Fundamentos de la Proteómica Clásica Fundamentos de la Proteómica Clásica MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS Alberto Jorge García Alberto Jorge García Laboratorio de Qu Laboratorio de Qu í í mica de Prote mica de Prote í í nas y Prote nas y Prote ó ó mica mica CBM-SO. CSIC-UAM CBM-SO. CSIC-UAM Curso de doctorado Curso de doctorado “ Estructura y Función de Macromoléculas” Estructura y Función de Macromoléculas” [email protected][email protected]TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
51
Embed
Fundamentos de la Proteómica Clásica MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE
Curso de doctorado “Estructura y Función de Macromoléculas”. TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS. Fundamentos de la Proteómica Clásica MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS. Alberto Jorge García. Laboratorio de Qu í mica de Prote í nas y Prote ó mica - PowerPoint PPT Presentation
Welcome message from author
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Fundamentos de la Proteómica ClásicaFundamentos de la Proteómica Clásica
MAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DEMAPAS DE PÉPTIDOS. IDENTIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOSPROTEÍNAS A PARTIR DE PÉPTIDOS
Alberto Jorge GarcíaAlberto Jorge García
Laboratorio de QuLaboratorio de Quíímica de Protemica de Proteíínas y Protenas y Proteóómica mica CBM-SO. CSIC-UAMCBM-SO. CSIC-UAM
Curso de doctoradoCurso de doctorado““Estructura y Función de Macromoléculas”Estructura y Función de Macromoléculas”
Técnicas Clásicas en Química de ProteínasTécnicas Clásicas en Química de Proteínas
Separación cromatográfica de una mezcla patrón de PTH-aaSeparación cromatográfica de una mezcla patrón de PTH-aass
Técnicas Clásicas en Química de ProteínasTécnicas Clásicas en Química de Proteínas
Vigentes hasta hace poco más de 4-5 añosVigentes hasta hace poco más de 4-5 años
Identificación “textual” de la proteínaIdentificación “textual” de la proteína
Estudios muy costososEstudios muy costosos
PormenorizadosPormenorizados
Muy lentosMuy lentos
Mantenimiento complicadoMantenimiento complicado
Reacciones secundarias no deseables Reacciones secundarias no deseables
Información limitadaInformación limitada
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
EVOLUCIÓN HISTÓRICAEVOLUCIÓN HISTÓRICA
Necesidad de desarrollar una técnica que permitiese aumentar
la velocidad de análisisvelocidad de análisis de las proteínas, cuyo objetivo inicial fue
determinar de una forma rápida cuáles eran las proteínas más
abundantes de una muestra que, generalmente, no son las de
interés
Los métodos de ionizaciónmétodos de ionización empleados entonces en
espectrometría de masas (FAB y PDMS) eran incapaces de
producir iones de proteínas mayores de 20 kDa20 kDa y necesitaban gran
cantidad de muestracantidad de muestra
El desarrollo, a principios de los 90, de técnicas de ionización
suave (MALDI y ESIMALDI y ESI) que permitían el análisis de cantidades
menores (inferiores al pmolinferiores al pmol) y podían trabajar con proteínas de
hasta 100 kDa100 kDa tuvo un gran impacto en el PMF
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
HIPÓTESIS HIPÓTESIS
Si se corta una proteína de forma predecible,
los tamaños de las piezas obtenidas
conformarán la “huella peptídica” de esa
proteína
Si cada proteína presente en una DB puede
ser cortada “in silico” de la misma forma, la
huella peptídica permitirá la identificación de
la proteína
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
PROCEDIMIENTO PROCEDIMIENTO
El “corte” de la proteína se realiza mediante digestión digestión
enzimáticaenzimática utilizando proteasas que rompen la proteína
generando un determinado número de péptidos
La “huella peptídica” de una proteína dependerá de la
proteasa empleada, pero es únicaúnica para cada una de ellas
TripsinaTripsina Corta R-X y K-X excepto si X=P
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)Peptide Mass Fingerprinting (PMF)>sp|P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin precursor (Allergen Bos d 6) (BSA) – Bos taurus (Bovine) MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA
Parámetros de búsqueda: VALORES DE MASASParámetros de búsqueda: VALORES DE MASAS
Modo Lineal Modo Lineal
Modo ReflectorModo Reflector Monoisotópico (mayor resolución) Monoisotópico (mayor resolución)
Average Average
Parámetros de búsqueda: Parámetros de búsqueda: DATA FILE OR QUERYDATA FILE OR QUERY
Data fileData file: Formato ASCII (texto simple). Si se especifica, MASCOT ignora Query
Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS
Para PMF se emplea una lista de masas donde
no se tiene en cuenta la intensidadno se tiene en cuenta la intensidad de los picos ¡!¡!
Principalmente si se trabaja a alta sensibilidadalta sensibilidad donde la intensidad de los péptidos es semejante a la de los contaminantes (matriz, queratinas, autolisis de tripsina)
Lista de 100 masas 60-80 péptidos son ruido o contaminantes
Probabilidad de asignaciones aleatorias
Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS Parámetros de búsqueda: LISTA DE MASAS
Método óptimo: Método óptimo:
Buen rendimiento de digestión
Correcta manipulación de la muestra
Equipo que permita buena resolución y exactitud de masa
Adecuada calibración
Adquisición del espectro idónea
Conocer las masas de los contaminantes
Parámetros de búsqueda: Parámetros de búsqueda: OVERVIEW AND REPORT HITSOVERVIEW AND REPORT HITS
Incluye en los resultadosuna tabla descriptiva
Número máximo de resultados a mostrar
AUTOAUTO: muestra sólo las proteínas con puntuación significativa
Ejemplo real Ejemplo real
Digerido en gel de BSA Digerido en gel de BSA
Start Search ...
RESULTADOS RESULTADOS
Albumin (Bos taurus)
Zona de incertidumbre
RESULTADOS RESULTADOS
IndexIndex
Results List Results List
RESULTADOS RESULTADOS
RESULTADOS RESULTADOS
Overview Table Overview Table gi|418694
gi|30794280
RESULTADOS RESULTADOS
Protein View Protein View
Protein View Protein View
RESULTADOS RESULTADOS
Interpretación de los ResultadosInterpretación de los Resultados
He identificado una proteína pero...
¿Es realmente correcta la identificación?
Análisis cuidadoso de los resultados
Coincidencia del resultado empleando distintos motores de búsqueda
Coincidencia del resultado haciendo la digestión con distintas proteasas
Las masas asignadas a la proteína, ¿son las más abundantes del espectro?
Del total de masas experimentales, ¿cuántas “encajan” con la proteína?
¿Cuánto se aleja nuestro resultado de la zona de incertidumbre?
Interpretación de los ResultadosInterpretación de los Resultados
¿El resultado apoya lo que se conoce previamente?
¿MW esp. es de una prot. degradada?
. . .
Coincidencia de la especie, tejido, compartimento subcelular, etc
Coincidencia del MW
PrecaucionesPrecauciones::
MW obs. > MW esp.
MW obs. < MW esp.
En DB, forma menos procesada
¿La prot. es oligomérica y vemos el oligómero?
Ventajas y Limitaciones del PMF Ventajas y Limitaciones del PMF
VENTAJAS VENTAJAS
LIMITACIONESLIMITACIONES
Análisis rápido y con bajo coste
Alta sensibilidad
Aplicable para un elevado número de muestras
La proteína debe estar en la DB o presentar un alto grado de homología con proteínas presentes para poder ser identificada
No aplicable para proteínas menores de 15 kDa o proteínas con alto número de modificaciones
Dificil identificación de mezclas de proteínas
Aplicaciones Aplicaciones
Identificación de proteínasIdentificación de proteínas
Determinación de la identidad de una proteína Determinación de la identidad de una proteína asociada con una determinada actividad observadaasociada con una determinada actividad observada
Identificación de sustratos de proteínas quinasasIdentificación de sustratos de proteínas quinasas
Determinación de la localización subcelular Determinación de la localización subcelular
Identificación de complejos de interacciónIdentificación de complejos de interacción
Protein IdentificationProtein Identification
General Yates, JR, 3rd, Database searching using mass spectrometry data. Electrophoresis, 19(6) 893-900 (1998). Bleasby, AJ and Wootton, JC, Construction of validated, non-redundant composite protein sequence databases. Protein Eng., 3(3) 153-9 (1990).
Peptide Mass Fingerprint Pappin, DJC, Hojrup, P and Bleasby, AJ, Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. Curr. Biol., 3(6) 327-32 (1993). James, P, Quadroni, M, Carafoli, E and Gonnet, G, Protein identification in DNA databases by peptide mass fingerprinting. Protein Sci, 3(8) 1347-50 (1994).
Sequence Query Mann, M and Wilm, M, Error-tolerant identification of peptides in sequence databases by peptide sequence tags. Anal Chem, 66(24) 4390-9 (1994). Pappin, DJC, Rahman, D, Hansen, HF, Bartlet-Jones, M, Jeffery, W and Bleasby, AJ, Chemistry, mass spectrometry and peptide-mass databases: Evolution of methods for the rapid identification and mapping of cellular proteins. Mass Spectrom. Biol. Sci., 135-50 (1996).