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aprenDenDo com as interaes Da natureza: microrganismos
simBiontes como fontes De proDutos naturais Bioativos
Raphael Conti Denise O. Guimares Mnica T. Pupo
em geral, os microrganismos, especialmente fungos e bactrias, so
lembrados como causadores de doenas. Esta associao natural, e,
infelizmente, mesmo em uma poca de tantos avanos cientficos e
tecnolgicos, algumas infeces microbianas podem comprometer a vida
de pacientes, principalmente aqueles que apresentam o sistema
imunolgico debilitado. Diversos microrganismos tambm causam doenas
em alimentos, plantas e animais, levando a prejuzos significativos
no agronegcio.
Esses processos patolgicos e de deteriorao frequentemente esto
relacionados a fatores de virulncia microbianos, que podem incluir
substncias qumicas conhecidas como micotoxinas. Porm,
microrganismos tambm so profcuos produtores de substncias qumicas
com grande aplicao na indstria farmacutica, pois so usadas como
frmacos ou como estruturasmodelo para o planejamento e
desenvolvimento de frmacos. Diversos antibiticos, anticancergenos,
imunossupressores e agentes redutores do colesterol sanguneo, entre
outros, tm suas origens em produtos naturais microbianos. Os
microrganismos apresentam, portanto, uma surpreendente capacidade
de produzir substncias qumicas com elevada potncia biolgica
(1).
Todas essas substncias qumicas, com efeitos txicos, teraputicos,
ou mesmo sem efeito biolgico conhecido, so denominadas produtos
naturais. Mas, qual a razo da aprecivel capacidade biossinttica dos
microrganismos? Diferentemente dos metablitos primrios, os produtos
naturais so produzidos por razes fisiolgicas especficas, sociais ou
predatrias, estando, portanto, relacionados com a ecologia dos
organismos produtores (2). Microrganismos esto em todos os lugares:
solo, ar, gua, pedras, na superfcie ou no interior de outros seres
vivos (plantas, animais, humanos), ambientes com condies extremas
de temperatura, pH, oxigenao, entre outros. Esses microscpicos
seres vivos no apresentam defesas fsicas e no se locomovem,
portanto precisaram desenvolver estratgias adaptativas que
permitissem sua sobrevivncia no ambiente.
Em um ecossistema os organismos esto constantemente interagindo
entre si; tais relaes podem ser intraespecficas ou interespecficas.
Em funo dos tipos de dependncia que os organismos mantm entre si, e
se h prejuzo ou benefcio para os organismos envolvidos, essas
relaes ainda so subdivididas em harmnicas e desarmnicas. Nas relaes
harmnicas no existe prejuzo para ne
nhuma das espcies envolvidas e, pelo menos uma delas,
beneficiada; j nas desarmnicas, ocorre prejuzo de uma das espcies e
benefcio da outra. A simbiose uma relao interespecfica, harmnica e
estvel, em geral de longa durao, frequentemente encontrada nas
comunidades terrestres e aquticas, com papel fundamental no
surgimento das principais formas de vida na Terra e na gerao de
diversidade biolgica (3).
Os microrganismos surgiram e se diversificaram previamente aos
macrorganismos multicelulares. Estes organismos maiores e mais
complexos forneceram novos potenciais habitats ricos em nutrientes
e que ainda propiciam proteo para os microrganismos. Assim, muitos
microrganismos se tornaram dependentes de seus hospedeiros para a
sobrevivncia. Por outro lado, os compostos bioativos produzidos
pelos microrganismos podem ser usados como agentes de defesa pelos
hospedeiros. Como resultado, plantas, animais e humanos tm se
envolvido em complexas interaes com microrganismos durante sua
evoluo (3).
muito provvel que os produtos naturais sejam resultados das
interaes entre organismos entre si e destes com o ambiente, e que
desempenhem funes precisas e definidas nessas associaes simbiticas,
representando uma das vantagens adaptativas e evolutivas para os
organismos produtores. Como consequncia dessa funo ecolgica, os
produtos naturais microbianos constituem fontes promissoras para a
bioprospeco de novas molculas com potencial aplicao na medicina
(frmacos), agricultura (agroqumicos) e nos estudos de processos
biolgicos (biologia qumica). De fato, a investigao de
microrganismos que vivem em associaes simbiticas com outros
organismos (ex.: plantas, insetos, organismos marinhos,
nematoides), e mesmo em associao com outros microrganismos, vem
sendo cada vez mais explorada na qumica de produtos naturais como
uma alternativa para a busca de molculas com atividade biolgica.
Alguns exemplos de interaes simbiontes so destacados a seguir.
microrgaNismos eNdofticos De acordo com a sanidade do hospedeiro
vegetal, o material coletado para anlise e a tcnica de isolamento
empregada, os microrganismos em relao simbitica com as plantas so
classificados em endofticos, epifticos, rizosfricos, entre outros
(4). Os endofticos, em geral fungos e bactrias, vivem intra e/ou
extracelularmente pelo menos em um perodo de seu ciclo de vida, sem
causar doenas aparentes ao hospedeiro (5).
A interao entre planta e endofticos dependente de um equilbrio
antagnico, pois microrganismos considerados como endofticos podem
ser fitopatgenos em seu estado latente (4). Verdadeiros endofticos
esto diretamente associados com a sanidade de seu hospedeiro,
proporcionandolhe benefcios atravs da produo, induo ou inibio de
metablitos primrios e/ou secundrios, com funes em controle biolgico
(fitohormnios, herbicidas, antimicrobianos), regulao de estresse
abitico, biorremediadores e vetores gnicos (4;5). Porm, as relaes
bioqumicas entre endfitos e suas plantas hospedeiras ainda no esto
totalmente esclarecidas.
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Acreditase que os metablitos secundrios bioativos produzidos por
esses microrganismos possam estar diretamente associados com a
planta hospedeira atravs da recombinao gnica entre as espcies
durante a fase evolutiva. De fato, alguns dados da literatura tm
mostrado a habilidade dos fungos endofticos de produzir in vitro
metablitos secundrios idnticos aos da planta hospedeira (Figu ra 2)
(5). O mais marcante exemplo foi o isolamento do antitumoral taxol
(1) do fungo endoftico Taxomyces andreanae, associado a Taxus
brevifolia (6). Mais recentemente, os produtos naturais vegetais
anticancergenos vincristina (2), camptotecina (3), podofilotoxina
(4) e hipericina (5), foram tambm isolados de fungos endofticos
associados aos respectivos hospedeiros vegetais (5), evidenciando
uma possvel transferncia gentica de genes biossintticos. Nesse
contexto, fica evidente a importncia da etnobotnica nos estudos de
bioprospeco por microrganismos endofticos. Novos produtos naturais
bioativos tm sido frequentemente descritos na literatura,
demonstrando a relevncia desses microrganismos em programas de
bioprospeco (5).
microrgaNismos e orgaNismos mariNHos Os mares e oceanos juntos
cobrem aproximadamente 70% da superfcie de nosso planeta e servem
de abrigo para 34 dos 36 filos j descritos, alguns exclusivamente
de ambiente marinho, e representados por aproximadamente 300 mil
espcies, distribudas entre a fauna e flora (7, 8), constituindo o
maior reservatrio de biodiversidade da Terra. Os
diversos fatores abiticos presentes nesses ecossistemas, como a
presso, salinidade, temperatura, pH, e biticos, como a competio por
espao, predao, incrustao da superfcie e reproduo, se refletem tanto
na variabilidade gentica, quanto nas rotas metablicas desses seres
vivos para que possam adaptarse ao habitat em que vivem.
Produtos bioativos marinhos so obtidos principalmente de
invertebrados, macroalgas e microrganismos (9). Os microrganimos so
geralmente isolados da gua do mar, de sedimentos, algas, peixes e
principalmente de invertebrados marinhos como esponjas, moluscos,
tunicados, cnidrios e crustceos (10). Alguns produtos naturais
isolados de invertebrados marinhos mostram grande semelhana
estrutural com produtos naturais bacterianos, sugerindo que os
microrganismos esto, no mnimo, envolvidos na sua biossntese ou so,
de fato, a verdadeira fonte desses metablitos (11, 12, 13). Esta
hiptese simbitica tem atrado a ateno dos pesquisadores, afinal a
produo em maior escala de eventuais produtos por fermentao
microbiana mais factvel e de menor impacto ambiental que o
isolamento de produtos naturais dos invertebrados marinhos
(11).
Em alguns casos h evidncias para essa hiptese, mas a
complexidade das associaes entre os organismos marinhos dificulta a
definio da origem biossinttica de muitos produtos naturais.
Esponjas, por exemplo, constituem um microambiente que pode abrigar
uma ampla diversidade microbiana, incluindo fungos, arqueobactrias,
bactrias heterotrficas, algas, cianobactrias,
figura 1. representao do processo de isolamento de endfitos. a)
vegetal em seu habitat natural (lychnophora ericoides); b) razes
separadas do vegetal coletado; c) microrganismos endofticos se
desenvolvendo a partir de fragmentos vegetais em meio de cultura;
d) microrganismos endofticos isolados em culturas puras; e)
microrganismos endofticos preservados em laboratrio
a
c
d e
b
Fotos: Raphael Conti
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criptofceas, dinofl agelados e diatomceas (14;15). Estes
sim-biontes podem estar localizados intra e/ou extracelularmente na
esponja hospedeira. Especula-se que funes como aquisio de
nutrientes, regulao metablica, mecanismos de defesa e fi xao de
nitrognio podem ser atribudas s interaes entre esponjas e
microrganismos (12;16). Novos produtos naturais bioativos
pro-duzidos por microrganismos marinhos tm sido frequentemente
relatados na literatura (17).
QUANDO A FUNO DO PRODUTO NATURAL NA RELAO SIMBI-TICA DESVENDADA
A grande maioria dos trabalhos envolvendo microrganismos
simbiontes, como aqueles associados a plantas e organismos
marinhos, tem sido direcionada seguindo as estratgias experimentais
tradicionais da qumica de produtos naturais, isto , envolvendo o
isolamento da linhagem microbiana de seu habitat, o cultivo em
laboratrio e a triagem dos extratos obtidos em dife-rentes ensaios
biolgicos para o isolamento e identifi cao dos pro-dutos naturais
bioativos. Esta abordagem permite a identifi cao de produtos
naturais ativos, objeto da bioprospeco, porm no fornece respostas
para a difcil questo que envolve as razes pelas quais os produtos
naturais so biossintetizados. Trabalhos mais recentes tm sido
direcionados para se determinar a funo real desses produtos
naturais para o microrganismo produtor. Exemplos elegantes da
determinao da funo ecolgica de produtos natu-rais microbianos
incluem estudos realizados com microrganismos associados a insetos.
Outros trabalhos envolvendo interaes entre nematoides e
microrganismos e entre microrganismos, tambm tm determinado a funo
dos produtos naturais envolvidos na relao simbitica.
MICRORGANISMOS E INSETOS Insetos, um dos fi los de animais mais
abundantes e complexos, abrigam um surpreendente nmero de
microrganismos simbiontes. As formigas se destacam, representando
um exemplo fascinante de interao simbitica com microrganis-mos.
Formigas Apterostigma dentigerum coevoluram em um mutu-alismo de
cerca de 50 milhes de anos com o fungo basidiomiceto Leucoagaricus
sp., que cultivado em jardins como fonte de alimento para as
formigas. Porm, fungos fi lamentosos parasitas do gnero Escovopsis
podem comprometer a viabilidade dos ninhos de formigas, devido ao
efeito txico frente Leucoagaricus sp. Como forma de
proteo, as formigas desenvolveram estruturas especializadas em
seu corpo para carregar actinobactrias, predominantemente dos
gneros Pseudonocardia e Streptomyces, responsveis pela produo de
antimicrobianos que controlam a infeco por Escovopsis sp.,
protegendo a fonte de alimento. Das culturas laboratoriais de
Pseu-donocardia spp. foi obtido o depsipeptdeo cclico
dentigerumicina (6), responsvel pela inibio do fungo parasita
Escovopsis sp. e de outros fungos patognicos, mas sem toxicidade ao
fungo usado para alimentao das formigas (18). Formigas cortadeiras
Acromyrmex echinatior tambm estabelecem relao simbitica com o fungo
Leucoagaricus gongylophorus e com actinobactrias dos gneros
Pseu-donocardia e Streptomyces. Antimicinas A1-A4 (7-10),
valinomicina (11) e actinomicinas D e X2 (12-13) (Figura 3) foram
identifi cadas de espcies Streptomyces em associao com as formigas
cortadeiras e possuem atividade antibitica relacionada com a proteo
das for-migas contra patgenos (19). Outra espcie de formiga
cortadeira, Acromyrmex octospinosus, tambm possui relao simbitica
com fungos do gnero Leucoagaricus, e com actinobactrias do gnero
Streptomyces. Diversas espcies Streptomyces spp. produziram o
anti-bitico macroldeo, candicinina D (14) (Figura 3), que,
juntamente com outros antibiticos produzidos por essas
actinobactrias, deve auxiliar no combate aos fungos patognicos que
possam causar morte de Leucoagaricus sp. (20).
Vespas tambm estabelecem relaes simbinticas com micror-ganismos.
Streptomyces sp., isolado da vespa Sceliphron caementa-rium, produz
o polieno macrocclico escelifolactama (15) (Figura 3), substncia
com atividade antifngica frente a Candida albicans resistente
anfotericina B (21). Outros metablitos, pertencentes a diferentes
classes qumicas, tambm foram identifi cados a partir da simbiose
entre Streptomyces sp. e as espcies de vespas Sceliphron
caementarium e Chalybion californicum (22). Vespas Philanthus spp.
cultivam bactrias simbiontes especfi cas Streptomyces spp. que so
incorporadas no casulo para proteo contra patgenos. A identi-fi cao
de substncias antibiticas produzidas por essas actinobac-trias,
como estreptoclorina (16), piericidina A1 (17), piericidina B1
(18), glucopiericidina A (19) piericidina A5 (20), piericidina C1
(21), 9-demetil-piericidina A1 (22), piericidina B5 (23) e
pie-ricidina IT-143-B (24) (Figura 4), indica que essa relao
favorece a garantia de sobrevivncia das vespas atravs da proteo das
larvas no casulo contra agentes patognicos (23).
Figura 2. Produtos naturais vegetais anticancergenos tambm
isolados de fungos endofticos
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Outro estudo demonstrou que uma espcie de Streptomyces sp.,
simbionte do besouro Dendroctonus frontalis, responsvel pela
pro-duo da micangimicina (25) (Figura 3), que possui ao
antago-nista de crescimento frente ao fungo Ophiostoma minus, o
qual um competidor natural do fungo Entomocorticium sp., este ltimo
por sua vez possui importante funo protetora durante o
desenvolvi-mento de larvas do besouro Dendroctonus frontalis (24,
25).
MICRORGANISMOS E NEMATOIDES Outros metablitos secundrios com
atividade biolgica e possvel aplicao industrial tambm po-dem ser
exemplifi cados a partir de microrganismos encontrados em associao
com nematoides. Bactrias pertencentes ao gnero Pho-torhabdus e
Xenorhabdus vivem em associao complexa de simbiose com nematoides
hospedeiros, parasitam larvas de insetos no solo e ainda enfrentam
competidores microbianos. Atravs da relao de simbiose entre
bactrias Photorhabdus e Xenohabdus com nematoides Heterorhabditis e
Steinernema, respectivamente, possvel a garantia de infeco de uma
ampla variedade de larvas de insetos no ambien-te, e essa
caracterstica utilizada no auxlio como controle biolgico natural na
agricultura. Quando um nematoide invade um inseto, ele regurgita a
bactria, esta por sua vez produz toxinas, proteases e
esterases que auxiliam no combate e morte do inseto. Alm disso,
as bactrias produzem molculas que auxiliaro no desenvolvimento de
jovens nematoides at a fase adulta, contra a resposta imune inata
dos insetos e como antibiticos contra competidores microbianos
naturais. Essas funes biolgicas mltiplas podem ser atribudas aos
compostos produzidos, estilbenos (26) e isocianetos vinlicos, como
a rabduscina (27) (Figura 3) (26).
MICRORGANISMOS E MICRORGANISMOS Outro tipo de associao que tem
levado caracterizao funcional de produtos naturais estudo de
simbiose entre dois microrganismos. A substncia rizoxina (28)
(Figura 3), com propriedades anticncer, produzida pela bactria
Burkholderia rhizoxinica, encontrada em associao simbitica com o
fungo Rhizopus microsporus. Nessa relao ambos benefi ciam da ao fi
topatognica da rizoxina contra o arroz que, durante estgio de
morte, serve como alimento para a bactria e para o fungo. Alm
disso, a bactria ganha proteo dentro das clulas fngicas com condies
favorveis de metabolismo citoslico e o fungo necessita da bactria
para garantir sua esporulao, enquanto garante sua resistncia
toxi-cidade da rizoxina via mutaes genticas em genes da tubulina,
alvo de mecanismo geral para ao dessa toxina (26).
Figura 3. Produtos naturais microbianos envolvidos na simbiose
de actinobactrias com formigas (6-14), vespas (15-24), e besouro
(25), e na simbiose de bactrias com nematoides (26-27) e fungo
(28)
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coNcluses clara a relevncia da incluso de microrganismos em
programas de bioprospeco. Ateno especial deve ser dirigida aos
microrganismos simbiontes, que produzem diversos produtos naturais
ainda desconhecidos e envolvidos em funes ecolgicas, sendo,
portanto, candidatos promissores para a descoberta de molculas com
aplicaes teraputicas e/ou agroqumicas. provvel que muitos dos
microrganismos em comunidades naturais sejam obrigatoriamente
dependentes de outras espcies de organismos (3), o que explicaria a
razo pela qual o cultivo em laboratrio de cerca de 99% dos
microrganismos seja difcil ou impossvel. Neste sentido, a
metagenmica e as tcnicas modernas de biologia molecular despontam
como alternativas para acessar o genoma dessa microbiota e,
consequentemente, o amplo arsenal qumico que ainda permanece
escondido na biodiversidade microbiana. Porm, o sucesso de projetos
na rea depende de trabalho integrado entre qumicos, bilogos e
farmacuticos, com conhecimentos nas reas de qumica orgnica, qumica
analtica, qumica medicinal, farmacologia, microbiologia, biologia
molecular, ecologia, entomologia, botnica, meio ambiente, entre
outros. No Brasil, o nmero de grupos de pesquisa que se dedica ao
estudo de produtos naturais microbianos vem aumentando
significativamente. Com trabalho integrado entre as diversas
expertises podese vislumbrar um futuro promissor que possibilitar a
descrio das funes de produtos naturais microbianos na mediao de
interaes simbinticas e, concomitantemente, a descoberta de novas
molculas teis para o planejamento de frmacos e agroqumicos.
Raphael Conti doutorando em cincias pelo Programa de PsGraduao
em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Cincias Farmacuticas de
Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo (FCFRPUSP), Ribeiro Preto,
SP. Email: [email protected].
Denise O. Guimares doutora em cincias pelo Programa de PsGraduao
em Cincias Farmacuticas FCFRPUSP e professora adjunta do curso de
farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Maca, RJ . Email:
[email protected].
Mnica T. Pupo doutora em cincias pelo Programa de PsGraduao em
Qumica do DQUFSCar, professora associada da FCFRPUSP e bolsista do
CNPq, Ribeiro Preto, SP . Email: [email protected].
Notas e referNcias bibliogrficas
1. Lopes, A. A.; Guimares, D. O.; Pupo, M.T. Cincia Hoje
Vol.286, no.30.
2011.
2. OBrien, J.; Wright, G.D. Curr. Op. Biotechnol. Vol.22,
no.552. 2011.
3. Moran, N.A. Curr. Biol. Vol.16, R866, 2006.
4. Selosse, M.A.; Baudoin, E.; Vandenkoornhuyse, P.C.R. Biol.
Vol.327,
no.639. 2004.
5. Borges, W. S.; Borges, K.B.; Bonato, P. S.; Said, S.; Pupo,
M. T. Curr. Org.
Chem. Vol.13, no.1137. 2009.
6. Stierle, A.; Strobel, G.; Stierle, D. Science, Vol.260,
no.214. 1993.
7. Faulkner, D.J. Nat. Prod. Rep. Vol.18, no.1. 2001.
8. Arrieta, J.M.; ArnaudHaond, S.; Duarte, C.M. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.
S. A. Vol.107, no.18318. 2010.
9. Bhatnagar, I.; Kim, S.K. Mar. Drugs Vol.8, no.2673. 2010.
10. Kelecom, A. An. Acad. Bras. Cienc. Vol.74, no.151. 2002.
11. Piel, J. Curr. Med. Chem. Vol.13, no.39. 2006.
12. Taylor, M. W.; Radax, R.; Steger, D.; Wagner, M. Microbiol.
Mol. Biol. Rev.
Vol.71, no.295. 2007.
13. Thomas, T.R.A.; Kavlekar, D.P.; Lokabharathi, P.A. Mar.
Drugs. Vol.8,
no.1417. 2010.
14. Lee, Y. K.; Lee, J.H.; Lee, H.K. J. Microbiol. Vol.39,
no.254. 2001.
15. Li, Z. Mar. Drugs. Vol.7, no.113. 2009.
16. Webster, N. S.; Taylor, M.W. Environ. Microbiol.
(doi:10.1111/j.14622920.
2011.02460.x.), 2011.
17. Bhatnagar, I.; Kim, S.K., Mar. Drugs Vol.8, no.2673.
2010.
18. Oh, D.C.; Poulsen, M.; Currie, C.R.; Clardy, J. Nat. Chem.
Biol. Vol.5,
no.391. 2009.
19. Schoenian, I.; Spieteller, M.; Ghaste, M.; Wirth, R.; Herz,
H.; Spiteller, D.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. Vol.108, no.1955. 2011.
20. Haeder, S.; Wirth, R.; Herz, H.; Spiteller, D. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A.
Vol.106, no.4742. 2009.
21. Oh, D.C.; Poulsen, M.; Currie, C.R.; Clardy, J. Org. Lett.
Vol.13, no.752.
2011.
22. Poulsen, M.; Oh, D.C.; Clardy, J.; Currie, C.R. PLoS One 6,
e16763. 2011.
23. Kroiss, J.; Kaltenpoth, M.; Schneider, B.; Schwinger, M.G.;
Hertweck,
C.; Maddula, R.K.; Strhm, E.; Svatos, A. Nat. Chem. Biol. Vol.6,
no.261.
2010.
24. Scott, J.; Oh, D.C.; Yuceer, M.C.; Klepzig, K.D.; Clardy, J.
Science
Vol.322, no.63. 2008.
25. Oh, D.C.; Scott, J.J.; Currie, C.R.; Clardy, J. Org. Lett.
Vol.11, no.633.
2009.
26. Crawford, J. M.; Clardy, J. Chem. Commun. Vol.47, no.7559.
2011.
4_NT_SBPC_39_p21a47_01.indd 47 05/07/12 18:25