluminium-Ionen freigesetzt, die das Wachstum von Mikroorganismen hemmen können. Hierin kann die Ursache für das verringerte Wachstum und die vergleichsweise nied-rigen Sensorsignale bei einer Besiedlung von Werkstoff 4 mit Penicillium expansum liegen. Dagegen erschien Bacillus polymyxa auf Werkstoff 4 genauso vital wie auf Werkstoff 5 aus Polycarbonat. Bei Bacillus polymyxa wurde verglichen mit Penicillium expansum keine oder nur eine geringe Ansäuerung des Mediums beobachtet. Daher kam es vermutlich auch nicht zu einer Säurekorrosion des Aluminiums und den oben beschriebenen Hemmwirkungen. Bei verschiedenen biofilmbildenden Bacillus-Arten wurde die Lochkorrosion von Aluminium zusätzlich durch die Produktion von Polyaspartat und �-Polyglutamat gehemmt (Örnek et al., 2002).

Mikrobieller Angriff auf Polycarbonat

Werkstoff 5 besteht aus durchsichtigem Polycarbonat. Polycarbonate zeichnen sich aus durch eine Unempfindlichkeit für Temperaturen bis 140°C, Transparenz und sind physiologisch inert. Andererseits sind sie begrenzt widerstandsfähig für Chemikalien in Verbindung mit ultravioletter Strahlung (Brydson, 1989).

Auf Werkstoff 5 wurde ein gutes Wachstum der Mikroorganismen beobachtet. Die gleichen Sachverhalte wie sie bereits für Werkstoff 1 erläutert wurden, können zu den für Werkstoff 5 ermittelten Messwerten geführt haben. Den einzigen Unterschied bildet die für Werkstoff 1 beschriebene hohe Eigenausgasung unbesiedelter Proben, die bei Werkstoff 5 nicht beobach-tet wurde. Sowohl bei Werkstoff 1 als auch bei Werkstoff 5 kann bei einer Besiedlung eine beginnende mikrobielle Materialzerstörung zur Erhöhung der Eigenausgasung geführt haben. Hinzu ka-men die art- und substratabhängigen flüchtigen Stoffwechselprodukte der Mikroorganismen. Aufgrund der hohen Widerstandsfähigkeit gegen physiologische Einflüsse (Brydson, 1989) spricht bei Polycarbonaten allerdings wenig für eine erhöhte VOC-Abgabe durch fortschrei-tende Materialzerstörung. Die Widerstandsfähigkeit von Polycarbonaten gegen biogenen Ab-bau ist jedoch abhängig von der genauen chemisch-physikalischen Beschaffenheit. Es besteht für Kunststoffe ein allgemeiner Zusammenhang zwischen Schmelzpunkt und biologischer Abbaubarkeit der Polymere. Aliphatische Polycarbonate können von verschiedenen Umwelt-

Diskussion 121

keimen abgebaut werden, sie sind vor allem anfällig für den Angriff durch Lipasen und Ester-asen (Pranamuda et al., 1999; Suyama et al., 1998; Suyama & Tokiwa, 1997). Bei den abbau-enden Organismen handelt es sich jedoch in erster Linie um Bakterien aus der Klasse der Pro-teobacteria und der Firmicutes (Suyama et al., 1998), die mit dem in dieser Arbeit untersuchten Bacillus polymyxa stammesgeschichtlich nicht direkt verwandt sind.

Anders als bei Polyurethan liegen zu Polycarbonat-abbauenden Schimmelpilze keine Veröf-fentlichungen vor. Auch für andere Kunststoffe überwiegen Untersuchungen der Abbaubar-keit durch Bakterien. Selbst als biologisch abbaubar deklarierter Kunststoff (Polyhydroxyal-kanoat) wird in erster Linie von Bakterien zersetzt, Pilze bauen den Kunststoff nur unter bestimmten Umweltbedingungen ab (Matavulj & Molitoris, 1992). Für Nylon wurde ein Ab-bau durch Weißfäulepilze nachgewiesen (Deguchi et al. 1997), während Polyethylen und an-deres Plastik von einigen Aspergillus-Spezies abgebaut wurde (Kathiresan, 2003).

Es spricht also vieles dafür, dass die Messergebnisse des besiedelten Werkstoffes 5 überwie-gend von den artspezifischen Stoffwechselprodukten der Mikroorganismen bestimmt wurden. Eine Verstärkung der Eigenausgasung des Polycarbonats durch die mikrobielle Materialzer-störung ist der erläuterten Literatur zufolge nicht wahrscheinlich.

4.5.2.3 Auswirkungen des Werkstoffes auf die Gassensorik

Durch den Einfluss des Substrates wird die Variabilität der mikrobiellen Emissionen weiter erhöht. Wie bereits in 4.3.2.3 und 4.4.2 erläutert, erschwert die hohe Variabilität mikrobieller Emissionen die korrekte Klassifizierung von Messdaten erheblich. Dies zeigt exemplarisch die PCA der Messdaten aller in dieser Arbeit untersuchten Werkstoff-Mikroorganismus-Kombinationen (Abbildung 4-4). Obgleich die Kulturen und Werkstoffe im Einzelvergleich unterscheidbar sind (vgl. Erg.), kommt es bei einer gemeinsamen Auswertung der Daten zu Überlappungen verschiedener Cluster. Angaben zu den Konsequenzen für die gassensorische Untersuchung mikrobieller Kontami-nationen in Innenräumen oder bemannten Raumstationen wurden bereits in Abschnitt 4.4.2 gemacht.

122 Diskussion

Abbildung 4-4: Unter dem Einfluss der verschiedenen Werkstoffmaterialien erhöht sich die Variabilität der spezifischen mikrobiellen Emissionen. Damit wird bei einer gemeinsamen Auswertung verschiedener Reinkultu-ren und Mischkulturen auf den drei untersuchten Werkstoffen die korrekte Zuordnung und Klassifizierbarkeit erschwert. Messsignale der Elektronischen Nase ENO-1 ausgewertet als PCA. Kontrollen: Werkstoff 1 (beschichtetes Aluminium): �; Werkstoff 4 (anodisiertes Aluminium): ; Werkstoff 5 (Polycarbonat): ; Aspergillus niger: auf Werkstoff 1: ; Bacillus polymyxa: auf Werkstoff 1: ; auf Werkstoff 4: �; auf Werkstoff 5: �; Penicillium expansum: auf Werkstoff 1: �; auf Werkstoff 4: �; auf Werkstoff 5: �; Pseudomonas fluorescens: auf Werkstoff 1:�; Bakteriendominierte Mischkultur: auf Werkstoff 1: �; Pilzdominierte Mischkultur: auf Werkstoff 1: �.

4.5.2.4 Zusammenfassung

Das bewachsene Werkstoffmaterial übte in einigen Fällen einen entscheidenden Einfluss auf die gassensorischen Messergebnisse aus. Einerseits geben die Werkstoffe materialeigene Emissionen ab, die durch den mikrobiellen Bewuchs ansteigen oder sich verändern können. Andererseits kann das Werkstoffmaterial die Physiologie der Mikroorganismen auf verschie-dene Weise beeinflussen. Diese Einflüsse auf die Physiologie werden vorrangig durch aus dem Material gelöste Substanzen verursacht, die von den Mikroorganismen verwertet werden können oder aber hemmend wirken.

Bei Werkstoff 1 wurden auch unbesiedelt hohe Messwerte mit der Elektronischen Nase ENO-1 erzielt, die auf eine hohe Eigenausgasung hinweisen. Zusätzlich kann es bei Werk-stoff 1 zu einem Abbau von Verbindungen aus dem Werkstoffmaterial gekommen sein, der wiederum von den physiologischen Eigenschaftender besiedelnden Organismenart abhängig ist. Hemmeffekte sind dagegen bei der Polyurethanbeschichtung eher unwahrscheinlich.

Die Eigenausgasung von Werkstoff 4 war eher gering. Bei einer Besiedlung mit Penicillium expansum wurden vermutlich durch mikrobielle Säurekorrosion Aluminiumkonzentrationen

Diskussion 123

erreicht, die das weitere Wachstum und die Abgabe von MVOC hemmten und so zu ver-gleichsweise geringen Sensorsignalen führten. Bei mit Bacillus polymyxa besiedeltem Werk-stoff 4 wurden keine vergleichbaren Auswirkungen ermittelt.

Die Eigenausgasungen von Werkstoff 5 waren relativ gering, und auch ein Einfluss auf die Physiologie der Mikroorganismen durch das Polycarbonat kann weitgehend ausgeschlossen werden. Hier beruhten die Sensorsignale bei einer Besiedlung tatsächlich auf der artspezifi-schen Verwertung des Hefeextraktmediums. Da bei einer Besiedlung von Werkstoff 4 und Werkstoff 5 mit Bacillus polymyxa die Messergebnisse fast identisch waren, ist auch bei Werkstoff 4 von einem geringen Einfluss des Materials auf das Wachstum und die Physiolo-gie dieses Organismus auszugehen.

Die verschiedenen Werkstoffmaterialien erhöhen die Variabilität der mikrobiellen Emissionen bei einer Kontamination. Eine hohe Variabilität der mikrobiellen Emissionen erschwert die korrekte Klassifizierung aufgrund gassensorischer Messungen.

4.6 Gassensorische Untersuchung von Mischkulturen

4.6.1 Wiederfindung einzelner Arten in Mischkulturen

Da unter natürlichen Bedingungen Mikroorganismen überwiegend in Mischpopulationen vor-kommen, sollte in dieser Arbeit festgestellt werden, ob sich einzelne Arten in Mischkulturen gassensorisch identifizieren lassen. Die untersuchten Mischkulturen wiesen keine deutlich erkennbaren Ähnlichkeiten mit den Reinkulturen der Organismenarten, aus denen sie zusam-mengesetzt waren, auf. Anhand der Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1 können danach in einer Mischkultur einzelne Organismenarten nicht identifiziert werden. Zu ver-gleichbaren Ergebnissen kamen Pavlou et al. (2004) bei der Untersuchung einzelner Erreger von Lungenentzündungen und von gemischten Infektionen mit einer elektronischen Nase. Die Gründe dafür sind u. a. darin zu suchen, dass es sich bei den Signalen der Sensoren um eine addierte Reaktion auf verschiedene Gase handelt (vgl. 4.2.4). Bei den zehn Sensorantworten handelt es sich um zehn verschiedene Summenparameter, die nur als Muster dieses speziellen Stoffgemisches erkannt werden können. Einzelne Komponenten dieses Gemisches sind mit der Methode nicht identifizierbar. Die Nichterkennung von Einzelmustern in komplexen Ge-mischen ist laut Stetter & Penrose (2002) ein mathematisches Problem, das bisher ungelöst ist. Nur bei Gemischen einer begrenzten Anzahl bekannter Gase kann anhand eines Trainings mit vielen verschiedenen Kompositionen die entsprechende Zusammensetzung identifiziert werden (vgl. 4.2.4). In Mikroorganismenkulturen müssten dabei verschiedene Parameter wie das Alter der Kultur, Umgebungsbedingungen usw. berücksichtigt werden, die zu einer gro-ßen Variabilität der Gasgemische führen. Ein solches Training mit den in dieser Arbeit unter-

124 Diskussion

suchten komplexen Gasgemischen der Mikroorganismenkulturen wäre mit einem enormen Aufwand verbunden. Zudem wäre es nur für die trainierten Mischkulturen gültig und nicht auf andere Mischkulturen übertragbar (vgl. 4.2.6).

Neben den genannten analytischen Gründen gibt es auch biologische Ursachen dafür, dass einzelne Organismenarten in den Mischkulturen nicht identifiziert wurden (s.4.6.2).

4.6.2 Physiologische Abweichungen zwischen Rein- und Mischkulturen

4.6.2.1 Zellkonzentration beim Animpfen

Zu den Ursachen für die ausbleibende Wiederfindung einzelner Arten aus einer Mischkultur gehört die Animpfkonzentration. Die Animpfkonzentrationen der einzelnen Organismenarten in den Mischkulturen waren geringer als in den Reinkulturen. Auch wurden die Organismen-arten nicht zu gleichen Teilen angeimpft, da sehr schnell wachsende Arten die übrigen Arten sofort überwachsen hätten (genaue Angaben vgl.Tabelle 2-4). Der Einfluss der Zellkonzentra-tion auf die Produktion von MVOC ist laut Borjesson et al. (1992) aber eher gering. Anderer-seits ergaben gassensorische Untersuchungen von Enterobakterien, dass erst bei Zellkonzent-rationen von 5 x 108 Zellen/ml Spezies bestimmt und voneinander unterschieden werden konnten (McEntegart et al., 2000). Und auch andere Untersuchungen ergaben eine Abhängig-keit des Ergebnisses von der Zellkonzentration (Casalinuevo et al., 2006). Zudem wirkt sich die Animpfdichte auf das Wachstumsstadium aus, in dem die Kultur sich nach einem be-stimmten Zeitraum befindet. Das Wachstumsstadium oder Alter hat in den meisten Fällen einen entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der flüchtigen Stoffwechselprodukte einer Kultur ( Bachinger & Mandenius, 2001; Brandgård et al., 2001; Cimander et al., 2002; Müller et al., 2004). Die veränderten Animpfkonzentrationen der einzelnen Organismenarten können daher den Zeitpunkt der einzelnen Wachstumsstadien und der altersabhängigen MVOC-Produktion beeinträchtigen. Zusätzlich können mikrobielle Wechselwirkungen wie z. B. Hemmeffekte der Organismenarten durch die Animpfdichte beeinflusst werden (Malakar et al., 1999). Allein durch die gegenüber den Reinkulturen veränderte Animpfdichte in den Mischkulturen ergeben sich so schwer vorhersehbare physiologische Effekte mit entspre-chenden Auswirkungen auf die Abgabe flüchtiger Stoffwechselprodukte. Diese Effekte tragen vermutlich dazu bei, dass deutliche Ähnlichkeiten zwischen Mischkulturen und Reinkulturen anhand der Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1 nicht hinreichend erkennbar sind.

Diskussion 125

4.6.2.2 Wechselwirkungen in Mischkulturen

In Mischkulturen können durch gegenseitige Wechselwirkungen der Mikroorganismen deut-lich veränderte Bedingungen gegenüber den Reinkulturen herrschen. Diese Wechselwirkun-gen beeinflussen direkt die Physiologie der Organismen und in der Folge auch die Art und Zusammensetzung ihrer gasförmigen Stoffwechselprodukte, die in dieser Arbeit untersucht wurden.

Bei diesen Wechselwirkungen kann es sich u. a. um Nährstoffkonkurrenz (Banning et al., 2003; Grossart, 1999; Korpi et al., 1998; Noguera et al., 1999; Stevik et al., 2004; Van der Grinten, 2004; Zhang et al., 1995), Hemmeffekte (Klich et al., 1992; Kulkarni & Reddy, 1992; Madigan et al., 1997; Weber, 1996), aber auch um gegenseitige Ergänzungen (Elvers et al., 1998; Szewzyk & Szewzyk, 2003; Weber, 1996) handeln. In gemischten Biofilmen kommt es zu komplexen Zell-Zell-Interaktionen, bei denen Organismen durch Abgabe flüch-tiger Stoffwechselprodukte andere Organismen anlocken, die diese Stoffwechselprodukte weiter verwerten. Die Zellen manipulieren sich gegenseitig in ihrer Physiologie und bilden effiziente physiologische Konsortien (Stoodley et al., 2002). Die Strukturierung der Mikro-bengemeinschaften kann über die Ausbildung von Gradienten bis zur Schaffung eigener Öko-systeme gehen. Die Verwertung bestimmter Substrate in Kommensalismen (Ernährungsge-meinschaften) aus verschiedenen Organismenarten kann effektiver sein und zu einer erhöhten Bildung von Biomasse führen (Ghannoum & o’Toole, 2004). Bei gemeinschaftlicher Nutzung von Ressourcen durch Mikroorganismen wird von einer Optimierung ausgegangen (Pringault et al., 1999).

Zur Steuerung komplexer Vorgänge setzen Mikroorganismen vielfach Substanzen frei, die der Kommunikation innerhalb der Art und zwischen verschiedenen Arten dienen (Jaworski et al., 2005). Diese Form der mikrobiellen Kommunikation wird als „Quorum Sensing“ be-zeichnet und beginnt zu greifen, wenn Organismendichten erreicht werden, in denen koordi-nierte Vorgänge möglich und vorteilhaft sind. Über die Freisetzung dieser Signalmoleküle mit Pheromonwirkung werden u. a. Vorgänge wie Biofilmbildung, Symbiose, Antibiotika-Bildung, DNA-Austausch und Sporulation reguliert (Park & Lee, 2004; Zhang et al., 2002).

In dem speziellen Zusammenhang der Messung gasförmiger Stoffwechselprodukte sollte er-wähnt werden, dass viele MVOC Pheromoncharakter haben und damit der biochemischen Kommunikation dienen (Lorenz, 2001). Hier kann es einen direkten Zusammenhang zwi-schen mikrobieller Kommunikation und Ausbildung bestimmter gassensorischer Signalprofile einer Kultur geben.

In Mischkulturen können Mikroorganismen auf verschiedene Weise hemmend auf andere Mikroorganismen wirken. Möglich sind Antagonismen und Konkurrenz um bestimmte Sub-strate (Calvente et al., 1999). Häufig erzeugt eine beteiligte Spezies für die andere Spezies

126 Diskussion

ungünstige Milieubedingungen. Dies geschieht z. B. durch die Abgabe hemmender oder toxi-scher Substanzen. Dabei kann es sich um geläufig erscheinende Vorgänge handeln wie die Bildung organischer Säuren bei Lactobacillus sp. (Malakar et al., 1999), die Freisetzung von Ammoniak bei Enterobacter cloacae oder von Blausäure bei Pseudomonas fluorescens (Fiddaman & Rossall, 1993). Verbreitet ist aber auch die Bildung spezifischerer antibiotisch wirkender Substanzen. Dazu zählen u.v.a. von Penicillium expansum gebildetes Patulin (Ciegler et al., 1977; Reiß, 1998; Venancio & Paterson, 2007), fungistatisch wirkende Sekun-därmetabolite verschiedener Aspergillus-Spezies, darunter auch Aspergillus niger (Klich et al. 1992), und antimikrobielle Peptide von Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Escherichia coli und Milchsäurebakterien (Girardin et al., 2002; Madigan et al., 1997).

Damit wurden für alle Mikroorganismen-Arten, aus denen sich die in dieser Arbeit untersuch-ten Mischkulturen zusammensetzten, Mechanismen zur Hemmung anderer Mikroorganismen nachgewiesen. Aufgrund hemmender Mechanismen kann es bei den Mikroorganismen zu erheblichen Verschiebungen der physiologischen Ausprägungen und dadurch auch der Abga-be flüchtiger Stoffwechselprodukte gekommen sein.

Da die Antibiotika teilweise flüchtig sind (Fiddaman & Rossall, 1993), wirkt sich bei gassen-sorischen Messungen ihre verstärkte Freisetzung auch direkt auf das Signalprofil der Kultur aus.

In welcher Weise sich die Mikroorganismen der untersuchten Mischkulturen letztendlich be-einflussten, war im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht zu ermitteln. Die Ausführungen sollen jedoch einen groben Überblick über die Komplexität von Vorgängen in mikrobiellen Mischpopulationen vermitteln.

Die vielfältigen gegenseitigen Einflüsse in Mischkulturen erhöhen die Variabilität der flüchti-gen Stoffwechselprodukte zusätzlich zu den Faktoren Alter der Kultur und Substrat (vgl. 4.3.2.3, 4.4.2 und 4.5.2.3). Wie in den genannten Abschnitten erläutert, erschwert die hohe Variabilität mikrobieller Stoffwechselprodukte eine gassensorische Identifizierung einzelner Mikroorganismenarten erheblich. Die hohe Variabilität der Stoffwechselprodukte sowie durch wechselnde Bedingungen in Innenräumen, bzw. in bemannten Raumstationen verursachte Unterschiede machen eine korrekte gassensorische Zuordnung mikrobieller Kontaminationen sehr komplex.

4.6.3 Vergleich zweier Mischkulturen

Die zwei untersuchten Mischkulturen enthielten jeweils drei Organismenarten, von denen zwei identisch waren. In der dritten Organismenart und in den Animpfdichten unterschieden sich die beiden Mischkulturen (vgl. Tabelle 2-4).

Die Untersuchungen mit der Elektronischen Nase ENO-1 ergaben Unterschiede der Mischkulturen, die aber in der PCA geringer erscheinen als die Unterschiede zu den Reinkulturen der enthaltenen Arten. Aufgrund der im vorangegangenen Kapitel diskutierten

Diskussion 127

der enthaltenen Arten. Aufgrund der im vorangegangenen Kapitel diskutierten Auswirkungen von Animpfdichte und Wechselwirkungen der Mikroorganismen in Mischkulturen auf die Freisetzung flüchtiger Stoffwechselprodukte ist das Ergebnis plausibel. Mischkulturen unter-schiedlicher Zusammensetzung bilden entsprechend unterschiedliche Produkte bzw. Produkt-konzentrationen, wie der Einsatz verschiedener Starterkulturen in Milchprodukten zeigt (Car-rasco et al., 2005; Weber, 1996).

Zu der Frage, warum die Ähnlichkeiten der Geruchsprofile der beiden Mischkulturen größer erscheinen als die zu den Reinkulturen können hier nur verschiedene Überlegungen formuliert werden:

�� In verschiedenen Mischkulturen mit einem gleichen und einem unterschiedlichen Partner entwickeln sich Mikroorganismen physiologisch ähnlicher als in ihrer Reinkultur. Sie bil-den eine Art „Mischkultur-Phänotyp“ aus. Entsprechend setzen sie auch ähnlichere gas-förmige Stoffwechselprodukte frei.

�� Bei zwei gleichen enthaltenen Arten überwiegen die Ähnlichkeiten über die Unterschiede der gasförmigen Stoffwechselprodukte.

�� Letztendlich setzt sich in beiden Kulturen die gleiche Art durch.

Da keine weiterführenden Untersuchungen zu diesen Überlegungen durchgeführt wurden und die Literatur wenig Erkenntnisse liefert, sollen sie als offene Fragen im Raum stehen bleiben. Zur letzten Überlegung soll jedoch erwähnt werden, dass nach dem optischen Eindruck die beiden Mischkulturen deutlich verschieden waren.


Anhand der vorgestellten gassensorischen Untersuchungen konnten in den Mischkulturen einzelne Arten nicht wiedergefunden werden. Die Ursachen hierfür sind analytischer und physiologischer Natur. In Mischkulturen kommt es zu komplexen physiologischen Verände-rungen gegenüber einer Reinkultur, die sich entscheidend auf die Freisetzung gasförmiger Stoffwechselprodukte auswirken. Zusätzlich eignen sich die Sensoren der Elektronischen Na-se ENO-1 weniger zur Identifizierung einzelner Komponenten, sondern liefern vielmehr Summenparameter bestimmter Stoffgruppen, für die sie sensitiv sind. Das bedeutet, dass be-reits eine einfache Aufsummierung von Messantworten verschiedener Reinkulturen voll-kommen andere Signale liefert, als die einzelnen Reinkulturen. Eine Mischkultur führt daher grundsätzlich zu anderen gassensorischen Messergebnissen als eine Reinkultur einer in der Mischkultur vorkommenden Mikroorganismenart. Zusätzlich ist es selbst wenn eine Orga-nismenart eine Mischkultur stark dominiert, aufgrund der mikrobiellen Interaktionen wahr-scheinlich, dass ihre Physiologie in der Mischkultur von der einer Reinkultur abweicht. Um-

128 Diskussion

fangreiche ergänzende Untersuchungen zum Ausgasungsverhalten von Mikroorganismen in Mischkulturen stehen noch aus.

Die Messungen der zwei verschiedenen Mischkulturen (bakterien- und pilzdominiert) ergaben gassensorische Unterschiede, die aber geringer waren als die Unterschiede zu den enthaltenen Organismen in Reinkultur. Die Ursachen können auch hier in mikrobiellen Wechselwirkun-gen und verschiedenen Animpfkonzentrationen liegen. Eine abschließende Aufklärung wurde anhand der vorliegenden Untersuchungen und der Angaben in der Literatur nicht erzielt.

Verschiedene Einflüsse wie die kombinierten Arten, Animpfdichten und Wechselwirkungen der Organismen wirken sich zusätzlich zu Alter und Substrat auf die Emissionen von Misch-kulturen aus. Die Variabilität flüchtiger Stoffwechselprodukte ist dadurch bei Mischpopulati-onen deutlich höher als bei Reinkulturen. Durch die hohe Variabilität der Emissionen wird ein gassensorischer Nachweis mikrobieller Kontaminationen schwierig. Bei zusätzlichen Störein-flüssen durch unterschiedliche Bedingungen und Nutzungen in Innenräumen oder bemannten Raumstationen wird eine gassensorische Kontaminationskontrolle mit der verfügbaren Tech-nologie problematisch. Daher konnte ein entsprechender gassensorischer Nachweis von Mikroorgansmen unter Innenraumbedingungen bisher nicht erbracht werden.

4.7 Fazit und Ausblick

Zielsetzung dieser Arbeit war die Schaffung von Grundlagen für einen gassensorischen Nachweis mikrobieller Kontaminationen in bemannten Raumstationen. Mit der Elektroni-schen Nase ENO-1 war unter Laborbedingungen eine mikrobielle Kontamination raumfahrt-technischer Baumaterialien (Werkstoffe) eindeutig nachweisbar. Die Faktoren Mikroorganis-menart, Substrat und Zusammensetzung von Mischkulturen wurden als Ursachen für spezifische mikrobielle Emissionen ermittelt und gassensorisch nachgewiesen. Zusätzliche Faktoren sind das Alter einer Kultur und Wechselwirkungen in Mischkulturen. Aufgrund der Abhängigkeit gasförmiger mikrobieller Stoffwechselprodukte von verschiedenen Faktoren ergibt sich eine hohe Variabilität. Diese hohe Variabilität erschwert den gassensorischen Nachweis mikrobieller Kontaminationen erheblich. Bei wechselnden Hintergrundbedingun-gen in Innenräumen wird ein gassensorischer Nachweis mikrobieller Kontaminationen durch die hohe Variabilität und geringe Konzentration der flüchtigen Stoffwechselprodukte sehr schwierig. Auf der bemannten Raumstation ISS weichen v. a. in schwer zugänglichen und schwach belüfteten Bereichen die Bedingungen von gängigen Raumluftsituationen ab. Hier kann es bei einer mikrobiellen Kontamination zu einer Anreicherung gasförmiger Stoffwech-selprodukte kommen. Dadurch können gegenüber dem „offenen Innenraum“ in diesen Berei-

Diskussion 129

chen mit geringer Luftzirkulation bessere Bedingungen für die gassensorische Untersuchung entstehen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit und die Arbeiten anderer Autoren zeigen auch, dass gezielte Untersuchungen von Mikroorganismen unter guten Nährstoffbedingungen durchaus vielver-sprechend sind. Der zukünftige Einsatz Elektronischer Nasen in der mikrobiologischen Ana-lytik ist also wesentlich abhängig von der Eignung der Fragestellung und Bedingungen.

Für weiterführende gassensorische Untersuchungen zu mikrobiellen Kontaminationen auf der ISS sollte daher ein auf einfachen Fragestellungen beruhender Bestimmungsschlüssel entwi-ckelt werden. Dabei sollte die Identität einer unbekannten Probe Schritt für Schritt anhand von „Ja/Nein-Antworten“ auf der Basis der trainierten Daten ermittelt werden.

Zusätzlich zur hohen Variabilität mikrobieller Emissionen verschlechterte die unbefriedigen-de Reproduzierbarkeit der Daten die Zuverlässigkeit der Messergebnisse. Die Schwächen der Elektronischen Nase ENO-1 in der Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit lassen sich durch größere Probenzahlen relativieren. Größere Probenzahlen ermöglichen zur Datenanalyse auch den Einsatz Künstlicher Neuronaler Netze, die gegenüber Drift und nicht linearen Daten we-niger empfindlich sind. Aufgrund der vorgegebenen Bedingungen konnten jedoch in dieser Arbeit keine höheren Probenzahlen erzielt werden. In zukünftigen Untersuchungen sollte der Aufwand bei der Probenpräparation daher geringer gehalten werden, um möglichst hohe Pro-benzahlen messen zu können. Zudem sollten in vorbereitenden Messungen für Untersuchungen auf der ISS weitere Maß-nahmen zur Driftkompensation ergriffen werden. Dazu gehört neben der in dieser Arbeit durchgeführten Kalibrierung mit Trägergas die regelmäßige Regeneration der Sensoren. Wei-ter sollten Driftverläufe langfristig ermittelt und modelliert werden, um die Vorhersagbarkeit aufgrund der Sensorendrift abweichender Messwerte zu überprüfen. Daten für das Training der Elektronischen Nase sollten zeitnah gewählt werden. Idealerweise könnte der Zeitraum geeigneter Trainingsdaten aufgrund der Modellierungsergebnisse ermittelt werden.

Ein weiterer entscheidender Punkt zukünftiger gassensorischer Untersuchungen von mikro-biellen Kontaminationen sollte deren Evaluierung unter Einsatz geeigneter Methoden zur Zellzahl- und Aktivitätsbestimmung der oberflächenbesiedelnden Mikroorganismen sein. Hierfür sollten geeignetere Maße der Werkstoffproben gewählt werden, die im Gegensatz zu den Werkstoffproben in dieser Arbeit den Einsatz gängiger mikrobiologischer Arbeitsweisen ermöglichen.

130 Diskussion

Zusammenfassung 131

5 Zusammenfassung

Das Wachstum oberflächenbesiedelnder Mikroorganismen kann in Innenräumen zu gesund-heitlichen Problemen der Bewohner und zu Schäden an den verbauten Materialen führen. Be-sonders kritisch ist eine mikrobielle Kontamination halbgeschlossener Systeme, wie sie in der bemannten Raumfahrt vorzufinden sind. Hier kann es entscheidend für die Sicherheit der Be-satzung sein, eine mikrobielle Kontamination frühzeitig zu erkennen und zu entfernen. Als Alternative zu anderen bekannten mikrobiologischen Nachweistechniken sollte die Möglich-keit untersucht werden, Mikroorganismen gassensorisch mit einer Elektronischen Nase an-hand ihrer flüchtigen Stoffwechselprodukte zu identifizieren.

Für die Untersuchungen wurden Baumaterialien (Werkstoffe) aus der Raumfahrttechnik mit vier verschiedenen Mikroorganismenarten besiedelt. Bei den untersuchten Werkstoffen han-delte es sich um mit Polyurethan beschichtetes Aluminium, um anodisiertes Aluminium und um Polycarbonat. Als Mikroorganismen wurden die Bakterien Bacillus polymyxa (bzw. Paenibacillus polymyxa) und Pseudomonas fluorescens und die Schimmelpilze Aspergillus niger und Penicillium expansum ausgewählt und in Reinkulturen auf den Werkstoffen ange-züchtet. Zusätzlich wurden Werkstoffproben mit Mischkulturen beimpft, die von Bakterien oder von Schimmelpilzen dominiert wurden. Die Bakteriendominierte Mischkultur enthielt Bacillus polymyxa, Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens, während die Pilz-dominierte Mischkultur sich Aspergillus niger, Bacillus polymyxa und Penicillium expansum zusammensetzte.

Die besiedelten Werkstoffe wurden gassensorisch mit der Elektronischen Nase ENO-1 unter-sucht. Die Elektronische Nase ENO-1 war mit einem Array aus zehn Metalloxidsensoren (MOS) ausgestattet. Metalloxidsensoren reagieren v. a. auf organische und anorganische Ga-se, die oxidierbar oder reduzierbar sind und eignen sich daher für die Untersuchung gas-förmiger mikrobieller Stoffwechselprodukte. Die Auswertung der Daten erfolgte mit der PCA (Principle Component Analysis / Hauptkomponentenanalyse) und mit der LDA (Lineare Dis-kriminanzanalyse). Die PCA dient der Reduzierung der Daten auf die wichtigsten Informatio-nen, die sich in einem zweidimensionalen Diagramm darstellen lassen. Die LDA kann einge-setzt werden, um die Unterschiede zwischen den multivariaten Datensätzen zu ermitteln. Da die Resultate beider Methoden keine absoluten Werte, sondern Verhältnisse der untersuchten Datensätze beinhalten, gelten sie ausschließlich für die behandelte Fragestellung und lassen sich nicht auf andere Fragestellungen übertragen oder extrapolieren.

Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Daten und zur Messgenauigkeit der Elektroni-schen Nase ENO-1 wurden anhand eines Aceton-Standards (1 ppm und 5 ppm in A. bidest) und unkontaminierter Werkstoffkontrollen (mit Polyurethan beschichtetes Aluminium) durch-geführt. Diese Untersuchungen ergaben eine nicht zufriedenstellende Reproduzierbarkeit und Messgenauigkeit, die für gassensorische Untersuchungen auch von anderen Autoren

132 Zusammenfassung

beschrieben wurde. Die Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit sind die mangelnde Konstanz der Sensorsignale über längere Zeiträume und versuchsbedingte Schwankungen der Feuchte des Trägergases. Auch unspezifische, untereinander korrelierende Sensorreaktionen auf die verschiedenen Messgaskomponenten können zu ungenauen Ergebnissen durch auf-summierte Messungenauigkeiten führen. Da es sich in der Anwendung bei den Sensorreaktio-nen meistens um Summensignale auf ein Gasgemisch handelt, können einzelne Messgaskom-ponenten außerhalb des optimalen Messbereiches liegen. Im schlimmsten Fall werden besonders charakteristische Substanzen des Messgases von unspezifischen Komponenten überlagert. Aufgrund dieser Feststellungen können die nachfolgenden Ergebnisse dieser Ar-beit eher als Tendenzen angesehen werden, die sich aber weitgehend durch die Arbeiten ande-rer Autoren stützen lassen.

Unter Laborbedingungen ließ sich die mikrobielle Kontamination der Werkstoffe mit der Elektronischen Nase ENO-1 eindeutig nachweisen. Die mikrobielle Besiedlung kann einer-seits zur erhöhten Eigenausgasung des bewachsenen Materials führen und andererseits schei-den die Mikroorganismen flüchtige Stoffwechselprodukte aus. Für einen gassensorischen Nachweis mikrobieller Kontaminationen im Innenraum reichen die Konzentrationen der durch die Mikroorganismen freigesetzten Emissionen normalerweise jedoch nicht aus. Dage-gen könnten im Innenraum der ISS Bereiche mit geringer Luftzirkulation günstigere Bedin-gungen für gassensorische Untersuchungen bieten, da es hier zu einer Anreicherung gasför-miger mikrobieller Stoffwechselprodukte kommen kann.

Die artspezifischen Stoffwechseleigenschaften von Mikroorganismen wirken sich auf die Zu-sammensetzung der von ihnen freigesetzten Gasgemische aus. Diese Unterschiede waren bei den untersuchten Mikroorganismen Aspergillus niger, Bacillus polymyxa, Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens mit der Elektronischen Nase ENO-1 eindeutig nachweisbar. Ein weiterer beeinflussender Faktor der Emissionen bei einer mikrobiellen Kon-tamination ist die Art des besiedelten Substrats. Der Einfluss der untersuchten Werkstoffmate-rialien beruhte auf ihrer Eigenausgasung und ihrer Wirkung auf die Physiologie und das Wachstum der Mikroorganismen. Während mit Polyurethan beschichtetes Aluminium das Messergebnis durch seine besonders hohe Eigenausgasung beeinflusste, ist der Einfluss von Polycarbonat als gering einzustufen. Anodisiertes Aluminium weist zwar eine geringe Eigen-ausgasung auf, es kann aber hemmend auf bestimmte Mikroorganismen wirken. Die Hem-mung kann aufgrund der Abgabe von organischen Säuren durch die Mikroorganismen zu-stande kommen, die eine biogene Korrosion des Aluminiums auslösen und zur Anreicherung von freien Aluminiumionen in toxischen Konzentrationen führen können. Die Folgen sind eine Abschwächung des Wachstums und der Freisetzung flüchtiger Stoffwechselprodukte. Diese reduzierten Emissionen waren bei Penicillium expansum auf anodisiertem Aluminium mit der Elektronischen Nase ENO-1 eindeutig messbar.

Zusammenfassung 133

Die Untersuchungen der Mischkulturen ergaben, dass einzelne Arten in der Mischkultur mit Hilfe der gassensorischen Untersuchungen nicht erkannt werden können. Die Ursache hierfür ist, dass bei gassensorischen Untersuchungen nicht die Möglichkeit besteht, einzelne Kompo-nenten des Gasgemisches aus dem Gesamtprofil herauszufiltern. Es ist zwar möglich, die Elektronische Nase auf eine definiert zusammengesetzte Mischkultur zu trainieren, um so die enthaltenen Arten zu bestimmen. Aufgrund der vielfältigen Wechselwirkungen und Einflüsse in Mischkulturen sind die Variationsmöglichkeiten jedoch so groß, dass ein solches Training für alle möglichen Mischkulturen mit einem unrealistischen Aufwand verbunden wäre. Die in dieser Arbeit untersuchten Mischkulturen enthielten jeweils drei Arten von Mikroorganismen. Zwei der Arten waren bei beiden Mischkulturen identisch, während sie sich in einer Art un-terschieden. In der Bakteriendominierten Mischkultur wurden Bacillus polymyxa, Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens kombiniert, während die Pilzdominierte Mischkultur Aspergillus niger, Bacillus polymyxa und Penicillium expansum enthielt. Zusätzlich wurden bei den identischen Arten verschiedene Animpfkonzentrationen gewählt. Die beiden Misch-kulturen waren gassensorisch deutlich zu unterscheiden, die Unterschiede waren jedoch ge-ringer als zu den Reinkulturen der enthaltenen Mikroorganismenarten.

Die in dieser Arbeit ermittelten Einflussfaktoren auf die mikrobiellen Emissionen waren Mikroorganismenart, Substrat (Werkstoff) und die Zusammensetzung von Mischkulturen. Weitere Einflüsse ergeben sich aus dem Alter der Kultur und Wechselwirkungen in Mischkul-turen. Diese Einflüsse führten zu gassensorisch erfassbaren Unterschieden aufgrund der ho-hen Variabilität der gasförmigen Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen. Die hohe Va-riabilität erschwert die gassensorische Identifizierung mikrobieller Kontaminationen erheblich, da nur eindeutig bekannte Signalmuster von der Elektronischen Nase identifiziert werden. Eine Extrapolation von bekannten auf unbekannte Signalmuster ist nicht möglich. Dieser Sachverhalt, geringe Konzentrationen der mikrobiellen Emissionen und schwankende Umgebungsbedingungen haben zur Folge, dass ein gassensorischer Nachweis zur Identifizie-rung mikrobieller Kontaminationen in bemannten Raumstationen wahrscheinlich schwierig sein wird.

In zukünftigen Untersuchungen könnte die Zuverlässigkeit der Ergebnisse durch verschiedene Maßnahmen gesteigert werden. Dazu gehören Maßnahmen zur Verbesserung der Reprodu-zierbarkeit und zur Driftkompensation, die Evaluierung anhand herkömmlicher mikrobiologi-scher Untersuchungen sowie die Entwicklung eines geeigneten Bestimmungsschlüssels für unbekannte Proben.

134 Zusammenfassung

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Zhang, R.-G., Pappas, T., Brace, J. L., Miller, P. C., Oulmassov, T., Molyneaux, J. M., Anderson, J. C., Bashkin, J. K., Wlnans, S. C. & Joachimiak, A. (2002). Structure of a bacterial quorum-sensing transcription factor complexed with pheromone and DNA. Nature 27; 417 (6892): 971-974

Zhang, T. C., Cheng, F. Y. & Bishop, P. L. (1995). Competition for substrate and space in biofilms. Water environment research 67 (6): 992-1003

148 Literatur

Abbildungen 149

Abbildungen

Abbildung 1-1: Schematische Darstellung des Aufbaus einer Elektronischen Nase (Arshak et al., 2004)..................................................................................... 24

Abbildung 1-2: Sensorreaktionen von sechs Sensoren S1 bis S6 auf verschiedene Komponenten (c1 bis c5) eines Gasgemisches (Boeker, 2001).. .................. 28

Abbildung 2-1: Übersicht des Gesamtaufbaus und der Fluidik der Elektronischen Nase ENO-1 (RST, 2003). ........................................................................... 36

Abbildung 2-2: Kompletter Messplatz von rechts nach links. .............................................. 39 Abbildung 2-3: Beispiel für ein Messprofil der Elektronischen Nase ENO-1. Die

Messung von 1 ppm Aceton am Messtag A (vgl. 2.2.2) wurde mit der in Tabelle 2-2 dargestellten Messsequenz durchgeführt........................ 40

Abbildung 2-4: Messaufbau von rechts nach links. .............................................................. 43 Abbildung 2-5: Messkammer mit Aspergillus niger auf Werkstoff 1................................... 50 Abbildung 3-1: Exemplarische Darstellung eines Verlaufsdiagramms für den

Aceton-Standard mit der Konzentration 5 ppm. Dargestellt sind als Beispiel für eine eher geringe Messgenauigkeit die Mittelwerte der 21 Messtage A bis U von Sensor Nr. 2 der Elektronischen Nase ENO-1. ......................................................................................................... 55

Abbildung 3-2: Exemplarische Darstellung eines Verlaufsdiagramms für den Aceton-Standard mit der Konzentration 5 ppm. Dargestellt sind als Beispiel für eine hohe Messgenauigkeit die Mittelwerte der 21 Messtage A bis U von Sensor Nr. 8 der Elektronischen Nase ENO-1. ......................................................................................................... 55

Abbildung 3-3: Deutliche Trennung der Konzentrationen 1 ppm und 5 ppm Aceton in A. bidest (Mittelwerte) durch die Sensoren 1, 2, 3, 5, 6 und 8 der Elektronischen Nase ENO-1. ....................................................................... 57

Abbildung 3-4: PCA zum Vergleich von Messdaten der Aceton-Standards (1 ppm und 5 ppm) mit Werkstoff 1. Die Güte der Klassifizierung, bzw. Trennung wurde mit nicht klassifizierten Daten überprüft. Die rote Kugel signalisiert einen überprüften Messwert. .......................................... 58

Abbildung 3-5: LDA von Messwerten des Aceton-Standards (1 ppm und 5 ppm) und der Kontrollen von Werkstoff 1. Die qualitative und quantitative Trennbarkeit von Aceton-Standard (in 1 ppm und 5 ppm) und Kontrollen des Werkstoffes 1 ist erkennbar. ............................ 59

Abbildung 3-6: Ergebnisse von Untersuchungen zum Driftverhalten der Sensoren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1 bei Messungen des Aceton-Standards (1 ppm). ....................................................................................... 60

Abbildung 3-7: Ergebnisse von Untersuchungen zum Driftverhalten der Sensoren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1 bei Messungen des Aceton-Standards (5 ppm). ....................................................................................... 61

Abbildung 3-8: PCA der Messtage A bis U von 1 ppm Aceton in A. bidest. Die Auswertung zeigt einen zeitabhängigen Verlauf der Messwerte in drei Clustern (Phase 1 bis 3). ....................................................................... 62

Abbildung 3-9: PCA der Messtage A bis U von 5 ppm Aceton in A. bidest. Die Auswertung zeigt einen zeitabhängigen Verlauf der Messwerte in zwei Clustern (Phase 1 und 2). .................................................................... 62

150 Abbildungen

Abbildung 3-10: Die Messgenauigkeit der verschiedenen Sensoren zeigt erkennbare Unterschiede besonders bei den Sensoren 2, 5, 6 und 8. Vergleich der Sensorsignale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Kontrollen I bis VI von Werkstoff 1. ............................................................................... 63

Abbildung 3-11: Untersuchung einer mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) anhand von Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von unbesiedelten Kontrollen und mit Aspergillus niger besiedelten Proben von Werkstoff 1 zeigt gut erkennbare Unterschiede zwischen nicht kontaminiertem und kontaminiertem Werkstoff................. 66

Abbildung 3-12: Anhand von Messungen mit der elektronischen Nase nachgewiesene mikrobielle Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). Die PCA von Messdaten der unbesiedelten Kontrollen und mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben von Werkstoff 1 verdeutlicht die Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffproben........................ 66

Abbildung 3-13: Mikrobielle Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1 zur Darstellung der Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffen.................................................................................................. 67

Abbildung 3-14: Untersuchung der mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mt die Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Pseudomonas fluorescens besiedelter Proben von Werkstoff 1 macht die Unterschiede zwischen unkontaminierten und kontaminierten Werkstoffen deutlich. ......................................................... 68

Abbildung 3-15: Nachweis der mikrobiellen Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit der bakteriendominierten Mischkultur besiedelter Proben von Werkstoff 1 stellt die Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffen dar. .......................................................... 68

Abbildung 3-16: Mit der Elektronischen Nase ENO-1 untersuchte mikrobielle Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). Die PCA der Messwerte der unbesiedelten Kontrollen 1 und der mit der pilzdominierten Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1 belegt die Unterschiede zwischen unkontaminierten und kontaminierten Werkstoffen. ....................................................................... 69

Abbildung 3-17: Mikrobielle Kontaminationen von anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA von Messwerten der unbesiedelten Kontrollen sowie der mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelten Proben des Werkstoffs 4 zeigt die Unterschiede zwischen nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffproben................................. 70

Abbildung 3-18: Untersuchungen zum Nachweis mikrobieller Kontaminationen von Polycarbonat (Werkstoff 5) mit der Elektronischen Nase ENO-1.

Abbildungen 151

PCA der Messwerte von unbesiedelten Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelten Proben des Werkstoffes 5 zur Darstellung der Unterschiede zwischen unkontamierten und kontaminierten Werkstoffen. ...................................... 71

Abbildung 3-19: Untersuchung durch verschiedene Mikroorganismen verursachter Kontaminationen von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Aspergillus niger und Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1 verdeutlicht die artspezifischen Unterschiede der Organismen................... 74

Abbildung 3-20: Durch verschiedene Schimmelpilze verursachte Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA von Messwerten der Schimmelpilze Aspergillus niger und Penicillium expansum nach Kultivierung auf Werkstoff 1 demonstriert die artspezifischen Unterschiede der untersuchten Schimmelpilze............................................ 74

Abbildung 3-21: Untersuchung mit der Elektronischen Nase ENO-1 zur Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit verschiedenen Mikroorganismen. PCA der Messwerte von Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens nach Besiedlung von Werkstoff 1 zur Veranschaulichung der artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen............................................................. 75

Abbildung 3-22: Nachweis durch verschiedene Bakterien verursachter Kontamination von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1 stellt die artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen dar................................................................................... 76

Abbildung 3-23: Durch verschiedene Mikroorganismen verursachte Kontamination von anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Penicillium expansum nach Besiedlung von Werkstoff 4 zur Verdeutlichung der artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen................................................................................... 76

Abbildung 3-24: Mit verschiedenen Mikroorganismen kontaminierte Proben von Polycarbonat (Werkstoff 5) untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Penicilllium expansum nach Kultivierung auf Werkstoff 5 demonstriert die artspezifischen Unterschiede der Mikroorganismen......................................................................................... 77

Abbildung 3-25: Nachweis durch verschiedene Bakterien ausgelöster Kontaminationen von beschichtetem Alumium (Werkstoff 1) mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte von Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens nach Besiedlung von Werkstoff 1 zur Verdeutlichung der artspezifischen Unterschiede zwischen den Bakterien. .............................................................................. 77

Abbildung 3-26: Mit verschiedenen Mikroorganismen kontaminierte Proben von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von Penicilllium expansum und Pseudomonas fluorescens nach

152 Abbildungen

Kultivierung auf Werkstoff 1 stellt die artspezifischen Unterschiede zwischen den Mikroorganismen dar. ........................................................... 78

Abbildung 3-27: Eigenausgasungen von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA von Messwerten der unbesiedelten Kontrollen von Werkstoff 1, 4 und 5 zur Verdeutlichung der materialabhängigen Ausgasungen der verglichenen Werkstoffe. ................................................ 80

Abbildung 3-28: Unterschiede zwischen beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nach einer Besiedlung mit dem gleichen Bakterium untersucht mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA der Messwerte von mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben der Werkstoffe 1, 4 und 5 verdeutlicht die im Zusammenhang mit einer gleichartigen mikrobiellen Kontamination messbaren materialabhängigen Unterschiede zwischen den Werkstoffen. ................... 82

Abbildung 3-29: Unterschiede zwischen beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1), anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und Polycarbonat (Werkstoff 5) nach einer Besiedlung mit dem gleichen Schimmelpilz nachgewiesen mit der Elektronischen Nase ENO-1. Die PCA zum Vergleich der mit Penicillium expansum besiedelten Proben von Werkstoff 1, Werkstoff 4 und Werkstoff 5 zeigt die im Zusammenhang mit einer gleichartigen mikrobiellen Kontamination messbaren materialabhängigen Unterschiede zwischen den Werkstoffen........................................................................... 83

Abbildung 3-30: Messprofil von beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1. ............................................. 84

Abbildung 3-31: Messprofil von anodisiertem Aluminium (Werkstoff 4) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 4. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1. ............................................. 85

Abbildung 3-32: Messprofil von Polycarbonat (Werkstoff 5) und seine Veränderung durch zwei verschiedene mikrobielle Kontaminanten. Radar-Plot der Messwerte unbesiedelter Kontrollen sowie mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 5. Dargestellt sind die Messwerte der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1. ...................................................... 86

Abbildung 3-33: Keine Wiederfindung einzelner Arten in einer mikrobiellen Mischkultur nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). PCA zum Vergleich von Messwerten der Elektronischen Nase ENO-1 von der Bakteriendominierten Mischkultur und den Reinkulturen der Mikroorganismen, aus

Abbildungen 153

denen sie zusammengestellt wurde, nach Kultivierung auf Werkstoff 1. ................................................................................................. 87

Abbildung 3-34: Keine Wiederfindung einzelner Arten in einer mikrobiellen Mischkultur nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1). PCA von Messwerten der Elektronischen Nase ENO-1 von der Pilzdominierten Mischkultur und den Reinkulturen der eingesetzten Mikroorganismen kultiviert auf Werkstoff 1. ................... 88

Abbildung 3-35: Unterschiede zweier Mischkulturen mit zwei gleichen und einer unterschiedlichen Art nach Kultivierung auf beschichtetem Aluminium (Werkstoff 1) gemessen mit der Elektronischen Nase ENO-1. PCA der Messwerte mit Bakteriendominierter Mischkultur und Pilzdominierter Mischkultur besiedelter Proben von Werkstoff 1. ................................................................................................. 90

Abbildung 4-1: Niedrige Messwerte von A. bidest. bei einer Kalibrierung mit angefeuchteter synthetischer Luft als Nullgas. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen des relativen Leitwerts (G0/G) der Sensoren 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1................. 100

Abbildung 4-2: Geringe Trennbarkeit der nicht kontaminierten und kontaminierten Werkstoffe. PCA aller in dieser Arbeit untersuchten unbesiedelten Kontrollen im Vergleich zu allen besiedelten Werkstoffen....................... 102

Abbildung 4-3: Messsignale der Elektronischen Nase ENO-1 ausgewertet als PCA. Die spezifischen VOC der Werkstoffkontrollen, verschiedener Reinkulturen und der beiden Mischkulturen reichen bei einer gemeinsamen Auswertung in einer PCA nicht für eine Unterscheidbarkeit und korrekte Zuordnung aus. Ausgewertet wurden unbesiedelte und besiedelte Proben des Werkstoffes 1 (beschichtetes Aluminium). ....................................................................... 113

Abbildung 4-4: Unter dem Einfluss der verschiedenen Werkstoffmaterialien erhöht sich die Variabilität der spezifischen mikrobiellen Emissionen. Damit wird bei einer gemeinsamen Auswertung verschiedener Reinkulturen und Mischkulturen auf den drei untersuchten Werkstoffen die korrekte Zuordnung und Klassifizierbarkeit erschwert. Messsignale der Elektronischen Nase ENO-1 ausgewertet als PCA. ................................................................................. 122

154 Abbildungen

Tabellen 155

Tabellen

Tabelle 1-1: Beispiele für Arbeiten, in denen Mikroorganismen mit Gassensoren nachgewiesen wurden. Neben den Autoren sind auch die verwendeten Sensortypen mit ihren Selektivitäten aufgeführt. ................... 22

Tabelle 2-1: Charakteristische Eigenschaften der in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Metalloxid-Sensoren (Infomaterial RST Rostock System-Technik GmbH), mit der Empfindlichkeit der einzelnen Sensoren für bestimmte Verbindungen und Stoffgruppen, Konzentrationsbereichen und Betriebstemperaturen. .................................. 38

Tabelle 2-2: Für jeweils einen Messvorgang an der Elektronischen Nase ENO-1 vorgenommene Einstellungen...................................................................... 39

Tabelle 2-3: Beschreibung der mikrobiell besiedelten und mit der Elektro-nischen Nase untersuchten Werkstoffe W1, W4 und W5............................ 46

Tabelle 2-4: Trockenmassen der Animpfsuspensionen für die Bakterien- und Pilzdominierten Mischproben in g/ml. ........................................................ 49

Tabelle 2-5: Untersuchte Kombinationen der Mikroorganismenkulturen mit den Werkstoffproben 1, 4 und 5 sowie dazu gehörige Kontrollen. .................... 51

Tabelle 2-6: Kürzel der untersuchten Kombinationen von Werkstoffen und Mikroorganismen......................................................................................... 51

Tabelle 3-1: Messgenauigkeit der zehn in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Sensoren bei Messung des Aceton–Standards (1 ppm und 5 ppm in A. bidest.)............................................................................... 54

Tabelle 3-2: Messgenauigkeit der zehn in der Elektronischen Nase ENO-1 eingesetzten Sensoren nach 6-maliger Messung der unbeimpften Kontrollen von Werkstoff 1. ........................................................................ 64

Tabelle 3-3: Übersicht der Unterscheidbarkeit von unbesiedelten Kontrollen und besiedelten Werkstoffproben. ...................................................................... 72

Tabelle 3-4: Vergleich der untersuchten Mikroorganismen anhand der Mess-werte der einzelnen Sensoren der Elektronischen Nase ENO-1 und der Auswertung mit der PCA....................................................................... 79

Tabelle 3-5: Vergleich der unbesiedelten Kontrollen der verschiedenen Werk-stoffmaterialien. ........................................................................................... 81

Tabelle 3-6: Vergleich der mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben der Werk-stoffe 1, 4 und 5. .......................................................................................... 82

Tabelle 3-7: Vergleich der mit Penicillium expansum besiedelten Werkstoffe 1, 4 und 5.......................................................................................................... 83

Tabelle 3-8: Vergleich von Messergebnissen der Mischkulturen mit denen der Reinkulturen der Mikroorganismen, aus denen sie zusammen-gesetzt waren................................................................................................ 89

Tabelle 3-9: Vergleich von Bakteriendominierter (MB) und Pilzdominierter Mischkultur (MP) im Überblick. ................................................................. 90

Tabelle 4-1: MVOC der in dieser Arbeit untersuchten Mikroorganismen (EADS & UFT, 2005)................................................................................ 110

156

157

Danksagung

Bei allen Personen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, möchte ich mich an dieser Stelle herzlich bedanken

Prof. Dr. Wolfgang Heyser vom Zentrum für Umweltforschung und Umwelttechnologie (UFT) danke ich für die wissenschaftliche Betreuung und Begutachtung dieser Arbeit, für seine Diskussionsbereitschaft und für die Entscheidungsfreiheit, die er mir gelassen hat. An Dr. habil. Andrea Ruf geht mein Dank für die Ergebnisdiskussion und die Begutachtung. Als den Mitgliedern des Prüfungsausschusses danke ich Prof. Dr. Jürgen Warrelmann, Prof. Dr. Detlef Gabel, Dr. Klaudia Hettwer und Roland Wozniewski.

Auch die Finanzierung meiner Projektstelle im F&E-Vorhaben „Material für Langzeitanwen-dungen im Weltraum MLA V – Mikrobiologie“ durch das Deutsche Zentrum für Luft- und Raumfahrt (DLR) möchte ich an dieser Stelle würdigen.

Für die herzliche Aufnahme und die freundliche und konstruktive Arbeitsatmosphäre danke ich der Arbeitsgruppe „Physiologische Pflanzenanatomie“ und dem „Nasenteam“. Insbeson-dere möchte ich die beständige Unterstützung durch Helga Wehrkamp, Anke Tolz und Martina Schiewe anerkennen. Für die Anregungen und tatkräftige Hilfe bei der Planung und Konstruktion des Messaufbaus danke ich Peter Behrend, Michael Birkner und Hans Lorenz. Bei Falko Berger bedanke ich mich für seine unendliche Geduld bei Soft- und Hardwareproblemen jeder Art.

Dr. Andreas Rabenstein und Jörg Peterschewski von der Amtlichen Materialprüfungsanstalt (MPA) Bremen danke ich für die Vorschläge zur Kultivierung der Mikroorganismen auf den Werkstoffen. Für die Einblicke in die Weltraumtechnologie spreche ich Peter Nobmann von EADS Space Transportation Bremen meinen Dank aus.

Mein ganz besonderer Dank geht an Dr. Klaudia Hettwer, Dr. Karin Platte, Ursula Stoll, und Anke Tolz für das Korrekturlesen und die vielen Hinweise und Anregungen. Bei Hanno Girke und Melissa Rogerson bedanke ich mich für die sprachlichen Verfeinerungen des Abstracts.

Meiner Mutter Margret Cording danke ich für ihre Loyalität und ihren Rückhalt. Und schließ-lich bedanke ich mich bei meinen Freunden, besonders bei Antje Seebeck, und bei allen ande-ren, die mir während dieser Arbeit zur Seite standen.

Dankbarkeit ist das Gedächtnis des Herzens.

Sprichwort

Anhang A-1

Anhang

Anhang 1 Einbindung in das Projekt MLA V ............................................................ 2

Anhang 2 Anhang zum Ergebnis-Teil – Diagramme zu Mittelwertvergleichen .... 9

Anhang 2.1 Messgenauigkeit – Aceton-Standard ............................................................. 9

Anhang 2.2 Vergleich unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe ................................... 20 Anhang 2.2.1 Werkstoff 1 .................................................................................................. 20 Anhang 2.2.2 Werkstoff 4 .................................................................................................. 23 Anhang 2.2.3 Werkstoff 5 .................................................................................................. 24

Anhang 2.3 Vergleich der Mikroorganismen-Arten........................................................ 25

Anhang 2.4 Vergleich der Werkstoffe............................................................................. 29 Anhang 2.4.1 Unbesiedelte Kontrollen .............................................................................. 29 Anhang 2.4.2 Besiedlung mit Bacillus polymyxa............................................................... 29 Anhang 2.4.3 Besiedlung mit Penicillium expansum......................................................... 30

Anhang 2.5 Vergleich von Reinkulturen und Mischkulturen.......................................... 31 Anhang 2.5.1 Bakteriendominierte Mischkultur ................................................................ 31 Anhang 2.5.2 Pilzdominierte Mischkultur ......................................................................... 32

Anhang 2.6 Vergleich der Mischkulturen ....................................................................... 34

Anhang 3 Evaluierung ................................................................................................ 35

A-2 Anhang

Anhang 1 Einbindung in das Projekt MLA V

Diese Arbeit stand in Verbindung mit dem F&E-Vorhaben „Material für Langzeitanwendung im Weltraum MLA V – Mikrobiologie“, das sich mit der Problematik mikrobieller Kontami-nationen auf bemannten Raumstationen beschäftigte (vgl. Einleitung, Abschnitt 1.1). Die er-zielten Ergebnisse sollten als Basis für eine frühzeitige, rasche und einfache Kontaminations-kontrolle mit einer Elektronischen Nase dienen. Es wurden verschiedene oberflächenbesie-delnde Mikroorganismen sowohl auf herkömmlichen Nährmedien als auch auf sechs raum-fahrttechnischen Werkstoffen untersucht. Regelmäßige Messungen der Kulturen über Zeit-räume von mehreren Wochen sollten Informationen über die spezifischen „fingerprints“ der einzelnen Mikroorganismen in verschiedenen Wachstumsphasen liefern. Dabei sollte ermittelt werden, welche Wachstumsstadien günstig für eine gassensorische Detektion kontaminieren-der Mikroorganismen sind. Neben den im Material und Methoden-Teil (Abschnitt 2.3.1.1) beschriebenen Werkstoffen wurden im Zusammenhang mit dem F&E-Projekt zusätzlich die folgenden Materialien besie-delt und gassensorisch untersucht:

�� Silikonbeschichteter Stahl für Druckleitungen im Wasserkreislauf und Steckverbindungen zur Stromversorgung (Werkstoff 2)

�� Kabelbaum für Stromleitungen mit Schrumpfschlauch und Kabelbinder (Werkstoff 3)

�� Nomex-Gewebe, ein technisches Textilmaterial mit hoher Beständigkeit u. a. gegenüber zahlreichen aggressiven Chemikalien und Flammen, verwendet für Kleidung und Aufbe-wahrungsbeutel (Werkstoff 6)

Die Werkstoffe wurden prinzipiell behandelt, besiedelt und gemessen wie in Kapitel 2 be-schrieben. Abweichend wurde in dieser ersten Versuchsphase die als Nullgas verwendete syn-thetische Luft nicht mit Aktivkohle gereinigt und die Desinfektion der Werkstoffe wurde ohne Ultraschallbehandlung vorgenommen. Die Messungen wurden direkt nach der Beimpfung, nach einem, zwei, drei, vier, sieben, neun, elf, vierzehn und siebzehn Tagen sowie nach drei Monaten durchgeführt.

Alle sechs Werkstoffe wurden in Kombination mit den im Kapitel Material und Methoden, Abschnitt 2.3.2 charakterisierten Mikroorganismen Aspergillus niger, Bacillus polymyxa, Penicillium expansum, Pseudomonas fluorescens sowie der Bakteriendominierten und Pilz-dominierten Mischkultur untersucht.

Die in dieser Versuchsphase erzielten umfangreichen Ergebnisse wurden aufgrund folgender Umstände nicht in die weitere Auswertung für diese Arbeit einbezogen:

�� Die als Null- und Trägergas verwendete synthetische Luft enthielt Spuren von Kohlen-wasserstoffen ungeklärter Herkunft, die sich in dem Wasser zur Befeuchtung der syntheti-schen Luft anreicherten und einen dieselartigen Geruch hervorriefen. Der Einfluss dieser

Anhang A-3

Verunreinigung auf die Messdaten kann nicht abgeschätzt werden. Der Fehler wurde erst im fortgeschrittenen Stadium der ersten Versuchsphase bemerkt und in der zweiten Ver-suchsphase durch einen Aktivkohlefilter für das Null- und Trägergas abgestellt. In Abbildung A-1 ist exemplarisch eine Messung mit verunreinigtem Trägergas in der ersten Versuchphase und mit gereinigtem Trägergas in der zweiten Versuchsphase dargestellt. Die Messprofile mehrerer Sensoren unterscheiden sich in den verglichenen Messungen deutlich. Diese Beobachtung ist übertragbar auf die übrigen Messungen. Es ist offen, ob durch die regelmäßige Kalibrierung der Sensoren mit der ebenfalls verunreinigten Nullluft der Einfluss der Verunreinigung vollständig aufgehoben werden konnte. Wieweit die Verunreinigungen der synthetischen Luft einerseits und die bereits diskutierte Sensoren-drift andererseits diese Abweichungen beeinflusst haben, kann nicht beurteilt werden.

�� Jede Werkstoff-Mikroorganismen-Kombination konnte nur an einer Probe untersucht werden, da lediglich eine begrenzte Anzahl an Werkstoffproben zur Verfügung stand, an-hand derer die Untersuchung aller Kombinationen vertraglich gefordert war. Diese ein-fache Ausführung der Untersuchungen ermöglicht keinerlei Aussagen zur Reproduzier-barkeit der Ergebnisse.

�� Aufgrund der Größe und schlechten Handhabbarkeit der Werkstoffproben waren die Re-sultate einer Validierung der gassensorischen Ergebnisse mit herkömmlichen mikrobiolo-gischen Methoden völlig unbefriedigend. Von einer weiteren Untersuchung mit moleku-larbiologischen Methoden musste daher abgesehen werden.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Zeit [min]

Abbildung A-1: Verschiedene Sensorsignale bei Messungen zweier identisch angesetzter Kulturen von Aspergillus niger auf Werkstoff 1 (Polyurethanbeschichtung auf Chromatschutzschicht und anodisiertem Alumi-nium) nach dreitägiger Inkubation bei 23°C. Beide Messungen wurden mit der Elektronischen Nase ENO-1 durchgeführt. Die obere Messung erfolgte in der ersten Versuchsphase, die untere Messung in der zweiten Ver-suchsphase ca. acht Monate später.

A-4 Anhang

Die Ergebnisse der ersten Versuchsphase sollen in Tabelle A-1 kurz in Beziehung zu den in den vorangehenden Kapiteln ausführlich erläuterten Ergebnissen gesetzt werden. Abweichen-de Ergebnisse werden kurz erläutert.

Tabelle A-1: Vergleich der Ergebnisse aus der Versuchsphase 1 und Versuchsphase 2. Eine umfangreichere Auswertung der Ergebnisse erfolgte aufgrund erheblicher Mängel in der Reproduzierbarkeit in der ersten Ver-suchsphase nur bei den Ergebnissen der zweiten Versuchsphase.

Aussage Versuchsphase 1 Versuchsphase 2

Mikrobielle Kontaminationen von Werkstoffen können unter Laborbedingungen gassensorisch nachgewiesen werden.

ja ja

Oberflächen besiedelnde Mikroorganismen sind im Laborversuch gassensorisch differenzierbar.

ja ja

Aufgrund der verschiedenen Wechselwirkungen der Eigenschaften von Werkstoffmaterial und besiedelndem Mikroorganismus können die Sen-sorsignale bei gleichem Organismus und ver-schiedenen Werkstoffen sowohl vollkommen unterschiedlich als auch fast identisch sein.

ja ja

Aus analytischen und physiologischen Gründen werden in Mischkulturen Spezies, aus denen sie zusammengesetzt sind, gassensorisch nicht wie-dergefunden.

ja ja

Zwei Mischkulturen aus teilweise identischen Organismenarten sind gassensorisch unter-scheidbar.

bei Betrachtung ak-tiver junger Kultu-ren, alte Kulturen sind gassensorisch

ähnlich

ja

Die Zusammensetzung der gasförmigen Stoff-wechselprodukte und folglich die gassensori-schen Messprofile sind abhängig vom physiolo-gischen Stadium oder Alter einer Kultur.

ja nicht untersucht

Anhang A-5

Ein Vergleich der ersten mit der zweiten Versuchsphase zeigt überwiegend identische Resul-tate (Tabelle A-1). Abweichungen ergeben sich lediglich durch den Umstand, dass die Kultu-ren in der ersten Versuchsphase an mehreren verschiedenen Tagen gemessen wurden (s. oben), während in der zweiten Versuchsphase nur drei Tage alte Kulturen untersucht wur-den. Die Messungen in der ersten Versuchsphase über längere Zeiträume ergaben Entwicklungs-verläufe in den Sensorsignalen der Elektronischen Nase ENO-1. Die Entwicklungsverläufe basierten schwerpunktmäßig auf den verschiedenen physiologischen Stadien der Kulturen und den sich entsprechend verändernden flüchtigen Stoffwechselprodukten. Die altersabhängige Bildung von MVOC wurde bereits von verschiedenen Autoren nachgewiesen (Adamek et al., 1992; Bachinger & Mandenius, 2001; Bjurman et al., 1997; Cimander et al., 2002 a; Navratil et al., 2004; Sunesson et al., 1996). Bei einigen Werkstoffen kann sich auch das Spektrum ihrer Emissionen aufgrund der Einwir-kungen während der Inkubation z. B. durch Feuchte verändern (Claeson et al., 2007). In Abbildung A-2 sind die Veränderungen der Emissionen einer Kultur von Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1 exemplarisch für alle in der ersten Versuchsphase untersuchten Mikroorganismen-Werkstoff-Kombinationen dargestellt. Die Veränderungen an den ver-schiedenen Messtagen sind deutlich zu erkennen.

Abbildung A-2: Die PCA zeigt exemplarisch die altersabhängige Entwicklung der Emissionen einer Kultur von Bacillus polymyxa auf Werkstoff 1. Dargestellt sind die Messungen mit der Elektronischen Nase ENO-1 von Beginn der Kultivierung (0 d) bis zu einer 17 Tage alten Kultur (17 d).

A-6 Anhang

Auch bei den Mischkulturen war eine altersabhängige Entwicklung der Emissionen zu beobachten. Die Mischkulturen setzten sich jeweils aus drei verschiedenen Mikroorganis-menarten zusammen, von denen zwei Arten in Bakteriendominierter und Pilzdominierter Mischkultur identisch waren (vgl. Material und Methoden, Abschnitt 2.3.2.2). Die beiden verschiedenen Mischkulturen unterschieden sich besonders in den ersten Tagen der Kultivie-rung deutlich voneinander, ältere Kulturen näherten sich in ihren Messsignalen an. Exempla-risch ist diese Beobachtung für eine Kultivierung auf Werkstoff 1 in Abbildung A-3 darge-stellt. Eine mögliche Ursache für die Annäherung der Sensorsignale bei älteren Kulturen kann ihre nachlassende Stoffwechselaktivität nach Verbrauch der leicht verfügbaren Nährstoffe sein.

Abbildung A-3: Der Entwicklungsverlauf der Mischkulturen mit Bakteriendominanz (B) und Pilzdominanz (P) zeigt die während der Kultivierung anwachsenden gassensorischen Unterschiede der Kulturen, die bei alten Kulturen fast vollständig verschwinden. PCA der Sensorsignale der Elektronischen Nase ENO-1 von einer Bakteriendominierten Mischkultur (B) und einer Pilzdominierten Mischkultur (P) auf Werkstoff 1 an verschie-denen Tagen der Kultivierung. Ausgewählt wurden Messwerte nach einem, drei, sieben, vierzehn und siebzehn Tagen Inkubation (1 d, 3 d, 7 d, 14 d und 17 d) bei 23°C.

Aufgrund der erläuterten Mängel in der ersten Versuchsphase und der daraus resultierenden geringen Reproduzierbarkeit der Daten, können die daraus gewonnenen Erkenntnisse ledig-lich der Orientierung dienen. Ein positiver Aspekt ist jedoch die Übereinstimmung von Resul-taten aus der ersten und aus der zweiten Versuchsphase. Im Rahmen der gegebenen Möglichkeiten wurden Mängel in der zweiten Versuchsphase auf-gehoben, indem das Null- und Trägergas gereinigt und Messungen mit mehreren Parallelen durchgeführt wurden. Schwierigkeiten, die direkt in der Technologie Elektronischer Nasen und in den durch das Projekt vorgegebenen Bedingungen begründet sind, wurden ausführlich in den vorangehenden Kapiteln erläutert und diskutiert.

Anhang A-7

In der zweiten Versuchsphase wurden Werkstoffe mit Mikroorganismen besiedelt und nach dreitägiger Inkubation mit der Elektronischen Nase ENO-1 gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden ausführlich in der vorliegenden Arbeit beschrieben und diskutiert. Auch für diese Untersuchungen lag nur eine begrenzte Anzahl von Werkstoffproben zur Verfügung, durch eine veränderte Versuchsplanung konnten hier im Gegensatz zu der ersten Versuchsphase Messungen mit sechs bis acht Parallelen vorgenommen werden.

Für das Projekt lag ein weiterer Aufgabenschwerpunkt auf der Dekontamination der besiedel-ten Werkstoffoberflächen. Die besiedelten Werkstoffe wurden mit verschiedenen geruchsar-men, alkoholfreien Desinfektionsmitteln gereinigt, um deren Einfluss auf die Emissionen und den Erfolg der Reinigung gassensorisch zu erfassen. Dazu wurden die Werkstoffe am Folge-tag der Reinigung mit der Elektronischen Nase ENO-1 untersucht. Der Erfolg der Reinigung wurde mit Abklatschplatten überprüft, und anschließend wurden die Werkstoffe mit Nährme-dium überschichtet, um eine Rekontamination durch überlebende Mikroorganismen zu simu-lieren. Nach nochmaliger neuntägiger Inkubation wurde eine weitere gassensorische Überprü-fung und eine mikrobiologische Untersuchung vorgenommen.

Die Auswertung der Abklatschplatten und der mikrobiologischen Untersuchung einer mögli-chen Rekontamination zeigte, dass die Desinfektion der Werkstoffe bis auf sehr wenige Aus-nahmen erfolgreich war. Die gassensorische Untersuchung der Werkstoffe am Tag nach der Desinfektion ergab gleiche Sensorsignale für zuvor besiedelte Werkstoffe und unbesiedelte Kontrollen. Die Sensorsignale unbesiedelter Kontrollen vor der Desinfektion waren von de-nen nach der Desinfektion eindeutig verschieden. Exemplarisch dargestellt ist diese Beobach-tung anhand der Untersuchung von Penicillium expansum auf Werkstoff 1 in Abbildung A-4.

Die gassensorische Überprüfung der mit Nährmedium überschichteten Werkstoffe nach neun Tagen führte aufgrund der geringen Rekontamination zu keinen nennenswerten Ergebnissen.

Die Untersuchungen zur Desinfektion der Werkstoffe wurden in diese Dissertation nicht ein-bezogen, da die meisten Ergebnisse vorhersehbar und kaum zu diskutieren waren.

Eine Risikoanalyse und weitere Untersuchungen für das F&E-Vorhaben „Material für Lang-zeitanwendung im Weltraum MLA V – Mikrobiologie“ wurden von anderen Projektmitarbei-tern wahrgenommen. Dazu gehörten die Untersuchungen gealterter Werkstoffe, die Auf-schluss über die Veränderungen der Emissionen über einen Zeitraum von zehn Jahren bieten sollten. Zudem wurden GC-MS-Messungen von Mikroorganismen auf herkömmlichen Nährmedien sowie besiedelter und unbesiedelter Werkstoffen vorgenommen, um Informatio-nen über die chemische Zusammensetzung der Emissionen zu erhalten. Die Ergebnisse der GC-MS-Analyse wurden teilweise in dieser Dissertation in die Einleitung und die Diskussion eingearbeitet.

A-8 Anhang

Abbildung A-4: Nach der Dekontamination waren unbesiedelte Kontrollen und zuvor besiedelten Proben iden-tisch, eine Besiedlung war nach einer Dekontamination gassensorisch nicht mehr nachweisbar. Die unbesiedel-ten Kontrollen veränderten durch die Desinfektion und waren gassensorisch verschieden von nicht desinfizierten Kontrollen. PCA der Messwerte von unbesiedelten Kontrollen und mit Penicillium expansum besiedelten Proben von Werkstoff 1 vor und nach der Desinfektion mit verschiedenen Desinfektionsmitteln.

Anhang A-9

Anhang 2 Anhang zum Ergebnis-Teil – Diagramme zu Mittelwertvergleichen

Anhang 2.1 Messgenauigkeit – Aceton-Standard


1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Abbildung A-5: Verlaufsdiagramm des Aceton-Standards mit der Konzentration 1 ppm. Dargestellt sind die Mittelwerte der 21 Messtage A bis U von Sensor Nr. 1 der Elektronischen Nase ENO-1.

A-10 Anhang


0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Anhang A-11


0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


A-12 Anhang


0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



0,9

0,92

0,94

0,96

0,98

1

1,02

1,04


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Anhang A-13


0,2

0,4

0,6

0,8

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



0,92

0,94

0,96

0,98

1

1,02

1,04


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


A-14 Anhang


0,9

0,92

0,94

0,96

0,98

1

1,02


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



1

1,2

1,4

1,6

1,8

2


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Anhang A-15


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



0

0,5

1

1,5

2

2,5


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


A-16 Anhang


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

2,2

2,4


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Anhang A-17


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



0,95

0,96

0,97

0,98

0,99

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


A-18 Anhang


0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



0,9

0,92

0,94

0,96

0,98

1


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Anhang A-19


0,88

0,9

0,92

0,94

0,96

0,98

1

1,02


Messung

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


A-20 Anhang

Anhang 2.2 Vergleich unbesiedelter und besiedelter Werkstoffe

Anhang 2.2.1 Werkstoff 1

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenAspergillus niger

Abbildung A-25: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Aspergillus niger besiedelter Pro-ben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenBacillus polymyxa

Abbildung A-26: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Bacillus polymyxa besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Anhang A-21

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenPenicillium expansum

Abbildung A-27: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenPseudomonas fluorescens

Abbildung A-28: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Pseudomonas fluorescens besie-delter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elekt-ronischen Nase ENO-1.

A-22 Anhang

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenBakteriendominierte Mischkultur

Abbildung A-29: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Bakteriendominierter Mischkultur besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

KontrollenPilzdominierte Mischkultur

Abbildung A-30: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Pilzdominierter Mischkultur be-siedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Anhang A-23


Werkstoff 4

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



Werkstoff 4

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A- 32: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 4. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

A-24 Anhang


Werkstoff 5

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G



Werkstoff 5

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A-34: Vergleich der Messwerte unbesiedelter Kontrollen und mit Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 5. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Anhang A-25

Anhang 2.3 Vergleich der Mikroorganismen-Arten

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Aspergillus nigerBacillus polymyxa

Abbildung A-35: Vergleich der Messwerte mit Aspergillus niger und Bacillus polymyxa besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Aspergillus nigerPenicillium expansum

Abbildung A-36: Vergleich der Messwerte mit Aspergillus niger und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

A-26 Anhang

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Aspergillus nigerPseudomonas fluorescens

Abbildung A-37: Vergleich der Messwerte mit Aspergillus niger und Pseudomonas fluorescens besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Bacillus polymyxaPenicillium expansum

Abbildung A-38: Vergleich der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Anhang A-27

Werkstoff 4

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A-39: Vergleich der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Proben von Werkstoff 4. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 5

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A- 40: Vergleich der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Penicillium expansum besiedelter Pro-ben von Werkstoff 5. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

A-28 Anhang

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Bacillus polymyxaPseudomonas fluorescens

Abbildung A-41: Vergleich der Messwerte mit Bacillus polymyxa und Pseudomonas fluorescens besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Penicillium expansumPseudomonas fluorescens

Abbildung A-42: Vergleich der Messwerte mit Penicillium expansum und Pseudomonas fluorescens besiedelter Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektroni-schen Nase ENO-1.

Anhang A-29

Anhang 2.4 Vergleich der Werkstoffe

Anhang 2.4.1 Unbesiedelte Kontrollen

Kontrollen

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Werkstoff 1Werkstoff 4Werkstoff 5

Abbildung A-43: Vergleich der Messwerte der unbesiedelten Kontrollen von Werkstoff 1, Werkstoff 4 und Werkstoff 5. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Anhang 2.4.2 Besiedlung mit Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A-44: Vergleich der Messwerte der mit Bacillus polymyxa besiedelten Proben von Werkstoff 1, Werkstoff 4 und Werkstoff 5. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektro-nischen Nase ENO-1.

A-30 Anhang

Anhang 2.4.3 Besiedlung mit Penicillium expansum


0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G


Abbildung A-45: Vergleich der Messwerte der mit Penicillium expansum besiedelten Proben von Werkstoff 1, Werkstoff 4 und Werkstoff 5. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektro-nischen Nase ENO-1.

Anhang A-31

Anhang 2.5 Vergleich von Reinkulturen und Mischkulturen

Anhang 2.5.1 Bakteriendominierte Mischkultur

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Bacillus polymyxaBakteriendominierte Mischkultur

Abbildung A-46: Vergleich der Messwerte der mit Bacillus polymyxa und Bakteriendominierter Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Penicillium expansumBakteriendominierte Mischkultur

Abbildung A-47: Vergleich der Messwerte der mit Penicillium expansum und Bakteriendominierter Mischkul-tur besiedelten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

A-32 Anhang

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Pseudomonas fluorescensBakteriendominierte Mischkultur

Abbildung A-48: Vergleich der Messwerte der mit Pseudomonas fluorescens und Bakteriendominierter Misch-kultur besiedelten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Anhang 2.5.2 Pilzdominierte Mischkultur

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Aspergillus nigerPilzdominierte Mischkultur

Abbildung A-49: Vergleich der Messwerte der mit Aspergillus niger und Pilzdominierter Mischkultur besiedel-ten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektro-nischen Nase ENO-1.

Anhang A-33

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Bacillus polymyxaPilzdominierte Mischkultur

Abbildung A-50: Vergleich der Messwerte der mit Bacillus polymyxa und Pilzdominierter Mischkultur besie-delten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elekt-ronischen Nase ENO-1.

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Penicillium expansumPilzdominierte Mischkultur

Abbildung A-51: Vergleich der Messwerte der mit Penicillium expansum und Pilzdominierter Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

A-34 Anhang

Anhang 2.6 Vergleich der Mischkulturen

Werkstoff 1

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sensor Nr.

Rel

ativ

er L

eitw

ert G

0/G

Bakteriendominierte MischkulturPilzdominierte Mischkultur

Abbildung A-52: Vergleich der Messwerte der mit Bakteriendominierter Mischkultur und Pilzdominierter Mischkultur besiedelten Proben von Werkstoff 1. Dargestellt sind die Mittelwerte der Signale der Sensoren Nr. 1 bis 10 der Elektronischen Nase ENO-1.

Anhang A-35

Anhang 3 Evaluierung

Zur Überprüfung der Klassifizierungsergebnisse von Aceton-Standard (1 ppm und 5 ppm) und Kontrollen des Werkstoffs 1 wurden die Daten per Losverfahren halbiert. Aus der einen Hälfte der so ausgewählten Daten wurde eine PCA erstellt, in den Tabellen bezeichnet als PCA - Klassifizierung (s. auch Ergebnisse, Abschnitt 3.1.1.2 und 3.1.2). Mit der anderen Hälfte der Daten wurde die Qualität der Klassifizierung in der PCA überprüft, in den Tabellen benannt als PCA - Überprüfung.

In Tabelle A-2, Tabelle A-3 und Tabelle A-4 sind die per Losverfahren ausgewählten Daten-sätze dargestellt.

Tabelle A-2: Die zur Klassifizierung in der PCA und zur Überprüfung ausgelosten Datensätze der Messtage A bis U von Aceton-Standard 1 ppm.

Aceton-Standard - 1 ppm: PCA - Klassifizierung PCA - Überprüfung


A-36 Anhang

Tabelle A-3: Die zur Klassifizierung in der PCA und zur Überprüfung ausgelosten Datensätze der Messtage A bis U von Aceton-Standard 5 ppm.

Aceton-Standard - 5 ppm: PCA - Klassifizierung PCA - Überprüfung


Anhang A-37

Tabelle A-4: Die zur Klassifizierung in der PCA und zur Überprüfung ausgelosten Datensätze der Messtage I bis VI der Kontrollen von Werkstoff 1. An jedem Messtag wurden sechs Proben gemessen, von denen jeweils zwei zu den Datensätzen a, b und c zusammengefasst wurden.

Werkstoff 1 – Kontrollen: PCA - Klassifizierung PCA - Überprüfung

I a I b I c II a II b II c III a III b III c IV a IV b IV c V a V b V c VI a VI b VI c

A-38 Anhang

In Tabelle A-5, Tabelle A-6 und Tabelle A- 7 sind die Ergebnisse der Klassifizierungsüber-prüfung aufgelistet.

Tabelle A-5: Ergebnisse der Überprüfung der PCA mit den nicht klassifizierten Datensätzen der hierfür ausge-losten Messtage von Messungen des Aceton-Standards (1 ppm) (vgl. Tabelle A-2).

Aceton-Standard -

1 ppm:

Datensätze der Messtage

Korrekte Zuord-nung

Keine korrekte Zu-ordnung

A 8 1 C 9 0 D 6 3 E 7 2 F 9 0 H 0 9 I 9 0 K 9 0 Q 9 0 S 7 2

81 % 19 %

Tabelle A-6: Ergebnisse der Überprüfung der PCA mit den nicht klassifizierten Datensätzen der hierfür ausge-losten Messtage von Messungen des Aceton-Standards (5 ppm) (vgl. Tabelle A-3).

Aceton-Standard -

5 ppm:

Datensätze der Messtage

Korrekte Zuord-nung


A 9 0 C 9 0 E 9 0 F 9 0 G 9 0 H 0 9 I 9 0 J 5 4 L 9 0 U 9 0

86 % 14 %

Anhang A-39

Tabelle A- 7: Ergebnisse der Überprüfung der PCA mit den nicht klassifizierten Datensätzen von Messungen der Kontrollen von Werkstoff 1, die hierfür per Losverfahren ausgewählt wurden (vgl. Tabelle A-4).

Werkstoff 1 – Kontrollen:

Datensätze Korrekte Zuord-nung


I c 3 3 II a 6 0 II b 5 1 III a 1 5 III b 6 0 III c 2 4 IV a 6 0 V b 6 0 VI a 3 3

70 % 30 %

A-40 Anhang

Gassensorische Untersuchungen mikrobiell kontaminierter ...

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