Top Banner
Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling Angela Saez 1 , Nadezda Apostolova 1 , Miguel Gonzalez-Guzman 1 , Mary Paz Gonzalez-Garcia 2 , Carlos Nicolas 2 , Oscar Lorenzo 2 and Pedro L. Rodriguez 1, 1 Instituto de BiologõÂa Molecular y Celular de Plantas, Universidad Polite  cnica de Valencia-Consejo Superior de Investigaciones Cientõ®cas, Camino de Vera, E-46022 Valencia, Spain, and 2 Departamento de FisiologõÂa Vegetal, Centro Hispano-Luso de Investigaciones Agrarias, Facultad de BiologõÂa, Universidad de Salamanca, Plaza de los Doctores de la Reina, E-37007 Salamanca, Spain Received 15 July 2003; revised 3 October 2003; accepted 20 October 2003. For correspondence (fax 34 963877859; e-mail [email protected]). Summary HAB1 was originally cloned on the basis of sequence homology to ABI1 and ABI2, and indeed, a multiple sequence alignment of 32 Arabidopsis protein phosphatases type-2C (PP2Cs) reveals a cluster composed by the four closely related proteins, ABI1, ABI2, HAB1 and At1g17550 (here named HAB2). Characterisation of transgenic plants harbouring a transcriptional fusion Pro HAB1 : green ¯uorescent protein (GFP) indicates that HAB1 is broadly expressed within the plant, including key target sites of abscisic acid (ABA) action as guard cells or seeds. The expression of the HAB1 mRNA in vegetative tissues is strongly upregulated in response to exogenous ABA. In this work, we show that constitutive expression of HAB1 in Arabidopsis under a cauli¯ower mosaic virus (CaMV) 35S promoter led to reduced ABA sensitivity both in seeds and vegetative tissues, compared to wild-type plants. Thus, in the ®eld of ABA signalling, this work represents an example of a stable phenotype in planta after sustained overexpression of a PP2C genes. Additionally, a recessive T- DNA insertion mutant of HAB1 was analysed in this work, whereas previous studies of recessive alleles of PP2C genes were carried out with intragenic revertants of the abi1-1 and abi2-1 mutants that carry mis- sense mutations in conserved regions of the PP2C domain. In the presence of exogenous ABA, hab1-1 mutant shows ABA-hypersensitive inhibition of seed germination; however, its transpiration rate was similar to that of wild-type plants. The ABA-hypersensitive phenotype of hab1-1 seeds together with the reduced ABA sensitivity of 35S:HAB1 plants are consistent with a role of HAB1 as a negative regulator of ABA signalling. Finally, these results provide new genetic evidence on the function of a PP2C in ABA signalling. Keywords: ABA, PP2C, HAB1, negative regulation, Arabidopsis. Introduction Abscisic acid (ABA) plays a crucial role in seed develop- ment, as well as in the regulation of plant responses to adverse environmental conditions (Koornneef and Karssen, 1994; Leung and Giraudat, 1998; Rock and Quatrano, 1995; Zeevaart and Creelman, 1988). During seed development, ABA regulates the synthesis of seed storage proteins and lipids, desiccation tolerance, as well as the promotion of seed dormancy. The role of ABA as a mediator of physio- logical responses to low-water potential situations is further evidenced genetically by ABA-insensitive and ABA-de®cient mutants, which are hypersensitive to drought and salinity (Leung and Giraudat, 1998). Water stress results in the increase of up to 40-fold in ABA levels, leading to a variety of adaptive responses, such as stomatal closure and differential gene expression (Zeevaart, 1999). Stomatal closure occurs through rapid changes of ion ¯uxes in guard cells and osmoregulation (reviewed by Schroeder et al., 2001). A variety of second messengers contribute to the transmission of the ABA signal. These include cyclic ADP-ribose, reactive oxygen species (ROS), phosphoinositides, phosphatidic acid, sphingosine 1-phos- phate, and Ca 2 (Allen et al., 2001; Gilroy et al., 1990; Jacob The Plant Journal (2004) 37, 354±369 354 ß 2003 Blackwell Publishing Ltd doi: 10.1046/j.1365-313X.2003.01966.x
16

Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

Apr 24, 2023

Download

Documents

Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Page 1: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�������������� ��� �� ���������� �������� �� �������� ��� ���� � �� ���� ������ � ���� � � ��������������� �� �� � � ��� ���������

������ ������ ������� ��� ������� ������ ����������������� ���� �� ���������������� ����� ����� ��

! �� "������� ��� ���� "# $��������������������� ����� ��� �������� � ������ �������� �������� ������ ����� �������������� �������

������ ������ ����������� �� ��� ���� !�"#$%% �������� ������ ��%&����� ��� '������ ��� � ���� ����� (�������)��� ������ ������ * ������� '������ ����� ����

�������� ���� ����� ���+� ��� &������ �� ,���� !�-.$$. ���� ����� �����

�������� �� �� ���� ������� � ������� ���� �������� � ������� �������� �������������� ���� ��� !�"##"� � �$%��� ������&�'(��%��������)�

�������

���� %� ���������� ����� �� �� �� � �� �&���� �������� � ���� ��� ����� ��� ������� � �������

�&���� �������� �� '� ����� �� ������ ��� ���� � ������ ( �� ) ������ � �� �� ���� �� ��

�� ���� �� ��� ������ ������ � �*+�� �*+�� ,�*� ��� ����-../ (���� ����� ,�*�)# �������� ���� ��

��� ���� ���� ���������� � ��� �������� �� ��� �������0 ����� 1���� �� ������ (���) ������ ��

���� � ������� �2��� �� %���� �� ����� �������� 3�� ���� �� �� �� � � ��� (�*�) ���� � �����

��� �� ��� # 4�� �2��� ��� �� �� ���� �$�� �� �������� � �� � ������ ���������� �� �� ��� �

� �2������ �*�# +� �� %��3� %� ��% �� �� ����� �2��� ��� �� ���� �� ����� �� ����� �

����1�%�� �� �� ���� (���5) '.� ������� ��� � ������ �*� �� ����� ��� �� ��� ��� ��������

� �� � ������� � %������� ���� # 4�� � �� �� 6��� �� �*� ���������� �� %��3 ����� �� �� �2�����

�� � ���� �������� � ����� ���� � ����� �����2��� ��� �� � ���� ���� # ������������ � ��� ��� 4�

7�� �� ����� ���� �� ���� %� ����� �� �� �� %��3� %����� ������� ���� �� ��� ��� ������ ��

���� ���� %��� ������ �� %�� �������� ������� �� �� ���� ��� ���� ���� �� ���� �� �

�� � ������ �� �� ����� ������ �� �� �� ������# +� �� ��� ��� �� �2������ �*�� �����

���� ��% �*������� �� ���� ��������� �� ��� ����������8 ��%����� � ��� ������� ��� %�

������ � �� �� %������� ���� # 4�� �*������� �� ���� �������� �� ����� ��� ������ %�� ��

������ �*� �� ����� �� �������� ���� ��� �� � �� %�� � ���� �� ���� � � ������� �������� ��

�*� ���������# 9������� �� � �� �� ������� ��% ����� ������� �� �� ������ �� � �� �� �*�

���������#

:��%��� 0 �*�� ��� ,�*�� ������� ���������� ����� ��#

+��������

*������� ���� �*+*) ����� � ������ ���� �� ���� �������$

%���, �� -��� �� �� �.� ��&������ �� ����� ��������� ��

������� �������%����� ���������� �/�������� ��� /������,

� �� 0��& ��� 1������, � "� ���2 ��� 3������, � ��

4������� ��� 5����%��, � "")� 6���& ���� �������%���,

*+* ��&����� �.� ����.���� �� ���� �����&� �������� ���

������, ����������� ���������, �� -��� �� �.� ���%����� ��

���� ���%����� 7.� ���� �� *+* �� � %������� �� �.����$

��&���� ��������� �� ��-$-���� ��������� ��������� ��

���.�� ��������� &���������� �� *+*$����������� ���

*+*$��8����� %�����, -.��. ��� .������������� ��

���&.� ��� �������� �0��& ��� 1������, � ")� 9����

������ ������ �� �.� �������� �� � �� ��$���� �� *+* ������,

������& �� � ������� �� �������� ���������, ��. �� ���%����

������ ��� ������������ &��� ���������� �4�������, � )�

:��%���� ������ ����� �.��&. ����� �.��&�� �� ���

;��� �� &��� ����� ��� ��%���&������ ������-�� ��

:�.������ � ���, ���)� * ������� �� ������ %�����&���

��������� �� �.� �����%������ �� �.� *+* ��&���� 7.���

������ ������ *6<$������, �������� ���&�� ������� ���:),

�.���.�����������, �.���.������ ����, ��.��&����� �$�.��$

�.���, ��� 5� � �*���� � ���, ���� 1����� � ���, � �� ����

/0 ����� 1������ � ���) '-, ���=�!

��� � ��� +���2-��� <����.��& 0��

���> ������!?@���!�$���A� ������ !!��

Page 2: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

� ���, � � 0��2�� � ���, � "� 0�%����$5.���. � ���, ����

B& � ���, ���� <�� � ���, ���� 9 � ���, � #)� 6�-�$

�����% ��&������& �������� � ��%���� ���-��2 �� ���.

�������� ��� ��&����� ��&������, ����������� �������

2������?�.���.������, ��� � ����.��� �� ���������������

��&������ ������-�� �� ���2������� � ���, �� )� C�������

�� �.� �B*$������& �������� .��������� ������ � �DE0�),

*+*$.������������� � �*+D�) �� ������������� �� *+* ���

���&.� � �:*6�) ���� ������ *+* ��&������& �D&�����

� ���, ���� 0 ��� ��������, ���� A���& � ���, ���)�

<������ �.���.���������?��$�.���.��������� ������ ��

*+* ��&������& ������� ������� 2��-� ������� 2������

��� �.���.������ ����2������� � ���, �� � 0��& ���

1������, � ")� ��� ��������, �.� &���$����$�����8� �������

2����� *+*$��������� ������� 2����� �**</) ���% ����� 2�3�

��&����� *+*$������ ���%���� ������ �0� � ���, ���)�

F��������� �� � ��%����� ��&����� **�4 ������ �������

���%��� ����������� �� *+*$������ ������ �.��&. ��.���$

���� �� ����%� %�%����� ����� �.������ �0� � ���, ���)�

��������, �.� *��3������ ���� ����%��� � ��:7�) �������

2�����, -.��. �� ������� �� **</, -�� �.�-� ��%������ �.�

��&������ �� ���%���� ������� �� *+* �C������ � ���,

�� )� *+*$������ ��: ��������� -�� �������� ��

���� &��� �����, ���������& �.�� �:7� ���� ������% ��

��: ��������� �C������ � ���, �� )� *���.�� �������

2����� �������� �� *+* ��&������& �� *+*$������ �������

2����� � �</*+*�), -.��. �� ������ �� *+* ��� -.��.

��������� &���������� �1*)$�������� &��� ���������� ��

������ ������� ������ �1�%�'$5������ � ���, � )� G�

�������� �� �����%$����������� ������� 2������, �.� ���$

��%$��������� ������� 2������ �56</)� ��� 56</�� ����

%������ *+* ��&������&, �� ���������� �� �������������

������ 56</� ��� 56</�� ����� �� ���������� �� �.� *+*$

�������� (��� ��� �� *+*$���������� � �(�*�) ���$

%���� �:.���, � !)�

5���������, *+* ��&������& �� ���� ��&����� �� �������

������� ������?�.������� �.���.������ �<<)� << ��� ������$

8�� ���� ��� %�@�� �������, <<�, << *, << + ��� �������

�.���.������ ����$ 5 �<< 5), �� �.� ����� �� �.��� ��$

������ �����8������, �������� ������ ��H���%���� ��� �����$

������ �� ��.������� �5�.��, � " )� 7.� �� �� �2����� ���� ���

��.������ �� <<� ��� << *) ��.����� *+*$������ ���%����

������& �� ���� ���� �:�.%��� � ���, � �) ��� ���������

*+*$���������� ���%����� �� ��%��� .��������� �9

� ���, � #)� D�-����, �.� ��%� ��& ������ *+*$������

���%���� ������ �� *��3������ �<�� � ���, � #)� G�������$

��&��, �� .�� ���� �������� ���� �.�� ��������� �� �.� << *

��&������ ����� �5B� ������� *+* ������������� �� *���

3������, -.��. �&&���� �.�� �5B� �������� �� � ��������

��������� �� *+* ��&������& �/-�2 � ���, �� )� �������,

������������ �� 5� �$��������� ��-��� /� �.������ �� ����

���� &��� ����� -�� ��������� �� ��.������� �� << + �0��

� ���, � �), ��� *+* ��������� �� ��� ������%�� �����

-��� ������ �� �� ��.������ �� << + �D�� � ���, � #)�

D�-����, �.��� ������ .��� �� �� ����������� -��. ������

�� �� ��������� << + ����� �� ���� �� �.� *��3������

&���%� �/��2 � ���, �� )�

G� ���� �� << 5, -.��� �� �.��%�����&���� ��.������ ��

���������, &������ �������� .�� �%�������� �.��� *��3����

��� << 5� �*+G�, *+G ��� << 5*) �� ��&����� ��&������ ��

�.� *+* ��&��� ���.-�� �1���� � ���, � � C����� � ���,

���� 7�.��.��@ ��� <����, ���)� 9.����� *+G� ��� *+G

��� ������� ��&������ �� *+* ��&������& ���. �� ����� ���

��&������� ������ �0��& � ���, � �, � #� C���� � ���,

� �� �����&�' � ���, � "�), << 5* ���� ��� ������

�� ��&���� *+* ��&������& �� ��.�������� ���������

�7�.��.��@ ��� <����, ���)� *�����������, << 5* ��&�����

�.� �������� �� �.� /� �.����� */7 �5.���� � ���, �� )�

��.�� ����� << 5� ��� �������� �� ��������� ��&��� �������$

���� ���������� 7.�, �.� 2�����$���������� ������� �.��$

�.����� �/*<<) ������� �.���.����� �������� �� �

��&����� ��&����� �� �� ����� �-� ��������$��2� 2�����

��0/) �����%� �:���� � ���, � �� 9�����%� � ���, � #),

��� �� ����� ������ �&&��� �.�� �� ���� �� � ��%%��

��%������ �� %��� �+������, �� )� 7.� ���� � �������

�.���.����� ����$ 5 �C< 5) ���� �� � ��&����� ��&����� ��

� ������$��������� %���&��$��������� ������� 2����� �C*</)

���.-�� �C��2���� � ���, � ", ���)�

G� �.�� -��2, -� ������� �������� ��� � ����� ��%� &���,

��%�� (*��� ���������& �� � ��&����� ��&����� �� *+*

��&������&� (*�� -�� ���&������ ������ �� �.� ����� ��

��H���� .�%���&� �� *��� ��� *��%, ��� �� -�� �����$

������ ��%�� *��%��(* ��� .�%���&� �� *���?*��%

������&�' � ���, � "�)� �����-��& ��������� ��� ��%��$

������ �C���2� ��� /��������, � #), -� .��� ��$��%��

�.� &��� �� *��%��(*�� ��� ����������� �� �� (*��� (*��

������� � ��������� << 5 �C��2���� � ���, ���), -.���

���������� -�� ��������� �������� �� ����, ����, ���%,

;�-�� ��� ����H� ������&�' � ���, � "�)� G� �.�� -��2,

� �������� �������� �� �����&���� ������ .�������& � ����$

����������� ����� ���-��� �.� &���� ;�������� �������

�1�<) �������� &��� ��� �.� (*�� ���%���� -�� ���$

���%��� *� � �����, -� ���� ���8�% �.�� (*�� ��

��������� ��H������ �� �.� �����, �������& 2�� ���&��

����� �� *+* ������, ��. �� &��� ����� ��� ������ (*��

���������� �� ��&������� ������ -�� ���� �� �� ��- �� �.�

������� �� *+* ��� -�� �����&�� ���&����� �� *+*

������&�' � ���, � "�)� .�-����, &������ �������� �����$

���& �.�� &��� �� *+* ��&������& -�� ���2��&� G� �.�� -��2,

-� �.�- �.�� �����&���� *��3������ ������, ���������& �

-5�6(*�� �����&���, �.�- � ��%��2���� *+* ��������������

+���2�&� �� *+* ��&������& �� ��.�� << 5� �*+G� ���

<< 5*) �� ��������� �������������� ������%���� -�� ���$

������ �������� �� :.��� �� ")� �� -��2 �� (*�� ���

�.� ��� �������� �����.�� �� 1��'���'$1����� � ��� � ���)

�� '���%�� ���.�� �.�- ������ *+* ��&������& �� ������

��� �������� �������������� �� ��%� &����� 5���������,

� 7$6B* �������� ������ �� (*�� �.��� ��%�� 0�3���)

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� ���

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

Page 3: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�������� ��.����� �������� �� *+* �� ������ +��. �.���$

����� ������ �.� ���� �� (*�� �� � ��&����� ��&����� ��

*+* ��&������&�

$� ��

D*+� �� �0 ����8� �2 �0 �� ��8 2� ��� �2 ����� ��%��

*� ����� ! << 5 ��������� &��� ������� ��� �� ���� ��

�.� &���%� �� *��3������ �/��2 � ���, �� ) ��� ����$

������ << 5� .��� ���� ��������� �� ��.�� ����� �������

�0����'� � ���, ���, �� � C��2���� � ���, � "� C���'�2�

� ���, � )� * ��� ���&�%��� �������& �! << 5� .��

�������� ���� �������� �� /��2 � ��� � �� )� 7.�� ��%����

���&�%���, �� �������� �� ����� << 5�, ������� ���������,

��&�� ��� ���%�� << 5�� 7.�������, �� ����� �� ������� �

��%���.������ �������- �� �.� ��H���� ��%�������

�%��& D*+� ��� � �������������� ����� �� ����� << 5�,

-� ��%����� � ������� ���&�%��� �������& � *��3������

<< 5�, �� -��� �� # << 5� ���% ��.�� ����� �������

���&�� �)�

7.� ���&�%��� �� �.� ��������� ����� �� �.��� � << 5�

��8��� ��� �������� �������� <.������&���� �.��������������

�� << 5� ���% ������ I� .�� ��� ��� ���� ��������� 5�����

I ������� �.� �������� �.����������� <�07F�1FG:7 << 5

�E � ���, ���)� G� �.� ���� �� ������ I�, �.� ���&�� ���$

�������� ������ �.���� �� �.� %�%���� �� �.� &��� �� �.�

�������� �� �-� ��������� ������ ���&����& ��H����� ����

�� �.� 5$���%���� ��&��� �� �.� &��� ������ �0����'� � ���,

�� )� D�-����, ������%����� �������� �� �.� ���������

������������ �� �.�� &��� �� << 5� �� ���2��&� 5����� I�

������� �.�*��3������ /*<< ��� /*<<$��2� �������� ���%

���� ��� %��'�� 5����� I! �������, �� � ��������������

%�%���, �.� -���$�.����������� ������� C< 5 ��'�%�

�C��2���� � ���, � ", ���)�

9����� �# D*+� �� �.� ������� �� ����� << 5�������� �.���&������ ���� �������& ���% �.� ���&�%��� �� �.� ��������� ����� �� � *��3������ << 5�>���� � ������, C< 5 �� ��#")� '� �� ���������, ��<< 5��3 C�J�) ��� ��<< 5 �3 C�J�)� �� 3�����0 � ����������� , C�<< 5 �3 4:3#)� 9� ���, 4%/*<< ��� #�)� :��+� ������, ��/*<< ��"����)� ���7�������� ��3��� , B�<< 5� �3 �F9�)� * <:G$+0*:7 �����. ��� ��H���� ��%������� �� 7*G� ��� B5+G ��������� -�� ������%�� ���& �.� �%��� ���� ��H������ D*+� �� � H���� ��������������%�%���� �� �.� ����� << 5 ��%��� -��� &��.���� ��� ���&���-��. 50K:7*0A ��"� ���& �.� �%��� ���� ���&� ��������� ������.� ������8��� G� �.� ���� �� D*+�, *��&�#���, *+G� ��� *+G , �.� �%��� ���� ���&� ��� -�� �"�=���, �# =���, ��"=��� ��� ���=� �, ������������� �������, ������� ����-�� &�������� ��� ���������-��. 7�FFJGF9�� � 7.�*1G ������8��� ���*��3������ << 5� ���:9G::$<��7 7�FC+0 �:<7�FC+0) ������� ������� ���<< 5� ���% ��.�� ����� ������� ��� ���������� *��3������ 1���%� G��������� �*1G) ������8��� ��� *+G�, *+G , D*+�, << 5*, /*<< ��� <�07F�1FG:7 ���*��& !�"�, *��&�#���, *��&# ##�, *��&�����, *��&� "� ��� *� &�! �, �������������

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

��! *� �� ��+ �� ���

Page 4: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�������, ������ I� �������� << 5� �������� �� *+* ��&���$

���&, ��. �� *+G�, *+G ��� << 5*� 7-� ��$�����.�� ���

�� ������&��.��, ��� �������& ������� << 5*$��2� ��������

��� �.� ��.�� �������& *+G�, *+G , D*+� ��� *��&�#����

<���$-��� ��%�������� ���.�� �������� �.�� ������ ��$

�����. ���� �-� ����� �� << 5�, ���� *+G�?*+G ��� D*+�?

*��&�#��� ���&�� �)� G�����, ������� �%��� ���� ��H����

��%������� ���-��� D*+� ��� *��&�#��� ������� #�L

��������� C�������, �.� B$���%���� ��������� �� D*+� ��.�$

���� !�L �������� �� �.� ������������& ��� ���%*��&�#���,

��� ��%� ������.�� �.�-��& �%��� ���� ��H���� ��%����$

��� �� �.� B$���%��� ��� �������� �� �.� ��� << 5�

���&�� �)� ���% �.��� ����, � ����� ��������� ���������.��

���-��� (*�� ��� *�� �.55$ ��� �� ���������� 7.�������,

-� ������� �� ��%� *�� �.55$ �� (*�%� *���, *��% ���

(*�� -��� �������� �� �� ���&����� �� *+* �0��&

� ���, � #� �����&�' � ���, � "�)� (*�% �� ���� ���&$

����� �� �������� �� *+*� .�-����, ��� ����� �� ���������� ��

��-�� �.�� �.� ��� �������� ��� (*�� ���&�� �)� *�

�����&�� �������� ����� �� �.� ���� �� *���?*��%, -.���

�.� ����� �� ���������� �� �������� �� *+* �� ������� .�&.��

��� *��� �.�� *��% ���&�� �)�

/���� �� ������� 8������� ������ �2 <��D*+�>1�<

K���& B���.��� ���� ��������, �.� (*�� %�B* -��

�������� ��������� �� ����, ����, ���%, ;�-�� ��� ����H�

������&�' � ���, � "�)� 7� ���.�� ������ �.�� ��������, �

�.�������������� �� �����&���� ������ .�������& � ����$

����������� ����� ���-��� �.� 1�< �������� &��� ��� �.�

(*�� ���%���� -�� ������� ��� 7�� �����&���� ����� -���

�������� ��� �.�� �.�-�� ��%���� �������� �� 1�< ������$

����, -.��. -�� ���&����� �� *+* �� ��� �.� �����

���&�� ��)� F��������� �� ���(*��6;'� -�� �������� ��

��� ����� ������ ���%����, ����������� �� 2�� ���&�� �����

�� *+* ������, ��. �� &��� ����� ���&�� ��), �����

���&�� ��,�), �%���� ���&�� ��) ��� ����H� ���&�� ��)�

1�< ���������� ������ �� �.� (*�� ���%���� -�� ����

�������� �� %������%���� ������, �������& �.� ���� %��$

����% ���&�� �&) ��� �.��� ������ %������% ���&�� �.)�

����� ���&�� ��,&), ���% ��� ������ ����� ��� �.�-�) ��

���(*��6;'� �����&���� ������ ���� �.�-�� 1�< ������$

����� 7.��� ������, ��&��.�� -��. ������� B���.��� ����

��������, �������� �.�� (*�� �� ��������� ��H������ �� ���

����� ��&����

9����� �# :�H���� ��%������� �� �.� B$���%���� ��������� �� (*��, (*�%, *��� ��� *��% &��� �������� *+*$%������� %�B* ���%���������) 7.� B$���%���� ���������� �� �.� �������� -��� ���&��� ���& �.� <G0FK< ���&��% ��� 1������ ����-���� <�������� -��. ��������� �%��� ���� ������� �������������� ����������� ��� .�&.��&.��� �� ����2, -.��� �.�� %���. ��� �����������) *+* �������� �� �.�(*��,(*�%,*��� ���*��% ������������ * ��%�$����� �������� �� �, � ��� � . ����� �� �C*+* �����%��� �� �.�-�� F��. ����2 �� �.� ������������� �������%����� � �& ����� �B*� 7.� ������& �� �.� &�� -�� ��������� �� ��.���% ���%��� �������&�

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� ��#

Page 5: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

9����� '# F��������� ������� �� ���(*��6;'� �� ��������� ������ ��� ������� ������5������� %��������� �.���&���.� �� �����&���� ������ .�������& � ��������������� ����� �� �.� (*�� ���%���� ��� ;'� �������� &������) 5�������� ������%�� ��� &��� ������ *������ ������ �� � ��������� ������� -��. �� �C *+*���) :������) :��� �������) F%���� �� �.� ���������� ���-��� .����$��$������� ���&� �"� . ����� ;�-����&)���) :���H� ������%�� ��� &��� ������ �, ���%����=.) G%�&�� �� ��$���$��� �������&� ������� -��. �� �C *+*� ��) 0������ ����� �&) <��%��� ����� %', %������%���� '���� �', ����&����� '���� �.) :.��� ����� %,�.��� ������ %������%� �, ���� ���%��������) *+*$%������� ���&������ �� 1�< ���������� �� ���(*��6;'� �����&���� ������ %�B* ������ �� �.� ��������� &���� -��� �����%���� �� �����&���� ������ ��B���.��� ���� �������� ���& ����� �B*� �������� ���% %��2$������� ��) �� ������ ������� -��. �� �C *+* ��� � . ��)�

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

��" *� �� ��+ �� ���

Page 6: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

������������ �� �0������������� �2 ��:>D*+� ����

:�H���� .�%���&� �� (*�� �� *���?*��% �&&���� �.��

(*�� %�&.� �� �������� �� *+* ��&������&� 7� �������&���

(*�� �������, -� &�������� �����&����*��3������ ������

���������& � -5�6(*�� �����&���� G������ �.��������������

�� �.� ��������� !� 7� ����� �������� �.�� �������%�����

#�L �.�-�� � -���� �.������� ���� ��-$.%����� �����$

����� ����� ��� �.�-�)� �������, �� 7� .�%�'�&�� �����

-��. .�&. %�B* ���������� ������ �� �.� -5�6(*�� �����$

&��� -��� ���������� :��.��� ���� �������� �� 8�� 7�.�%�'�&�� ����� �������� �.� �������� �� � ���&�� �����$

���� �� �.� -5�6(*�� �����&��� �� �������� �� �.� ����$

&���� (*�� &��� ���&�� ��)� 7.� � 2� � �GG ���&%���,

������������& �� �.� ����&���� (*�� &���, �.�-�� �

.�&.�� ��������� �� �.� -���$���� ����2 ������ �.�������

%��� 6B*-�� ������ �� �.� &�� ����� ��� �.�-�)� B���.���

���� �������� �.�-�� ������������ .�&.�� ��=��$����)

���������� �� �.� -5�6(*�� �����&��� ��%����� �� ����$

&���� (*�� ���&�� ��)� ���.��%���, �.� ������$�����

������ �� �.� ����&���� (*�� %�B* -��� ��� �������$

���� ������� �� �.� �����&���� ����� �� ��%����� �� �.� -���$

���� ������� ���&�� ��)�

7� �����%��� -.��.�� �������� ��������������� ���&$

������ �� (*�� ������� *+* �����������, -� ��%����� &��$

%������� ��� ����� �������& �������%��� �� -5�6(*��

��� -���$���� ����� �� %���� �����%����� -��. *+*

���&�� ��,�)� *� � ���� ����$������8������, -5�6(*�� �����

��������� &���� ���������� �� � �C *+* %���%

���&�� ��), ��� �.��� �������&� ���.�� ��������� &����

9����� ;# C������� �������� �� -5�6(*�� �����&���� ������1��%������� ������ �� -5�6(*�� ����� ������ *+* ������������� ��%����� �� -���$���� ����������) :��.��� ���� �������� �� *��3������ �����&���� ����� ���������& � -5�6(*�� �����&���� 9�, 0�$� ���2&����� D�=D�, �����&���� ����� .�������& �-5�6(*�� �����&���� 1���%�� 6B* -�� ��&����� -��. � �GG, ������� �� � ����� %�%����� ��� ������ -��. � (*�� ������ 7.� �$2� � �GG ���&%��� &�����������% �.� ����&���� (*�� &��� �� ������������) B���.��� ���� �������� �� *��3������ �����&���� ����� ���������& � -5�6(*�� �����&���� F��. ����2 �� �.� ���� ��������� �������%����� � �& ����� �B*�������� ���%-��� ���� �9�, 0�$����2&����) �� D�=D� �����&���� ������� 7.� ������& �� �.� &��-�� ��������� �� ��.���%���%��� �������&� 7.� ����&����(*�� &��� ��� �.� -5�6(*�� �����&��� ��� ������������) :��� &��%������� ��� �������& �������%��� �� -��� ���� ��� -5�6(*�� �� �������� �� *+*� 9��� ���� �0�$�) ��� -5�6(*�� ����� �� C: �&�� �����������%����� -��. ���&.�) �� -��.�� �����) � �C *+*� 7.� �.���&���. -�� ��2�� � �C:) �� �� �*+*) ���� ����� ��-��&���) <�������&� �� ����� �.�� &��%������ ��� ��������� &���� ���������� �� �.� �������� �� �.� ��������� �������������� �� *+*� *������%����� �� ����� �����.�� 0�$� ����� ������), -5�6(*�� �8���� ������) �� �3�%�� ����� �����&��) ������ -��� ��-�� ��� ������ 8�� ��, ��� ��� � �C*+*) �� � ���� �� �C*+*) ��������) <�������&� �� ����� �.�� &��%������ ��� ��������� &���� ���������� �� C: %���% �-.��� ���%��) �� %���% �����%����� -��. ��� %C %��������.���.�� ���%��) �� �� �C���������'�� �����2 ���%��)� :����-��� ������ �� ���� ����� ��-��&� F���� ���� ����������:6�� �.��� ����������� ������%����-��. %��� �.�� ��� ����� ������ ��� ���� ������

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� ��

Page 7: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

������ ���&�� ��) �� �������� �� -���$���� ������� 7.���

���� �������� � ������ ����������� �� -5�6(*�� ����� ��

*+* -��. ������� �� -��� ����� �������, �� � ���� ����$

������8������, �������%����� ��L �� -5�6(*�� ����� -���

���� �� &��%����� ��� ������� &���� ���������� �� %��$

�% �����%����� -��. � �C *+*, -.����� -���$����

����� ��� ��� ���&�� ��)� *�� 8�� �����&���� ����� �.�-��

��%���� &��%������� �.�������� �� �.� �������� �� *+*

����� ��� �.�-�)�

9� -��.�� �� ���.�� ���%��� �.� �������� �� -5�6(*��

����� �� ��.�� &��%������� ������� ��%���� ������ ������

���� &��%������� ��� ������� ����� �������& �������%���

%����� �.��&. *+* ������� G�����, ���. *+*$�����������

�� -��� �� *+*$��8����� %����� ��� ���� �� ������ �.�

����� �� &��%������� ��� &��-�. ������ ������ �� ��%����

������ �1��'���'$1'%�� � ���, �� � 0���$/�������'���

� ���, � !� 0���'$C����� � ���, ���� 9����� ��� ���2��$

�����, � �)� :��� &��%������� ���� ��� %C%������� ���

�� � ������ ����� �� ������� �%��&���� ��� &��-�. ������ ��

-���$���� ����������� �� ��������, -5�6(*�� ����� -���

���� �� &��%����� ��� �.�� ��������� &���� ����������

���� ��. ���������� ���&�� ��)� *� ���������� ���� &��$

%������� ����� -�� ������� �� �� �.� �������� �� ������$

���'��, �� ��.������ �� 1* �������.����� 1*� ��� *+* ����

����&������� ����� �� ���� &��%�������, ��� *+*$�������$

���� ��� *+*$��8�����) %����� .��� � ��-�� ���� ��� 1*�

����& &��%������� �/�������� ��� /������, � �)� 7.��

��H���%��� -�� ��%����� �� -���$����, -5�6(*�� ���

�3�%�� ����� &��%������ �� � %���% ���������& ������$

���'��� G� �������� �� -��� ����, ���. -5�6(*�� ��� �3�%��

����� &��%������ ��� ��������� &���� ���������� ��%��$

�% �����%����� -��. �� �C ���������'��, ���������& �

������ ��H���%��� ��� 1*� �� �.�� �������%����� ���&�

���&�� ��)�

��:>D*+� ������ �0�< �0��� ���������� �� ��� 0��

0� 0� ������������� ���� *�*��������� ��<�0 ��

� ����0 8������� �2 *�*��������� ��

:��%���� ������ ��� �����H��� �������� �� -���� ���� ��

� 2�� *+*$���������� ������� �.�� ��������� -���� ����

���&.� ����������� 7.�������, �.� *+*$����������� �3����

��� �3�%�� %����� ��� ���� ��������� �� -����$������ ���$

������� ������ �� �%������ ��&������ �� ���%���� �������

9�%�%��2�� ���&.� ���������� �� �������& ������ �� �.�

�����& ��%���.��� �� � ;�- ��%���� .���� ��&�� ���)

�.�-� �.��, ��%����� �� -��� ����, -5�6(*�� ��� �3�%��

������ ��������� � ������ -���� �.������� � . ����� ����$

��� �� ��. ����������� 7.�� ����� �&&���� �.�� -5�6(*��

������ �.�- � .�&.�� ������������� ���� �.�� -���$����

������� 9.�� %������ �� �.� ���� �� �9 �� �����.��

������� ������, �.� -���� ���� �� -���$���� ������ -��

�������%����� �-����� ��-�� �.�� �.�� �� -5�6(*�� ���

�3�%�� ������ ���&�� ��)� 7.�, ����������� ��������������

�� (*�� ������� �� ��������� ������������� ��� ������

��������� �� ���&.��

*+* .�� �� ��.������� ������ �� ���� &��-�., ��� ������$

��&��, *+*$����������� %����� �.�- .�&.�� *+*$���������

���� &��-�. �.�� -���$���� ������ �D�%%�����. � ���,

� ")� ��&�� ���) �.�-� �.�� -5�6(*�� ������ .�� �

������ ����������� �� �.� *+*$���%���� ��.������� �� ����

&��-�. �� ��%����� �� -���$���� ������� G� �������� ��

�� �C*+* �� �.� %���%, ���� &��-�. �� -5�6(*�� ������

-�� �������%����� �-����� .�&.�� �.�� �.�� �� -���$����

������� *�����������, ������&�� ����� �� -���$���� ������

�� �� �C *+*$���������& %���% ��� �� &��-�. ������ ��

�.� ������ ���� �� �.� ����� ��� �����-��& �� �.� ������

���&�� ��)� G� ��������, ����� -��2� �� � %���% �����$

%����� -��. �� �C *+*, -5�6(*�� ������ �.�-�� ������

��.������� �� ���� &��-�. ��� &���� ������, ��� ���������

;�-���� ���� �.��� ���������� ���&�� ��)�

�������, �� ���.�� ��������. �.� ���� �� (*�� �� *+*

��&������&, -� ���%���� -.��.�� �.� �������� �� *+*

����������� �� �����&���� ������ -�� ����%������ �� �������

���������� �� *+*$���������� &���� ���&�� ��)� ,*��= ��

�� *+*$�������� &���, -.��� ���������� �� �����������

��.������ ���. �� �3���� ��� �3�%�� %����� �0��& � ���,

� #)� -5�6(*�� ������ ���� �.�-�� � ������ �������� ��

�.� ���������� �� ,*��= ��� *+* �����%��� ���&�� ��)�

*��%������ �� ��� �����������5����3�8���� ����0��

��5���) %�B* �� ������ �� ���&.�, �������� ��� *+*,

��� �� �� ������ �� �������%����� ��L �� �.� �3����%����

��%����� �� -���$���� ������� �:���'.�� � ���, � #)� 0�2�$

-���, -5�6(*�� ������ ������ �5��� ���������� ������ ��

���� .��� �� �.��� �������� �� -���$���� ������� ,&%>* �� �

����$, ���&.�$ ��� *+*$�������� &��� �.��, �� �������� ��

�.� ��.��������$���������� ���%��� �6�F), �������� *+*$

���������� ���%���� �� ��� ���%���� �:.���'�2� ��� E�%�$

&�.�$:.���'�2�, � #)� G%������ �������� �� ,&%>* ��

*+* -�� �������� �� -5�6(*�� ������ ��%����� �� -���

����� 7.�������, �.� ������ �.������&���� ��������� ��

*+* �� -5�6(*�� ������ -��� ���� ���������� -��. �

������ ���������� �� �.��� *+*$���������� &�����

����2������� �2 � /�&7* �������� ����� �2 D*+�

* 7$6B* ��������� %���� �� (*�� -�� ������8�� �� �.�

:��2 ���������� �� 7$6B* �����, -.��. ����������� �� �����

����2 �%��� :*0/M�� ��� �.���>??��&�������2���?�&�$���?

�����������)� G� ����� �� �������� ���������� .�%�'�&��

��� �.� 7$6B* ���������, &���%�� 6B* -�� �������� ���%

2���%����$��������� �������&� �� �.� :*0/M�� ��� ���� ���

-�� ��%����� �� :��.��� ���� �������� ���&�� !�)�

D�%�'�&�� ��� .�%�'�&�� ���������� -��� �.� ���$

���&��.�� ���&�� !�), ��� ������ .�%�'�&�� ��� �.� 7$

6B* ��������� �� (*�� -��� �������� ��� ���.�� �������

7.� 6B* ��H���� �� �.� 7$6B* ;��2��& ��&��� �� �.�

:*0/M�� ��� ���� ��������� �.�� �.� 7$6B* ��������� ���� ��

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

�!� *� �� ��+ �� ���

Page 8: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�.� ��� �� �.� �.��� ������ �� (*�� �.���>??��&�������2���?

�&�$���?�����������)� G� ����� �� ���8�% �.��� ����, �

&���%�� ���&%��� ��@����� �� �.� ���� ������ �� �.� 7$

6B* ��������� -�� �������� �� <5� ��� -�� ��H������

:�H���� �������� ���8�%�� �.�� �.� 7$6B* ��������� -��

��������� �� ��������� ���� �� �.� (*�� &��� ��%�����&

������ �� �.� *71 ����� �����)� 7.�������, �.� 7$6B* �����$

���� ���� �� �.� �.��� ������ �� (*��, ���� ��&.� ����������

������% �� �.� ��&�����& �� �.� ����. ���� �� (*��

���&�� !�)� 7.� �$2� 7$6B* ���������%�&.� ������ �������&

�� ������ �.� ��������� �� �.�(*�� ����������� G� ��� ����, �.��

7$6B*$�������� ������ �� (*�� �� ��������� �� ����� ��

9����� .# -5�6(*�� ������ �.�- *+*$������������� ��%����� �� -���$���� ���������) 6��&.� .��������������� �� -5�6(*�� ������� ��$���$��� ������ -��� ��%����� �� �.� �����& ��%���.��� �� � ;�- ��%���� .���� * �.���&���. -�� ��2�� ���.� ��&�����& �� �.� ������%��� ����) ��� � . ����� ������� �� ��. ���������� ������%)���) F�.����� ������������� ���� �� -5�6(*�� ������ ��%����� �� -��� ����� 0��� �� �9 -�� %������ �� �����.�� ������� ������ �� ���.�� 0�$� ����� ������),-5�6(*�� �8���� ������) �� �3�%�� ����� �����&��) ���������) ���� &��-�. ����� ��� ������& *+* ������������ 7.� ���� &��-�. -�� �����%���� ����� � ���� �� �.� �������� �� �$���$��� �������&� ���� C: ������ ���������&�� �C *+* �8���� ����) �� %���% -��.�� *+* ����� ����)� F���� ���� ��������� �:6 �� � ��)���) 1��-�. �� 0�$� ��� -5�6(*�� ������ �� %���% �����%����� -��. �� �C *+*� 7.� �.���&���.� -��� ��2�� ����� �� ���� �� �.� �������� �� �$���$����������&� ���% C: %���% �� ������ ���2��& ����) �� ���������& �� �C *+* �%�����)� *���� � ���� �� �� �C *+*$���������& %���%, -5�6(*�� ������������� ;�-��� ������%)���) F��������� �� *+*$��&����� &���� �� -5�6(*�� ������ ��%����� ��-���$���� �������� %�B* ������ �� �.� ��������� &����-��� �����%���� ��B���.��� ������������ ���& ����� �B*� �������� ���%%��2$������� ������ ��) �� ������ ������� -��. �� �C*+* ��� � . ��)� ��������&���.� �� A$��� 8�%-�� �� . ��� ,*��=,�� . ��� �5���, # . ��� ,&%>* ��� �� . ��� /��� F��. ����2 �� �.� ���� ��������� �������%����� �� �& ����� �B*� 7.� ������& �� �.� &�� -�� H����8�� ��.������������ -��. � /�� ������

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� �!�

Page 9: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

����� �� �.� ���� �� �.� ���� ��� �%��� ����� �� �.� D*+�

�������, -.��. ������� ��������� ������� ��� << 5 �������

�6�� � ���, � !� �����&�', � ")� 7.�������, �.�

:*0/M�� ��� ���� ��2��� �������� � ��� ������ �� (*���

G�����, B���.��� ���� �������� ������ �� ������ � ���$���&�.

(*�� ���������� �� �.� 0�3��� %���� ���&�� !�)�

.���$� ����� �� �� *�*�0����������

<��&��� �� 0�3��� .�%�'�&�� ���������� -�� .��������

���, ����H�����, ���� &��%������� ������ -��� ���$

���%�� ���&�� #)� G� �.� ������� �� ���&���� *+*,

0�3��� %���� ����� �.�-�� -���$���� &��%������� ������

����� � ���� ������8������ �� ��5� D�-����, �� �.� ��������

�� ���&���� *+*, �.� 0�3���%���� �.�-�� *+* .����$

��������� ��.������� �� ���� &��%������� ���&�� #�� G5�� ��

���# �C *+* ��� 0�3��� ����� G5�� �� ��!# �C *+* ���

5��%��� -��� ����)� 9���$���� ��� 0�3��� %���� ������

-��� ������� ��� �.� �������& �� ����� �.�-�� -���$����

&��%������� ������ �� ��� �C *+* ����� ��� �.�-�)� � ����� �.�-�� � ��&��&����� �� �.� 0�3��� �.������� ��

���=� � ������������& �� � ����� �� ���� �=� �� � �����

� � ���)� � *+*$.������������� ����� �.�-�� 2���%����$

���������� ��� -��� .�%�'�&�� ��� �.� 7$6B* ���������

�� �����%���� �� <5� �������� �� � ��)� 7.��� ���� �&$

&��� �.�� �.� 0�3��� %������ �� ��������� ��� ��&��&����

�� � ���&�� ������ ���� ���2�� �� �.� 7$6B* ����������

*��������� ����=�������� �������� �� &��%������� ��

%���� �����%����� -��. ���������& �������������� ��

B�5� ���&�� #�) �� %������� ���&�� #�) -��� ���� ���$

���%��� 5�%����� �� -���$���� �����, 0�3��� %����

�.�-� ��.����� ��.������� �� &��%������� ���� �.���

����������� ��%���� ������ ����2� &��%������� �.��&.

*+* ������� �.�������, �.��� ������ ��� ���������� -��.

�.� *+*$.������������� ��.������� �� &��%������� ��������

������ �������, �� ��.����� ����������� �� ��.������� ��

&��%������� �� ���������'�� -�� �������� �� 0�3���

%���� ��%����� ��-���$���� ����� ���&�� #�)� 7.�� �����

��������� � .�&.�� ��H���%��� ��� 1*� ����& &��%�������

�� 0�3��� ��%����� �� -��� ����, -.��. �� �� �&���%���

-��. ���. �.� ����&������� ���� �� 1*� �� *+* ����&

&��%������� ��� �.� .������������� �������� �� 0�3���

�� *+*�

�������, -� ��������%�� 0�3��� ������ -��. �.� (*��

�6B* ���� �.� ������� �� ��� �-� ���%����� :���� ���%

�.��� ����������� 0�3���>>(*�� ����� �.�-�� -���$����

&��%������� �� �.� �������� �� ���.�� ��� �C *+* ��

�� %C %������� ���&�� #&)� 7.��� ������ ���8�% �.��

0�3��� %������ �� ����������� ��� �.� ��.����� ��������

�� *+* �������� �� �.� %���� ������

/������������ ��� �� .���$�

9���� ���� �� �����.�� ������ �� 0�3���%���� -�� ��%����

�� �.�� �� -���$���� ������ ����� ��� �.�-�), ��� -.���

����� ������������� ���� -�� H��� ��%���� �� -���$���� ���

0�3��� ������ ���&�� #�)� 7.�� ����� �� �� ���������� ��

������� �������� �� -���� ���� �� ����$��$������� ������� ��

*��� ��� *��%, �� ��%�* ��������� ������, -.��. �.�-

2������� �� -���� ���� ��%���� �� �.�� �� -���$���� ������

�1���� � ���, � � C����� � ���, ���� 7�.��.��@ ��� <����,

���)� 7�2��& ���� ������ �.� ��%������� �� �.� << 5

����%��� �������� �� *+* ��&������&, �� �� ����������� �.��

����$��$������� �� (*�� �� ���%��� �� %��2�� �� �.�

�������� �� ��.�� << 5��

7� � ���

7.� �%�������� �� �.� << 5 ����� �� ������� ������?�.���$

���� �.���.������ �� ������ �� .�&.��&.��� �� �.� .�&.

�%��� �� ��%� &���� ��� ����� ! ) ���� �� �.�*��3������

&���%� �/��2 � ���, �� )� G� ��������, �� %��� �.�� ��

<< 5� ��� ���� �� �.� .%�� &���%� �5.��& � ���, ���)

��� ���� ! ��� ���� �� �.� ����� &���%� �:���2, � !)�

7.�������, -��. ������� �� ��.�� �2������� ��&����%�,

������ ���% �� .��� &������ �������� �.� ��&������

%��.����%� ����� �� << 5 ��$�.���.���������� G� ��&�,

%�%%��� ��� ������, ���%���� ��� ���� -.��� << 5� ���

�� ��&����� ��&������ �� ������� 2����� �������� ���������

9����� <# C������� �.�������������� �� �.� 0�3��� %�������) C�� �� (*�� &��� ��� ������������ �� �.� 7$6B* ��������� �� �.� 0�3���������� 7.� �%�����& ��&��� �� �.� *71 ����������� ����� ������ F���� �������������� �� ����2 ��������) :��.��� ���� �������� �� &���%�� 6B* ���% -���$���� ������ �(*��?(*��) �� ���������� .�%�'�&�� �0�3���?0�3���) �� .�%�'�&�� �(*��?0�3���) ��� �.� 7$6B* ��������� ���% �.� :*0/M�� ��� ����� 1���%�� 6B*-�� ��&����� -��. � �GG, ������� �� � ����� %�%����� ��� ������ -��. �&���%�� (*�� ����� ����%������& ���% ��������� � !=�"��� 7.� �$ ���"$2� � �GG ���&%���� &�������� ���% �.� -���$���� �� �.� 7$6B*$��&&��(*�� �������, ������������, ��� ������������) B���.��� ���� �������� �� -���$���� ��� 0�3��� %�B* ������ -��. �������������� ���&%��� �� (*�� �6B* ����������� ����=�!��)� F��. ����2�� �.� ���� ��������� �������%����� � �& ����� �B* �������� ���% %��2$������� ������ ��) �� ������ ������� -��. �� �C *+* ��� � . ��)� 7.� ������&�� �.� &�� -�� H����8�� �� .������������ -��. � /�� ������

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

�! *� �� ��+ �� ���

Page 10: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�� � ����� �� ������ ������&�', � "� 7�2�2�-� � ���, � "�

9��%2� � ���, ���)� <����������, �� ������, �.� ������$

������ C< 5 ���� �� � ��&����� ��&����� �� � C*</

���.-�� ��������� �� -�����& �� ���� ������ �C��2����

� ���, � ", ���)� D�-����, �.� ��&������ ���� �� �2��$

����� << 5� ������� ������� �� ��.�� ���������� ���

��������, ���. ����� ��� .%�� << 5� ��$�.���.�������

������$��������� 2������ ���, �.�������, ����������� �� ����

����� ��&������ �5.��& � ���, ���)� *��������� ���%����

�� ���&��� �������� �� << 5� ��� -��� ���%����� ��

������� 7.�, *��3������ /*<< ��� <�07F�1FG:7 ���

��&����� ��&������ �� �.� 50*J*7* ���.-��, -.��. ��

9����� -# *+*$.������������� ��.������� �� ���� &��%������� �� 0�3��� %�������) :��� &��%������� ��� �������& �������%��� �� -���$���� ��� 0�3���%���� �� �������� �� *+*�9���$���� �5��%��� ���2&����) ��� 0�3���%���� �����-��� ��-�� �� C: �&�� ������ �����%����� -��. ���&.�) �� -��.�� �����) ��� �C *+*� 7.� �.���&���. -�� ��2�� �� ���� ����� ��-��&���=�) <�������&� �� ����� �.�� &��%������ ��� ��������� &���� ���������� �� �.� �������� �� �.� ��������� �������������� �� *+*, B�5�, %������� �����������'��, ������������� *������%����� �� ����� �� 5�� �-.��� ��%����) ��� 0�3��� %���� �����2 ��%����) ������ -��� ��-�� ��� ������ �� ���� ��������) 9.��� ����� ������������� �� -���$���� �-.��� ������) ��� 0�3��� �����2 ������) %���� ������� 5.��&�� �� ���� -���� ������� ����& ���&.� ������ �����%��� ������������� :6 -�� ���� �.�� !L��&) 5�%���%�������� �� �.� 0�3��� .��������������� �� *+*� :���� ���% -���$����, 0�3���%���� ��� � �������������� 0�3��� ��������%�� ���� ����������& �.�(*�� �6B* ���� ������� �� ��� �-� ���%����) -��� &��%������ �� C: %���% �� %���% �����%����� -��. ���.�� ��� �C *+* �� �� %C %�������� 7.��.���&���. -�� ��2�� ����� �� ���� �C *+*) ��� " � �� %C %�������) �����

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� �!�

Page 11: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

�������� �� ��&������ �� �.��� ��� ;���� %������% ��'�

�9�����%� � ���, � #� E � ���, ���)� �������, �.� *��3��

����� << 5* ��&����� �.� /� �.����� */7 ��� �.�������

������� �.� ���� �� << 5 �� ������� /� ��������� ��� %�%$

����� ������������ �5.���� � ���, �� )�

7.� 8��� �� *+* ��&������& ���� ������ � ��&��8���� ���$

�������� �� �� �����������& �� � ����� ������� ��&�����

�� << 5�� :����� �� �3�� ��� �3�% %�����, ���������

���������� ������%����, �� -��� �� �������� �� �����&����

��%�* ��������� ������, �������� �.�� << 5� ��� �� ��&�����

��&������ �� *+* ��&������& �1���� � ���, � � C�����

� ���, ���� :.���, � "� 7�.��.��@ ��� <����, ���)� 7���$

����� ���������� ������ ��%��'� ����������� ��%���������

�.�� �������������� �� *��� ��� ��%�* ����2�� �.� ����$

���� �� � �������� &��� ������ �� �� *+*$�������� ���%�$

��� �:.���, � ")� 7.� ������8������ ��� �.������&����

�.�������������� �� ����$��$������� ������� ��3����,�=�3���

�,.) �� �.� *��� &��� -��� ������ �� ������� �� ������

�������� �� �.� ���� �� *+G� �� � ��&����� ��&����� �� *+*

��&������& �1���� � ���, � )� 7.�� ������ -�� ���.�� ��$

������ ��� *��% �� �.� ��������� �� �.� ����$��$������� �3�%�

�,� ������ ��� �������� �� *+* ��������� �� �����%�����

�3����," �3�%��,� �� �3����,5 �3�%��,� �C����� � ���, ���)�

������ ����������� �� �.� ���� �� *+G� .�� ������ ���% �.�

-��2 ��9 � ��� � ���), -.��. H������� �.� ���� �� *+G� ��

� ��&����� ��&����� �� *+* ��&������& �� �.� ����� �.��

*��� �������������� ��*��3������ ���� ��� ������ �.�*+*

��&������& ���.-��� D�-����, �� ���%� ��&���� �� �.��2 �.��

�� ���� *+G� -�� � �������� ��&����� �� *+* ��&������&

������� �� � ��&����� ���, -5�6*��� ����� �.��� �.�-

��.����� �������� �� *+*, -.��. -�� ��� �������� ��

9 � ��� � ���)� *�����������, �.� ������ �� 9 � ��� � ���)

��� ������� �� �.��� �� :.��� �� "), -.��. �.�-�� �.��

�������������� �� *��� �� %��'� ����������� ��� �� � ����2$

��� �� *+*$�������� &��� ����������� *��������� ������$

%���� -��� �� ��H���� �� ������� �.�� ������������

*������� �� << 5 �������� �� �3����,5 �3�%��,� ������

�������� �.�� *+G� ��� *+G ��������� �� �������%�����

��L �� �.� *+*$������ << 5 �������� �C����� � ���, ���)�

7.��� ���� ��������� �.�� ���������� << 5� ����������� ��

*+* ��&������&� G�����, �� .�� ���� �.�-� �.�� ���������

��.������� �� ��%�* ���������� ����� �� ��������� ��������$

��� �� *+* ����& �������%��� �� ����� ��������� ��� ����

&��%������� �7�.��.��@ ��� <����, ���)� G� �.�� �������,

�.� ������� ��(*��, ��%���*���?*��% ��H���� ��%�������

��� *+*$������ ���&������, %��� �� � ��2��� ����������

��������� �� ��&���� *+* ��&������&� 5���������& �.� ��%$

������� �� �.� ����� ����%��� �� << 5� �������� �� *+*

��&������& ���� ������ I� �� ��&�� �) ��� �.� ���������

��������� ��������� �� �.��� ��������, �� ��������������

�������. -�� ��������� �.����� 9� �������� �.�� �� ����

(*�� -�� � �������� ��&����� �� *+* ��&������&, �������$

���� �� � -5�6(*�� �����&��� %�&.� ���� �� ��.����� ��

���� ����������� �������� �� *+*� *������������, ��������

���&������ �� (*�� %�&.� ���� �� �� *+*$�����������

�.������� �� ���� �� -�� � ��&����� ��&����� �� *+*

��&������&� 7.� �������� �� *+* �������� �� -5�6(*�� �����

������� �.� ������ .����.����� 7.�, ������������� ������ ��

-5�6(*�� 7� ����� ��������� ��.����� -���� ���� �� ��%$

����� �� ������� ������, �� �������� ��� �� *+*$�����������

�.�������� 7.�� ����� -�� ���8�%�� �� 7� ������, -.��.

�.�-�� �� �������%����� �-����� .�&.�� ������������� ����

�.�� -���$���� ������, ��� �����H����� �� ��������� ���$

�������� �� ���&.� ������ ���&�� ��,�)�

���.�� �������� �� *+*$%������� ��������� ���. ��

����� �� -��� �� �� ��&������� ������ ��������� �.�� ��$

������ ���&������ �� (*�� ��� �� � ������ *+* �����$

������ ���&��� � ��� �)� ��� ��������, ���� &��-�. ������

���� �������� � ������ ����������� �� ��.������� �� &��-�.

�� *+* �� -5�6(*�� ������ ��%����� �� -��� ���� ���&�$

� ��,�)� 7.� ��.������� ������ �� .�&. *+* �������������� ��

���� &��-�. .�� ���� ��������� �� ���������� �� �.� ��.�$

���� �������� ���.-�� �+������ � ���, ���� 1.����%���

� ���, ���)� *�����������, � �������� ���2 ���-��� �.� *+*

&��-�.$������� ���.-�� ��� ���� ����� ������� .�� ����

�������� �� �.� ��������� �� ������$��������� �������

2����� ��.������ �G5/�), -.��. �� ������ �� *+* �9��&

� ���, � ")� +��. ���� ��� �.��� %������%���� ���������� ��

-5�6(*�� ������-��� ��%��2���� ��������� �� �.� ��.�������

������ �� �� �C *+* ��%����� �� -���$���� ������

���&�� ��)� G�����, ���� ��. .�&. *+* �������������,

�.� �.��� ������ %������% �� -5�6(*�� ����� �� ���� ��

�-���. ���% ��&������� �� ����������� &��-�. ��� �� ���$

��� ;�-��� ���&�� ��)� *� ��.����� (*�� ����������

��������� ��.������� �� &��-�. �� *+*, �.� *+*$%�������

���&������ �� (*��%�&.� ��������� �� ��&������ �� �.�

���� ����� ������ ������ �� *+* �� %������%���� �������

�������, �.� �.��&�� �� �.� %�B* ������ �� �.��� &����

���������� �� ���&���� *+* =,*��=� �5��� ���,&%>* =

���� ��;��� � ������ *+* ��&������& �� -5�6(*�� ������

��%����� �� -���$���� ������� ���&�� ��)�

G� ����� �� ��%����� �� ���� �� (*�� �������, -� ����

�������� � 7$6B* ��������� %���� �� (*��� B� &���

�������� %���� �� 7$6B*$�������� ������ �� ��%� &����

�������� �� *+* ��&������& .�� ���� �.����������� ���$

������� 7.� 7$6B* ��������� ������� �� �.� 0�3��� ������

�������� �� �.�� ���� �� ��������� �� ����� �� ����� �� �.�

���� �� �.� 5$���%���� ��� �%��� ���� ������� �� D*+�,

-.��. ������ � �� �� �.� �� ��������� %����� �� �.� << 5

��%��� ������&�', � ")� G�����, B���.��� ���� ��������

������ �� ������ � ���$���&�. (*�� ����������� 7.�������,

�.� 7$6B*$�������� 0�3��� ������ �� ��2��� �� �� ��� ���

������ �� �.� ���� �� (*�� �������� *+* ����=��������

�������� ��������� �.�� 0�3��� ����� -��� .�������������

�� �.� ��.������� �� &��%������� �� *+*, �� ��%����� ��

-��� ���� ���&�� #)� *�������&��, �� ��������� ��H���%���

��� 1*� ����& &��%������� -�� �������� �� 0�3��� �����

��%����� �� -��� ���� ���&�� #) ���, �����H�����, (*��

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

�!� *� �� ��+ �� ���

Page 12: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

������� ���� ���� �� �%������� �.������&���� ���� ��

���%��� &��%�������� 7.�, -� �&&��� �.�� ���%�����

�� &��%������� -��� �%��� ��� ���� � �������� ������ ��

1*�, �� ���� � ��&����� ��&������ �� *+* ��&������& ��

D*+� ���������

9.����� �� ��.����� �������� �� *+* �� &��%�������

-�� �������� ��� 0�3���%����, ��� ������������� ���� -��

��%���� �� �.�� �� -���$���� ������� * ��%���� ����� -��

�������� ��� �3����,� �� �3����,. ����������, -.��. -���

*+*$������������� �� &��%�������, �� �.�-�� 2������� ��

-���� ���� ��%���� �� -��� ���� �1���� � ���, � )� *�������$

����, �.� ����$��$������� �3�%��,� %���� ��������� -���$

���� *+*$������ ���%���� ������& �C����� � ���, ���),

��� *+*$%������� ���&.� ��������� -��� ��� ��������

�� ��.������� �� ��%�* ���������� �7�.��.��@ ��� <����,

���)� 7�2��& ���� ������ �.� ���� �.�� �� ����� ��� << 5�

��� ��&����� ��&������ �� *+* ��&������&, � ������� ���$

������ ��������� %�&.� ������� �.� ���2 �� �.������� ��

������������� ������ ��� ���&�� ����$��$������� ��������

C�������, �������� �� �.� *��3������ &���%� ������� �

������� ������& �� (*��, ���� (*�%� *��.�&. �.��� �-�

.�%���&�� << ��� ���2��� �� .��� ��%������� ��������

����� ��� (*�% ��������������� ���&������ �� �������� ��

*+* �� ��&��8������ ��-�� �.�� (*�� ���&�� �), �� ��

�������� �.�� D*+ ��� *+G�?*+G ) �������� ��������� %��2�

�.� ����$��$������� �� (*��� G� -��� �� ��������� �� ����

-.��.�� ��%������� ������������ �� �.��� << 5� �������

������������� �����

7.� �3���� ��� �3�%�� %�����, �� -��� �� -5�6(*��

������, �.�- � ������ *+* ������������ G� .�� ���� ���$

������ �&&����� �1���� � ���, � ) �.�� ����$� ��� ��� $�

�������� .��� ��%����� ��&����� ������� ��� %�&.� ��� ��

�������& �.��� ����&���� ��������� ��������� ��&������

�� *+* ��&������&) �� � ���� ��%����� 7� ������� �.�

%������� ����� �� D*+� ������, �� -��� �� ��H���� ��

�������� ��� ����&���� ��������� D�-����, ��������& ��

�.� �.������� �� -5�6(*�� ������, � ��%��� %���� ��� ��

������&��, -.��� ��.����� D*+� �.���.����� ��������

��������� �.� *+* ����������� ������� �� ��$�.���.��$

������& � �������� ��&����� �� *+* ��&������&� 7.�, ����$

���� ��&������ �� *+* ��&������& ���� �� ����������� ���.��

�.��&. ���%����� �� ������ ��%������ ��3����, �3�%��) ��

�� �������� ��$�.���.��������& �������� �-5�6(*��)� 7.�

���&�� �� D*+� �� ��2��� ��������� ���% �.��� �� *+G� ���

*+G , �� ���� �� D*+� ������� ����� �� ��.����� ��������

�� *+*� D*+� %�&.� ������� ���.�� �� �.� ��%� �� �� �

��������� �����. �� *+* ��&������& �.�� *+G� ��� *+G �

5.�������������� �� ��- ����$��$������� ������� �� *���

��� *��% ��� ����H��� ��������� �������� -��. 0�3���

��� ��H���� �� ������� �.�� H������� *�����������, �� -���

.��� �� ��������� �.� �������� ����������� �� ���. << 5 ��

*+* ��&������&� �������, *+* ���%���� ��������������� ���$

&������ �� *���, *��% ��� (*��, �.�������, ������& ��

��.����� ��$�.���.��������& �������� ��� ���������� ��

�.� ��&���� *� *���, *��% ��� (*�� ���������� �� ������

���&����� �� *+*, ���������� �� �.� ��&��� -��� ����

�� ��%����.�� ��$�.���.��������& ��������, ��������& �.�

�������� �� *+* ���������

B�&����� ��&������ �� ��&��� ����������� �� ��H���� ���

� ������ ������� �� �.� ��%���� ��&������& ���.-��� �.��

������� �� � ����� C��.����%� �� ��&����� �������2, ����2$

�&� �� ��-������% ��&������& �� ��������������� ����������

��� � ��%%�� ���� �� ��&������& ���.-���, ����������� ��

.��%��� ������ �C�5���, � )� 9��. ������� �� *+*

��&������&, �� �������� �� *���, *��%, ��%�* ��� (*��,

��.�� &���� .��� ���� ������8�� �� ��&����� ��&������

�� �.� ���.-��� 7.�, ����������� ���������� �� �.�

*? �0������ .�%����%��� ������� ! �*7D+!) ����� ��

*+* ������������� �� � ����� �� *+* ���������, -.��.

�&&���� �.�� *7D+! ���������� � ��&����� ���������������

��&����� �� �.� *+* ��&��� �D�%%�����. � ���, �� )�

G���������&��, *7D+! �� �.� 8��� ���&�� ��������� �� *+G�

�D�%%�����. � ���, �� )� 7.� �������� ����������� �$��$

��� ��.����� �������� �� *+*� �F�*�) ���� ����� � ������

���� �� � ��&����� ��&����� �� *+* ��&������& �5���� � ���,

� !� <�� � ���, � ")� 7.� ��������� ��� %���� �.�-�

��.����� �������� �� *+* ���, �.�������, ������� �����$

�������� �� ������� ��&������& �������� ������� ������ ���

��&����� ��&������ �� *+* ��&������&� 7.� %�B* ���$

������& ������� *+D� �� � ����� %������� �� *+* ��&���$

���& �D&����� � ���, ���)� * ��������� ����$��$�������

�30� ������ �.�-� *+* .���������������, ���������& �.��

*�(� ��&������� %������� *+* ��&������& �D&�����

� ���, ���)� �������, �.�%���� �� ��.����� �������� ���

��.����� ������ �� �� *+*$�������� &���, �&&�����& �

��&����� ��&������ ������� ��� �.�� ���� ������� ���

5.�, � )� 7.�������, � ��%���� ��&����� ��&������

%��.����% ���%� �� .��� ������� �� ����� *+* ��&������&

��� �� ����� ���������� ������� ������ �� ��������

���������� �� �.� *+* ���.-��� G� ��%���� �� � %�@��

�.�����&� ��� �.� ���� �� �������� ���������� ��&������&

���%���� ���2��& �.� 2��-� �����%�������, �����������

�.� ���&��� �� �.� ��&����� ��&������ �� �.� ���.-���

=2��������� ��������

����� ������

*��3������ �0������ ������ -��� �������� &��-� ���� &����$.��� ���������� �� ���� ���������& � � > � ���%������>���� %��$���� ��� �� ����� �����, ����� -��� ������$���������� �������%��� -��. #�L ��.���� ��� � %��, �����-�� �� ��%%�����������. � ��L) ���������& ����L 7����� A$��� ��� �� %�� ���,8�����, ��� -��.�� -��. ������� ��������� -����� :�����8������ ���.� ����� -�� �������� ��� � ���� �� ��5� *����-����, ����� -�����-�� �� C���.�&�=:2��& �C:) ������ �C���.�&� ��� :2��&,� ! ) ���������& ����� %���% ��%����� �� C: ����� ����� ����L ������, ������8��-��. �L �&��, ��� �.� �D-�� ��@���� �� ��#-��. /�D ������ ���������&� <����� -��� ������ ��� �������� ��

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� �!�

Page 13: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

� &��-�. �.�%��� .����& � ���������� �������%��� �� �5 ����� �!$. ��&.�?"$. ���2 �.��������� �� "�=��� �F %� ������

,�� 3����� ���������� �� ������� �2

����� ��� ������

7.� �����& ��&��� �� �.� (*�� �6B* -�� ������� ���% �.��:/*�< 5$D* �������� ������&�' � ���, � "�) ���& ��!����!GG=!���G ����� ��&������ ��� �������� ���� � �G=!���G����� ��&����� �+GB� � �5������., <��� *���, K:*)� 7.� �+GB� �$D*+� �������� -�� ����������� �� * ��3������ �� 2�����5�"5� ��1J !�� 6������� � ���, � "�) �� ���������������, ���*��3������ ������ �0�$� �������) -��� ��������%�� �� �.� ;������� %��.�� �5��&. ��� +���, � ")� :���� �� ������ ��������%��-��. �+GB� �$D*+� -��� .�������� ��� ������ �� 2���%������������� %���% �� �������� 7� �����&���� ������� 7 �����, �������� ��������� %���% �� ����� �.� ��&��&����� �����, ��� �����$&���� ����� -��. � � > � ����������?���������) ����� -��� ���������:��.��� ���� �������� -�� ������%�� �� ������ ����� �������& ����&�� 7$6B* ����� 7� ���&�����, .�%�'�&�� ��� �.� ���������%��2��, -��� ��� ��� ���.�� �������7.� $2� ���&%��� �� �.� (*�� ���%���� ��&��� ��� �� �.��

-��2 -�� �������� �� <5�$%������� �%���8������ ���% 5��%��������� ���& ���&����������� ��D*+�> ��$5**5*15**7*7*71$7*757*51 ��� ��D*+�> ��$55755*711*755755****75*1*$1*77755� 7.�� ������ ���%�� ��������� � ��H� �� DG ��������� �.� *71 ����� ����� �� �.� (*�� �����& ��H����� 7.��%���8�� 6B* -�� ������ ���� �.� �� DG ���� �� � �+�������� :/$1�< ������� �+�������� :/$1�< ����� ��H� �� DG ��� 7��G����� �� ����� �� �.� ����� ����� �� � ���%�������� ;'� �����&��H���� ������� ������% �� �.� ������� ����0�� �7:�) ���%�$������ 7.�, �.� ����%������ ����� ��+�������� :/$���(*��6;'�).������� � ��������������� ����� ���-��� �.� (*�� %�B* ��

����������� ��H���� ��� �.� ;'� �����& ��H����� 7.� ��%$����� ���������� �������� ��%������& �.� (*�� ���%����, �.� ;'������& ��H���� ��� �.� 7:� ���%������ -�� �������� �������G=���G ����� ��&����� �5*C+G* ���� 7.� �������& ��������-�� ��%�� �5*C+G* ���$���(*��6;'� ��� -�� ��� �� �����$���% *��3������ ������ �� ��������� ������ 7.� ;'� ��������&��� ��� �� �.�� ���� �5.� � ���, � !) -�� 2����� �������� �� �:.��� �+�����, K:*)���� ��������� ��%���%�������� �� �.� 0�3��� %����, �.� ;'�

�������� &��� �� �.� �+�������� :/$���(*��6;'� �������� -���������� -��. �.� �����& ��H���� �� (*��, &��������& �.� �+��$������ :/$���(*��6(*�� ��������� 7.� ��%����� ���������� ���$����� ��%������& �.� (*�� ���%����, �.� (*�� �����& ��H������� �.� 7:� ���%������ -�� �������� ���� ���G=���G �������&����� �5*C+G* ���� �DE1�)� 7.� �������& �������� -����%�� �5*C+G*����$���(*��6(*�� ��� ��� �� ��������%0�3��� �/*B�) ������ �� ��������� ������ 7����&���� ������ -����������� �� ����� �� � C: %���% �:�&%� C�� �) -��. � %& ���

.�&��%���� + �:�&%� D ##�, :�&%�$*�����., :� 0���, C�, K:*)�

;� ������� ������

7� %����� *+* �����������, ����� -��� ������ �� ����� %���%,��%����� �� C: ����� �����, �L ������ ��� ���������& ������$�������� �� *+*� 7� �����%��� ����������� �� ��.������� �� &��%���$���� �� .�&. ��%����% �� ���������'��, �.� %���% -�������%����� -��. ���������& �������������� �� ���.�� ����%�.������ ��� %�������, �� ���������'��, ������������� G� ����� ������� ���� &��%�������, �.� ��������&� �� ����� �.�� .�� &��%�$����� ��� ��������� ���� &���� �������� ���������� -�� �����$%�����

,��� ��<�0 �� ������������� ������

7.� ���� &��-�. ����� ��� ������& *+* ����������� -�� ������%���� %������& ���� &��-�. ����� � ���� �� �.� �������� �� �$���$����������&� ���� C: ������ ���������& �� �C*+*� /������� ���������� -���� ���� -�� ������%�� �� �����.�� ������ �� �.� ��%��������%����� ���&� ��� ��'� ���% ���&�� �$-��2$��� ������� ���������� ��� ��������� -��� ������� ��� �9 -�� �����%���� ���%����� ���������� � ��5 ��� �������%����� ��L �������� .%��$��� ��D)) ����� �.� ��������� ������� �� ��%��9.��� ����� ������������� -�� %������ ��������� �� ���������

�� <�� � ��� �� ")� +��. -���$���� ��� 0�3��� ������ �8�� ������$���� ��� ������%���, �.��� ����������� ������%����) -���&��-� ���� ���%�� -������& ���������� ��� � ���� ��� -����.�� ��@����� �� ���&.� ������ �� ��%������� ���%������& ����&�$���� ��� %���%����& ���� ����������� �� �������& ���� -��. :����9���� <��� -���-��&.�� ����� ��� �� �.� ��%� ��%�� <��� �������$��& �� ������ -��� ��@����� �� �.� ��%� �����%��� �� �����%����.� ���2&���� ���� �� -���� �����

,7* ��������

*��� ��=� �����$���$��� �������&� -��� ����������� ���% C:������ �� � �$%� ;��2� ���������& � %� �� C: ������� ��� �L������� 7.� ;��2� -��� �.�2�� ���� ���� ;�������� ��&.�� *������ ����, �������&� -��� %��2$������� �� ������� -��. �� �C *+*�<���� %������� -�� ��������� ��� ���'�� �� ��H�� �����&��� 7�����B*-�� ��������� �� ��������� �� 1��'���'$1'%�� � ��� � �� ),��������� �� ���%����.���=�&����� &��� ��� ������� �� � �����%�%������ +���� -��� .��������� -��. �����%$���%��& � <$�������� ������� %�B* ������ -��� H����8�� �� <D�:<D��$

GC*1F �������� �� B���.��� ����� ���& � +���%�&��& ��������+*:���� ��@�8�% F����N �)� * ���$���&�. �6B* ����� ���(*��-���������� �� ��������� ��������� �� �����&�' � ��� �� "�)� 7.��5��� �����-�� 2����� �������� �� 0� :'������ �G������� �� <����+����&�, D�&���)� 7.� ,*��=, ,&%>*, ����� �/��) ��� (*�%������ -��� �������� �� <5� �%���8������ ���% &���%�� 6B* ��-���$���� 5��%��� ������� <��%��� ,*��=, ,&%>* ��� /�� .������� ��������� ��������� �� 1��'���'$1'%�� � ��� � �� )� <��$%�� (*�%> ��$1717**75*1****1*5***1 ��� ��$155*5575$5*7*775*5*751�

�������� �0������������� �2 .���$� ����

* ��"$�� &���%�� ���&%��� ��@����� �� �.� ���� ������ �� �.� 7$6B* ��������� -�� �������� ���% 0�3��� ������ �� <5� ���&���%��� 0+��> ��$151711*55157715715**57 ��� ��"�> ��$755117757111*75*5*7� 7.� �%���8�� ������ -�� ��H��$��� �� ���. ��������

'�������� ���������

7.� ;��������� �.���&���.� �� ������ ���������& �.�;'� �����$��� &��� ���� ������� �� �.� (*�� ���%���� -��� ��2�� ���& �0���� 75:$:0 �������� %��������� ��� ����� �������& ���������%�&��& �����%� ��� 1�< ���������, �.� ���������� ����� -�� ����&�� ��� ����� �� �"" �%��� �%������-�� �������� ���-��� ������ ��� �%� 5.��������� ���$;��������� -�� �������� ���-���!!� ��� #�� �%�

�3��%��������

9� �.��2 C�&�� *� *������ ��� ���������� �� �������� ��������,��� ������� :����� ��� 5.������.�� ���2 ��� �������� ������& �� �.�

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

�!! *� �� ��+ �� ���

Page 14: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

%��������� 9� ��2��-���&� C���� 6� 1�%�' ��� .�� ����������-��. �������� %���������� 9� �.��2 ����. F�2�� ��� �.� :��2G������� 1���%�� *������� 0��������� ��� ��������& �.� ��H����$������� *��3������ 7$6B* ��������� %�����, ��� *+�5?B*:5��� ����������& �.��� ������ C�1�1� -�� �������� �� �C����������� F������� � 5���� �����-�.��� <�0��� -�� �������� �� ���%�� � 5�@�� �������. ��������� 7.�� -��2 -�� �������� ��1����� +�G ���$��!� ��� +G� �� $��� � ���% �.� C��������� ��5������ � 7������&�� ��� �F6F��

$�������

������ �#>#� ���� �# #� ,��������� �#"#� ��������� :#� ,��������4#� 4���� ?#?#� ������ =# ��� ��������� >#+# � ���) * ��8��� ���&��� &��� ���� �����% ����������� ����%����� ������� ���%����%���%����� 7����, ;��, ����=���#�

*�������� �#� ������� �#� �� �� 9# ��� �������� ># � ���) G����$������� ���-��� �������� ���� ��� ��.����� ��&������& �������������� ���, ��, ����=�����

*����� #@# � �� ) �������� 2����� ��&�����& �� ����� �������$%���� *���? ,�? ��� &�? ����? �A, �!�=� �

������ �#� :���� � # ��� �������� �#># � ���) 6��.���.����������� .%�� ������$��������� 2������ �� ������� �.���.��������� 5 ���.� ��� ���� ������%�� 1? ����? �0 ? �-.,��#��=��#� �

������� +#� ������� =#� ���� �#� �������� :#� ����� �#� �������,# ��� 4������� >#*# � �� ) <.������ ��� ��������� ����������� ���.� *��3������ /��) �.����� */7 ��� �.���.����� *�<< 5*������ ���, �;, ����=���!�

����� @#� ��%�� ?#� B���� @#� ,������ 4#� :����� ��� ,# ��� ������># �� !) F�&������� 1�< �� � ����� �������� �� ������� ����? ����?<, � �=����

������� �#># ��� *��� �#9# �� ") ������ ���> � ��%���8�� %��.����� * ��3������ $%������� ��������%����� �� *��3�������0������� ����� 1? �<, #��=#���

������ # �� " ) 7.� ������� ��� ��&������ �� ������� �.���.�$������ *���? ,�? ����0 ? .A, ���=��"�

������ �#� ��� ������ �#� *����� 7#� ������� �# ��� ������ # �� !) * ������� �������� ����������� �������� �� �������� ������&��� ����������� �� *��3������� �����, �-', � � =� ���

7� � �#:#� ,��� � �#$#� ������ #4# ��� *������� 7# �� !) 5������������� �� �.� ������� ������?�.������� �.���.����� 5 �� �� *���������� !��: 1? �., !# "=!"� �

7�������� $#� *������� *#� 7� ������ ,#� 7����3� 9#� ������ >#� 5��������� �# ��� "����� � ># �� "�) F�8����� �������� 7�$����$%��$������� ������� ��� * ��3������ $%������� &��� ���������� ������� 7���? *��� ,�? �', �###=�#""�

9��3�� ���� $#$#� �������� �#�# ��� $�3� �#7# � �� ) *������� ������&������& �� ����� ��� �������&�� ����� ���, �; �:����),:��=:���

9� ��� $# ��� ����� �#,# �� ) *� *��3������ %���� -��.����&����� *+* &��� ����������> �%���������� ��� ��&�������&����� �������� ����� 1? �-, �!�=�# �

��� ������ �#� �������� =#� ������ �#� :�%����� ,#� :������ ?#��� ������ # � ���) ��&������ �� �������� ���� ��&������& ���.� ��.����� �������� ���.-�� �� *��3������� ����� ���, ��,���#=�� !�

������� �#� $���� �#7# ��� 4��%��� � �#># �� �) F�������� ����������%�� �����% �� ��&�� �����% �� ��&�� �������� ����.�$��.��� ��������� ���%���� ������� 7����, ';<, #! =##��

������������ � �#� 5������ �#7#� ,������� "#7#� ����� C#� ,�� 4#,#��� @��3��������� � �#:# �� ) *� �������� ����$������������� 2�����, </*+*�, %������� �������� ����$���������

&��� ���������� �� ������ ������� ������� ����? 7���? *��?���? ��*, D<, �#!#=�## �

��������������� �# #� $��������� 7#� ����� � �#� $��������� #"#������ � �# ��� "������� !# � ���) B�&����� ��&������ �� �����$��� ���� ��&�����& �� �.� '� �� ��������� ��<< 5� ����� � ���� ������ ���%���� ��&������ ��� ���%����� �� ���� &��%������������� �0�����? �'', ���=����

���������������� �#� ��� ������ �#� *���� � >#�#� *������� >#�#� �&���� � #� ���� �#$#� ����� >#"#� �������� $# ��� $��������� #"# � �� ) 7.� �.���$�.��� ����.�� ��.����&����� *+* ����$��'�� �.� ���������� �� ����.���� �� �������� ����.���� ��������, �;, �"��=�"�!�

�� �� 9#� *�������� �#� ������� �#� @���� �#�#� 5�������� �# ����������� ># �� ) *+G� ������� �.���.����� 5 �� � ��&�������&����� �� �������� ���� ��&������&� ����� ���, ��, �" #=� ���

,��� �#>#� *���� �#� *����� =# ��� ������ �#># �� #) *������� ������&��� ����������� �� ������%�� ����� �� ���� ������ > ���.��.����� %�B* ���%������ ��� ���%���� ��������� ��H���������� �.���.��������� ��� ���.���.���������� ������, �/�,"�= �

,��������� �#� +��� �# ��� ������ =# �� ") :�&������& �� ������������ �� ��&���� ����� &��-�.� �0����? /����? ,? ���? )��? � ����?���? '.', ��� =�����

,��������� �#� ,�������� 4#� "����� �#� ,������� *# ��� ������ =#� �� ) D�%����%��� ������� *7D+! �� � ���&�� �� �.� ��������.���.����� *+G� ��� ��&����� .��%��� ��������� �� *��3�������� !��: 1? ��, �� =���"�

,��������2� 5#� :%�3� >#�# ��� ��������� >#+# � ���) *� %�B*���$������& �������, *+D�, %������� ����� �������� ���� ��&�������������� �� *��3������� ���, �/<, �##=�"#�

>���� 4#� $����� �#� � ����� �#�# ��� ������� �# �� ) *����������� ��&��� ����������� �� &��� ����� �� %������� �� �.���.�$������ 6 ��������� ����? 7���? *��? ���? ��*, D<, � � =� � #�

:��3� 7#� *�������� >#� ����� 7#@#� *�� ��� *#� 5�����3� �# ������� 3��� �# � �� ) 7.� ��%���%��� �� ������� �.���.�������������� ������ ������� �� �.� &���%� �� *��3������� ������0�����? ��D, �"= ��

:��������� �# ��� :�� ��� �#�# �� �) :��� ���%���� ���&��%�������� G� *��3������ �:�%�������, 5� ��� C�����-��',F�, ���)� B�- E��2> 5��� :����& D����� 0��������� <����, ������=����

:%�3� >#�#� ����� >#,#� ������ ?#� :��� �� :#� "�������� �#�7�"���� �# ��� ��������� >#+# � �� ) 6�������� �� � &���$������������� ������� �.���.����� * ��&������ �����, �5B�,������� �������� ���� ������������� �� *��3������� ����� ���, �;, "� = "!��

"�3��� �# #� ���� �� �#$#� ������ �#>#� ������ � 7# ��� ,����������� �#�# �� ") *������� ����$������ ���%���� ������%������� �� ������ *6<$������� ����? 7���? *��? ���? ��*, D.,��"�#=��"� �

"������������� 9#� ��$������ =#�# ��� *�������� �#�# � ���) G��$����� .���2���.���.��� �� � �.������&���� ��&��� ��&�����& �.�/�$��-��� ���������& ���������� �� &��� ������ ����? 7���?*��? ���? ��*, D-, "!"#="! �

"����:��� ������� :#�#� ���� �#�#� $��E � �#>#� >��� ��� �#=#�!� ��% 3�� �#=#� ��%���� �#,#� B������� >#�# ��� :����������# �� !) G�������� ��� �.��������'����� �� �������� ����$��8�����*��3������ %����� �� �-� ��- ����� ����� 1? �/, !��=!!��

"����� ># ��� �������� ># �� ") *������� ���� ��&��� ������������*���? ,�? ����� �0�����? ����� ���? ����? ;D, � = �

"����� >#� *�������7������ �#� ����� � #�#� ��������� 7#� ��������9# ��� �������� ># �� �) *��3������ *+* �������� &��� *���>������� �� � �����%$%������� ������� �.���.������ �����,�<;, ���"=��� �

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� �!#

Page 15: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

"����� >#� ������ �# ��� �������� ># �� #) 7.� *��3������*������� *��&��7�!7��/��!% �*��%) ��� *��� &���� ������.�%���&�� ������� �.���.������ 5 �������� �� �������� ������&��� ������������ ����� ���, D, #� =##��

"�� >#� @���� F#C#� @� ��� �#*# ��� � ����� �#�# � ���) ��&$������ �� �������� ����$������ ���%���� ������ ��� ������.������ �� &��� ���� **</ 2������ �����, �A-, ���=����

"������������ "#� ��������� �# ��� ����� �#,# � ���) * ����&��$%������� �������%����� ������ �.��2����� �� %������� �� �����$��� ���� ��� ��H���� �.� *+G� ������������� ������ ��*��3�����������? 7���? *��? ���? ��*, DA, �#" =�#"#�

"������� !#� $��������� 7#� ����� � �#� $��������� #"# ��� ������ � �# � ���) * ��- ������� �.���.����� 5 ���<< 5�) �������� �������� ���� �� �����8����� ��������� �� ���%��� ����.�������� ����� �0�����? ��., � � =� �!�

"������� !#� ����� � �#� ����� � �# ��� $��������� 7# � �� )C������� ������& �� � ��������� ������� �.���.����� 5���<< 5 ) -��. ���� ������� ��� �����&��������� �$��&$����� �� *+* ��� �����% �� ���%��� ����� �� '� �� �����������0�����? �����? ��;, �" =� ��

"�� �# ��� 9�������� �# � ���) * %������ �� �.� *��3������ (@)�&��� �������& � ���B* ������& ������� ������� ��������� ���������� ����, ����, ��� ����2����� ����� ���, ��, ���= �!!�

"���� �#� "�� @#� $� ��3� 9#� � ����� �#�# ��� ��������� �#"#�� �) G%%������������� �%������� ������� �.���.����� ��&$������ �� /� �.������ �� &��� ������ ����? 7���? *��? ���? ��*,D/, � = �!�

������ # �� ) 1������ �������� �� .��%��� ��&������&� *���?,�? ����� �0�����? ����� ���? ����? ./, � = ���

����3�� 7# ��� :��������� �# �� #) 5�%%���� ��������� ���*��3������ &�������� ����� 1? ��, �#= ���

������ �#� �� �� 9#� ��������� 7#� 5��� ���� �# ��� �������� >#� ���) 7.� *+G� ��� *+G ������� �.���.������ 5 ��� �� ���&����� �������2 ��&������ ���� �� �.� �������� ���� ��&������&���.-��� ����� 1? �., �=����

�� 3����� +#� *����� "#� ��� ��� @#� *����� >#� *���� ���� �#�B%������ :#� �������� �# ��� ,��� ,# �� ") C< 5, � ������������ �.���.����� 5, �������� �� � ��&����� ��&����� ��%���&��$��������� ������� 2����� ���.-��� �� ����� ��� �����������? 7���? *��? ���? ��*, D., � �"=� ���

�� 3����� +#� *�������� =#� ��%��������� �#� "�%� �� �#� >���3� �#�$��������� #"#� >�����3� ,# ���,��� ,# � ���) 7.� ������$������������� �.���.����� 5 �� � ��&����� ��&����� �� � %���&��$��������� ������� 2������ 1? ����? �0 ? �-A, �" ��=�" � �

������ :#� "����� �# # ��� ������ =# �� �) * ������� �.���.����� 5 �������� �� *+* ��&��� ����������� �� *��3������ �0������������, �<;, ��� =�����

������3�� �#� :���� $#� *������ ,#># ��� 9�3������ 4# �� )7����$ ��� �������%����� ��������$�����8� ���������� �� ��<< 5 ����������� �� �� 3�����0 � ����������� � ���?;�? ;��? �<�, ��#=��!�

���� ����� 4# ��� �3���� 9# �� ! ) * ������� %���% ��� �����&��-�. ��� ��������� -��. ������� ����� ������ �0�����?�����? �., �#�=� #�

�� ����� �#�#� ������ �#� 5��� ���� �#� 9����� 9# ��� ��������># � �� ) *��3������ �:7� ������� 2����� %������� �.� ��&$������ �� ���%���� ������� �� �������� ���� ��� ���� ������%�� �������� ���&�� ������� ���������� ����� ���, �;,��" =�� �

��� �#:#� ����� :#� ���� �� �#$#� �%���� *# ��� ,�����������#�# � ���) 6��&.�$������ &��� ���� ��&��� ������������������� ��.��&�����$�$�.���.���� 7����, ;�/, � !=� �

��� B#�#� :��� �� :#� @���� >#�#� ��%���� �# ��� ��������� >#+#�� #) 6����������� �������� ���� ��&������ �� &��� ���� ���-

����� �.������ �� *��3������ -��� ���� ��� �3�� ��� �3�%%������ ����� ���, D, �� =� ��

��� B#�#� ��� ������ �#� :%�3� �#�#� ������ # ��� ���������� >#+# �� ") ���� �� ������������������� �� *+* ��&������ ��&��� ���� ����� �.������ ��� ����� -���� ����� �����, �A�, "#= ��

��� B#�#� ������ ?#� *������� �#� 4������� �#� :�� ����� *#� �������#>#� ������ =# ��� ��������� >#+# � ���) 5����% �.������ ����$����� �� .����&�� �������� %������ �������� ���� ��&������& ��&��� ������ 7����, ;/<, #��=#���

$�3� �#7# ��� C������� $#�# �� �) 7.� ���� �� .��%���� ����&���� �������%���� G� ����� (�� ��� �6�����, <��, ���)� 6��$����.�> /�-�� *����%�� <����.���, ��� !#�=! #�

$��������� #"# �� ") <������ �.���.����� 5 �<< 5) ������� ��.�&.�� ������� ����� ���? ����? 'A, � = #�

$��������� #"#� *������� �# ��� ������ =# �� "�) *+G , � ������������� �.���.����� 5 �������� �� �������� ���� ��&��� �����$������ �� *��3������� '!�� )��? ;��, �"�=� ��

$��������� #"#� "������# # ��������� =# �� "�)C������� ������&�� *��3������ �0������ �� � ��- ������� �.���.����� 5 �<< 5)-��. .�%���&� �� *+G� ��� *+G � ����� ���? ����? 'A, "# =""��

������ �#� ������� +#� "���� ?#># ��� ��������� >#+# �� �) :����&��&������ �� ���- ����� �.������ ��� �������� ���� ��&������& ��&��� ����� �� �.���.��������� ��� ���.���.��������� �����������? 7���? *��? ���? ��*, D�, ���= �� �

��������� >#+#� ������ �#>#� ,��������2� 5#� :%�3� >#�# ���@�����7# � ���) 1��� ���� ��&��� ������������ *���? ,�? ����� �0������? ����� ���? ����? .�, ! #=!�"�

������ ># �� !) 5� �$��������� ������� 2������ ��� ������ ��&�������������� �� ������� �����, �-;, � ��=� � �

������ ># �� ") C�������� �������� �� ������� �.���.����� 5�������� �� �������� ���� ��&��� ����������� �� .�&.�� �����������? 7���? *��? ���? ��*, D., #�= "��

�������3�� :# ��� ?���������������3�� :# �� #) 1��� ������$���� ��� ��&��� ����������� �� -����$������ ��������� ������0�����? ��., � #=����

���3� �#># �� !) E���� ������� ������?�.������� �.���.������>%������ ����� ��� ������� ��&������� @���, ��, �!�#=�!#��

����� >#�#� ��������� �#�#� ����� $#7#� ,���� �#�# ��� @��3���>#�# �� �) G���������� �� � ������� �.���.����� -��. �� *��3������� ������=�.������� �������� 2������ �����, �<<, # �=# ��

�������� �#� �������� =#� !3�� �� "#� *��3����� �#� B����� ���� �#������� >#� :���� �# ��� ������� � "# �� #) 6����������� ������$���� �� �-� �5�� &���� ����������& ������� ���%������ ����&����$������ ��H���� *+* ��� �� ��&����� �� *�*�, *��� ���*A,% �� *��3������� ����� 1? ��, ��#=�! �

4������E�� �# ��� ����� 4# � ���) *�������� ��.������� �� ��������.���.����� 5 ����������� ���� �����%����� �� *��3�������0������� ����� 1? �<, �!�=�#��

4�3�3�%�� �#� ������ 4# ��� ����� ,# �� ") <������ �.���.����� 5 ���.� ��.����� �.� .%�� ������$���������� ��" ��� B/C*</ ���.-���� !��: 1? �-, �#��=�#� �

@���� ,#� C�� C#� ������ #� ������ �#>#� ��� ��� @#"# ��� 9�%3��"#�# �� ") G5/�, � ������$��������� ������� 2����� ��.���������% *��3������ �0������ ��������� -��. ���. 5�� � ��� 5��6�,��� ��� ���������� �� ������ �� �������� ����� ����� 1? �.,���=����

@���3�� >#� ,�������� >#� "��� >#� ����� 7# ��� !�� +# � ���) <���,� ���� 5 :��?7.� �.���.�����, ����������� �.� D�1 ���.-�� �����.���.��������& �.� %���&��$��������� ������� 2����� D�&�����? ��� ����? ��, ��=!��

@������ @#=# ��� 9��3�� ���� $#$# �� �) *��3������ %�����-��. ������ �������� �� B�5� ��� ��%���� ������� �0�����?�����? D', !� =!!!�

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

�!" *� �� ��+ �� ���

Page 16: Gain-of-function and loss-of-function phenotypes of the protein phosphatase 2C HAB1 reveal its role as a negative regulator of abscisic acid signalling

@������ � $#@#� @�� ��� >#�# ��� ������%��� =#�# �� #) * ���$����� ���� ��� 2�����$���������� ������� �.���.����� �� �.� *���3������ �)*�*/*� ��&������& ���.-��� ����? 7���? *��? ���?��*, D;, ���!#=���# �

@�� ?#� :����� >#� �������� =#� ������� $#� "��� ,#�#� 9� ��� $# �������� �#,# �� #) *������� ���� ��&������& �.��&. ������ *6<$������ �� ������� �����, �-A, � != ����

@�� ?#� ������� ># #� "������������ "#� ,��������� �#������� =# ��� ����� �#,# � ���) 7.� �3���� %������ ����2�*+* ��&������& ��-������% �� �*6<� ������� ����� 1? ';,��#=����

F����� "#� ����� B#� $�3� �#7#� ������������ �#� ���� ?#� F�� @#���������� 7# ��� B��� >#:# � ���) C�������� �� �������� ����

��&��� ����������� ��� �������.���� �� �� :%$��2� ������� ��*��3������� &�? ���, �, ##�=#"��

?�� "# #� ������� �#:# ��� ����3� �#=# � ���) �:)/!,;!��/ �������� ������� �.���.����� 5 �.�� ��&����� 50*J*7* ���.-�������������& ���% ���� �������� �� *��3������ �.��� ��� ;�-��%������%�� ����? ����? �', �# =�""�

B������� >#�# �� ) *������� ���� %��������% ��� ��� ��&�������G� ����0 ����� �� �������� ����� � �2 ����� (�� ����D���2���, <���, D���, C�*� ��� 0�����&�, /���, ���)� *%����$��%> F������� :������, ��� �" = �#�

B������� >#�# ��� ��������� $#�# �� "") C��������% ��� �.�����$�&� �� �������� �����*���? ,�? ����� �0�����? ��������? ����? 'D,�� =�#��

� +���2-��� <����.��& 0��, /0 ����� 1������, � ���), '-, ���=�!

7 ���� � ������� �2 *�* �� ������ 3� D*+� �!