Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

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Fundamentos de Fundamentos de Espectrometría de MasaEspectrometría de Masa

BiológicaBiológica

Matías MöllerMatías Möller

Lab. Fisicoquímica BiológicaLab. Fisicoquímica BiológicaInstituto de Química BiológicaInstituto de Química BiológicaFacultad de CienciasFacultad de CienciasUniversidad de la RepúblicaUniversidad de la República

3 de mayo de 20133 de mayo de 2013

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Bibliografía recomendada:

Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122.

Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

3

1- Generalidades1- Generalidades

2- MALDI-TOF2- MALDI-TOF

3- ESI-Q3- ESI-Q

4- Peptide Mass Fingerprinting y4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MStandem MS

Espectrometría de masa

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1- Generalidades1- Generalidades

Espectrometría de masa

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Técnica que permite laTécnica que permite laseparación y determinación de separación y determinación de

la relación masa/carga de la relación masa/carga de iones gaseososiones gaseosos

Espectrometría de masa

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Espectrometría de masa

Espectrometría Espectrometría ≠ Espectroscopía≠ Espectroscopía(Medición de un rango) (implica absorción o

emisión de energía radiante)

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Espectrometría de masa

Determinación de masa y/o composición:

Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares

Polisacáridos, oligosacáridos

Lípidos Lipidoma

Fragmentos de ácidos nucleicos

Técnica muy sensible:puede analizar g-ng (y menos) de material

Espectrometría de masa de Espectrometría de masa de BiomoléculasBiomoléculas

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Espectrometría de masa

Determinación de masa y/o composición

Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de

péptidos

Modificaciones postraduccionales

Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínasInteracción con compuestos de bajo PM

Plegamiento

Niveles de expresión/modificación posttraduccional

Espectrometría de masa de ProteínasEspectrometría de masa de Proteínas

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Gel 2D de hígado humano

http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

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Espectrometría de masa

cyt C ~ 12000 Da

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Espectrometría de masa

Espectrometría de masa biológicaEspectrometría de masa biológica

Lisozima

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Los Iones son importantes

Espectrometría de masa

[M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-

De la unión de iones especialmente a moléculas quecontienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da)

[M+H]+ o [M-H]-

De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos,fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+)

En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones cambios en m/z:

[M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

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Espectrometría de masa

PMPM(péptido)(péptido) = 1162 Da = 1162 Da

Modo positivo Modo negativo

m = +1 +23 +39 -1

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Espectrómetro de masa

Espectrometría de masa

Entrada:Entrada:Volatilización/Volatilización/

IonizaciónIonización

AltoAltoVacíoVacío

AnalizadorAnalizadorde masasde masas DetectorDetector

MuestraMuestra

MALDIESI

TOFCuadrupolo

Tampa de IonesFTICR

Sector Magnético

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¿Cómo volatilizar una proteína?

Espectrometría de masa

Premio Nobel de Química 2002

Fenn (1988)- ESI: Electrospray IonizationTanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization

Sin Premio:Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI(como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

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Espectrómetros de masa

(configuraciones para grandes biomoléculas)

Espectrometría de masa

MALDI-TOFMALDI-TOF:: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight

ESI-QESI-Q:: ElectroSpray Ionization-Quadrupole

ESI-ITESI-IT:: ElectroSpray Ionization-Ion Trap

FT-MSFT-MS: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

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2- MALDI-TOF2- MALDI-TOF

Espectrometría de masa

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Ionización por MALDI:

Espectrometría de masa

(Matrix assisted Laser desorption/ionization)

Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbeenergía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra:

La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevandola proteína cargada hacia la entrada del analizador.

El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+.

Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador medianteun campo eléctrico

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Matriz

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MALDI

Espectrometría de masa

Desorción/Ionización por LaserAsistida por Matriz

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdoa su “tiempo de vuelo”(t).

t (m/z)1/2

las partículas con menor m/z llegan antes al detector

No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte unaenergía cinética:

Ek = zeEsdonde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek,

½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D

m/z = 2eEs(t/D)2

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

½mv2 = zeEs v = (2zeEs/m)½

t = D/v = (m/2zeEs)½D m/z = 2eEs(t/D)2

Fuente

Sin E, iones a la deriva

Detector

Fig. Separación por TOF

+ + +

E+ -

ss DD

+

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Tubo de vuelo

Detector

4-25 kV

Espectrometría de masa

Carlos Cerveñansky

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Tubo de vuelo

Detector

4-25 kV

Espectrometría de masa

Carlos Cerveñansky

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

29

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z)

0

3222.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

ns

ity

Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]

1672.917

Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)

1672.92

1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0

Mass (m/z)

0

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% I

nte

ns

ity

Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]

1672.918

Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)

Resolución en MALDI-TOF

Carlos Cerveñansky

30

Los Isótopos son importantesLos Isótopos son importantes

Espectrometría de masa

Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos

Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu),se basa en una escala relativa al 12

6C = 12 amu

1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g

Abundancia isotópica:

1212CC 12.000012.0000 98.90 %98.90 %1313CC 13.003413.0034 1.10 %1.10 %

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ElementoElemento MasaMasa %%1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.015

12C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02

79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31

Carlos Cerveñansky

32Carlos Cerveñansky

33

100

5725 5729 5733 5737 5741 5745Mass (m/z)

0

2093

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% In

ten

sity

Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]

2xC13

C12

C13

Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 l de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)

Carlos Cerveñansky

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MALDI-TOF

Espectrometría de masa

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3- ESI-MS3- ESI-MS

Espectrometría de masa

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ESI-Q

Espectrometría de masa

ElectroSpray Ionization - Quadrupole

Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2

(gas secante).

El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarsey las proteínas cargadas viajan hacia el analizador

El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

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Espectrometría de masa

ESI

N2

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ESI

Espectrometría de masa

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ESI-Q

Espectrometría de masa

Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones deun pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados.

Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral

Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven deelectrodos del filtro de masas

Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienenmuy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

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ESI-Q

Espectrometría de masa

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ESI-Q

Espectrometría de masa

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ESI-Q

Espectrometría de masa

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ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

10+9+

11+

13+

12+

14+

10+9+

11+

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ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

10+9+

11+

13+

12+

14+

10+9+

11+

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ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1) n = (x2-1)/(x1-x2)

n = (1084.1-1) / 72.1 = 15M = (1156.2 x 15) -15 = 17328

n+

(n+1)+

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ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

Mioglobina de caballo

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ESI-MS

Espectrometría de masa

Deconvolución del espectro

Bajo PM

Alto PM

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ESI-MS

Espectrometría de masa

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Espectrometría de masa

Comparación ESI-MS y MALDI-TOFComparación ESI-MS y MALDI-TOF

Cyt C

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Comparación

Espectrometría de masa

MALDI-TOFMALDI-TOF ESI-(Q3 o IT)ESI-(Q3 o IT)Cargas/ion Pocas, en general

1Muchas

Rango de m/z 50000 3000

Rango de masas

200.000 70.000

Interacciones no covalentes

No Si

MS/MS limitado, PSD Si, CID

Acoplar LC No Si

Tolerancia a contaminantes

Si No

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