Fumarate hydratase (EC. 4.2.1.2) Amalina Ghaisani Komarudin 10507008 Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung
Feb 24, 2016
Fumarate hydratase (EC. 4.2.1.2)
Amalina Ghaisani Komarudin10507008
Program Studi KimiaInstitut Teknologi Bandung
Agenda Presentasi
• Pendahuluan• Struktur Fumarase• Mekanisme Fumarase• Isolasi Fumarase• Pemurnian Fumarase• Karakterisasi Fumarase• Kinetika Fumarase• Defisiensi Fumarase
Pendahuluan
Siklus Krebs
Reaksi yang Dikatalisis
Reaction: (S)-malate = fumarate + H2O
Tata nama enzim Fumarase
EC 4 : LyaseEC 3.1 : Carbon-Oxygen LyaseEC 3.1.1 :Hydro-LyaseAccepted name: Fumarate Hydratase
Fumarase (EC. 4.2.1.2)
Hydro LyaseCarbon-Oxygen LyaseLyase
Penggolongan Enzim Fumarase
Fumarase
Class I
Fumarase A, Fumarase B
Class II
Fumarase C
•Klasifikasi berdasarkan penyusunan subunit, kebutuhan logam dan ketermostabilan.• Prokaryot memiliki tiga jenis Fumarase : Fumarase A, Fumarase B dan Fumarase C
Struktur Fumarase C dari E.coliTerdiri dari tiga domain, dimana posisi region 1-3
berjauhan
Memiliki dua buah dicarboxylate binding site
yaitu A site dan B site
A site dan B site teridentifikasi memiliki
area yang tidak terisi ligan
Residu pada sisi aktif Fumarase
Mekanisme Enzim Fumarase
Isolasi Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris
E. gracilis•+ buffer 1 (50 mM triethanolamine-HCl pH 7.8
•+ malate 10 mM
•5 mM EDTA
•10 mM 2-mercaptoethanol
Diisolasi dari sel
yang kekurangan vitamin
B-12 mengguna
kan metode Trypsin
digestionDimurnikan dengan
sentrifugasi gradien densitas
Fumaras
e
50 g selCrude extract
• + 70 mL buffer• French pressure cell pada 10.000 lb/in2
•Sentrifugasi 27.000 x g selama 30 menit
•Dipanaskan pada suhu 50o C selama 3,5 menit•Sentrifugasi pada 27.000 x g selama 20 menit
Supernatan
pH dibuat menjadi 7.8 dengan 2 M triethanolamine
Ekstrak enzimFraksinasi dengan
amonium sulfat 40 % dan 60 %
Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. bacillaris
Hasil fraksinasiSupernatan
•Dialisis dengan bufer selama 3
jam
•Sentrifugasi
• Ditambah NADH, NAD+, NADPH, NADP+
Kromatografi afinitasMatrix gel Orange A
Karakterisasi Fumarase
Pemurnian Fumarase Euglena gracilis var. Bacillaris (lanjutan)
Karakterisasi Fumarase
Aktifitas enzim
•+ 2 mL 50 mM potassium phospate•+ 50 mM malat •Diukur serapan pada l 250 nm( 1 Unit enzim = 1 mmol fumarat/menit)
Berat molekul
•SDS-PAGE (gel 10%)•Native-PAGE
Hasil elektroforesis
Parameter kinetika Enzim Fumarase
•Aktivitas maksimum pada pH 8,4 • Km Malat = 0,14 mM• Km Fumarat = 0,031 mM• ATP merupakan inhibitor• Pada 10 mM Tris-acetate (pH 7.3) dan konsentrasi malat= 1 mM, 32,2 mU E. gracilis fumarase terinhibisi 50% oleh 0,35 mM ATP.
Defisiensi Enzim Fumarase• Defisiensi fumarase disebabkan
oleh mutasi gen yang mengkode fumarase
• Kekurangan Fumarase menyebabkan ensefalopati, retardasi mental yang berat, fitur wajah yang tidak biasa, kelainan otak, dan serangan epilepsi karena jumlah abnormal rendah fumarase dalam sel.
• Pola penurunan penyakit ini adalah autosomal resesif
Referensi• Purification, Characterization and Immunological Properties of Fumarase
from Euglena gracilis var. Bacilaris. Hitoshi Shibata, William E. Gardiner, Steven D. Schwartzbach. Journal of Bacteriology, Nov. 1985, P. 762-768
• The role of the allosteric B site in the fumarase reaction. Irwin A. Rose and Todd M. Weaver. www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0307524101
• Structure of Free Fumarase C from Escherichia coli . Todd Weaver. Acta Cryst. (2005). D61. 1395-1401
SEKIAN DAN TERIMA KASIH