G4220 95301 1290InfinityLC System ES

7/25/2019 G4220 95301 1290InfinityLC System ES

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Agilent Technologies

Sistema LC Agilent 1290

Infinity

Manual y gua de referencia

rpida del sistema


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Manual y gua de referencia rpida del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Avisos Agilent Technologies, Inc. 2009-2011,2012

No se permite la reproduccin de partealguna de este manual bajo cualquierforma ni por cualquier medio (incluyendo sualmacenamiento y recuperacin electrnic-os y la traduccin a idiomas extranjeros) sinel consentimiento previo por escrito de Agi-

lent Technologies, Inc. segn lo estipuladopor las leyes de derechos de autor esta-dounidenses e internacionales.

Nmero de referenciadel manual:

G4220-95301

Edicin

05/2012

Impreso en Alemania

Agilent TechnologiesHewlett-Packard-Strasse 876337 Waldbronn

Este producto puede usarse comocomponente de un sistema de diag-nstico in vitro si dicho sistema estregistrado ante las autoridades com-petentes y cumple la normativa apli-cable. De lo contrario, nicamenteest previsto para un uso general delaboratorio.

Garanta

El material contenido en este docu-mento se proporciona "tal como es"y est sujeto a modificaciones, sinprevio aviso, en ediciones futuras.Adems, hasta el mximo permitidopor la ley aplicable, Agilent rechaza

cualquier garanta, expresa o implci-ta, en relacin con este manual y concualquier informacin contenida enel mismo, incluyendo, pero no limi-tado a, las garantas implcitas decomercializacin y adecuacin aun fin determinado. En ningn casoAgilent ser responsable de loserrores o de los daos incidentaleso consecuentes relacionados conel suministro, utilizacin o uso deeste documento o de cualquier infor-macin contenida en el mismo. En elcaso que Agilent y el usuario tenganun acuerdo escrito separado concondiciones de garanta que cubranel material de este documento y queestn en conflicto con estas condi-ciones, prevalecern las condiciones

de garanta del acuerdo separado.

Licencias sobre la tecnologa

El hardware y/o software descritosen este documento se suministranbajo una licencia y pueden utilizarseo copiarse nicamente de acuerdocon las condiciones de tal licencia.

Avisos de seguridad

PRECAUCIN

Un aviso de PRECAUCINindicaun peligro. Llama la atencinsobre un procedimiento de ope-

racin, una prctica o similar que,si no se realizan correctamente ono se ponen en prctica, puedenprovocar daos en el productoo prdida de datos importantes.No avance ms all de un avisode PRECAUCINhasta que se

entiendan y se cumplan comple-tamente las condiciones indica-das.

ADVERTENCIA

Un aviso de ADVERTENCIAindica un peligro. Llama la aten-

cin sobre un procedimiento deoperacin, una prctica o simi-lar que, si no se realizan correc-tamente o no se ponen enprctica, pueden provocardaos personales o la muerte.No avance ms all de un avisode ADVERTENCIA hasta que se

entiendan y se cumplan comple-tamente las condiciones indica-das.


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Manual y gua de referencia rpida del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3

En esta gua

En esta gua

Este manual describe el sistema LC Agilent 1290 Infinity:

1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto

Este captulo ofrece una introduccin al sistema LC Agilent 1290 Infinity y asus conceptos principales.

2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto

Este captulo describe las funciones del sistema LC 1290 Infinity.

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Este captulo explica cmo aplicar la teora y cmo usar las funciones del sis-tema LC para realizar separaciones optimizadas.

4 Configuracin e instalacin del sistema

Este captulo incluye informacin sobre la instalacin del software, la configu-racin de la torre de mdulos y la preparacin del sistema para su funciona-

miento.

5 Gua de inicio rpida

Este captulo proporciona informacin sobre la adquisicin de datos y su an-lisis con el sistema LC 1290 Infinity.

6 Apndice

Este captulo proporciona informacin adicional sobre la seguridad, los aspec-tos legales, Internet y sobre cmo configurar un mtodo.


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4 Manual y gua de referencia rpida del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Contenido

Contenido

1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto 7

Teora del uso de partculas pequeas en la cromatografa lquida 8Beneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m 14

Calentamiento derivado de la friccin 18

2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto 21

Nuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity 22Componentes del sistema 26

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 39

Volumen de retardo y volumen de extracolumna 40Cmo configurar el volumen de retardo ptimo 42Cmo conseguir volmenes de inyeccin ms elevados 52Cmo conseguir un alto rendimiento 54Cmo conseguir una resolucin ms elevada 57Cmo conseguir una sensibilidad ms elevada 60Cmo conseguir un arrastre de contaminantes mnimo 69

Cmo evitar los bloqueos de columnas 71

4 Configuracin e instalacin del sistema 73

Instalacin del software 74Instalacin del mdulo 76

5 Gua de inicio rpida 93

Sobre la gua de inicio rpida 94Preparacin del sistema 95Adquisicin de datos en la vista Control del mtodo y el anlisis 101Anlisis de datos 108


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Contenido

6 Apndice 115Informacin sobre seguridad 116Informacin sobre disolventes 119Agilent Technologies en Internet 120Configuracin de un mtodo mediante la opcin Edit Entire Method 121


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Contenido


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7



1Introduccin a la cromatografa lquidade rendimiento ultraalto

Teora del uso de partculas pequeas en la cromatografa lquida 8

Beneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m 14

Calentamiento derivado de la friccin 18

Este captulo ofrece una introduccin al sistema LC Agilent 1290 Infinity y a susconceptos principales.


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1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraaltoTeora del uso de partculas pequeas en la cromatografa lquida

Teora del uso de partculas pequeas en la cromatografa lquida

Introduccin

En 2003, Agilent present las primeras columnas de silicio poroso disponiblescomercializadas con partculas de 1,8 m. Estas columnas fueron las primeras

de una clase conocida como columnas "inferiores a 2 m" o STM. Estos mate-riales de relleno se introdujeron en las columnas ZORBAX de Resolucin Rpi-da y Alto Rendimiento capaces de soportar 600 bar de presin para su uso conel sistema LC de Resolucin Rpida Agilent Serie 1200, presentado en 2006.En 2009, se ampli el rango para incluir columnas de Resolucin Rpida y AltaDefinicin capaces de soportar usos rutinarios con 1200 bar de presin con elfin de admitir la introduccin del sistema LC Agilent 1290 Infinity con suamplio rango operativo de hasta 1200 bar de presin y una velocidad de flujode 5 ml/min.

Estas columnas de tamao de partcula inferior a 2 m (1,8 m) se pueden uti-lizar para alcanzar dos objetivos principales:

1 Una cromatografa ms rpida

Las columnas cortas con partculas inferiores a 2 m ofrecen la oportuni-dad de reducir drsticamente el tiempo de anlisis mediante el aumento dela velocidad del flujo sin perder la eficacia de separacin.

2 Una resolucin ms elevada

Las columnas largas con partculas inferiores a 2 m proporcionan una efi-cacia superior y, por tanto, una mayor resolucin, necesaria para realizar laseparacin de muestras complejas. Una dispersin inferior tambin signi-fica una menor dilucin de los picos de analitos y las consiguientes ganan-cias de sensibilidad, particularmente para LC/MS.

La presin necesaria para conducir el disolvente por una columna que con-tenga partculas STM aumenta rpidamente a medida que la velocidad delflujo se eleva para realizar separaciones ms rpidas, ya que la longitud de lacolumna aumenta para obtener ms resolucin. Por tanto, la aceptacin de lascolumnas STM se ha producido al mismo tiempo que el desarrollo de los siste-mas UHPLC (sistemas HPLC que ofrecen presiones superiores a la normativade 400 bar existente desde la aparicin de la HPLC). Los sistemas LC de rendi-miento ultraalto (o presin ultraalta) tambin ofrecen volmenes de retardobajos y la recogida de datos rpida necesaria para picos estrechos de la croma-

tografa de alta resolucin o rpida. El sistema LC Agilent 1290 Infinity es la


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Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto 1Teora del uso de partculas pequeas en la cromatografa lquida

referencia en UHPLC, ya que constituye el primer sistema que puede abarcarcompletamente todos los rangos de rendimiento de UHPLC ya existentes en elmercado, adems de extenderse a todos ellos.

La teora

La eficacia de separacin en HPLC se puede describir mediante la ecuacin deVan Deemter (Figura 1en la pgina 9). Esto se obtiene a partir del modelo dealtura de plato utilizado para medir la dispersin de los analitos a medida que

descienden por la columna. H es la altura equivalente a un plato terico (aveces denominada HETP), dpes el tamao de partcula del material de relleno

de la columna, u0es la velocidad lineal de la fase mvil y A, B y C son las cons-

tantes relacionadas con las diferentes fuerzas dispersoras. El trmino A estrelacionado con la difusin turbulenta o con varios pasos de flujo por lacolumna; B est relacionado con la difusin molecular por todo el eje de lacolumna (longitudinal); C est relacionado con la transferencia de masa de los

analitos entre la fase mvil y la estacionaria. La separacin alcanza su eficaciamxima cuando H est al mnimo. El efecto de cada trmino individual y laecuacin combinada se muestran en la Figura 1en la pgina 9, donde la alturade plato se representa frente a la velocidad del flujo lineal en la columna. Estetipo de grfica se conoce como la curva de Van Deemter y se utiliza para deter-minar la velocidad del flujo ptima (punto mnimo de la curva) y obtener lamayor eficacia en la separacin de una columna.

Figura 1 Una curva de Van Deemter hipottica

Curva deVan Deemter resultante

Resistencia

a la transferencia de masa

partculagrande

partculapequea

Alt

uradeplatotericoH

Difusin longitudinal

Trmino de varios pasos,difusin turbulenta

Flujo lineal u


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Las representaciones de Van Deemter en la Figura 2en la pgina 10muestranque la reduccin del tamao de las partculas aumenta la eficacia. El cambiode los tamaos de partculas ms utilizados de 3,5 m y 5,0 m a partculas de1,8 m ofrece una mejoras de rendimiento significativas. Las partculas de1,8 m ofrecen valores de altura de plato dos o tres veces ms bajos y eficaciasproporcionalmente superiores. Esto permite utilizar columnas ms cortas sinsacrificar la resolucin y, por tanto, tambin se reduce el tiempo del anlisis ala mitad o a una tercera parte. La eficacia aumentada se obtiene en granmedida de la reduccin en varios pasos de flujo como resultado del menortamao de las partculas; esto lleva a un trmino A ms pequeo (difusin tur-bulenta). Adems, unas partculas ms pequeas significan tiempos de trans-ferencia de masas ms breves, lo que reduce el trmino C, y se puede observarque el efecto general es una prdida de eficacia muy reducida a medida que lavelocidad del flujo aumenta (la pendiente de la lnea se reduce). Esto quieredecir que la separacin en partculas ms pequeas se puede acelerar an msmediante el aumento de las velocidades del flujo y sin reducir la eficacia de

una manera significativa.

Figura 2 Curva de Van Deemter para diferentes tamaos de partculas

e

0,0045

0,0040

0,0035

0,0030

0,0025

0,0020

0,0015

0,0010

0,0005

0,0000

-0,0005

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

5,0 m

3,5 m

1,8 m

2 ml/min 5,0 ml/min

Velocidad lineal intersticial ( - cm/sec)

HETP(cm/placa)


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Una separacin cromatogrfica se puede optimizar en funcin de parmetrosfsicos de la columna HPLC como el tamao de la partcula, el tamao delporo, la morfologa de las partculas, la longitud y el dimetro de la columna,la velocidad del disolvente y la temperatura. Adems, se puede considerar latermodinmica de una separacin y se pueden manipular las propiedades delsoluto y las fases estacionaria y mvil (porcentaje de disolvente orgnico,fuerza inica y pH) para lograr la retencin ms corta posible y la mayor selec-tividad.

Figura 3 Seleccin de condiciones ptimas para HPLC

La resolucin se puede describir como una funcin de tres parmetros:

eficacia de la columna o platos tericos (N),

selectividad (),

factor de retencin (k).

Segn la ecuacin de resolucin (Figura 4en la pgina 12), la selectividadposee el mayor impacto en la resolucin (Figura 5en la pgina 12). Esto signi-fica que la seleccin de las propiedades y la temperatura adecuadas de lasfases mvil y estacionaria es muy importante a fin de lograr una separacincorrecta.

FSICA QUMICA

Adsorcin o desorcin lenta

Isotermos no linealesEquilibrio qumico (pH)

Presin

OPTIMIZA

LA CINTICA

DE LA SEPARACIN

OPTIMIZA

LA TERMODINMICA

DE LA SEPARACIN

Tamao de partcula, Porosidad,Dimensiones de columna,

Velocidad de flujo, Temperatura

Propiedades de la fase estacionariay mvil, Propiedades del soluto,

Temperatura


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Figura 4 Ecuacin de resolucin

Figura 5 Efecto del nmero de plato, factor de separacin y factor de retencin en R

Independientemente de si el mtodo de separacin de resolucin rpida se hacreado recientemente o se ha transferido de un mtodo convencional exis-tente, es claramente beneficioso disponer de una variedad amplia de agentesqumicos de fase estacionaria en una gama de formatos de columna.

Agilent ya ofreca ms de 140 columnas ZORBAX 1,8 m de Resolucin Rpiday Alto Rendimiento (14 posibilidades de selectividad; de 15 a 150 mm de longi-tud; dimetros internos de 2,1, 3,0 y 4,6 mm). Con la presentacin del sistemaLC Agilent 1290 Infinity, la gama de STM se ampla hasta incluir las columnasde Resolucin Rpida y Alta Definicin (RRHD) de 1200 bar. Esto permiteseleccionar la fase estacionaria ptima para maximizar la selectividad. Laresolucin, la velocidad del flujo y el tiempo de anlisis se pueden optimizarmediante la seleccin de la longitud de columna y el dimetro adecuados. Ade-


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ms, el funcionamiento con columnas STM ms largas se ha vuelto ms accesi-ble que nunca.

Muchos laboratorios llevan a cabo un proceso de anlisis minucioso paraseleccionar la mejor combinacin de la fase estacionaria, la fase mvil y latemperatura para sus separaciones. Agilent ofrece soluciones de desarrollodel mtodo tanto para los sistemas LC Agilent 1290 Infinity como para la serie1200. Estas soluciones ofrecen una automatizacin total de este largo procesode seleccin, lo que facilita que el desarrollo y la transferencia de mtodos se

convierta en una tarea ms sencilla y fiable.

Las columnas RRHD y RRHT de 1,8 m de ZORBAX utilizan la misma qumicaque las columnas de ZORBAX con partculas de 3,5 y 5 m. Como resultado,para cualquier fase determinada de ZORBAX, las partculas de 5,0, 3,5 y1,8 m proporcionan una selectividad idntica, lo que permite una transferen-cia de mtodo bidireccional sencilla, rpida y segura entre el sistema LC con-vencional, el UHPLC y el LC preparativo.


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1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraaltoBeneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m

Beneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m

Una cromatografa ms rpida

Existen muchas ventajas al disponer de tiempos de anlisis ms cortos. Loslaboratorios de alto rendimiento poseen una mayor capacidad y pueden anali-

zar ms muestras en menos tiempo. Ms muestras en menos tiempo tambinsignifica menos costes. Por ejemplo, si se reduce el tiempo de anlisis de20 min por muestra a 5 min, el coste de 700 muestras se reduce un 79 %(Tabla 1en la pgina 14).

La calculadora de ahorro de costes de Agilent ofrece una forma sencilla de cal-cular el ahorro de costes que se obtiene con el cambio de HPLC convencional a

UHPLC con columnas de tamao de partculas de 1,8 m. Esta calculadoraest disponible en el sitio Web de Agilent Technologies junto con una calcula-dora de transferencia de mtodos (www.chem.agilent.com). Los resultados sepresentan en un grfico y en forma de tabla.

Unos tiempos de anlisis ms cortos tambin ofrecen respuestas ms rpidas.Esto es importante en el control de procesos y en las pruebas de liberacinrpida. Ahora en lugar de esperar horas para liberar un nico lote de un fr-

maco, toda la adecuacin, calibracin y anlisis de muestras del sistema se

Tabla 1 Ahorro de tiempo y costes en 700 anlisis

Tiempo del ciclo Tiempo del ciclo de 20

min

Tiempo del ciclo de 5

minAnlisis 700 700

Coste aprox. por anlisis1

1 disolventes = 27 $/l, desechos = 2 $/l, trabajo = 30 $/h

$ 10.58 $ 2.24

Coste aprox. por 700 anlisis1 $ 7400 $ 1570

Ahorro de costes - $ 5830

Tiempo2

2 24 horas/da

10 das 2,5 das


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Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto 1Beneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m

puede llevar a cabo en menos de una hora. Las respuestas rpidas tambin

son importantes para los qumicos sintticos que utilizan sistemas LC/MS delibre acceso para la confirmacin del compuesto y el control de la reaccin.Los tiempos de anlisis ms cortos tambin aceleran el proceso de desarrollodel mtodo de forma significativa.

Figura 6 Calculadora de ahorro de costes


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1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraaltoBeneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m

Figura 7 Relacin entre el tamao de partculas, la eficacia y el tiempo de anlisis

100

75

50

30

15

8,500

6000

4,200

N/A

N/A

21.000

14.000

12.500

10.500

7.000

4.200

2.100

35.000

23.250

17.500

12.000

6.500

2.500

Presin

-33%

-67%

-50%

-80%

-90%

150

Longitud dela columna(mm)

Eficacia dela columnaN(5 m)

Eficacia dela columnaN(3,5 m)

Eficacia dela columnaN(1,8 m)

Reduccindel tiempode anlisis

Eficacia (N) Tiempo

de anlisis

Volumende pico

Usode disolvente


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Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto 1Beneficios de las columnas con partculas inferiores a 2 m

Una resolucin ms elevada

Las columnas largas con partculas ms pequeas generan una eficacia y unaresolucin ms elevadas. Esto es importante para el anlisis de muestras com-plejas procedentes de estudios metabolmicos y protemicos. Adems, lasaplicaciones como la determinacin del perfil de impurezas pueden benefi-ciarse de una potencia de separacin mayor. Incluso los anlisis LC/MS de fr-macos en fluidos biolgicos se pueden beneficiar de la capacidad de picossuperior, gracias a la interferencia reducida por la supresin de iones. En

general, una potencia de separacin mayor ofrece ms confianza en los resul-tados analticos.

Figura 8 Se pueden obtener capacidades de pico de ms de 700 mediante una columna

ZORBAX RRHT SB-C18 (2,1 x 150 mm, 1,8 m) para analizar una digestin trp-tica de BSA

Abso

rbancia[mU

A]

Capacidad de pico = 694

"LC con resolucin GC"

Tiempo [min]


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1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraaltoCalentamiento derivado de la friccin

Calentamiento derivado de la friccin

Si se fuerza la fase mvil por la columna a una gran presin y a una velocidadde flujo elevada, se genera calor. Los gradientes de temperatura resultantes(radiales y longitudinales) pueden tener un impacto en la eficacia de lacolumna.

donde F es la velocidad del flujo y p es la presin.

La termostatizacin potente de la columna (por ejemplo, mediante un bao deagua) genera un gradiente de temperatura radial fuerte, lo que provoca unaprdida significativa de la eficacia de la columna. La termostatizacin de lacolumna de aire inmvil reduce el gradiente de temperatura radial y, por

tanto, reduce la prdida de eficacia. No obstante, se debe aceptar una tempe-ratura de salida de la columna ms elevada. La temperatura elevada puedeafectar a la selectividad. Con una retropresin inferior, se minimizan las prdi-das de rendimiento debido al calor por friccin, de forma que las columnasinferiores a 2 m con un dimetro interno de 4,6 o 3 mm ofrecen eficaciassuperiores en comparacin con las respectivas columnas de 2,1 mm de dime-tro interno.

Un ejemplo de una transferencia del mtodo de gradiente a una columna STMde 2,1 mm de dimetro interno en la que la separacin se ha acelerado semuestra en la Figura 9en la pgina 19. El anlisis inicial en la columna de2,1 mm se llev a cabo a una velocidad de flujo de 0,22 ml/min, lo que gener380 bar de presin a una temperatura ajustada en 37 C con todos los picosseparados en 12,5 min (no se muestra el cromatograma). El flujo se aument a0,66 ml/min y los tiempos de gradiente se redujeron por un factor de tres, loque gener 1020 bar de presin con todos los picos eluidos en 4,2 min (parte

superior de la Figura 9en la pgina 19). Esto debera ofrecer la misma separa-cin, pero se puede observar una prdida de resolucin entre los picos 7 y 8 yentre el pico 5 y el pico principal; esto se debe a que el calentamiento de lacolumna cambia la selectividad de estos componentes. Se ha demostrado quesi se ejecuta el termostato de la columna a 5 C menos, es suficiente para com-pensar el efecto del calentamiento dentro de la columna y restablecer la sepa-racin (parte inferior de la Figura 9en la pgina 19). La presin aumenthasta 1070 bar, lo que tambin indica que la temperatura interior de la

columna era inferior.


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Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraalto 1Calentamiento derivado de la friccin

Figura 9 Influencia de la generacin de calor por friccin sobre la selectividad y elefecto de la disminucin de la temperatura de la columna

En resumen, el uso de un material de relleno inferior a 2 m ofrece una mayoreficacia, una resolucin ms elevada y separaciones ms rpidas. El sistemaLC Agilent 1290 Infinity y las columnas RRHD aumentan el espacio de separa-cin disponible y permiten conseguir un nmero mayor de estos beneficios.Las funciones del LC 1290 Infinity se tratan en El sistema LC Agilent 1290Infinity: descripcin del producto en la pgina 21; en Optimizacin delsistema LC Agilent 1290 Infinity en la pgina 39se explica cmo aplicar lateora y cmo utilizar estas funciones para desarrollar separaciones optimiza-

das.


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1 Introduccin a la cromatografa lquida de rendimiento ultraaltoCalentamiento derivado de la friccin


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2El sistema LC Agilent 1290 Infinity:descripcin del producto

Nuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity 22

Componentes del sistema 26

Este captulo describe las funciones del sistema LC 1290 Infinity.


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2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del productoNuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Nuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity

El sistema LC Agilent 1290 Infinity est diseado para ofrecer la mayor flexi-bilidad a la hora de realizar cromatografas lquidas analticas mediante todoslos tipos de tecnologas de columnas actuales y emergentes. El sistema LC1290 Infinity posee la variedad ms amplia de parmetros operativos, por lo

que puede reproducir ajustes de mtodos transferidos desde cualquier sistemaHPLC o UHPLC analtico preexistente disponible por parte de cualquier pro-veedor. El sistema LC Agilent 1290 Infinity ofrece nuevos conceptos de diseoradicales para lograr este objetivo y, an as, muestra claramente su origen defiabilidad en la ingeniera que ha convertido a los sistemas Agilent HPLC en lalnea de HPLC disponible ms exitosa.

Este sistema ofrece:

Velocidades de flujo de 0,05 ml/min a 5 ml/min para la cromatografa con-vencional o rpida con todos los dimetros de columna analtica de 1 a5 mm de dimetro interno y todos los tipos de material de relleno decolumna.

Un rango de presin de hasta 1200 bar (>17400 psi) que permite la cromato-grafa rpida en columnas cortas, una alta resolucin en columnas largasmediante material de relleno inferior a 2 m y una seleccin mayor de laviscosidad en la fase mvil.

Volmenes de retardo ultrabajos para los gradientes ms rpidos con detec-cin espectromtrica de masa o deteccin ultravioleta/luz visible.

La capacidad para utilizar cualquier mtodo transferido de otro sistemaanaltico HPLC o UHPLC.

Un control sofisticado de la bomba para ofrecer un ruido cromatogrfico yruido acstico muy bajos y obtener mejores resultados y un mejor entornode trabajo.

Un desgasificador y una vlvula de purga automtica integrada en el mdu-lo de la bomba.

Un inyector automtico de volumen variable con volumen de retardo redu-cido, arrastre de contaminantes reducido y la opcin de funcionar como uninyector automtico de loop fijado.


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El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto 2Nuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Un mdulo nuevo de cubo flexible para agregar funcionalidades al inyector

automtico, como la limpieza posterior del asiento de la aguja y el funciona-miento del loop fijado.

Un compartimento de columna termostatizado con una capacidad de usomejorada y soluciones de vlvulas integradas con un rango de presin dehasta 1200 bar (17400 psi).

Un detector de diodos con una sensibilidad y una estabilidad de la lneabase altamente mejoradas que utiliza un sistema de celdas de cartucho con

guas de onda optofludicas. Una velocidad de recopilacin de datos de hasta 160 Hz con informacin

espectral completa.

Una gama nueva de columnas ZORBAX RRHD de tamao de partcula infe-rior a 2 m para el funcionamiento a presiones de hasta 1200 bar.

Una ayuda para la mezcla para la amortiguacin automtica y la mezcla deaditivos en la bomba cuaternaria 1290 Infinity.

El avance ms significativo es el rango de presiones y velocidades de flujo quepuede utilizar el sistema. Esta condicin operativa se puede describir como elrango de potencia (flujo x presin) del instrumento y se entiende ms fcil-mente de forma grfica (Figura 10en la pgina 24). Como se puede ver en eldiagrama, el rango de potencia de la bomba 1290 Infinity permite un funciona-miento a 1200 bar con un flujo de hasta 2 ml/min, que se reduce a 800 bar amedida que el f lujo aumenta hasta 5 ml/min. Esto abarca las condiciones del

rango operativo de todos los sistemas UHPLC existentes en el mercado y posi-bilita la transferencia directa de los mtodos de cualquiera de estos sistemasal sistema 1290 Infinity.


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2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del productoNuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity

Figura 10 Rango de potencia de los sistemas UHPLC (presin x espacio operativo de lavelocidad del flujo)

El rango de presin ofrece la capacidad de trabajar con las ltimas partculasinferiores a 2 m en columnas largas para obtener una resolucin elevada y encolumnas cortas para obtener una separacin rpida a velocidades de flujo

aumentadas. El rango de velocidades del flujo no solo permite utilizar losmtodos tradicionales, sino tambin materiales de relleno porosos (o pelicula-res) por la superficie (por ejemplo, Poroshell) a velocidades de flujo elevadas.Estos tipos de relleno han ganado inters recientemente como alternativa almaterial inferior a 2 m para las separaciones de eficacia elevada. El rango develocidades de flujo permite seleccionar la columna de dimetro ms ade-cuada para la separacin, ya sea 2 mm para aplicaciones de flujo bajo como lasrequeridas por algunos sistemas MS o hasta 5 mm de dimetro interno (nor-

malmente 4,6 mm) para sistemas LC ms tradicionales o una mayor capacidadde carga. El rango de velocidades de flujo admite los ltimos descubrimientosen investigacin que muestran los beneficios del uso de velocidades de flujomximas para aumentar la eficacia en separaciones de gradiente. (ConsultePetersson et al., J.Sep.Sci, 31, 2346-2357, 2008, Maximizing peak capacity

and separation speed in liquid chromatography).

Agilent RRLC

Proveedor D

Proveedor C

LC estndar

Proveedor B

Proveedor A

1290 Infinity


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El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto 2Nuevas funciones del sistema LC Agilent 1290 Infinity

El nuevo detector de diodos ofrece niveles nuevos de sensibilidad combinados

con unas caractersticas de lnea de base extraordinarias y una gran facilidadde uso gracias a su diseo de celdas innovador.

El inyector automtico presenta el conocido diseo de flujo de Agilent para lainyeccin de volmenes variables con un arrastre de contaminantes bajoactualizado para una mayor presin y unas aplicaciones de volumen inferior.Se puede agregar un mdulo completamente nuevo (el Cubo Flexible) en elinyector automtico para ofrecer la inyeccin de loop fijado y, as, obtener el

volumen de retardo ms bajo y otras mejoras de rendimiento, como la limpiezaposterior del asiento de la aguja.


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2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del productoComponentes del sistema

Componentes del sistema

La Bomba binaria Agilent 1290 Infinity

La Bomba binaria Agilent 1290 Infinity contiene nuevas tecnologas para sol-ventar los problemas de bombeo de los disolventes LC a presin ultraalta y avelocidades de flujo elevadas: motores de accionamiento potentes en los pisto-nes; nuevo material en los propios pistones para soportar la carga de trabajo ytransferir de forma activa el calor de los sellos; intercambiadores de calormicrofludicos y el Jet Weaver, un dispositivo de mezclado microfludico. Labomba puede suministrar flujo en el intervalo de 0,05 5 mL/min a presionesde hasta 1200 bar.

El mdulo de la Bomba binaria Agilent 1290 Infinity contiene dos bombasidnticas de alta presin (1200 bar), un desgasificador de disolventes de dos

canales, una vlvula de entrada de seleccin de disolvente con cuatro canales,una vlvula de purga automtica y un dispositivo de mezcla de bajo volumen(el Jet Weaver) integrado en una carcasa individual. El desgasificadoraumenta la estabilidad del flujo, especialmente a velocidades de flujo bajas, yla sensibilidad del detector.

Figura 11 La Bomba binaria Agilent 1290 Infinity


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El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto 2Componentes del sistema

Figura 12 Identificacin de las piezas y esquema de la Bomba binaria 1290 Infinity

Cada cabeza de la bomba es un pistn doble diseado en serie que utiliza uncontrol del firmware nuevo y un material del pistn nuevo, el carburo de sili-

cio, que elimina de forma eficaz el calor de la bomba. El capilar que une lospistones principal y secundario posee un intercambiador de calor integradopara eliminar el calor generado a una presin y un flujo elevados. Cada cabezade la bomba posee una vlvula de entrada pasiva y una vlvula de salidapasiva en la cmara del pistn principal. Cada pistn est accionado de formaindependiente y precisa por un motor de 65000 pasos que ofrece 300 unadesviacin de picolitros por paso.

El movimiento de los pistones est controlado de forma inteligente medianteun loop de realimentacin para garantizar que esta amortiguacin activa delpulso de presin cree un flujo sin ondas. El accionamiento del pistn se ajustasolo segn las caractersticas de compresibilidad del disolvente y las caracte-rsticas hidrulicas del sistema para mantener el estado sin ondas. Esto, juntocon el control de movimiento suave, que reduce el pulso de presin provocadopor el movimiento del pistn, y la mezcla eficiente de bajo volumen garantizanque el ruido de la bomba en las trazas UV sea lo ms bajo posible. Un micro-

procesador especializado en la bomba se encarga del control de movimiento

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suave y de la optimizacin del movimiento de los pistones para una optimiza-

cin en tiempo real segn los parmetros estticos y dinmicos. Adems delrendimiento cromatogrfico, estas funciones permiten que la bomba funcionede forma muy silenciosa.

Cuando se utilizan soluciones tampn concentradas como fase mvil, laopcin de lavado activo de sellos est disponible para aumentar la vida til delos sellos de la bomba.

Una vlvula de seleccin de disolventes permite formar mezclas binarias (iso-

crticas o de gradiente) a partir de uno de los dos disolventes por canal. Losgradientes binarios se crean en la vlvula de purga mediante mezclas a granpresin de disolventes de las bombas A y B. La vlvula de purga permite cam-biar el flujo mediante el control del software hacia los residuos para purgardisolventes nuevos a travs de la cabeza de la bomba. Un sensor conectado a lavlvula de purga sirve para monitorizar la presin del sistema.

Figura 13 El mezclador Jet Weaver

El paso del flujo de la bomba se ha optimizado para obtener un retraso mni-

mo de gradientes e incorpora un sistema de mezcla innovador que emplea latecnologa de microfluidos. El dispositivo de mezcla, conocido como Jet Wea-ver, utiliza una red de canales microfludicos de varias capas (120 m x120 m) para asegurarse de que el flujo se mezcle completamente. El Jet Wea-ver presenta dos volmenes estndar: 35 l para aplicaciones de deteccin UVnormales y 100 l para situaciones ms complejas como el uso de cido tri-fluoroactico en la deteccin UV. Tambin est disponible un Jet Weaver de380 L para obtener un ruido de lnea base extremadamente bajo en estas

aplicaciones complejas. Para la deteccin MS, a menudo es posible trabajar sin

El i t LC A il t 1290 I fi it d i i d l d t 2


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el Jet Weaver y obtener el mezclado suficiente utilizando nicamente el volu-

men de base de 10 l del paso de flujo de la bomba. Las aplicaciones tpicasson mtodos de alto rendimiento con gradientes rpidos en las columnas de2,1 mm de alta resolucin.

La Bomba binaria 1290 Infinity est preparada para admitir el montaje de ra-les de vlvula adicionales en los lados derecho o izquierdo de la bomba. Enestos rales se pueden agregar hasta dos vlvulas adicionales de seleccin de12 disolventes. De esta forma se permite utilizar un mximo de 26 disolventes

de gradientes binarios para el desarrollo de mtodos analticos. Existe dispo-nible un "accionamiento por grupos" especial que hace que las vlvulas deseleccin de disolvente externas formen parte de la interfaz de usuario de labomba y que permite realizar una seleccin sencilla de los disolventes por susnombres.



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La Bomba cuaternaria 1290 Infinity

En comparacin, la Bomba cuaternaria 1290 Infinity slo est equipada conuna cabeza de la bomba y una vlvula de gradiente de varios canales adicional(MCGV) para repartir los eluyentes segn el gradiente programado. Segn estprincipio de mezclado a baja presin, los disolventes se encuentran en el mez-clador de entrada y, por tanto, se mezclan antes en la cabeza de la bomba.

La cabeza de la bomba es la misma que en la Bomba binaria 1290 Infinity y,por tanto, presenta los mismos valores de rendimiento y detalles tcnicos.Tambin se puede equipar con un lavado de sellos activo para aumentar lavida til de los sellos de la bomba cuando se utilicen soluciones tampn con-centradas.

Un sensor de presin controla la presin durante el anlisis antes de que losdisolventes entren en la vlvula multiuso, un selector de corriente de cuatrocanales que permite las diferentes funcionalidades que se muestran en lasfiguras siguientes. La vlvula multiusos est equipada con un filtro en lnea,

que siempre se utilizar durante un anlisis, un mezclador Jet Weaver opcio-nal de 380 L, que garantiza la mejor mezcla posible de disolventes y se puedeinstalar fcilmente, un capilar de restriccin opcional y una conexin al sis-tema de residuos.

El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del producto 2


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Tabla 2 Funcionalidades de la vlvula

Figura 14 Aplicacin estndar Figura 15 Configuracin de volumen de mezcla extra

Figura 16 Funcin de purga automtica Figura 17 Limpieza posterior del filtro en lnea

Bomba

Filtro

Inyector

Residuos

Jet Weaverde Agilent

Bomba

Filtro

Inyector


Residuos

Bomba

Filtro

Inyector


Residuos

Bomba

Filtro

Inyector


Residuos



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La aplicacin estndar (1) se utiliza para la mayora de los anlisis, mientras

que la configuracin de volumen de mezcla extra (2) se utiliza en cualquiertipo de aplicacin de lnea base crtica en la que el rendimiento de la mezcla yla lnea base UV dependiente se pueden mejorar de forma significativamediante el uso del mezclador Jet Weaver de Agilent. Posee una funcin depurga automtica (3) instalada, as como la posibilidad de realizar la limpiezaposterior del filtro en lnea (4). De esta forma puede limpiar el filtro y aumen-tar su vida til.



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g y p pComponentes del sistema

El Inyector automtico Agilent 1290 Infinity

El Inyector automtico Agilent 1290 Infinity ofrece el conocido diseo de flujode Agilent con inyeccin de volumen variable y lo lleva a un nuevo nivel derendimiento. Los nuevos materiales inertes en el asiento de la aguja y en elsello del dispositivo de medicin ayudan a obtener un arrastre de contaminan-tes extremadamente bajo. El volumen hidrulico reducido del paso del flujo esadecuado para gradientes ms rpidos. Adems, la capacidad de utilizar inyec-ciones solapadas y la reduccin automtica del volumen de retardo (ADVR)

contribuyen a obtener tiempos de ciclo ms breves y suministros de gradientean ms rpidos a la columna. El sistema extrae exactamente el volumen con-figurado de la solucin de muestra sin residuos y logra una gran reproducibili-dad en todo el rango desde un volumen de inyeccin submicrolitro hasta unmximo de 40 l. El capilar de inyeccin estndar instalado permite inyeccio-nes de 20 l.

Figura 18 Esquema de los pasos de inyeccin en el Inyector automtico 1290 Infinity

1. Vlvula en posicin de mainpass:

flujo a travs

2. Vlvula en posicin de bypass:

extraccin de la muestra

3. Vlvula en posicin de bypass:lavado de la aguja

4. Vlvula en posicin de mainpass:muestra inyectada



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Un mdulo aadido opcional totalmente nuevo, el Cubo flexible, funciona a la

perfeccin con el inyector automtico para proporcionar capacidades adicio-nales. Con la incorporacin del nuevo mdulo de Cubo flexible, que se com-pone de una bomba de jeringa de 500 l, una vlvula de presin baja y dosvlvulas de intercambio de presin alta, son posibles ms opciones. Por ejem-plo, el sistema de inyeccin de flujo a travs se puede sustituir por un loop deinyeccin fijo mediante la bomba de jeringa y el sistema de vlvulas del Cuboflexible con el fin de llenar el loop de muestra. La ventaja de esta configura-cin es que elimina el volumen de retardo del inyector automtico y, por tanto,

puede ser la opcin preferida en algunas situaciones de alta productividad ygradiente rpido. La desventaja es que la flexibilidad de las inyecciones devolumen variable est desactivada y se desecha una parte de la muestra al lim-piar el loop. Otras tareas, como la limpieza posterior automtica del asiento dela aguja de inyeccin tras la inyeccin son posibles con el Cubo flexible, lo queotorga ms confianza ya que se puede evitar el arrastre de contaminantes decompuestos difciles o los bloqueos provocados por las muestras sucias.

El estante de muestras del inyector automtico posee 10 posiciones fijas paralos viales de 2 ml y dos bandejas extrables, que pueden ser idnticas o no,seleccionadas de:

una bandeja para viales de 2 ml con 54 posiciones,

una placa de microtitulacin con 96 pocillos (configurable en varias altu-ras),

una placa de microtitulacin con 384 pocillos (configurable en varias altu-

ras).Si es necesario, el inyector automtico se puede termostatizar de 4 C a 40 Csi se aade el mdulo de control de la temperatura del inyector automtico.



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El Compartimento de columnas termostatizado Agilent 1290 Infinity

El Compartimento de columnas termostatizado (TCC) Agilent 1290 Infinitycontrola la temperatura entre 10 C por debajo de la temperatura ambiente yhasta 100 C a 2,5 ml/min y 80 C a 5 ml/min, respectivamente. La especifica-cin de estabilidad de la temperatura es 0,05 C y la especificacin de preci-

sin 0,5 C (con calibracin)1. Esto se logra mediante una combinacin deconduccin desde el contacto con las aspas del termostato, la temperatura deaire inmvil en el entorno de la columna y, lo ms importante, mediante el

calentamiento (o enfriamiento) previo de la fase mvil al pasar por un inter-cambiador de calor antes de entrar en la columna. Existen dos zonas de tem-peratura independientes en cada TCC que pueden funcionar conjuntamentepara columnas largas de hasta 300 mm de longitud o funcionar a temperaturasdiferentes para columnas cortas de 100 mm de longitud o menos.

El mdulo dispone de un intercambiador de calor de dispersin baja de 1,6 ly cada kit de vlvulas contiene intercambiadores de calor de dispersin baja

adicionales para cada columna. Los intercambiadores de calor de dispersinbaja, hasta 4, se pueden montar de forma flexible dentro del TCC. Para el fun-cionamiento del sistema HPLC convencional, tambin estn disponibles inter-cambiadores de calor integrados de 3 l y 6 l.

Cada TCC puede albergar una unidad de vlvula interna para facilitar aplica-ciones de intercambio de la vlvula, desde el intercambio simple entre doscolumnas hasta la regeneracin automtica de columnas, la preparacin demuestras o la limpieza posterior de la columna. Cada cabeza de la vlvulaconstituye un kit completo que contiene todos los capilares necesarios, inter-cambiadores de calor adicionales de dispersin baja y otras piezas.

Las vlvulas de intercambio presentan una facilidad de uso y una flexibilidadexcepcionales a la hora de realizar conexiones con la vlvula: cuando se pulsa,la unidad de accionamiento de la vlvula de cambio rpido se desplaza haciadelante para acceder fcilmente (consulte la Figura 19en la pgina 36a laizquierda). El usuario puede intercambiar cabezas de las vlvulas alternativas

en el mecanismo de accionamiento para diferentes aplicaciones (consulte laFigura 19en la pgina 36a la derecha). Tenga en cuenta la etiqueta RFID(identificacin por radiofrecuencia) en la parte superior de la cabeza de la vl-vula.

1 Todas las especificaciones son vlidas para el agua destilada a temperatura ambiente de 25 C,

con un valor de 40 C y un rango de flujo entre 0,2 y 5 ml/min.

2 El sistema LC Agilent 1290 Infinity: descripcin del productoC t d l i t


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Figura 19 Vlvula de cambio rpido en TCC

Se pueden "agrupar" hasta tres TCC para permitir aplicaciones avanzadas,como el intercambio entre ocho columnas para el desarrollo de mtodos auto-matizados o para que haya ms columnas disponibles para diferentes aplica-

ciones. Por tanto, la columna que se va a utilizar se convierte en un parmetrodel mtodo simple. Esto requiere dos cabezas de vlvulas de 8 posiciones y 9puertos, cada una en dos de los TCC. Los TCC agrupados se representan en elsoftware como una nica unidad con una interfaz para facilitar su funciona-miento.

Las mejoras adicionales en comparacin con los diseos anteriores incluyenun mejor aislamiento trmico, mejores guas de capilares y un sensor de"puerta abierta" para que los mtodos puedan definir que la puerta debe estarcerrada (lo que es especialmente til para los mtodos de temperaturas altas obajas).



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El Detector de diodos 1290 Infinity

El Detector de diodos 1290 Infinity presenta un diseo ptico nuevo que uti-liza una celda de cartucho con guas de onda optofludicas con una gran sensi-bilidad y una dispersin baja, un amplio rango lineal y una lnea base muyestable para las aplicaciones LC estndares o ultrarrpidas. La celda de cartu-cho Max-Light de Agilent aumenta drsticamente la transmisin de luzmediante el principio de la reflexin interna total junto con un capilar de cris-tal de slice fundida sin recubrimiento y alcanza un nivel nuevo de sensibili-

dad sin sacrificar la resolucin a travs de los efectos de dispersin delvolumen de la celda. Este diseo minimiza las perturbaciones de la lnea baseprovocadas por el ndice de refraccin o los efectos trmicos y supone unaintegracin ms fiable de las reas de pico.

Figura 20 El paso de luz a travs del Detector de diodos 1290 Infinity

El mdulo tambin incluye un control electrnico de la temperatura paramejorar an ms la resistencia a los efectos de la temperatura ambiental. Aun-que el volumen hidrulico de la celda de cartucho Max-Light es muy pequeo,la longitud de paso es de 10 mm. Sin embargo, para obtener una sensibilidadan mayor existe otra celda de alta sensibilidad Max-Light de Agilent con unalongitud de paso de 60 mm disponible. Las celdas se intercambian fcilmenteal deslizarlas hacia dentro o hacia afuera del soporte de la celda y se alineanautomticamente en el banco ptico. La fuente de luz del DAD es una lmpara

de deuterio y el rango operativo de longitud de onda cubierto es de entre 190 y

Espejo

Lmpara de deuterio

Celda de cartucho Max-Light

Gua de ondaoptofludica

Rendija programable

Red de difraccin

Matriz de 1024 diodos



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640 nm. Una matriz de 1024 diodos se encarga de la deteccin. La entrada al

espectrograma se realiza mediante una rendija ptica programable que ofreceuna resolucin espectral de 1 a 8 nm. Esto se lleva a cabo normalmente en elcentro del rango, pero se puede reducir a 1 nm para optimizarlo y obtener unaresolucin espectral alta (no se suele ser necesario en los espectros UV de faselquida), o abrir hasta 8 nm para obtener una transmisin de luz mxima y unruido mnimo en la seal.

Las seales cromatogrficas se extraen de los datos de los diodos dentro delfirmware del mdulo. Se pueden definir hasta 8 seales individuales, cada unacon una longitud de onda de la seal, una anchura de banda de agrupamientode diodos y, en caso necesario, una longitud de onda y una anchura de bandade referencia. Las seales se pueden emitir a un mximo de 160 Hz (160 pun-tos de datos/segundo) para registrar de forma precisa los picos cromatogrfi-cos ms rpidos (ms estrechos). Al mismo tiempo, el mdulo tambin puedeemitir espectros de rango completo al sistema de datos a la misma velocidadde 160 Hz.

Para los laboratorios regulados, es importante que todos los parmetros de losmtodos estn registrados. El DAD 1290 Infinity no solo registra los valoresdel instrumento, sino tambin las etiquetas RFID (etiquetas de identificacinde radiofrecuencia) incorporadas en la lmpara y el cartucho de la celda deflujo, a fin de que el sistema tambin registre la identidad y las variables deestos componentes importantes.



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39Agilent Technologies

3Optimizacin del sistema LC Agilent1290 Infinity

Volumen de retardo y volumen de extracolumna 40

Volumen de retardo 40Volumen de extracolumna 41

Cmo configurar el volumen de retardo ptimo 42

Cmo conseguir volmenes de inyeccin ms elevados 52

Cmo conseguir un alto rendimiento 54

Cmo conseguir una resolucin ms elevada 57

Cmo conseguir una sensibilidad ms elevada 60Cmo conseguir un arrastre de contaminantes mnimo 69

Cmo evitar los bloqueos de columnas 71

Este captulo explica cmo aplicar la teora y cmo usar las funciones del sis-tema LC para realizar separaciones optimizadas.

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityVolumen de retardo y volumen de extracolumna


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y

Volumen de retardo y volumen de extracolumna

El volumen de retardose define como el volumen del sistema entre el puntode mezcla en la bomba y la parte superior de la columna.

El volumen extracolumnase define como el volumen entre el punto de inyec-cin y el punto de deteccin, excluyendo el volumen en la columna.

Volumen de retardo

En separaciones de gradiente, este volumen provoca un retardo entre el cam-bio de la mezcla en la bomba y la llegada del cambio a la columna. El retardodepende de la velocidad de flujo y del volumen de retardo del sistema. En rea-lidad, esto significa que en cada sistema HPLC existe un segmento isocrticoadicional en el perfil de gradiente al inicio de cada anlisis. Por regla general,el perfil de gradiente es indicado en trminos de ajustes de mezcla en labomba y el volumen de retardo no se cita aunque afectar a la cromatografa.El efecto ser ms significativo a velocidades de flujo bajas y volmenes decolumna pequeos y puede afectar significativamente a la transferabilidad delos mtodos de gradiente. Por lo tanto, para las separaciones de gradiente

rpidas es importante tener volmenes de retardo pequeos, especialmenteen columnas de dimetro estrecho (por ejemplo, de 2,1 mm de d.i.) como lasque se suelen utilizar en la deteccin espectromtrica de masas.

El volumen de retardo de un sistema incluye el volumen en la bomba desde elpunto de mezcla, las conexiones entre la bomba y el inyector automtico, elvolumen del paso de flujo a travs del inyector automtico y las conexionesentre ste y la columna.

Como ejemplo, en los mtodos HPLC con material empaquetado de 5 m sesuelen utilizar velocidades de flujo de 1 ml/min en una columna de 4,6 mm ded.i. y aproximadamente 0,2 ml/min en una columna 2,1 mm de d.i.(mismavelocidad lineal en la columna). En un sistema con un volumen de retardo tpi-co de 1000 l y utilizando una columna de 2,1 mm, se generara un segmentoisocrtico oculto de 5 min mientras que en un sistema con 600 l el volumende retardo sera de 3 min. Estos volmenes de retardo seran demasiado altospara tiempos de anlisis de uno o dos minutos. Con empaquetados de subdos

Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3Volumen de retardo y volumen de extracolumna


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m la velocidad de flujo ptima (a partir de la Curva de Van Deemter) es un

poco ms alta, por lo que la cromatografa rpida puede utilizar de tres a cincoveces estas velocidades de flujo que generarn tiempos de retardo de aproxi-madamente un minuto. Sin embargo, el volumen de retardo debe reducirsems para conseguir tiempos de retardo correspondientes a una fraccin deltiempo de anlisis deseado. Esto se consigue con el sistema LC de Agilent 1290Infinity debido al volumen de retardo bajo del paso de flujo de la bomba, alvolumen bajo del mezclador Jet Weaver y al volumen bajo del paso de flujo atravs del inyector automtico.

Volumen de extracolumna

El volumen extracolumna es una fuente de dispersin de picos que reducir laresolucin de la separacin y debe minimizarse. Las columnas con dimetroms reducido requieren volmenes extracolumna proporcionalmente ms

pequeos para limitar al mnimo la dispersin de picos.En un cromatgrafo de lquidos el volumen extracolumna depender de lostubos que conecten el inyector automtico, la columna y el detector; y del volu-men de la celda de flujo del detector. El volumen extracolumna se ha minimi-zado en el Sistema LC Agilent 1290 Infinity mediante los tubos de dimetroestrecho (0,12 mm de d.i.), los intercambiadores de calor de volumen bajo enel compartimento de la columna y la celda de cartucho Max-Light en el detec-

tor.

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityCmo configurar el volumen de retardo ptimo


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Cmo configurar el volumen de retardo ptimo

La Tabla 3en la pgina 42y la Tabla 4en la pgina 43muestran los volmenesde componente que contribuyen al volumen de retardo del sistema en el sis-tema LC Agilent 1290 Infinity. En la configuracin estndar con la Bombabinaria Agilent 1290 Infinity, el mezclador Jet Weaver, el Inyector automtico

Agilent 1290 Infinity y el Compartimento de columnas termostatizado, el volu-men de retardo del sistema es de aproximadamente 125 l. Este volumen deretardo estndar es adecuado para la mayora de las aplicaciones. Por ejemplo,una separacin rpida en una columna de 50 mm x 2,1 mm rellena con part-culas inferiores a 2 m a una velocidad de flujo moderada de 0,6 ml/min darlugar a un tiempo de retardo tpico de gradiente de aproximadamente 0,2 min,que por lo general es aceptable con tiempos de gradiente de dos a tres minutos(consulte Tabla 6en la pgina 44). Resulta til a menudo considerar la veloci-

dad de flujo en trminos de volmenes de columna y se puede ver en la Tabla 7en la pgina 45que con esta columna a 0,6 ml/min fluyen a travs del sistemaaproximadamente 6 volmenes de columna por minuto y que el volumen deretardo es de aproximadamente 1,2 veces el volumen de la columna.

Una configuracin con la Bomba cuaternaria Agilent 1290 Infinity, el Inyectorautomtico 1290 Infinity y el Compartimento termostatizado de columna pre-senta un volumen de retardo de 430 L, lo que da lugar a un tiempo de retardo

de 0,7 min. Este es el lmite de aceptacin de los tiempos de gradiente de3 min.

Tabla 3 Volmenes de retardo de los mdulos LC 1290 Infinity

Componentes Volumen de retardo (l)

Bomba binaria 10

Mezclador Jet Weaver (estndar) 35

Bomba binaria + Jet Weaver 45

Bomba cuaternaria 350

Bomba cuaternaria + Jet Weaver V380 500

Inyector automtico (loop fijado de 5 l) 5

Inyector automtico (volumen variable, estndar) 80

Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3Cmo configurar el volumen de retardo ptimo


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Intercambiador de calor de dispersin baja del compartimento decolumna

1.6

Tubos de conexin, 0,12 mm de d.i., por 100 mm 1.1

Tabla 4 Volmenes de retardo de las configuraciones del sistema LC binario 1290Infinity

Configuraciones del sistema1

1 5 l agregados para permitir conexiones en las configuraciones del sistema

Volumen de retardo (l)

Bomba binaria + Inyector automtico de loop fijado (MSsolamente)

20

Bomba binaria + Jet Weaver + Loop fijado 55

Bomba binaria + Inyector automtico estndar (MS solamente) 90

Bomba binaria + Jet Weaver + Inyector automtico 125

Tabla 5 Volmenes de retardo de las configuraciones del sistema LC cuaternario 1290Infinity

Configuraciones del sistema1

1 5 l agregados para permitir conexiones en las configuraciones del sistema

Volumen de retardo (l)

Bomba cuaternaria + Inyector automtico de loop fijado (MSsolamente)

360

Bomba cuaternaria + Inyector automtico estndar (MSsolamente)

430

Bomba cuaternaria + Jet Weaver V380 + Loop fijado 510Bomba cuaternaria + Jet Weaver V380 + Inyector automtico 580

Tabla 3 Volmenes de retardo de los mdulos LC 1290 Infinity

Componentes Volumen de retardo (l)



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Tabla 6 Tiempos de retardo del sistema para que el gradiente alcance la cabeza de la

columna

Velocidadde flujo(ml/min)

Volumen de retardo del sistema (microlitros)

20 55 90 125 360 395 430 465

Tiempos de retardo (minutos)0.2 0.10 0.28 0.43 0.60 1.80 2.15 2.55 2.90

0.4 0.05 0.14 0.21 0.30 0.90 1.08 1.28 1.45

0.6 0.03 0.09 0.14 0.20 0.60 0.72 0.85 0.97

0.8 0.03 0.07 0.11 0.15 0.45 0.54 0.64 0.73

1.0 0.02 0.06 0.09 0.12 0.36 0.43 0.51 0.58

1.5 0.01 0.04 0.06 0.08 0.24 0.29 0.34 0.39

2.0 0.01 0.03 0.04 0.06 0.18 0.22 0.26 0.29

3.0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.12 0.14 0.17 0.19

4.0 0.01 0.01 0.02 0.03 0.09 0.11 0.13 0.15

5.0 0.00 0.01 0.02 0.02 0.07 0.09 0.10 0.12



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Para gradientes muy rpidos de ms de 0,5 min, que solo se pueden lograr conel sistema LC binario Agilent 1290 Infinity, el volumen de retardo del sistemase puede reducir fcilmente sin cambiar la configuracin fsica del sistema.Este cambio se alcanza variando el comportamiento del inyector automtico.

El volumen de retardo de 80 l del Inyector automtico Agilent 1290 Infinityse produce por el paso de flujo de la vlvula de inyeccin a travs del disposi-tivo de medida, la aguja, el asiento de la aguja y los capilares de conexin devuelta a la vlvula de inyeccin (consulte Figura 18en la pgina 33). Para rea-lizar una inyeccin, la vlvula cambia de la posicin de mainpass a la posicinde bypass de forma que el dispositivo de medida pueda suministrar la muestraal capilar de la aguja. La inyeccin se realiza cuando la vlvula regresa a laposicin de mainpass y la muestra se evacua en la columna. La vlvula perma-nece en esta posicin durante el anlisis de forma que el inyector automticoevacue continuamente y, por lo tanto, el gradiente fluya a travs de este volu-men de retardo para alcanzar la columna. Este proceso se puede eliminar si secambia la vlvula de inyeccin de la posicin de mainpass a la posicin debypass tras haber realizado la inyeccin y haber evacuado la muestra inyec-tada en la columna. En la prctica, esta operacin se puede realizar pocossegundos despus de la inyeccin y se activa al seleccionar la funcin "Reduc-cin automtica del volumen de retardo" (ADVR) en el men de configuracindel inyector automtico. El factor de evacuacin (normalmente, 5 veces elvolumen de inyeccin) garantiza que transcurra el tiempo suficiente para eva-cuar la muestra del inyector antes de cambiar a la posicin de bypass. Esto

reduce eficazmente el volumen de retardo del sistema de 125 l a 50 l.

Tabla 7 Volumen aproximado del lquido en dimensiones de columna tpicas asumiendo

porosidad de 0,6

Dimetro dela columna(mm)

Longitud de la columna (mm)

30 50 100 150 250

Volumen de la columna - Fase lquida (microlitros)

2.1 62 104 208 312 520

3.0 127 212 424 636 1060

4.0 226 377 754 1131 1885

4.6 299 499 997 1496 2493



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Cuando se utiliza la funcin ADVR, se ha de tener presente que el gradiente ya

se ha iniciado en la bomba en el momento de la inyeccin. Cabra preguntarsesi el gradiente ya ha alcanzado el inyector automtico, en cuyo caso daralugar a un pequeo paso en el gradiente. Esto ocurre cuando el volumen deretardo es inferior al volumen de evacuacin y no plantea necesariamente unproblema, pero es un factor que debe considerarse en una transferencia delmtodo. Con un factor de evacuacin de 5 y un volumen de inyeccin de 10 l,el inyector automtico permitir el paso de 50 l antes de cambiar a la posi-cin de bypass, con un volumen de retardo de 50 l, lo que significa que el gra-

diente acaba de alcanzar la vlvula de inyeccin. Los volmenes de inyeccinms pequeos no tendrn ningn efecto. Sin embargo, en el caso de volmenesde inyeccin ms grandes, se producir un pequeo paso en el gradiente. Lavelocidad de flujo utilizada tambin afectar a la decisin de utilizar o no lafuncin ADVR. A 0,2 ml/min, el tiempo de retardo que se ahorra es de 21segundos, mientras que a 1,0 ml/min, es de 4 segundos.

Probablemente la funcin ADVR no es adecuada en el caso de aplicaciones concompuestos conocidos, ya que generan problemas de arrastre de contaminan-tes.

Para minimizar la dispersin de picos y el volumen de retardo en el comparti-mento termostatizado de columna, ha de instalarse el intercambiador de calorde dispersin baja. El intercambiador de calor de dispersin baja se incluye enlos kit de capilar recomendados para las aplicaciones de dispersin baja. El kitde capilar comn incluye tambin capilares estrechos de 0,12 mm de d.i. Sesuministran los intercambiadores de calor incorporados de 3 l y 6 l para

garantizar la retrocompatibilidad y slo deberan utilizarse en caso de que senecesite ejecutar un mtodo convencional, aunque en este caso tambin seraposible utilizar el intercambiador de dispersin baja.

Para mantener la resolucin en el Detector de diodos Agilent 1290 Infinity, lacelda de cartucho Max-Light posee un volumen de dispersin bajo (volumen1,0 l) y no se necesita ninguna optimizacin de volumen adicional. Cuando seutilice la celda de sensibilidad alta Agilent Max-Light alternativa para obtener

un sensibilidad ms elevada, el volumen de la celda se optimiza para su utiliza-cin con columnas de dimetro interno de 3 mm y 4,6 mm.

Para operar con la bomba se recomienda fijar el disolvente correcto en la pan-talla de configuracin de la bomba. Incluso a pesar de que el control inteli-gente ajusta automticamente la onda de presin a un mnimo, lacompresibilidad del disolvente puede influir en el mantenimiento de la veloci-dad de flujo absolutamente correcta a alta presin. Esto garantiza la aplica-cin en todo momento de valores de compresibilidad correctos para las fases



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mviles utilizadas. Las funciones de calibracin estn disponibles para las

Bombas binarias y cuaternarias Agilent 1290 Infinity.En la Bomba binaria 1290 Infinity, el volumen de retardo fsico de la bombadepende principalmente de la utilizacin del mezclador Jet Weaver. Para ladeteccin UV, debera utilizarse siempre el Jet Weaver. Sin embargo, para ladeteccin espectromtrica de masas, el usuario puede decidir si ignorar el JetWeaver mediante la retirada de 35 l del volumen de retardo. Esto slo tienesentido para la operacin de gradiente ultrarrpida (menos de 0,5 min) o parasu utilizacin con columnas de volumen muy pequeas. Consulte la Tabla 6enla pgina 44para obtener informacin del efecto sobre el tiempo de retardo enel sistema. Si se ignora el Jet Weaver, los tubos de conexin al inyector auto-mtico se dirigirn directamente desde la vlvula de purga. Asegrese de queel Jet Weaver se ha lavado con disolvente sin tampones u otros aditivos antesde desconectarlo.

En ocasiones puede resultar aconsejable aumentar el volumen de retardo en labomba. Especialmente cuando se utiliza la deteccin UV y se ha agregado un

compuesto de absorcin UV fuerte a la fase mvil. En estos casos, es posibleque se acente cualquier ruido de la bomba; la utilizacin de cido trifluoro-actico (TFA) en el anlisis de protenas y pptidos constituye el ejemplo mscomn. El efecto puede mitigarse aumentando el volumen del mezclador. Elmezclador Jet Weaver tiene dos volmenes alternativos en la misma unidad. Elcambio del volumen bajo, 35 l, al volumen alto, 100 l, se realiza desinstaln-dolo, dndole la vuelta y volviendo a instalarlo. El volumen de mezcla (y portanto el volumen de retardo) aumenta 65 l y mejora el funcionamiento de la

lnea base con aditivos como el TFA. La configuracin del Jet Weaver se regis-tra automticamente mediante una etiqueta RFID. Para aplicaciones comple-jas con el ruido de lnea base UV ms bajo posible, est disponible unmezclador Jet Weaver de 380 L, que se instala de forma anloga al mezcladorJet Weaver estndar.

El procedimiento para sustituir un Jet Weaver en la Bomba binaria 1290 Infi-nity se ilustra en Sustitucin del Jet Weaver en la Bomba binaria 1290

Infinity en la pgina 49.Debido a la configuracin y al principio de mezcla diferente de la Bomba cua-ternaria Agilent 1290 Infinity, el volumen de retardo fsico es mucho mayor yen las aplicaciones estndares no es necesario un mezclador Jet Weaver adi-cional. An as, es posible instalar un mezclador Jet Weaver opcional de380 L para las aplicaciones crticas de lnea base, como las aplicaciones deTFA. El mezclador Jet Weaver opcional posee una carcasa diferente, que seadapta al diseo de la Bomba cuaternaria 1290 Infinity.



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El procedimiento para instalar un Jet Weaver en la Bomba cuaternaria 1290

Infinity se ilustra en Instalacin del Jet Weaver V380 en la Bomba cuaternaria1290 Infinity en la pgina 50.



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Sustitucin del Jet Weaver en la Bomba binaria 1290 Infinity

1 Extraiga las conexiones de los capitales del Jet Weaver. 2 Extraiga los tornillos hexagonales que fijan el Jet Weavera la carcasa de la bomba.

3 Instale el nuevo Jet Weaver.

NOTAEl Jet Weaver tiene una parte frontal y otra posteriorcon volmenes internos diferentes (35 / 100 l) que seoptimizan para obtener un volumen de retardo bajo oel mejor rendimiento de mezcla.

4 Vuelva a instalar las conexiones de los capilares.

La entrada situada en la parte inferior del Jet Weaverest conectada al puerto central de la vlvula de labomba a travs de un capilar (longitud 300 mm, 0,17 mmde d.i.). La salida situada en la parte superior estconectada a un inyector automtico.



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Instalacin del Jet Weaver V380 en la Bomba cuaternaria 1290

Infinity1 Afloje el tornillo de la tapa metlica del Jet Weaver. 2 Extraiga la tapa metlica. Para ello, elvela (1) y

extrigala del panel frontal (2).

3 Introduzca el Jet Weaver en la abertura del panel frontal(1) y empjelo hacia abajo (2).

4 Monte los dos capilares de conexin del Jet Weaver.Para ello, tenga en cuenta la orientacin correcta.

1

2

1

2



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5 Conecte el capilar de entrada entre el Jet Weaver y el

puerto 2 de la vlvula multiuso. Conecte el capilar desalida al puerto 1.

Puerto 1

Puerto 2

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityCmo conseguir volmenes de inyeccin ms elevados


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Cmo conseguir volmenes de inyeccin ms elevados

En la configuracin estndar del inyector automtico Agilent 1290 Infinity seincluye un loop de muestra de volumen variable para hasta 20 l inyecciones.El dispositivo de medicin puede inyectar un volumen mximo de 40 l y elcartucho de loop de muestra puede cambiarse para este fin (consulte el

manual del inyector automtico 1290 Infinitypara obtener informacin). Elvolumen de retardo del sistema aumentar por lo tanto debido al inyectorautomtico.

Siempre que un mtodo disminuya de una columna grande a una ms peque-a, es importante que la conversin del mtodo acepte la reduccin del volu-men de inyeccin en relacin al volumen de la columna para mantener elrendimiento del mtodo. De este modo, el volumen de la inyeccin se manten-dr al mismo porcentaje con respecto a la columna. Esto es particularmenteimportante si el disolvente de la inyeccin es ms fuerte (ms eluotrpico) quela fase mvil de inicio y cualquier aumento afectar la separacin, especial-mente de los primeros picos (factor de retencin bajo). En algunos casos es lacausa de la distorsin de los picos y la norma general es mantener el mismodisolvente de inyeccin o aplicar uno ms suave que la composicin del gra-diente de inicio. Esto tiene que ver con si, o en qu medida, puede aumentarseel volumen de inyeccin y el usuario debera buscar seales de aumento dedispersin (picos ms anchos o ms torcidos y una resolucin de pico redu-cida) con el fin de aumentar el tamao de la inyeccin. Si se realiza una inyec-cin en un disolvente dbil, el volumen podr probablemente aumentar ms yaque el efecto ser la concentracin del analito en la cabeza de la columna alinicio del gradiente. Por el contrario, si la inyeccin se encuentra en un disol-vente ms fuerte que la fase mvil de inicio, el volumen de inyeccin aumen-tado esparcir la banda del analito por la columna del gradiente, dando comoresultado la dispersin de los picos y la prdida de la resolucin.

Puede que la consideracin principal para determinar el volumen de inyeccinsea el dimetro de la columna, puesto que esto tendr un gran impacto en ladispersin de los picos. La altura de los picos puede ser superior en unacolumna estrecha que con una inyeccin ms larga en una columna msancha, ya que hay menos dispersin de picos. Con columnas de d.i. de 2,1 mmlos volmenes habituales de inyeccin podran ir de 5 a10 l pero dependebastante, como se comentaba anteriormente, de la qumica del analito y de lafase mvil. Una gua aproximada para el volumen de inyeccin mximo puede

Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3Cmo conseguir volmenes de inyeccin ms elevados


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obtenerse mirando el volumen de la columna (consulte ) en volmenes deinyeccin de separacin en gradiente de aproximadamente 5 % del volumen dela columna podra alcanzarse al mismo tiempo que se mantiene una buenaresolucin y la dispersin de los picos.

Una forma de lograr mayores inyecciones es utilizar una columna de retencinseleccionada mediante una vlvula de intercambio para capturar y concentrarla inyeccin antes de intercambiarla, por ejemplo, inyectndola, en unacolumna analtica, consulte . La vlvula puede colocarse segn sea necesarioen el compartimento termostatizado de columna.

Figura 21 Enriquecimiento de muestras

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityCmo conseguir un alto rendimiento


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Cmo conseguir un alto rendimiento

Algunos laboratorios operan en entornos de alta productividad (HT) en losque la carga requiere la aplicacin de secuencias de cientos o incluso miles deinyecciones para completar un trabajo. En estos casos, es muy convenienteminimizar los ciclos de tiempo, ya que ahorrar incluso unos pocos segundos

por inyeccin reducir el tiempo necesario para completar el trabajo en unacantidad significativa y til. Los pasos fundamentales para obtener tiempos deciclo rpidos y operaciones de alta productividad son:

Utilizar separaciones rpidas

Solapar inyecciones

Minimizar el tiempo de equilibrado

Regeneracin alternada de la columna

El primer paso para obtener una operacin de alta productividad es asegu-rarse de que los mtodos utilizados tienen tiempos de ciclo cortos, es decir,que son mtodos de cromatografa rpida. El uso de columnas cortas conempaquetado de tamao de partcula de 1,8 m es ideal para este propsitodebido a la alta eficiencia disponible en una columna corta. Si los mtodosimplican separacin isocrtica, se conseguirn los tiempos de ciclo ms rpi-dos, al no ser necesario equilibrar las columnas entre anlisis. Sin embargo, lo

ms habitual es emplear mtodos de gradiente debido al rango o complejidadde las muestras. Al desarrollar el mtodo el rango de gradiente debe mante-nerse al mnimo requerido para obtener la separacin. En muchos sistemas deacceso abierto se utilizan gradientes con disolventes orgnicos del 5 % al95 % para obtener la mayor flexibilidad a la hora de tratar con un rango decompuestos desconocidos. En situaciones de alta productividad debe conside-rarse si ser suficiente un rango ms corto sobre la base de que se reduce elrango esperado de compuestos para anlisis y esto no slo permitir reducir

los tiempos de anlisis sino tambin los tiempos de equilibrado entre opera-ciones.

El tiempo de ciclo se compone de varios elementos: Tiempo de ciclo = inyec-cin + separacin + equilibrado + procesamiento de datos.

Con un nmero grande de muestras que procesar, incluso una pequea reduc-cin del tiempo de ciclo puede dar lugar a una gran reduccin del tiempo nece-sario para completar el trabajo. Por esta razn el procesamiento de datos

Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3Cmo conseguir un alto rendimiento

d li f d l d f l i t t li


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puede realizarse fuera de lnea de forma que el sistema se centre en analizarlas muestras y en recopilar los datos.

La inyeccin se puede optimizar en trminos de velocidad recordando quedibujar la muestra demasiado deprisa puede reducir la reproducibilidad. Sepueden obtener ganancias marginales en este sentido, ya que los volmenes demuestra utilizados tienden hacia el extremo ms pequeo del rango en todocaso. Una parte significativa del tiempo de inyeccin es consumida por losmovimientos de la aguja desde el vial hasta el puerto de lavado. Estas manipu-laciones se pueden efectuar mientras se lleva a cabo la separacin previa. Esto

es lo que se conoce como "inyeccin solapada" y puede activarse fcilmentedesde la pantalla de configuracin del inyector automtico en el software decontrol ChemStation. Se puede indicar al inyector automtico que cambie elflujo a travs del inyector automtico a bypass una vez que se haya realizado lainyeccin y seguidamente tras, por ejemplo, 3 minutos en un anlisis de 4minutos, para que inicie el proceso de aspiracin de la siguiente muestra y lapreparacin de la inyeccin. Esta estrategia puede ahorrar entre 0,5 y 1minuto por inyeccin. Para compuestos pegajosos se recomienda seguir este

procedimiento durante el equilibrado de columna, cuando el inyector autom-tico haya observado las condiciones de partida del siguiente anlisis de gra-diente.

El paso del equilibrado de columna puede consumir una parte significativa deltiempo de ciclo. Por regla general, la columna necesita lavarse con tres a cincoveces el volumen de columna antes de quedar estabilizada para la siguienteinyeccin y este proceso puede suponer el 50 % o ms del tiempo de separa-

cin en algunas aplicaciones. Se trata de un proceso esencial, pero puedeexcluirse del tiempo de ciclo si se utiliza la regeneracin alternada automticade la columna. Para ello, se necesita una cabeza de vlvula de dos posiciones ydiez puertos, 1200 bares, en el compartimento de columna; una segundacolumna analtica, idntica a la primera; y una segunda bomba. Mientras unacolumna se utiliza para el anlisis de separacin, la otra se lava con el compo-sicin inicial del gradiente de la fase mvil; para iniciar la siguiente inyeccinla columna recin reequilibrada se cambia al paso de flujo analtico. Las dos

columnas alternan de esta forma durante la secuencia completa de inyeccio-nes. La segunda bomba slo es necesaria para lavar una mezcla isocrtica atravs de la columna, por lo que puede utilizarse una bomba ms sencilla quelas bombas 1290 Infinity. Por ejemplo, una bomba isocrtica 1200 Series serasuficiente para realizar la tarea. La configuracin se ilustra en Figura 22en lapgina 56.

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityCmo conseguir un alto rendimiento


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Figura 22 Regeneracin alternada de la columna

Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 Infinity 3Cmo conseguir una resolucin ms elevada

Cmo conseguir una resolucin ms elevada


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Cmo conseguir una resolucin ms elevada

Una resolucin mayor en una separacin mejorar los anlisis de los datoscualitativos y cuantitativos, permitir la separacin de ms picos u ofrecerun mayor mbito para acelerar la separacin. En esta seccin analiza cmopuede aumentarse la resolucin examinando los dos puntos siguientes:

Optimizar la selectividad Embalaje de partculas de menor tamao

Columnas ms largas

Gradientes poco profundos, flujo ms rpido

Volumen de columna extra mnimo

Optimizar el disolvente y el volumen de inyeccin

Recopilacin de datos suficientemente rpidaLa ecuacin de resolucin describe la resolucin entre dos picos:

donde

Rs=resolucin, N=recuento de placa (medida de la eficacia de la columna),

=selectividad (entre dos picos),

k2=factor de retencin del segundo pico (anteriormente llamado factor de

capacidad).

El trmino que tiene el efecto ms importante en la resolucin es la selectivi-

dad, , y en la prctica la variacin de este trmino supone el cambio del tipode la fase estacionaria (C18, C8, fenil, nitrilo, etc.), la fase mvil y la tempera-tura para maximizar las diferencias de selectividad entre los solutos que sevan a separar. Este es un trabajo importante que se hace mejor con un sistemade desarrollo de mtodo automatizado que permita la evaluacin de unaamplia gama de condiciones en diferentes columnas y fases mviles en un pro-tocolo de reconocimiento ordenado. Esta seccin considera cmo conseguiruna resolucin ms alta con cualquier fase estacionaria y mvil elegida. Si se

3 Optimizacin del sistema LC Agilent 1290 InfinityCmo conseguir una resolucin ms elevada

ha utilizado un sistema de desarrollo de mtodo automatizado en la decisin


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ha utilizado un sistema de desarrollo de mtodo automatizado en la decisinsobre las fases, es probable que se utilicen columnas cortas para un anlisisrpido en cada paso del reconocimiento.

La ecuacin de la resolucin muestra que el siguiente trmino ms importantees el recuento de placa o eficacia, N, y que ste puede optimizarse de distintasmaneras. N es inversamente proporcional al tamao de la partcula y directa-mente proporcional a la longitud de una columna y por lo tanto, una partculade menor tamao y una columna ms larga dar un nmero de placa superior.La presin se eleva con el cuadrado inverso del tamao de la partcula y pro-

porcionalmente con la longitud de la columna. ste es el motivo de que el sis-tema LC 1290 Infinity est diseado para trabajar a 1200 bar de manera quepueda ejecutar partculas de subdosmicrones y la longitud de la columnapueda aumentarse hasta 100 mm 150 mm. Hay incluso ejemplos de colum-nas de 100 mm y 150 mm unidas para tener una longitud de 250 mm . La reso-lucin aumenta con la raz cuadrada de N por lo que duplicar la longitud de lacolumna aumentar la resolucin en un factor de 1,4. Lo que se puede conse-guir depende de la viscosidad de la fase mvil ya que esto est directamente

relacionado con la presin. Las mezclas de metanol generarn ms retropre-sin que las mezclas de acetonitrilo. El acetonitrilo es preferible a menudoporque las formas de los picos son mejores y ms estrechas sumado a la visco-sidad ms baja aunque el metanol generalmente permite una selectividadmejor (definitivamente para molculas pequeas inferiores a 500 Da). La vis-cosidad puede reducirse incrementando la temperatura pero debera recor-darse que esto puede cambiar la selectividad de la separacin. El experimentomostrar si esto supone un incremento o descenso de la selectividad. A

medida que aumenta el flujo y la presin, debera tenerse en cuenta que elcalor por friccin del interior de la columna aumentar y que ello puede cau-sar una mayor dispersin y posiblemente un pequeo cambio en la selectivi-dad; ambos podran verse como una reduccin de la resolucin. El lti

G4220 95301 1290InfinityLC System ES

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