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Gama de hospedeiros de replicao de plasmdeos IncP1 intactos
Comparao da gama de hospedeiros de IncP-1g pKS208 e pMBUI1T17 e
de IncP-1b pBP136 por ensaios conjugativos.
Ensaios de transformao: comparar isoladamente as funes
replicativas e a gama de hospedeiros de replicao
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Conjugao
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Conjugao Materiais e mtodos1 ensaio: Pseudomonas putida como
doadorahospedeiro permissivo de plasmdeos IncP-1g
2 ensaio: Escherichia coli como doadora
Cinco linhagens receptoras:E. coli e P. putida: classe
GammaproteobacteriaCupriavidus pinatubonensis:
BetaproteobacteriaAgrobacterium tumefaciens e Sphingobium
japonicum: Alphaproteobacteria
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Conjugao - ResultadospKS208 no se auto-transferiuNo possui gene
traC completo
Plasmdeo auxiliar pRK2013Carrega genes para transferncia de
IncP-1aReplicon ColE1 com genes RK2 conjugativos
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Conjugao - Resultados Plasmdeos IncP-1g e IncP-1b :P. putida E.
coliP. putida C. pinatobunensisE. coli C. pinatobunensisP, putida
S. japonicum , A. tumfaciensIncP-1g XIncP-1b pB136KM E. coli A.
tumefaciensIncP-1g: baixas frequnciasIncP-1b pB136KM: altas
frequnciasE coli S. japonicumIncP-1g XIncP-ib PB136KM
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Introduo
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Conjugao - ConclusoIncP-1g e IncP-1b tm gamas de hospedeiros
sobrepostas, mas diferentes;
A gama de hospedeiro aparente de IncP-1g limitadaFraca
transferncia doador hospedeiroFraco estabelecimento no receptor
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Transformao Materiais e mtodos
Plasmdeos purificados de P. putida KT2440quantificao do DNA
feita por densitometria
Transformao por eletroporao
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EletroporaoA clula exposta a um campo eltrico de alta
intensidade, que desestabiliza a membrana;
Formam-se poros na membrana, permitindo a entrada do DNA exgeno
de interesse;
Quando o campo eltrico desligado, a membrana se reestrutura, e o
DNA fica mantido no interior da clula.
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EletroporaoProcedimento no-qumicoNo altera a estrutura biolgica
ou funo da clula;Performance rpida e simples;Grande eficincia;Pode
ser aplicada a diferentes tipos celulares, desde que se ajuste os
parmetros eltricos;
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DNA doador: P. putida KT2440
Clulas transformadasPreparao de clulas eletrocompetentesMisturar
com DNA plasmidial de interesseSubmeter mistura ao
choqueTransformao Materiais e mtodos
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Transformao Materiais e mtodosPlaqueamento ps-transformao:
gar sem antibitico: contagem das clulas viveis
gar com antibitico: contagem dos tranformantes
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Transformao - Resultados
P. putida e C. pinatobunensis Todos os trs plasmdeos se
estabeleceramEficincias indistinguveisAlphaproteobacteriapmBUIT17
XpK208: A. tumefaciens; X S. japonicumpBP136Km: A. tumefaciens; S.
japonicumE. colipMBUI1T17: eficinciaPBP136KM e pKS208:
eficincia
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Transformao - ResultadosEficincias do estabelecimento dos
plasmdeos IncP-1 intactos nos cinco hospedeiros.
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Transformao - Concluso
Resultados consistentes com os obtidos no experimento de
conjugaoAtividade replicativa baixa em AlphaproteobacteriaGama de
hospedeiros dos plasmdeos IncP-1g se sobrepe apenas parcialmente
com a de IncP-1b
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Discusso GeralNo foi observada autotransferncia de IncP-1g
pKS208 nos experimentos de conjugao
Delees no quadro de leitura em traC
pKS208 X IncP-1gSequncias dos produtos gnicosContedo G+C dos
operons tra e trb
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Discusso Geral
Isolamento e caracterizao de novos IncP-1gMais plasmdeos como
pKS208Determinao da base gentica de sua deficincia conjugativa