Fusarium oxysporumのリアルタイムPCRによる検出 誌名 誌名 日本土壌肥料學雜誌 = Journal of the science of soil and manure, Japan ISSN ISSN 00290610 巻/号 巻/号 844 掲載ページ 掲載ページ p. 299-301 発行年月 発行年月 2013年8月 農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センター Tsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research Council Secretariat
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Fusarium oxysporumのリアルタイムPCRによる検出Measurement of Fusarium oxysporum by real-time PCR method 中央農業総合研究センター (305-8666 つくば市観音台
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Fusarium oxysporumのリアルタイムPCRによる検出
誌名誌名 日本土壌肥料學雜誌 = Journal of the science of soil and manure, Japan
ISSNISSN 00290610
巻/号巻/号 844
掲載ページ掲載ページ p. 299-301
発行年月発行年月 2013年8月
農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat
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浦嶋泰文・唐津敏彦・長岡一成・橋本知義
キーワード Fusαrium oxysporum, リアルタイム PCR,
インターカレーション法,希釈平板法
1 .はじめに
Fusarium oxysporumは土壌中などに普遍的に生息し
ており,植物病原菌として重要な糸状菌である.土壌中の
Fusarium oxysρorumの菌密度の検出に関しては駒田培
地(駒田, 1976)や西村培地(西村, 2008)などの選択培
地が活用されている.これらの選択培地の使用は低コスト
でとても優れた方法であるが培養時間と手聞がかかるこ
とが難点である.それに加え,駒田培地は含有成分のひと
つである PCNBが日本では 2000年までに登録が全て抹
消され,新たに入手することはできない等の問題がある.
また,それに代替する選択培地として開発された西村培地
も劇物を使用する必要がある.
リアルタイム PCR法はPCRによって増幅する DNA
量をリアルタイムに測定(モニタリング)する方法であ
る. PCRの反応過程で増幅する DNA(量)は蛍光物質
を利用して増幅する DNA量を測定している.その検出法
は大きく分けて 3つの方法がある.それはインターカレー
ション法,ハイブリダイゼーション法およびLUX(Light
Upon eXtension)法である(北条, 2008). 本研究では
インターカレーション法を用いた.インターカレーション
法は SYBR@Green1などの蛍光物質が二本鎖DNAに入
り込み,励起光の照射によって蛍光を発する特性を利用し
てDNA量を測定する方法である.蛍光の強さは核酸の量
に比例して強くなるため蛍光強度を測定することによっ
てDNAの増幅量を知ることができる. この方法は比較的
に安価であるが,ターゲット以外の領域が増えてしまっ
ても,その DNA量が測定されてしまう欠点がある.その
Yasufumi URASHIMA, Toshihiko KARASA WA,
Kazunari NAGAOKA and Tomoyoshi HASHIMOTO: Measurement of Fusarium oxysporum by real-time PCR method 中央農業総合研究センター (305-8666つくば市観音台3-1-1) Corresponding Author :浦嶋泰文2013年3月 14日受付・ 2013年5月30日受理日本土壌肥料学雑誌第 84巻第 4 号 p.299~301 (2013)
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ためにリアルタイム PCR後に融解曲線分析を行い,ター
ゲット以外の領域が増えていないことを確認する必要があ
る.最近,佐藤および豊田がリアルタイム PCRを用いた
土壌徴生物の検出についてとりまとめており,その中で
Fusarium属菌についても多くの研究を紹介している.
そこで本研究では, リアルタイム PCR法を用いて土壌
中の Fusαriumoxysporumの菌密度を迅速に定量的に検
出する方法を検討し,希釈平板法による結果との関係を比
較・検討した.
2.材料および方法
1) PCR条件
Fusarium oxysporum検出のためのプライマーとして
CLOX1 (5'-CAGCAAAGCA TCAGACCACT AT AAC
TC-3' )および CLOX2(~CTTGTCAGTAACTGGA
CGTTGGT ACT-3' )を用いた (Muleet al., 2004).用
いた単離菌は以下の通りである.Fusarium oxysporum
f.sp. asρaragi (北海道アスパラガス圃場), Fusarium
ρroliferatum (長野県アスパラガス圃場), Fusarium
oxysρorum f. sp. raρhani, Fusarium oxysρorum f. sp. cucumeri世zum,Fusarium oxysρorum f. sp. sρinaciae,
Fusarium solani (以上,東北農業研究センター福島研究
拠点,門田氏保存菌株). Fusarium単離菌から抽出した
DNA (Qiagen社の DNeasyPlant Mini Kit使用)を対
象として Muleet al. (2004) の報告を基に PCRを行い,
プライマーの特異性を確認した.その際の PCR条件は,
950C-2分, (940C-50秒, 60oC-50秒, 720C-1分)
x 35サイクル, 720C一7分, 40C一∞である. PCR酵
素として KOD-Plus- (東洋紡社製)を用いた. PCR
産物を電気泳動にかけ Fusariumoxysporumのみにバン
ドが認められるか確認した.
2) リアルタイム PCR条件
budcell (出芽細胞)密度を測定した Fusarium
oxysρorum菌液を調整した.豊田ら (1994)の方法に基
づき Czapek液体培地(土壌徴生物研究会編, 1992) に
Fusarium oxysporz仰を接種し 280
Cで4日間培養した.
滅菌した 4重脱脂綿をひいたガラスロートを用いて培養
菌液の櫨過を行い, budcellの懸渇液を得た.得られた
budcell懸濁液を 15μLとり, Thoma血球計算盤(深さ
0.1mm)にのせ,顕微鏡下でbudcellの個数を測定 (20
x20のマス内の胞子を測定)した.20 x 20のマス内は0.1
μLのbudcell数に相当するため,測定した budcell数に
104をかけて菌懸濁液 1mLあたりの budcell数を算出し
た.
budcell密度が判明した懸濁液を希釈し, budcell
密度の異なる懸濁液を調整した.その液より DNAを
FastDN A SPIN Kit for Soil (Q-Biogene製)を用いて
抽出した. ここで土壌からの DNA抽出用のキットを用い
たのはその後のサンフ。ル DNAを土壌から抽出することを
目的としているからである.抽出した DNAを用いてリア
ルタイム PCRの条件を設定した.
300 日本土壌肥料学雑誌第84巻第4号 (2013)
リアルタイム PCR装置は CFX96(バイオラッド社)を
用い,試薬は SsoAdvanced™SYBR Green@ Supermix
(バイオラッド社製)を使用した.本研究で設定したリア
ルタイム PCRの反応条件は以下の通りである.950C-3
分, (950C-10秒, 600C -10秒, 720C -30秒)x 50サ
イクルで、計測することで増殖曲線分析を行い, 950C-10
秒, 65Tから 95Tまで0.50C刻みで計測することにより
融解曲線分析を行った.反応溶液組成は以下の通り,サン
プル(鋳型DNA)2μL, SsoAdvanced™ SYBR Green@
Supermix10μL, Forwardフライマー 0.6μL,Reverseプ
ライマー 0.6μL,超純水 6.4μLとした.増殖曲線分析でサ
イクル数を 50とかなり多めに設定したが,サイクル数が
多いことによる非特異増幅は融解曲線分析により判断する
ことが可能であった.
3) リアルタイム PCRと希釈平板法による結果の比較
ホウレンソウ連作圃場(東北農業研究センター内ピ
ニルハウス:淡色黒ボク土壌,連作 27作)における
Fusαrium oxysporumの菌密度が異なる土壌を対象とし
て,西村の培地を用いて希釈平板法により計測した菌密度
と抽出した DNAについてリアルタイム PCRにより推定
した菌密度との関係を比較・検討した.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
23.13kb惨
綱"・・.4.36kb惨 叫
2.02kb惨
--------図1 PCR産物の電気泳動結果
1: A Hind m, 2 ~ 5 : Fusarium oxysporum f. sp. asparagi. 6 : Fusarium oxysporum f. sp. raPha据え 7:Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum, 8 & 9 : Fusarium oxysporum
f. sp. sPinaciaι10: Fusariumproliferatum, 11 : Fusarium solani. 12 :ネガティブコントローノレ
lnami, K., Yoshida, C. Hirano, Y., Kawabe, M., Tsushima, S., Takeoka, T.,andArie, T. 2010.Real-timePCR fordifferential determination of the tomato wilt fungus, Fusarium oxysporum f. sp.lycopersici, and its races.f Gen.PlantPathol., 76,116-121.
Mule, G., Susca A., Stea G., and Moretti 2004. Specifc detection of the toxigenic species Fusarium prol併ratumand F. oxysporum from asparagus plants using primers based on calmodulin gene sequences. FEME Microbiol. Letter., 230, 235-240