Gerichtete Evolution als Methode zur Erzeugung enantioselektiver Cyclohexanonmonooxygenasen (CHMOs) für die Katalyse von Baeyer-Villiger-Reaktionen DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät Chemie der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Diplom-Chemiker Toni Schneider aus Frankenberg/Eder Mülheim an der Ruhr 2004
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us unkatalysierten Reaktion.[25] E = Enzym, vierungsenergie, ≠ zeigt einen Übergangszustand
tisch auf der Energiediffernz im Enzym-
ntioselektiven Reaktion wetteifern beide
entrum im Enzym. Aufgrund der chiralen
s werden diastereomere Enzym-Substrat
hiedliche Werte für die freie Energie (∆G)
en. Die Differenz der Aktivierungsenergie
afür, dass ein Enantiomer schneller reagiert
für die Selektivität einer Reaktion, welche
enantiomeren Substrate A und B abhängt.
Grundlagen der Biokatalyse 23
Diese Werte sind von äußerster Wichtigkeit, da sie die optische Reinheit des Produktes
bestimmen. ∆∆G≠ setzt sich aus einen Enthalpie- (∆∆H≠) und einem Entropieterm (∆∆S≠)
zusammen. Das Aufbrechen und Neuknüpfen von Bindungen während das Substrat ins
Produkt übergeht, bestimmt im wesentlichen die Aktivierungsenthalpie. Der Entropiebeitrag
beinhaltet die Lage der Reaktanden zueinander, Änderungen konformeller Flexibilität
während des induced fit Prozesses und verschiedene Konzentrations- und Solvationseffekte.
In Tab. 1 sind die Enantiomerenüberschüsse den korrespondierenden ∆∆G≠ -Werten
gegenübergestellt.
E
[EA]
[EA]
E + P
E + P
+ A
+ B
∆∆G≠ = ∆∆H≠ − Τ ∆∆S≠
∆∆G≠ = − RΤ ln (νA /νB)
Abb. 18: Energiediagramm für eine enzymkatalysierte enantioselektive Reaktion.[25] E = Enzym; A und B = enantiomere Substrate, P und Q = enantiomere Produkte; [EA] und [EB] = diastereomere Enzym-Substrat-Komplexe; ≠ zeigt einen Übergangszustand an. ∆∆G, ∆∆H und ∆∆S =Differenz der freien Energie, Enthalpie und Entropie; R = Gaskonstante, T = Temperatur, vA und vB = Reaktionsgeschwindigkeiten von A und B.
Tab. 1: Freie Energiewerte, Reaktionsgeschwindigkeiten und optische Reinheiten[25]
∆∆G≠ [kcal/mol] vA / vB e.e. [%]
0.118 1.2 10
0.651 3 50
1.74 19 90
2.17 39 95
3.14 199 99
4.50 1999 99.9
Klassifizierung der Biokatalysatoren 24
4 Klassifizierung der Biokatalysatoren
Bisher wurden über 3200 Enzyme identifiziert[73-76]. Ältere Schätzungen zufolge sollen über
25000 Enzyme existieren[77]. Jedoch sind es sicherlich mehr. Eine Klassifizierung der Enzyme
ist in Tab. 2 dargestellt. Insgesamt gibt es sechs Kategorien, die sich aus den Reaktionstypen
ergeben.
Tab. 2: Einteilung der Enzyme nach Reaktionstypen.[25]
a Die geschätzte kommerzielle Nutzung eines Enzyms für eine bestimmte Transformation eines nichtnatürlichen Substrates rangiert von +++ (äußerst nützlich) bis +/- (geringer Gebrauch). Die Prozentwerte geben den Forschungsstand der jeweiligen Enzymklasse für den Zeitraum von 1987-2003 wieder.
Klassifizierung der Biokatalysatoren 25
4.1 Cofaktoren
Cofaktoren (Tab. 3) sind für eine Vielzahl enzymatisch katalysierter Reaktionen erforderlich.
Ihr Molekulargewicht ist relativ gering im Vergleich zum Enzym (wenige hundert Da, im
Gegensatz zu 15 - 1000000 Da für Enzyme). Sie dienen als Lieferant von Redoxäquivalenten,
wie Wasserstoff und Sauerstoff, Elektronen und Kohlenstoffeinheiten.
Tab. 3: Geläufige Coenzyme in Biotransformationen.[25]
Coenzym Reaktionstyp Recyclinga
NAD+/NADH
NADP+/NADP
Addition oder Entfernung
von Wasserstoff
(+) [++]
(+) [+]
ATPb Phosphorylierung (+) [+]
SAM C1-Alkylierung (+) [+/-]
Acetyl-CoA C2-Alkylierung (+) [+/-]
Flavinc Oxygenierung (-)
Pyridoxalphosphat Transaminierung (-)
Biotin Carboxylierung (-)
Metallporphyrin-Komplexec Peroxidierung (-)
a(+) bzw. (-) steht für Cofaktorregenerierung erforderlich bzw. nicht erforderlich. Die Durchführbarkeit, angezeigt in eckigen Klammern, rangiert von durchführbar [++] bis kompliziert [+/-]. bFür andere Triphosphate wie GTP, CTP und UTP ist die Situation entsprechend. cViele Flavin- und Metalporphyrin-abhängige Mono- oder Dioxygenasen erfordern NAD(P)H als zusätzliches indirektes Reduktionsagens.
Die Cofaktoren wie NAD(P)H und ATP sind zu teuer um sie in stoichiometrischen Mengen
einzusetzen. Werden coenzymabhängige Enzyme verwendet, so setzt man die Cofaktoren in
katalytischen Mengen ein und regeneriert sie in situ. Dies ist für einige Reaktionstypen recht
gut entwickelt, andere bedürfen noch weiterer Entwicklung (sieheTab. 3). Die Tatsache, dass
einige Cofaktoren fest am Enzym gebunden sind, macht eine Cofaktorregenerierung
überflüssig. Viele Enzyme erfordern koordinierende Metalle wie Fe, Ni, Cu, Co, V, Zn, Ca,
Mg oder Mn. Diese sind häufig fest an das Enzym gebunden, so dass sie nicht zugesetzt
werden müssen und wenn doch, dann lässt sich das entsprechende Metallion leicht über das
Medium zusetzen.
Oxygenasen 26
5 Oxygenasen[78-81]
Enzyme, die reduktiv Sauerstoff aktivieren und diesen in Substrate einbauen, werden in
Mono[82-84]- und Dioxygenasen eingeteilt, je nachdem, ob ein oder zwei Atome des
molekularen Sauerstoffs auf den Weg zu den Reaktionsprodukten in das Substrat eingeführt
werden.
5.1 Dioxygenasen
Dioxygenasen lassen sich in zwei Hauptklassen einteilen: in haemabhängige, pflanzliche
Eisen-Schwefel Oxygenasen und in Rieske nicht-hämabhängige Eisen-Schwefel Oxygenasen.
Dioxygenasen katalysieren cis-Dihydroxylierungen, aromatische Ringspaltungen und
Hydroperoxidierungen. In allen Fällen wird zuerst eine hochreaktive instabile
Peroxoverbindungen gebildet. Dieses Intermediat lässt sich durch anschließende Reduktion zu
dem entsprechenden (Di)Hydroxyderivat abfangen (Abb. 19).[85]
Sub-H + O2
DioxygenaseSub-O-O-H Sub-OH
Reduktion
z.B. NaBH4
Sub-H + O2Dioxygenase Reduktion
z.B. NaBH4
O
OSub
OH
OHSub
Hydroperoxid
endo-peroxidSub = Substrat
Abb. 19: Grundgleichung für Dioxygenasen
So werden Alkene durch Lipidoxyxgenasen zum Allylhydroperoxid oxidiert und durch
Reduktion zum Allylalkohol umgesetzt. Die Bildung von Lipidperoxiden in lebenden Zellen
wird unter anderem für Ateriosklerose und Krebs verantwortlich gemacht.[86]
Oxygenasen 27
Die Bildung von endo-Peroxiden ähnelt einer Cycloaddition von Singulett-Sauerstoff an
ungesättigte Systeme und kommt in der Biosynthese von Prostaglandinen und Leukotrienen
vor.
Die Dioxygenase katalysierte Cycloaddition von Sauerstoff gilt als Initialschritt des
Metabolismus von aromatischen Verbindungen in prokaryontischen Zellen.[87, 88] In lebenden
mikrobiellen Zellen wird das entstandene endo-Peroxid (Dioxetan) enzymatisch zum
synthetisch nützlichen cis-Glykol reduziert (
Abb. 20).[89, 90]
+ O2O
O
OH
OH
Dioxygenase Reduktase
H2Dioxetan cis-Glykol
Abb. 20: Dioxygenase katalysierte Reaktion als Schlüsselschritt zum Abbau aromatischer Verbindungen.
5.2 Monooxygenasen
Monooxygenasen bauen aus molekularen Sauerstoff ein Sauerstoffatom in Substrate ein,
während aus dem anderen Sauerstoffatom Wasser gebildet wird. Die Sauerstoffaktivierung
geschieht bei allen Monooxygenasen auf gleicher Art und Weise: Sauerstoff wird reduktiv auf
Kosten eines Donors (NADH oder NADPH), aktiviert. Die Erzeugung der eigentlichen
aktiven sauerstoffübertragenden Spezies wird bei den Monooxygenasen durch Systeme
bewerkstelligt, die zu Zweielektronenübertragungen fähig sind, wobei Übergangsmetalle (Fe,
Cu) oder gebundene organische Cofaktoren (Pteridine[91] und Flavine) beteiligt sind. Die
Bildung von Oxometallverbindungen oder anderen oxidierten Intermediaten wird durch die
sukzessive Übertragung von zwei Elektronen auf O2 möglich. In Abb. 21 ist die
Grundreaktion dargestellt.
Oxygenasen 28
Sub + O2 + H+ + NAD(P)HMonooxygenase
SubO + NAD(P)+ + H2O
Sub = Substrat
Abb. 21: Grundgleichung für Monooxygenasen
Monooxygenasen katalysieren eine Vielzahl oxidativer Reaktionen: Hydroxylierungen von
aliphatischen und aromatischen Substraten, die Epoxidierung von Alkenen,
Heteroatomoxidationen und Baeyer-Villiger Transformationen. Der Oxidationstyp hängt im
Allgemeinen von der prosthetischen Gruppe innerhalb des betreffenden Enzyms ab;
Hydroxylierungen und Epoxidierungen werden durch metallabhängige Monooxygenasen vom
Cytochrom P450 Typ katalysiert[92], wobei Heteroatom- und Baeyer-Villiger Oxidationen
durch flavinabhängige Enzyme katalysiert werden[93]. In Abb. 22 sind einzelne
zeigten, dass die Sequenz von Iwakai et al. die korrekte CHMO Sequenz ist (Abb. 34).[181]
Abb. 34: CHMO-Sequenz nach Iwakai et al.[176]
Der natürliche Stamm NCIMB 9871 produziert eine Lactonhydrolase. Es müssen also
geeignete Inhibitoren zur Reaktion hinzugefügt werden, um die Hydrolyse des Lactons zu
verhindern.[172] Furstoss und Mitarbeiter fanden einen anderen Weg, um das Problem zu
umgehen. Sie verwendeten in Fermentierungen Acinetobacter TD 63, ein Stamm ohne
Hydrolase Gen. Nachteilig ist allerdings die Pathogenität des Stammes,[172, 182] zumal
Expressionssysteme in S. cerevisiae („designer yeast“)[173] und E. coli[111, 183]. für
Biotransformationen mit ganzen Zellen zur Verfügung stehen.
Genexpression 41
7 Genexpression
7.1 Klonierung
In der Botanik und der Mikrobiologie bezeichnet der Begriff des Klonierens die
ungeschlechtliche, genetisch identische Vermehrung eines Organismus. Als Beispiel kann
man Pflanzenklone, die aus der Blattvermehrung einer Pflanze zu ganzen neuen Pflanzen
entstanden sind, anführen.
Molekularbiologisch versteht man unter Klonieren den Einbau eines Gens oder eines
DNA-Abschnittes in einen Träger (Klonierungsvektor) und die nachfolgende Vermehrung
und Bildung des Genproduktes in einer geeigneten Wirtszelle. Als Klonierungsvektoren
dienen Plasmide. Dies sind kleine DNA-Doppelstrang-Ringe, bakteriellen Ursprungs. Sie
können die Zellmembran mit Hilfe physikalischer Methoden passieren. Einmal ins Bakterium
eingeschleust, werden sie wie zelleigene DNA weitervermehrt.
Im einzelnen läuft das Klonieren folgendermaßen ab (Abb. 35):
Ein Plasmid X und die zu klonierende DNA besitzen beide eine Schnittstelle für ein
Restriktionsenzym (oftmals EcoRI). Nach erfolgtem Schnitt haben beide DNA-Fragmente
überstehende 5'-OH-Enden (klebrige Enden). Das DNA-Fragment lagert sich nun über die
klebrigen Enden in das linearisierte Plasmid ein. Eine DNA-Ligase verknüpft Plasmid und
DNA-Fragment kovalent. Die rekombinante DNA ist entstanden. Diese kann nun in eine
geeignete Wirtszelle (ein Bakterium) transformiert werden. Besitzt die klonierte Fremd-DNA
des Plasmids eine Protein codierendes Gen, so kann in der Wirtszelle das dazugehörige
Protein exprimiert werden.
Das Markergen, welches in den häufigsten Fällen eine Antibiotikaresistenz codiert, ist der
Indikator für die Anwesenheit dieses Vektors und damit auch der übertragenden Fremd-DNA
in der Wirtszelle. Denn wird neben dem Fremd-Gen als Markergen die Antibiotikaresistenz
übertragen, so sind alle Wirtszellen, die den Vektor integriert haben, in einer
antibiotikahaltigen Nährlösung noch lebensfähig. Zellen, die den Vektor nicht integriert
haben, sterben hingegen ab. Somit lassen sich Zellen, welche Fremd-DNA aufgenommen
haben, in antibiotikahaltiger Nährlösung selektionieren.
Genexpression 42
Abb. 35: Schema des Klonierens. M = Markergen, steht in den häufigsten Fällen für eine Antibiotikaresistenz.[184]
Genexpression 43
7.2 Expressionssystem der Cyclohexanonmonooxygenase
Das in E. coli BL21(DE3) überexprimierende Plasmid (Abb. 36) für die
Cyclohexanonmonooxygenase wurde mittels molekularbiologischer Methoden konstruiert.
Hierzu wird der Vektor pET 22b(+) verwendet. Im Endkonstrukt, mit der Bezeichnung
pMM04, erfolgt die Proteinexpression durch einem starken T7 Promoter, welcher über die
Zugabe von Isopropylthio-β-D-galctopyranosid (IPTG) zum Kulturmedium gesteuert werden
kann.[183]
pET22-CHMO7021 bp
Amp(r)
lacI
CHMO
T7 promoterlacO
f1 ori
ColE1, pBR322 ori
T7 terminator
Xho I (159)
Nde I (1817)
Abb. 36: pET 22b(+) mit klonierter CHMO.
Gerichtete Evolution von Enzymen 44
8 Gerichtete Evolution von Enzymen
Charles Darwin führte die Komplexität der Lebewesen auf einen Algorithmus von Mutation
und natürlicher Selektion zurück.[185] Die Produkte dieses Evolutionsalgorithmus sind auf
allen Ebenen sichtbar, von der erstaunlichen Vielfalt des Lebens bis zu einzelnen
Proteinmolekülen. In den 1980/90er Jahren wurde der Mechanismus der Evolution in das
Laboratorium übertragen. Wissenschaftler und Ingenieure benutzen ihren eigenen
Algorithmus, um Moleküle auf ihre Zwecke hin umzugestalten. Die gerichtete Evolution
erlaubt es uns, Enzymfunktionen zu erforschen, welche in der natürlichen Umgebung nicht
erforderlich sind, ohne dass eine Kenntnis der molekularen Zusammenhänge erforderlich
wäre. Dieses Design steht im Kontrast zu dem herkömmlichen Design, in welchem Proteine
rational durch Einsatz von Computern und ortsgerichteter Mutagenese umstrukturiert werden.
Im Folgenden wird beschrieben, wie die molekulare Evolution im Reagenzglas gesteuert
werden kann, um maßgeschneiderte Biokatalysatoren zu erhalten.
8.1 Wozu gerichtete Evolution ?
Der Einsatz natürlicher Enzyme für industrielle Anwendungen −vom Katalysator in der
chemischen Synthese bis zu Additiven für die Waschmittelindustrie− scheitert häufig daran,
dass die Enzyme den spezifischen Anforderungen nicht genügend angepasst sind, da
natürliche Enzyme auf spezifisch biologische Funktionen eines lebenden Organismus hin
optimiert wurden. In der Biotechnologie werden Enzyme benötigt, die über einen möglichst
langen Zeitraum hinweg stabil und aktiv sind. Außerdem werden häufig zusätzliche
Anforderungen gestellt, wie beispielsweise Stabilität gegenüber organischen Lösemitteln und
ein breites Substratspektrum.
Es ist nun möglich, Enzyme in rekombinanten Mikroorganismen zu produzieren. Eine
geeignete Modifikation auf DNA-Ebene bewirkt eine neue Aminosäuresequenz und damit
auch neue Enzymeigenschaften. Hinderlich ist die Unkenntnis über den Zusammenhang
zwischen Aminosäuresequenz und Enzymeigenschaften, von der Fähigkeit zur heterologen
Expression in Wirtsorganismen bis hin zur katalytischen Aktivität in nichtnatürlichen
Umgebungen. Zahlreiche Experimente an der Proteinsequenz zeigen, dass es der kumulative
Gerichtete Evolution von Enzymen 45
Effekt vieler kleiner Anpassungen ist, der zu neuen Proteineigenschaften führt. Weiterhin
kann der Verlust von nur wenigen Wasserstoff-Bindungen im Enzym einen missgefalteten
und damit inaktiven Zustand zur Folge haben. Die Aufrechterhaltung der Faltung des Proteins
und die gleichzeitige Evolvierung des katalytischen Zentrums ist so komplex, dass jeder
rationale Ansatz eine genaue Kenntnis der Struktur, des Mechanismus und der Dynamik
erfordert, was zur Zeit nahezu unmöglich ist.
8.2 Evolution im Labor
8.2.1 Erweiterung der natürlichen Diversität
Die Hürden, die das rationale Enzymdesign mit sich bringt, werden von der Evolution
umgangen. Die Kraft der Evolution als ein Algorithmus zum molekularen Design kann
wahrscheinlich am Besten durch das Studium ihre Produkte verstanden werden. Bei der
Betrachtung der Entwicklungsgeschichte der heutigen Proteine haben wir gelernt, dass diese
hochadaptierte Moleküle sind. Eine Vielzahl von α/β fässerartigen Enzymen verdeutlicht
dies.[186] Vertreter dieser Enzyme katalysieren sehr verschiedene Reaktionen. Trotz dieser
großen funktionellen Diversität sind sie aller Wahrscheinlichkeit nach aus einem Urmotif
durch Zufallsmutagenese, Rekombination und natürliche Selektion evolviert wurden.
Andererseits zeichnen sich funktionell homologe Enzyme verschiedener
Ursprungsorganismen häufig durch eine geringe strukturelle Homologie aus und können in
Abhängigkeit ihres Fundortes unterschiedlichste Eigenschaften (Stabilität, Löslichkeit,
pH-Tolereanz usw.) zeigen.[187-189]
Die Evolution ist also ein mächtiges Werkzeug, welches nachweislich die Fähigkeit zur
Änderung der Enzymfunktion und zur Feinabstimmung der Enzymeigenschaften besitzt.
Dieser Algorithmus kann für die Neuentwicklung von Enzymen im Labor eingesetzt werden.
Die Herausforderung besteht nun darin, den Zeitraum für die Evolution auf Monate oder
sogar Wochen schrumpfen zu lassen.
Gerichtete Evolution von Enzymen 46
8.2.2 Auswahl einer Evolutionsstrategie
Die Evolution in der Natur beruht auf der Anpassung an die sich ständig ändernde Umwelt.
Sie arbeitet weder in eine bestimmte Richtung noch hat sie ein bestimmtes Ziel. Der
zugrundeliegende Prozess, die Reproduktion und das „Überleben der Mutante“, geschieht
spontan. Im Gegensatz dazu besitzt die gerichtete Evolution ein konkretes Ziel und der
Schlüsselprozess –Mutation, Rekombination und Screening oder Selektion– werden durch
den Experimentator kontrolliert.
Die Kernschritte der gerichteten Evolution eines Enzyms sind in Abb. 37 gezeigt. Von einem
oder mehreren Elternsequenzen ausgehend lässt sich die genetische Vielfalt für die Evolution
über Mutagenese und oder Rekombination erzeugen. Die veränderten Gene werden in ein
Plasmid kloniert und in einem geeigneten Wirtsorganismus wie beispielsweise Bakterien oder
Hefe exprimiert. Die von den Klonen exprimierten verbesserten Enzyme werden über ein
Hochdurchsatzscreeningsystem, oder durch Selektion, identifiziert. Die für die verbesserten
Enzyme codierenden Gene werden isoliert und einer erneuten Runde der gerichteten
Evolution unterzogen. Nach Durchlaufen von mindestens zwei Zyklen hat man einen
evolutionären Druck hinsichtlich der gewünschten Eigenschaft ausgeübt. Wird dagegen nur
ein Zyklus durchlaufen, erhält man lediglich eine Bibliothek von Zufallsvarianten des
untersuchten Enzyms.
Gerichtete Evolution von Enzymen 47
1
MRek
Abb. 37: Schlüsselschritte e
Für die Ausführung ein
ist es wichtig, die komb
typisches Enzym besteh
hundert), wobei 20 mög
Sequenzraum, also die S
unserer Vorstellungskra
korrespondierenden Fu
sorgfältig geplant werd
gewünschten Funktion u
ist es vielversprechende
als nach der gewünschte
Eigen[192] und Kaufma
geeigneten Proteinen be
für die Evolution im Lab
die der Evolution unterz
dass bei einer bergaufw
. Wildtyp- bzw. Mutanten-Gen.
utation/ ombination
3
6. IsolieW
ines typischen Experiments z
es erfolgreichen Projekte
inatorischen Eigenschafte
t aus einer Kette von N
liche Aminosäuren an jed
umme aller theoretisch m
ft (20N). Eine Erforschung
nktionen im Labor mus
en,[191] denn einem groß
nd wahrscheinlich sogar
r, die Evolution eines ode
n Funktion in zufällig erz
nn[193] betrachten die
stehende Landschaft des
or wird für jede Eigensch
ogen werden, verschiede
ärtsgerichteten Bewegung
. Klonieren der Mutantenin ein Plasmid.
4. Transformation der Plasmide inBakterien, welche die Enzym-
varianten produzieren (eine Zelle, eine Sequenz).
5
rie
u
s
n
e
s
en
a
r
e
E
S
a
n
,
. Evaluieren der Kolonien aufdie gewünschte Eigenschaft.
ung der verbesserten Gene und derholung des Prozesses.
r gerichteten Evolution.[190]
für die gerichtete Evolution von Proteinen
dieses Systems in Betracht zu ziehen. Ein
Aminosäuren (N ist gewöhnlich ein paar
r Position der Kette vorliegen können. Der
öglichen Variationen, liegt somit außerhalb
des gigantischen Sequenzraumes und seine
offensichtlich streng limitiert sein und
Teil des Sequenzraumes wird es an der
n einem gefalteten Protein mangeln. Daher
mehreren existiernden Enzymen zu lenken
ugten Peptidbibliotheken zu schauen.
volution als Kletterübung in einer aus
equenzraumes. Das Proteinlandschaftsbild
ft oder jedes Sortiment von Eigenschaften,
sein. Nach Arnold ist es wahrscheinlicher,
d.h. ausgehend von niedriger Performance,
Gerichtete Evolution von Enzymen 48
in der Proteinlandschaft der Erfolg sich eher mit kleinen Schritten (ein oder zwei
Aminosäureaustausche) einstellt. [191, 194] Die Variationsvielfalt (es gibt 19N Sequenzen, die
nur einen Aminosäureaustausch irgendeiner gegebenen Sequenz mit N-Aminosäuren
besitzen) bietet viele Möglichkeiten verbesserte Mutanten zu finden. Eine effektive
Evolutionsstrategie, veranschaulicht in Abb. 38 und in Abb. 39, basiert auf kleinen Schritten
(vorzugsweise ein Aminosäureaustausch in jeder Generation), die entweder sequentiell oder
durch Rekombination[13, 195] akkumuliert werden, um die gewünschte Enzymfunktion zu
erhalten.[191, 194] Solch ein Ansatz ist kompatibel mit einer geringen Mutationsrate über das
gesamte Gen. Ein alternativer Ansatz ist die Anwendung einer höheren Mutationsrate über
eine schmale Region des Gens.[196] Die Mutagenese über das gesamte Gen erlaubt die
Entdeckung unerwarteter Ergebnisse. Mehr noch, die ortsspezifische Mutation, welche es
vermag neue Kombinationen vom Aminosäureaustausche zu erzielen. Dabei handelt es sich
um Kombinationen die unerreichbar durch einzelne Schritte wären, da die Intermediate nicht
bevorzugt sind. Der Ablauf der evolutionären Erforschung des Proteinsequenzraumes ergibt
sich aus dem Potential des Suchwerkzeuges, der Häufigkeit positiver Mutationen (gewöhnlich
klein) und der Wahl der Ausgangspunkte(s). Ein anderer Ansatz zur Erzeugung von Diversität
für die gerichtete Evolution ist das in vitro Shuffling −auch „family shuffling“ [197] genannt−
homologer Gene. Eine Rekombination von zwei oder mehreren Elterngenen führt zu einer
chimären Genbibliothek für die Evolution auf die gewünschten Merkmale. Die
rekombinanten Sequenzen, entstanden durch unterschiedliche Evolvierung von einem
gemeinsamen Vorfahren, besitzen eine ähnliche Struktur und Funktion. Sie stellen sehr große
Sprünge im Sequenzraum dar und ergeben funktionelle Proteine.[197, 198] Eine in vivo
Rekombination kann auch zu interessanten neuen chimären Enzymen führen[199-202], wobei die
Diversität begrenzt ist.
Gerichtete Evolution von Enzymen 49
e
Abb. 38: Sequentielle Anordnung von 1
Abb. 39: Rekombination verbesserter G
Eine natürl. Funkt. ausübendes Wildtyp-Enzym
Eine neue Funkt. ausübendes Wildtyp-Enzym
n
Anzahl der Mutatione
Relative Performanc
-2 Aminosäureaustausche.[194]
e
Relative Performanc
Rekombination
1-2 Mutationen
n
Anzahl der Mutatione
ene.
Mutagenesemethoden 50
9 Mutagenesemethoden Die von Mullis beschriebene Polymerasekettenreaktion (kurz: PCR für engl. Polymerase
Chain Reaction) bildet die Grundlage aller heute bekammten Mutagenesemethoden. Als ein
Meilenstein in der Zufallsmutagenese kann die von Chen und Goedell entwickelte epPCR
(fehlerhafte Polymerasekettenreaktion) betrachtet werden.[203] In dieser wurden die
Bedingungen einer klassischen PCR empirisch (z.B. MgCl2-Konzentration) variiert, um so die
gewünschte Mutationsrate zu erzielen. Die Methode wurde später noch durch Cadwell und
Joyce verbessert.[204] Diesem Prozess der Erzeugung von Punktmutationen folgte 1994 die
von Stemmer entwickelte Methode des DNA-Shufflings[13, 205] und 1998[206] und 1999[207]
Arnolds Staggered Extension Prozess und Random Priming Recombination Methode. Dies
sind alles rekombinante Prozesse, welche eine hohe Diversität der Gene zu Folge haben.
Seitdem wurden diese und andere Methoden, wie Sättigungsmutagenese[208] oder
Kassettenmutagenese[209-213], auf der Suche nach Enzymvarianten mit verbesserter Stabilität
und Aktivität angewendet.
Im Folgenden wird das Prinzip der Polymerasekettenreaktion erläutert und es wird näher auf
einige wichtige Mutagenesemethoden eingegangen.
9.1 PCR
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion lassen sich Gen-Sequenzen vervielfältigen, ohne
einen lebenden Organismus, wie z.B. E. coli oder Hefe zu benutzen. Die PCR wird in
biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben
verwendet, zum Beispiel für die Erkennung von Erbkrankheiten, für das Erstellen und
Überprüfen genetischer Fingerabdrücke, für das Klonieren von Genen und für
Vaterschaftstests.
9.1.1 Geschichte
Die PCR wurde in den frühen 1980er Jahren vom späteren Nobelpreisträger Mullis
entwickelt. Seine Idee war es, ein Verfahren zu entwickeln, das DNA durch wiederholte
Mutagenesemethoden 51
Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase künstlich
vervielfältigt.
DNA-Poymerase kommt in allen Lebewesen vor, sie verdoppelt die DNA vor der Zellteilung
indem sie an einen einzelnen DNA-Strang bindet und einen dazu komplementären Strang
erzeugt. In Mullis ursprünglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro (in einer
kontrollierten, künstlichen Umgebung) verwendet. Die doppelsträngige DNA wurde durch
erhitzen auf 96 °C in zwei Einzelstränge aufgeteilt. Bei dieser Temperatur wird die DNA
Polymerase inaktiviert und muss daher nach jedem Erhitzen erneuert werden. Mullis
ursprüngliches Verfahren war sehr ineffizient, da es viel Zeit und große Mengen an DNA-
Polymerase erforderte.
Später wurde der PCR-Prozess verbessert, indem die DNA-Polymerase von thermophilen
(Hitze liebenden) Bakterien verwendet wurde, die bei über 110 °C in Geysiren leben. Die
DNA-Polymerase dieser Lebewesen ist themostabil und bleibt daher beim Erhitzen während
der PCR-Zyklen aktiv. Da nicht mehr ständig neue DNA-Polymerase hinzugefügt werden
musste, konnte der Vervielfältigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert
werden.
Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus Thermophilus aquaticus
gewonnen und Taq genannt. Taq-Polymerase erfährt gegenwärtig breite Anwendung. Ein
Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin, dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA
produziert, was zu Mutationen (Fehlern) in der DNA-Sequenz führt. Polymerasen wie Pwo
oder Pfu, die aus Archaea gewonnen werden, haben einen Korrekturmechanismus, der die
Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt.
9.1.2 PCR in der Praxis
Zur Durchführung einer PCR werden mehrere grundlegende Komponenten benötigt.
• Die zu vervielfältigende DNA (die Matritze)
• Zwei Primer, um Anfang und Ende des zu vervielfältigenden Abschnitts festzulegen
• DNA-Polymerase, um den festgelegten Abschnitt zu kopieren
• Nucleotide, die Bausteine für den von der DNA-Polymerase zu synthesierenden
DNA-Strang
Mutagenesemethoden 52
Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einen sogenannten Thermocycler statt. Diese
Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die
Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird.
9.1.3 Primer
Das zu vervielfältigende DNA-Fragment wird durch die Primer bestimmt. Primer sind kurze,
künstlich erzeugte DNA-Stränge, die weniger als 50 Nucleotide lang sind und exakt mit dem
Anfang bzw. dem Ende des zu vervielfältigenden DNA-Teils übereinstimmen. Sie lagern sich
an den Start- und Endpunkten der Ausgangs-DNA an und dienen der DNA-Polymerase für
die Synthese des neuen DNA-Strangs. Wie man die Länge und den Schmelzpunkt des Primers
festlegt, hängt von einer Reihe von Faktoren ab. Der Schmelzpunkt eines Primers ist die
Temperatur, unterhalb der sich der Primer an die Ausgangs-DNA anlagert. Wird dieser
überschritten, löst sich der Primer wieder von der Vorlage. Der Schmelzpunkt steigt mit
zunehmender Primer-Länge. Sollte ein Primer zu kurz sein, kann er sich an verschiedenen
Stellen der DNA anlagern, wodurch man den zu vervielfältigenden Bereich nicht mehr genau
bestimmen kann. Auf der anderen Seite ist die Länge des Primers durch die zum Erreichen
des Schmelzpunkts benötigte Temperatur begrenzt. Ist der Schmelzpunkt zu hoch, d.h. über
80 °C, kann das zu Problemen führen, da DNA-Polymerase bei solch hohen Temperaturen
weniger aktiv ist. Die optimale Länge für den Primer liegt im Allgemeinen zwischen 30 und
40 Nucleotiden bei einem Schmelzpunkt zwischen 60 °C und 75 °C.
9.1.4 Ablauf
Der PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20 bis 40 Zyklen. Jeder Zyklus besteht aus drei
Schritten (Abb. 40). Zunächst wird die doppelsträngige DNA erhitzt, um die Stränge zu
trennen. Dieser Schritt wird Melting (Schmelzen) genannt. Die Wasserstoff-
Brückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen. Im
ersten Zyklus wird die DNA oft für längere Zeit erhitzt um sicherzustellen, dass sich sowohl
die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollständig aufgetrennt haben und nur noch aus
einem Strang bestehen.
Nach der Trennung der Stränge wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an die
einzelnen DNA-Stränge anlagern können. Dieser Schritt heißt Annealing (Anlagern). Die
Mutagenesemethoden 53
Temperatur während dieser Phase hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 5 °C
unter ihrem Schmelzpunkt. Wird die Temperatur falsch gewählt, kann das dazu führen, dass
die Primer sich nicht oder an der falschen Stelle an der Ausgangs-DNA anlagern.
Schließlich füllt die DNA-Polymerase die fehlenden Stränge. Sie beginnt am angelagerten
Primer und folgt dann dem DNA-Strang. Dieser Schritt heißt Elongation (Verlängerung). Die
Temperatur hängt nun von der DNA-Polymerase ab. Die Zeit die dieser Schritt benötigt,
hängt von der DNA-Polymerase und der Länge des DNA-Fragments, das vervielfältigt
werden soll, ab.
Abb. 40: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus. (1) Schmelzen bei 96 °C. (2) Anlagerung. (3) Verlängerung (P=Polymerase). (4) Der erste Zyklus ist beendet. Es folgen weitere Zyklen.
Mutagenesemethoden 54
Die beiden entstandenen DNA-Stränge bilden die Vorlage für den nächsten Durchlauf, die
Menge an DNA verdoppelt sich also mit jedem Zyklus. Der Ablauf einer korrekten PCR lässt
sich über verschiedene Parameter einstellen. Dazu gehören die Temperaturen, die Zeiten, die
Salzkonzentrationen, der pH-Wert, die Zugabe von Additiven, usw.
9.2 Fehlerhafte PCR
Die meistbenutzte Zufallsmutagenese zur Erzeugung von Enzymvarianten mit definierter
Mutationsfrequenz ist die fehlerhafte PCR (engl.: error prone PCR, epPCR). Error prone
PCR-Protokolle sind modifizierte Standard PCR Methoden. Sie wurden entworfen um die
natürliche Fehlerrate zu erhöhen.[203, 214] Gewöhnlich wird die Taq Polymerase[215] benutzt, da
ihre natürliche Fehlerrate recht hoch ist, wobei AT durch GC ausgetauscht wird. In epPCR
Reaktionen werden höhere MgCl2-Konzentrationen an als in Standard PCR Reaktionen
verwendet, wodurch nichtkomplementäre Basenpaare stabilisiert werden.[216, 217]. Auch die
Zugabe von Mangan kann die Fehlerrate erhöhen.[218] Andere Methoden zur Erhöhung der
Fehlerrate benutzen unterschiedliche Konzentrationen an Nucleotiden in der PCR
Reaktion.[219-221] Empirisch kann man die Fehlerrate so einstellen, dass durchschnittlich
entweder eine, zwei, drei (oder mehr) Aminosäuren im Protein ausgetauscht werden. Die
epPCR ist jedoch nicht wirklich randomisiert, da manche Aminosäuren aufgrund der
Entartung des genetischen Codes benachteiligt sind.
9.3 Randomisierte Oligonucleotid-Mutagenese
Hierbei werden zufällige Mutationen, welche auf synthetischen Oligonucleotiden codiert sind,
in eine spezifische Region inkorporiert. Die Anzahl der Mutationen eines einzelnen Enzyms
innerhalb einer Population kann durch Variation der Länge der Zielsequenz und dem Grad
ihrer Randomisierung während der Synthese der Oligonucleotide erfolgen. Die randomisierte
Oligonucleotid-Mutagenese bietet ein mächtiges Werkzeug für das schnelle Erstellen von
großen Mutantenbibliotheken.[222] Diese Bibliotheken können dazu benutzt werden, um
Sequenzeinschränkungen innerhalb eines Proteins zu erforschen.
Mutagenesemethoden 55
9.4 Ortsgerichtete Mutagenese
Der Austausch, die Insertion oder Deletion von einem oder mehreren definierten Nucleotiden
eines gegebenen Gens wird als ortsgerichtete Mutagenese bezeichnet.[223] Hierbei wird ein
kurzer Oligonucleotid-Primer an ein Einzelstrang DNA-Templat, welcher das zu
mutagenisierende Gen enthält, hybridisiert. Das Oligonucleotid ist gänzlich komplementär zu
der Region des Templats ausgenommen der oder die Positionen, welche die Mutation(en)
tragen.
9.5 Sättigungsmutagenese
Mit Sättigungsmutagenese lässt sich eine Bibliothek von Mutanten, die alle möglichen
Mutationen an einer oder mehreren vorbestimmten Stellen besitzt, herstellen. Diese Methode
wird in gerichteten Evolutionsexperimenten verwendet, um die Anzahl der
Aminosäureaustausche über randomisierte Mutagenese zu erhöhen.[208] In Kombination mit
Hochdurchsatz-Screening Methoden wurde Sättigungsmutagenese erfolgreich zur
Verbesserung von enzymatischen Eigenschaften, wie der Thermostabilität[208, 224, 225], der
Substratspezifität[226] und der Enantioselektivität[227], eingesetzt.
9.6 Kassettenmutagenese
Hierbei handelt es sich um die gezielte Randomisierung eines bestimmten Genabschnitts
(Kassette). Durch Restriktionsenzyme wird der gewählte Genabschnitt aus der Templat-DNA
herausgeschnitten und durch verschiedene Verfahren randomisiert. Der mutierte Genabschnitt
wird wieder in die Templat-DNA eingefügt und durch PCR amplifiziert.[209-213] Eine
verwandte kombinatorische multiple Kassettenmutagenese (CMCM) wurde von REETZ
variiert und in der gerichteten Evolution eines enantioselektiven Enzyms eingesetzt.[228, 229]
9.7 DNA-Shuffling
Das DNA-Shuffling, eine Methode zur in vitro Rekombination von homologen Genen, wurde
von STEMMER eingeführt.[197] Die zu rekombinierenden Gene werden durch DNaseI zufällig
Mutagenesemethoden 56
fragmentiert. Fragmente von gewünschter Größe werden an einem Agarosegel gereinigt.
Beim Durchlauf von mehreren Denaturierungs-, Anlagerungs-, und Erweiterungszyklen
mittels einer Polymerase werden die Fragmente wieder zusammengebaut (siehe Abb. 41).
Eine Rekombination tritt auf, wenn Fragmente von unterschiedlichen Eltern an einer Region
mit hoher Sequenzidentität anlagern. Nach dieser Zusammenlagerung wird eine PCR
Amplifikation dafür benutzt, um ganze chimere Gene zu erzeugen. Über DNA-Shuffling
wurden chimäre Enzyme mit verbesserter Aktivität und Stabilität gefunden.[230-233]
E e
S
S 2
S 1
Abb. 41: DNA-Shuffling.[190]
9.8 Staggered Extension Process (StEP)
Der StEP[206] ist im Vergleich zu dem DNA-Shuffling, welch
und Amplifikationsschritte bedarf, einfacher und weniger arb
Über-Kreuz-Hybridisierung von wachsenden Genfragmenten w
Im Einzelnen handelt es sich um eine Denaturierung, das A
Spezies 4
lterliche Gen
pezies 3
pezies
pezies
D g
es
eit
ä
n
NA-Shufflin
C e
Fragmenta
sintensiv. E
hrend der P
hybridisieren
himäre Gen
tions-, Isolations-
r beruht auf einer
rimer Elongation.
der Primer und
Mutagenesemethoden 57
einem Elongationssschritt, dessen kurze Dauer und die Wahl einer suboptimalen Temperatur
die Primerextension begrenzt. Die nur teilweise verlängerten Primer werden über mehrere
Zyklen hinweg zufällig an unterschiedliche Eltersequenzen wieder angelagert. Das Schema ist
in Abb. 42 dargestellt. Die vollständigen rekombinanten Produkte können, in Abhängigkeit
von der in dem StEP erhaltenen Produktausbeute, mit einer zweiten PCR amplifiziert werden.
Für die StEP-Methode wird jedoch eine Sequenzhomologie von mindestens 80 %
vorausgesetzt.[187-189]. Deshalb hat sie eine begrenzte Anwendung.
g
Abb. 42: StEP-Rekombination.
Annealin
n
Elongatio Denaturierung gefolgt von dem zufälligen Anlegen
der Primer und Elongation
n
Mehrere Zycle
Mutagenesemethoden 58
Es existieren noch eine Vielzahl weiterer Mutagenesemethoden, wie ITCHY[234, 235], Binary
Patterning[236, 237], das von REETZ entwickelte ADO-Shuffling[238] und viele mehr. Eine gute
Übersicht über die verschidenen Mutagenesemethoden bietet das Buch „Directed Evolution
Library Creation“ von Francis H. Arnold und George Georgiou.[239]
9.9 Anwendung der gerichteten Evolution von funktionellen
Enzymen
Die oben beschriebenen Methoden wurden insbesondere von ARNOLD[12] und STEMMER[13]
angewandt, um Enzyme mit höherer thermischer Stabilität und/oder Aktivität in organischen
Lösemitteln zu erzeugen. Im Arbeitskreis REETZ wurden die ersten Beispiele für gerichtete
Evolution von Enzymen beschrieben.[240] Es handelt sich um Lipasen.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 59
10 Hodurchsatzscreening-Systeme auf
Enantioselektivität
Die gerichtete Evolution zur Generierung enantioselektiver Enzyme für die organische
Synthese bringt das Problem mit sich, dass tausende von Biokatalysatoren auf
Enantioselektivität bewertet werden müssen. Die Bestimmung der ee-Werte wird traditionell
durch chirale Gaschromatographie oder chirale HPLC durchgeführt, wobei gewöhnlich nur
wenige Proben pro Tag gemessen werden können. Bis 1995 standen praktisch keine
Hochdurchsatz-Screeningverfahren zur Verfügung.[29] Seitdem wurden verschiedene
Methoden, wie Systeme die auf UV/VIS[29, 241-244], IR-Thermographie[245], MS[246, 247] und
Kapillarelektrophorese[248] beruhen, entwickelt.
10.1 UV/VIS-basierende Assays
Das erste in der gerichteten Evolution von enantioselektiven Enzymen verwendete
Hochdurchsatzscreening basierte auf UV/VIS Spektroskopie.[29] Dieses System ist beschränkt
auf die hydrolytisch kinetische Racematspaltung von chiralen p-Nitrophenolestern durch
Lipasen oder Esterasen. Die p-Nitrophenolester (S)-1/(R)-1 wurden als Modellsubstrate
benutzt, um eine Bibliothek, bestehend aus ca. 1000 Varinaten einer Lipase aus
Pseudomonas aeruginosa, nach vielversprechenden Biokatalysatoren für die hydrolytisch
kinetische Racematspaltung von chiralen Estern zu evaluieren. Die Hydrolyse in gepufferten
Medium liefert das p-Nitrophenolat 3 welches eine starke Absorption bei 405 nm zeigt. Bei
Durchführung der Reaktionen in Mikrotiterplatten kann mit einem photometrischen
Plattenlesegerät die Absorption als Funktion der Zeit gemessen werden. Da die Racemate nur
eine Informationen über den Gesamtumsatz liefern, wurden die (R)- und (S)-Substrate einzeln
prepariert und auf einer 96er-Well Mikrotiterplatte paarweise getrennt betrachtet. Wenn nun
der Verlauf der Absorptionszeitkurve einer Mutante in beträchtlicher Weise von der
Absorptionszeitkurve des Wildtyp abweicht, so zeigt dies einen Hit an.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 60
O NO2
O
R
CH3
ROH
CH3
O
+R
OH
CH3
O
-O NO2+
H2O
Lipase-Varianten
rac-1 (R=n-C8H17) (S)-2 (R)-2
3
(A)
Abzeit(C)
Na
sei
Su
An
ein
Qu
Än
(B)
(C)
b. 43: (A) zeigt die Hydrolysegleichung von rac-2-Methyldecansäure-p-nitrophenylester. (B) gibt den lichen Verlauf der lipasekatalysierten Hydrolyse der Ester (R)-1 und (S)- 1 für die Wildtyp-Lipase und für eine verbesserte Mutante aus der ersten Generation wieder.
chteilig an dem Assay ist, dass ein Chromophor (p-Nitrophenol) im Substrat vorhanden
n muss und eine eventuelle Substratkonkurrenz nicht erfasst wird, da die (S)- und (R)-
bstrate paarweise getrennt untersucht werden müssen.
dere UV/VIS-basierende Ansätze zum Screening enantioselektiver Hydrolasen verwenden
en kolorimetrischen Assay.[242, 249] Diese sind allgemeingültiger als der ursprüngliche
ick-E-Test.[241] Sie beruhen darauf, dass es bei der Hydrolyse eines Esters zu einer
derung des Säuregehaltes kommt. Durch Verwendung eines Puffers (N,N-bis(2-
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 61
hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure) und eines pH-Indikators (p-Nitrophenol) mit
gleichem pKa-Wert wurde eine lineare Korrelation zwischen der Menge der freigesetzten
Säure und dem Grad der Protonierung festgestellt (Kazlauskas-Test).[242] Der Vorteil dieses
Systems beruht darauf, dass kein Ester mit chromophorer Gruppe, wie der p-Nitrophenolester,
erforderlich ist. Es können also auch „normale Substrate“ so wie der Methylester 4 (Abb. 44)
Der Kazlauskastest auf enantioselektive Hydrolasen ist zwar billig und praktisch, aber
wirkliche E-Werte in einer kinetischen Racematspaltung chiraler Ester liefert auch dieser Test
nicht, da (R-) und (S-) Substrate getrennt untersucht werden.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 62
10.2 Enzymgekoppelte-Assays
Es wurden verschiedene ee-Assays entwickelt, die von einem Enzymgekoppelten Prozess
Gebrauch machen. Wenn ein Produkt einer enzymatischen Reaktion durch ein anderes Enzym
zu einem nachfolgenden Produkt, welches zu einem spektroskopisches Signal führt,
umgesetzt wird, so ist ein Enzym gekoppeltes Assay möglich. Dies wurde als erstes im
Hochdurchsatz mit Fluoreszensspektroskopie als Detektionsmethode gezeigt.[250] Chirale
Ester, welche einen fluorogenen Rest besitzen, unterliegen der enzymkatalysierten Hydrolyse.
Das zuerst gebildete Produkt (Alkohol) wird enzymatisch unter der Bildung eines über
Fluoreszens detektierbaren Folgeproduktes abgebaut. Weitere Enzym gekoppelte Prozesse die
ohne einen fluorogenen Rest auskommen wurden von anderen Gruppen beschrieben.[251, 252]
10.2.1 Enzym-Immuno-Assay
Ein anderes UV/VIS-basierendes Hochdurchsatz-Screening System auf Enantioselektivität
verwendet einen Enzym-Immuno Assay[253], einer Technologie die routinemäßig in der
Biologie und Medizin angewendet wird. Dieser Assay wurde für die enantioselektive
Ruthenium katalysierte Hydrogenierung von Benzoylameisensäure zu Mandelsäure
entwickelt (siehe Abb. 45). Der Gebrauch eines Antikörpers, der an beide Enantiomere
bindet, ermöglicht es die Konzentration der Reaktionsprodukte zu bestimmen. Durch
Verwendung eines (S)-spezifischen Antikörpers lässt sich dann die Enantioselektivität
bestimmen. Über 1000 ee Bestimmungen pro Tag mit einer Genauigkeit von +/- 9 % sind
somit möglich.
OCOOH
Ph
HOCOOH
Ph
HOCOOH
PhEnantioselektiver
Katalysator
Ausbeute
ee
Abb. 45: Enzym-Immunoassay als Hochdurchsatzscreening für enantioselektive Katalysatoren. Der Antikörper, gekennzeichet mit grauer Farbe, erkennt beide Enantiomere, wobei der Antikörper, gekennzeichnet mit schwarzer Farbe, nur das (S)-Enantiomer erkennt.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 63
10.3 Fluoreszenz-basierende Assays
Fluoreszenzbasierende Assays sind gewöhnlich sehr sensitiv.[250] Wenn die fluoreszierende
Gruppe allerdings mit dem Substrat verknüpft ist und bei der enzymkatalysierten
enantioselektiven Transformation miteingeht, so führt der Prozess der gerichteten Evolution
zur Bildung eines Enzyms, welches spezifisch für das Substrat mit fluoreszierender Gruppe
und nicht für das Substrat allein ist. Mit der Verwendung eines molekularen Sensors, der bei
der Bildung eines bestimmten Produktes fluoresziert[254] lässt sich ein Enzym, ohne die
Verwendung eines Fluorophors, auf das gewünschte Substrat evolvieren.
In 2001 entwickelte SHAIR einen fluoreszensbasierten ee-Assay, welcher mit
Fluoreszenzmarkern in DNA-Mikroarrays arbeitet.[255] Als Modellsubstrate wurden chirale
Aminosäuren benutzt. Diese wurden zuerst an der Aminfunktion geschützt (N-Boc). Danach
wurden die Proben kovalent über Aminfunktionen an die feste Phase gekuppelt. In einem
zweiten Schritt wurden die nicht gekuppelten Aminfunktionen der festen Phase extensiv
acyliert. Im dritten Schritt erfolgte die Entschützung der Aminosäuren. Und schließlich, im
vierten Schritt, wurden in einer kinetischen Racematspaltung zwei pseudoenantiomere
Fluoreszenzmarker an die freien Aminogruppen gekuppelt. Das Gelingen der ee-Bestimmung
beruht auf eine im ausreichendem Maße vorliegende kinetische Racematspaltung während der
Amidbildung.[256] Die ee-Werte sind durch Messung des Verhältnisses der
Fluoreszenzintensitäten zugänglich. Es sind über 8000 ee Bestimmungen pro Tag möglich
und die Genauigkeit dieses Verfahrens liegt bei +/- 10 % des wirklichen Wertes.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 64
Schritt 1 Schritt 2
Schritt 3 Schritt 4
r
Abb. 46: Reaktionsmikroarray zur Hochdurchsatzbestimmung
Fluoreszenzmarke
der Enantioselektivität.[255]
chiraleProbe
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 65
10.4 MS-basierende Assays
Die (R)- und (S)-Enantiomere eines gegebenen chiralen Produktes haben identische
Massenspektren und können so nicht massenspektrometrisch unterschieden werden.
Unterschiedliche Massenspektren für die beiden Enantiomere lassen sich jedoch durch
Verwendung eines chiralen Derivatisierungsreagenzes erzeugen.[257] Voraussetzung dafür ist,
dass die kinetische Racematspaltung beim Schritt der Derivatisierung in ausreichendem Maße
abläuft (Prinzip von Horeau[256]). Die relativen Mengen der Diastereomere können durch
Integration der zugehörigen Signale bestimmt werden. Die Genauigkeit einer ee-Bestimmung
liegt bei +/- 10 %.[257] Anwendungen im Hochdurchsatz wurden noch nicht gezeigt, aber
dieses sollte prinzipiell möglich sein.
Ein anderer auf MS basierender Ansatz kommt ohne eine Derivatisierungsreaktion aus und
wurde erfolgreich von REETZ in der gerichteten Evolution von Enzymen eingesetzt.[246, 247]
Dieser verwendet deuteriummarkierte Pseudoenantiomere oder Pseudomesoverbindungen.
Diese Methode kann für kinetische Racematspaltungen oder Desymmetrisierungsreaktionen
prochiraler enantiotope Gruppen tragender Verbindungen, verwendet werden (siehe Abb. 47).
Da die Produkte der Transformationen stets Pseudoenantiomere sind, welche sich in der
Konfiguration als auch in der Masse voneinander unterscheiden, ergibt eine Integration der
MS-Signale den ee- oder den E-Wert. Die Ungenauigkeit der ee-Werte liegt bei +/- 2 %. Die
ursprüngliche Form des Systems wurde automatisiert und so ist man in der Lage bis zu
1000 ee Bestimmungen pro Tag durchzuführen.[246] Ein MS-Instrument, welches eine 8-Kanal
Multiplex Elektronensprayquelle verwendet, erlaubt sogar 8000 ee Bestimmungen pro
Tag.[247]
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 66
R1 R2 R1 R2
FG FG*
R1 R2
FG'
R1 R2
FG'FG'' FG''*+ +(A)
R1
+ +
R2 R1 R2*
FG FG
R1 R2
FG'
R1 R2*
FG'FG''+ + +(B)
FG'' FG''*+ +(C)
FG FG' FG'FG'' FG''*+ + +(D)
FGFG
R R
FG*FG'
R R
FG'FG
R R
+
FG FG* FG' FG* FG FG'
Abb. 47: Asymmetrische Transformation von pseudoenantiomeren (A) und (B), pseudomeso (C) und pseudoprochiralen (D) Verbindungen. FG steht für die funktionelle Gruppe, FG' bzw. FG'' stehen für die durch Umsetzung gebildeten funktionellen Gruppen. Ein Stern (*) symbolisiert die Isotopenmarkierung.
10.5 NMR-basierende Assays
NMR Messungen sind gewöhnlich zeitaufwendig. Die Entwicklung von Durchflusszellen
erlaubte jedoch den Einsatz der Methode in der kombinatorischer Chemie.[258-261] Die
technologischen Fortschritte wurden auf zwei verschiedene NMR basierende Hochdurchsatz
ee-Assays angewandt.[262] Der erste Ansatz benutzt ein chirales Reagenz oder ein NMR-
Shift-Reagenz zur klassischen Derivatisierung. Eine Parallelisierung ermöglicht die
Bestimmung von 1400 ee-Werten pro Tag. Die Genauigkeit liegt bei +/- 5 %. Der zweite
Ansatz ist vom Prinzip her mit dem MS-System verwandt, welches weiter oben beschrieben
wurde. Chirale-, oder Mesosubstrate werden isotopenmarkiert. Die resultierenden
Pseudoenantiomere oder pseudo-meso Verbindungen können dann gescreent werden. Die
Anwendung ist beschränkt auf kinetische Racematspaltungen und Desymmetrisierungen von
prochiralen Verbindungen, welche enantiotope Gruppen tragen (siehe Abb. 47). Der Assay
bedient sich der 1H-NMR Spektroskopie. Eine 13C-Markierung wird verwendet um zwischen
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 67
den (R)- und (S)-Formen der chiralen Verbindung zu unterscheiden. Es kann praktisch jedes
Kohlenstoffatom in der zu interessierenden Verbindung markiert werden, wobei
Methylgruppen, in welchen es nicht zu einer Aufspaltung von 1H-Signalen durch 1H, 1H
Kopplungen kommt, bevorzugt sind. Die entscheidenden Signale sind ein Singulett, welches
aus der CH3-Gruppe des einen Enantiomers resultiert, und ein Dublett, welches aus der 13CH3-Gruppe des anderen Enantiomers resultiert. Es können bis zu 1400 Proben mit einer
Genauigkeit der ee-Bestimmung von +/- 2 %. gemessen werden. Die Verwendung einer
vierfach parallelen Durchflusszelle kann den Probendurchsatz um den Faktor vier
erhöhen.[263]
10.6 Kapillarelektrophorese-basierendes Assay
In der analytischen Chemie wird zur Bestimmung der Enantiomerenreinheit manchmal
Kapillarelektrophorese (CE) eingesetzt. Der Elektrolyt enthält Cyclodextrinderivate als
chirales Selektionsmittel.[264-266] Die ursprüngliche Form der CE erlaubt aber nur ein paar
Dutzend ee-Bestimmungen pro Tag. Mit dem Human-Genomprojekt wuchsen die
analytischen Anforderungen, was in den letzten Jahren die Kapillarelektorphorese
revolutionierte. Die Kapillar-Array-Elektrophorese (CAE) arbeitet mit einer hohen Anzahl an
parallelen Kapillaren und wurde der ee-Bestimmung im Superhochdurchsatz angepasst.[248]
Mittels CAE sind bis zu 20.000 ee Bestimmungen pro Tag möglich. Eine Derivatisierung des
Produktes mit einem fluoreszenzaktiven Reagenz ermöglicht die Verfolgung der Reaktion.
Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion ergibt sich eine Präzision von
+/- 3 %.
10.7 Circulardichroismus-basierendes Assay
Eine Alternative zur chiralen GC oder HPLC, ist die Abtrennung der Edukte von den
enantiomeren Produkten mit einer achiralen Säule und die anschließende Bestimmung des
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 68
Enantiomerenüberschusses über Circulardichroismus (CD). Damit die Methode angewandt
werden kann, muss der g-Faktor unabhängig von der Konzentration und linear hinsichtlich
des Enantiomerenüberschusses sein. Diese Bedingungen können nicht eingehalten werden,
wenn die chiralen Verbindungen Dimere oder Aggregate bilden, denn solche enantiomeren
oder diastereomeren Spezies würden ihre eigenen CD-Effekte zeigen. REETZ zeigte 2000 in
einem Evolutionsprojekt zur gerichteten Evolution, dass mit CD unter Benutzung eines
Durchflussinstrumentes und einem Autosampler bis zu 9000 ee Bestimmungen pro Tag
möglich sind.[267]
10.8 IR-Thermographie-basierendes Assay
Auf IR-Thermographie basierende Assays für enantioselektive Katalysatoren wurden von
REETZ entwickelt.[245, 268] Die Identifizierung von enantioselektiven Katalysatoren läuft über
die Verfolgung der Wärmetönung einer katalytischen enantioselektiven Reaktion. Eine
zeitaufgelöste Detektion einer enzymkatalytischen enantioselektiven Racematspaltung wurde
mit der Lipase aus Candida antarctica durchgeführt.[269] Als Substrate wurden separat (S)-
und (R)-1-Phenylethanol und Vinylacetat als Acylierungsmittel benutzt. Es konnte gezeigt
werden, dass die Reaktion hoch (R)-selektiv ist. Dies lässt sich daran erkennen, dass die Wells
der Mikrotiterplatte, welche das (R)-Enantiomer enthalten einen Hot Spot zeigen, was mit den
Literaturdaten, die ein ee-Wert von über 99 % zugunsten des (R)-Enantiomers bei einem
Umsatz von 50 % voraussagen, übereinstimmt. Eine Quantifizierung steht jedoch noch aus.
Hochdurchsatzscreeningsysteme auf Enantioselektivität 69
Ph
OHOAc
Lipase Ph
OAc
Ph
OHOAc
Lipase Ph
OAc
(S) (S)
(R) (R)
Abb. 48: Lipasekatalysierte Umsetzung von (S)- bzw. (R)-1-Phenylethanol.
Abb. 49: Zeitaufgelöste IR-Thermographieaufnahmen der lipasekatalysierten Veresterung von 1-Phenylethanol vor Beginn der Reaktion (a), nach 0.5 min (b) und nach 3.5 min Das Kontrollexperiment ohne Enzym ist jeweils in der letzten Reihe gezeigt.
Aufgabenstellung 70
11 Aufgabenstellung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Enzym Cyclohexanonmonooxygenase (CHMO)
unter Anwendung des Prinzips der gerichteten Evolution in einen effizienten Katalysator für
die Baeyer-Villiger-Oxidation von Substraten umzuwandeln, die mit schlechten
Enantioselektivitäten reagieren. Speziell sollten 4-Hydroxy- und 4-Methoxycyclohexanon als
Substrate dienen. CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus rekombinant in E. coli sollte dabei
als Biokatalysator dienen. Bei der enzymatischen Umwandlung von 4-Hydroxycyclohexanon
1 zu [1]# folgt eine spontane Umlagerung zu 2 (Abb. 50). Der Wildtyp-CHMO führt zu einem
ee von nur 9 % zugunsten des (R)-Enantiomers.[270]
Abb. 60: Ausschnitt aus einer typischen Excel-Tabelle. Spalte eins und zwei geben die Nummer bzw. Position des jeweiligen Wells an. Spalten drei bis fünf geben die Retentionszeiten und Spalten sechs bis sieben die Integrationsflächen des Substrates und der Produktenantiomere an. In den letzten beiden Spalten ist der Enantiomerenüberschuss und der Umsatz aufgeführt.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 94
O
OH
4-Hydroxy-cyclohexanon
R)- und (S)-Lacton
Abb. 61: Gif-Bild einer GC-Analyse. Die Signale bei einer Re4.302 min sind die beiden Enantiomeren. Bei 1.478 min liegt da
13.5.3 Kapillartrennsäule zur Auftrenn
Lactonenantiomeren
Die Auftrennung der Enantiomeren erfolgte an einer chiralen K
Firma BGB Analytik AG. [276] Ihr Einsatzbereich erstreckt sic
und Terpene. Die Parameter der Kapillartrennsäule sind:
BGB-178
20 % 2,3-Diethyl-6-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin gel
85 % methylpolysiloxan)
• Innendurchmesser: 0.25 mm
• Filmdicke: 0.25 µm
• Länge: 15 m
(
O
O
OH
tentionszeit von 3.975 min unds Substrat.
ung der 5-Ring-
apillartrennsäule BGB-178 der
h auf Lactone, Alkohole, Ester
öst in BGB-15 (15 % Phenyl-,
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 95
Die eigentliche Länge der BGB-178 beträgt 30 m. Es wurde eine Halbierung der Länge der
Kapillartrennsäule vorgenommen, um die Retentionszeiten zu verkürzen (von 8 min auf unter
5 min) und damit einen höheren Durchsatz an Proben zu erzielen.
13.5.3.1 Faktorbestimmung
Das Produkt einer Baeyer-Villiger-Reaktion besitzt logischerweise einen höheren
Sauerstoffanteil als das Edukt. Dies hat zur Folge, dass bei Verwendung eines FID-Detektors
das Produkt im geringeren Ausmaß detektiert wird als das Edukt. Um den genauen Umsatz zu
erhalten, musste eine Faktorbestimmung durchfgeführt werden (erfolgt durch die analytische
Abteilung für Gaschromatographie des Max-Planck-Instituts). Zur Bestimmung des Faktors
wurden Reinsubstanzen von Edukt und Produkt verwendet, wobei das Edukt als Standard
gesetzt wurde (Faktor: 1). Für das 5-Ring-Lactonprodukt wurde ein Faktor von 1.31 ermittelt.
13.5.3.2 Chromatographie-Bedingungen
Die analytischen Messungen erfolgten isotherm, um ein zeitaufwendiges Abkühlen des
GC-Ofens, was bei Benutzung eines Temperaturprogramms der Fall wäre, zu vermeiden. So
ließ sich die Zeit zwischen zwei Injektionen kurz halten. Die einzelnen Parameter sind unten
aufgeführt.
• Ofentemperatur 5 min auf 150 °C
• Trägergas Wasserstoff
• Trägergasdruck 0.4 bar
• Injektortemperatur 220 C
• Detektortemperatur 350°C
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 96
13.5.4 Kapillartrennsäule zur Auftrennung der Enantiomeren von
5-Methoxy-2-oxepanon
Die Auftrennung der Enantiomeren erfolgte an einer chiralen Kapillartrennsäule BGB-176SE
der Firma BGB Analytik AG.[277] Ihr Einsatzbereich erstreckt sich auf Lactone, Alkohole,
Ester und Terpene. Die Parameter der Kapillartrennsäule sind:
BGB-176SE
20 % (2,3 Dimethyl-6-tert-butyl-dimethylsilyl-β-cyclodextrin) gelöst in einer SE52 (5 %
Phenyl-, 95 % methylpolysiloxan).
• Innendurchmesser: 0.25 mm
• Filmdicke: 0.25 µm
• Länge: 30 m
Chromatographie-Bedingungen
• Ofentemperatur 8 min auf 150 °C
30 °C/min auf 210 C
2 min isotherm auf 210°C
• Trägergas Wasserstoff
• Trägergasdruck 0.7 bar
• Injektortemperatur 220 C
• Detektortemperatur 320°C
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 97
14 Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO auf die
beiden Modellsubstrate
14.1 Ergebnisse zum Modellsubstrat 4-Hydroxycyclohexanon Im Folgenden sind die Ergebnisse der durch epPCR generierten Mutantenbanken der ersten
und zweiten Generation, der Sättigungsmutagenesen und der Einzelmutationen auf das
Wesentliche zusammengefasst.
14.1.1 Enzymvarianten der ersten Generation
Ausgehend vom Wildtyp der CHMO aus Acinetobacter sp. NCIMB 9871 wurde eine erste
Generation von Enzymvarianten mit fehlerhafter PCR generiert. Es wurden sieben
Bibliotheken (1300-1800 Mutanten je Bibliothek) mit unterschiedlichen PCR-Bedingungen
erstellt (siehe Molekularbiologische Arbeiten), wobei 60 bis 90 % aller Mutanten einer
Bibliothek aktiv waren (Tab. 15).
Innerhalb der ersten Generation mit ca. 10000 Mutanten wurden sowohl verbesserte
(R)-selektive als auch verbesserte (S)-selektive Mutanten gefunden. Es wurden insgesamt 10
Mutanten sequenziert (Tab. 16). Bei diesen lagen zwischen einer und drei ausgetauschte
Aminosäuren vor. Die beste (R)-selektive Mutante (I-H7-F4, 54 % ee) übertrifft den Wildtyp
um das sechsfache bezüglich der Enantioselektivität. Die beste (S)-selektive Mutante I-J6-F9
zeigt einen Enantiomerenüberschuss von sogar 83 %.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 98
Tab. 15: Ergebnisse aus der ersten Generation.
Bibliothek
Anzahl
der
Mutanten
Beste (R)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Beste (S)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Wt - - 100 9 - - -
C 1344 I-C2-B7 100 34 I-C3-A10 72 8
D 1440 I-D1-B6 100 21 I-D9-G3 100 0.2
E 1440 I-E1-F1
I-E12-B5
100
80
55
49 I-E15-C11 75 8
F 1440 I-F1-F5
I-F13-B2
100
89
40
45 I-F4-B9 100 46
H 1440 I-H7-F4 100 54 I-H3-C9 100 18
J 1344 I-J2-E12 100 17 I-J6-F9 85 83
K 1728 I-K7-D11 86 43 I-K2-F5
I-K6-G2
100
100
79
78
Aufgeführt sind die jeweils beste (R)- und (S)-Mutante einer Bibliothek. Liegt noch eine ähnlich gute Mutante vor, so ist auch diese mitaufgeführt. Die Bibliotheken A, B und G liegen nicht vor, da die Anzahl der Klone zu gering war. Wt = Wildtyp-Enzym.
Tab. 16: Sequenzierungen aus der ersten Generation.
Mutante Aminosäure-Austausch Selektivität ee in %
I-C2-B7 F432Y, K500R (R) 34
I-F1-F5 L143F (R) 40
I-E1-F1 L426P (R) 55
I-E12-B5 F432I (R) 49
I-H7-F4 L426P, A541V (R) 54
I-H3-C9 L220Q, P428S, T433A (S) 18
I-F4-B9 D41N, F505Y (S) 46
I-K6-G2 K78E, F432S (S) 78
I-K2-F5 F432S (S) 79
I-J6-F9 F282G, F432S (S) 83
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 99
14.1.2 Enzymvarianten der zweiten Generation
Ausgehend von den verbesserten Enzymvarianten I-F1-F5, I-F4-B9 und I-K2-F5 aus der
ersten Generation wurden mehrere Bibliotheken von Enzymvarianten mit fehlerhafter PCR
generiert. Tab. 17 zeigt aus welchen Templaten (Ausgangsmutanten) die einzelnen
Bibliotheken (zwischen 750 und 2000 Mutanten) der zweiten Generation erstellt wurden. Die
Ergebnisse sind in Tab. 18 zusammengefasst.
Tab. 17: Ausgangstemplate der zweiten Generation.
Templat aus
erster Generation Umsatz
ee
in %
Mutationsbezeichnung
der zweiten Generation
I-F1-F5 100 40 (R) II-A
I-F4-B9 100 46 (S) II-B
I-K6-G2 100 78 (S) II-C
I-F1-F5 100 40 (R) II-D
I-F4-B9 100 46 (S) II-E
Mix* II-G
I-F1-F5 100 40 (R) II-H
I-F1-F5 100 40 (R) II-I
* Für die Bibliothek II-G wurde ein Templatmix aus verschiedenen Mutanten der ersten Generation verwendet (siehe Molekularbiologische Arbeiten).
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 100
Tab. 18: Ergebnisse aus der zweiten Generation.
Bibliothek
Anzahl
der
Mutanten
Aktiv-
Mutanten
Beste (R)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
Beste (S)-
Mutante
Umsatz
in %
ee
in %
II-A 1056 40 %
II-A1-G1
II-A11-A5
II-A10-B6
100
75
46
41
52
54
II-A1-B2 97 52
II-B 768 30 % II-B1-C3 100 44 II-B1-G8 100 54
II-C 960 5 % − − − II-C12-A7 91 80
II-D 1920 80 % II-D19-E6 98 90 II-D8-
A12 85 5
II-G 1152 < 1 % II-G2-H7 98 47 − − −
Aufgeführt sind die jeweils beste (R)- und (S)-Mutante einer Bibliothek. Liegen noch ähnlich gute Mutante vor, so sind diese mitaufgeführt.
Die Bibliotheken der zweiten Generation besitzen eine relativ geringe Anzahl an aktiven
Mutanten. Dies ist darauf zurückzuführen, dass weitere Mutationen die Wahrscheinlichkeit
eines missgefalteten Zustands des Enzyms erhöhen.
In der Bibliothek II-A, deren Ausgangsmutante I-F1-F5 40 % ee zugunsten des (R)-
Enantiomers zeigt, liegen Mutanten mit verbesserter (R)-Selektivität (Tab. 18) vor. Eine
Umkehrung der Enantioselektivität wurde in der gleichen Bibliothek (II-A1-B2) gefunden.
Die Bibliotheken II-B und II-C, deren Ausgangsmutanten I-F4-B9 und I-K6-G2 sind, zeigen
keine Verbesserung der (S)-Selektivität. In der Bibliothek II-B wurde allerdings eine Mutante
mit umgekehrter Selektivität gefunden. Es handelt sich hierbei um die Mutante II-B1-C3
(44 % ee zugunsten des (R)-Enantiomers).
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 101
In der Bibliothek II-D führte die zweite Runde, ausgehend von der Mutanten I-F1-F5
(ee =40 %), mit fehlerhafter PCR zu einer merklich verbesserten Mutanten (II-D19-E6). Diese
katalysiert die B.-V.-Oxidation mit einer Enantioselektivität von 90 % zugunsten des (R)-
Enantiomers. Eine Sequenzierung der Mutante ergab, dass zusätzlich zur elterlichen Mutation
(L143F) drei neue Aminosäureaustausche vorliegen (E292G, L435Q, T464A). Welchen
Einfluß die einzelnen Mutationen haben, wird später in Kapitel 14.1.4 untersucht.
In der Bibliothek II-E wurde eine im Vergleich zur Ausgangsmutanten (I-J6-F9,
liegt allerdings noch unterhalb der besten (S)-Mutanten (I-K6-G2) aus der ersten Generation.
Die Bibliothek II-G, welche auf einem Templatmix basiert ist nahezu inaktiv. Eine Erklärung
hierfür wurde nicht gefunden.
Von der II-Generation wurden einige Mutanten sequenziert. Sie tragen zwei oder drei
zusätzliche Mutationen im Vergleich zu ihren elterlichen Mutanten (Tab. 19).
Tab. 19: Sequenzierungen der zweiten Generation.
Mutante Aminosäureaustausch Konfig. ee in % Umsatz
in %
II-A8-H8* D41N, Q393L, F505Y (R) 49 70
II-A10-B6 T60A, V82E, L143F (R) 54 46
II-D19-E65 L143F, E292G, L435Q, T464A (R) 90 98
fett gedruckt: Aminosäureaustausche der Eltern-Mutanten
*gehört zur Bibliothek II-B
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 102
14.1.3 Sättigungsmutagenesen
Ausgehend von den verbesserten Varianten der ersten und zweiten Generation wurden durch
fehlerhafte PCR Sättigungsmutagenesen an den in Tab. 20 aufgeführten Positionen
vorgenommen.
Wahl der Positionen
Die Positionen der Sättigungsmutagenesen ergeben sich aus den verbesserten Mutanten der
ersten (Tab. 16) und zweiten (II-D19-E6) Generation. Hierbei handelt es sich um solche
Aminosäuren, deren Austausch einen signifikanten Effekt auf die Enantioselektivität bewirkt,
sowie die flankierenden Aminosäuren. Position 432 ist besonders interessant, da diese
Position in fünf verschiedenen CHMO-Varianten ausgetauscht wurde (Tab. 16). Pro
Bibliothek wurden etwa 400 Bakterienkolonien betrachtet. Bei einem Aminosäureaustausch je
Mutante werden alle theoretisch möglichen 20 Mutanten mit einer Wahrscheinlichkeit von
99 % erfasst (Abb. 62). In Bibliothek I-SAT1 wurden die Positionen 426 (Mutante I-E1-F1,
verantwortlich für hohe (R)-Selektivität) und 432 (Mutante I-K15-C1 verantwortlich für hohe
(S)-Selektivität) gleichzeitig gesättigt. Im Gegensatz zu den Einzelsättigungen I-SAT2 und
I-SAT3, geht aus der Bibliothek I-SAT1 sowohl eine bessere (R)- als auch (S)- selektive
Mutante hervor (Tab. 21). Das Zusammenspiel beider Aminosäureaustausche ist also
entscheidend.
P = 1-(1-f)n n = ln(1-P) / ln(1-f)
Abb. 62: Formel zur Abdeckung einer Sättigungsbank.[278] P = Wahrscheinlichkeit der Abdeckung; f = Häufigkeit der einzelnen Mutanten; 1/f = Anzahl der Varianten auf DNA-Ebene; n = Anzahl der Kolonien.
Ergebnisse aus der Evolvierung von CHMO 103
Tab. 20: Positionen der Sättigungsmutagenesen.
Bibliothek Position Bibliothek Position
I-SAT1 426+432 I-SAT9 493
I-SAT2 432 I-SAT10 500
I-SAT3 426 I-SAT11 505
I-SAT4 427 I-SAT12 429
I-SAT5 428 I-SAT13 430
I-SAT6 143 I-SAT14 431
I-SAT7 292 I-SAT18 436
I-SAT8 464 - -
Tab. 21: Ergebnisse aus den Sättigungsmutagenesen.
99 523f von medigenomix GCTGGCCAGATGACGTAAGTTTTG Seq
99 1050 forw gaagatgtgaaagccaatccg Seq
99 650rneu gaggtgtttagccagaggtgcca Seq
Molekularbiologische Arbeiten 139
17.3 Kultivierung von E. coli Stämmen
Für eine Plattenkultivierung werden die E. coli Zellen über Nacht auf Agarplatten angezogen.
Eine Kultivierung der E. coli Zellen in flüssiger Form erfolgt mit 50 – 250 ml LB/CB-
Medium in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben. Das Medium wird mit einer Einzelkolonie oder
mit einem Tropfen aus der Gefrierkulturen inokuliert und für 6 - 22 Stunden in einem
Schüttler bei 37°C mit 150 - 180 rpm kultiviert.
17.4 DNA-Preparation
17.4.1 Mini-Plasmidpreparation
Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab stehen verschiedene Protokolle zur
Verfügung[281]. Das QIAprep Spin Miniprep Kit wird zur Erlangung von hochqualitativer
DNA verwendet.
17.4.2 Maxi Plasmidpreparation
Zur Aufreinigung von Plasmid-DNA im großen Maßstab wird das Qiagen Plasmid Maxi Kit
verwendet. Ausbeuten von bis zu 500 µg sind mit dieser Methode möglich. Das Kit basiert
auf einer alkalischen Lyse der Bakterienzellen in NaOH/SDS in Gegenwart von RNaseA und
einem Anionenaustauscherharz.
17.5 DNA-Aufreinigung
17.5.1 DNA-Fällung
Eine Ethanol-Fällung wird zur Aufkonzentrierung von DNA verwendet:
• 0.1 Volumina 3 M Natriumacetatlösung (Endkonzentration 0.3 M)
• Zugabe von 2 Volumina abs. Ethanols
• Abkühlen auf -70 °C für 60 min
Molekularbiologische Arbeiten 140
• Zentrifugieren bei 12000 rpm für 30 min (4 °C)
• Waschen des Pellets mit 750 µl 70 %iger Ethanol-Lsg.
• Zentrifugieren für weitere 15 –45 min
• Lufttrocknen des Pellets und lösen in Wasser bei Raumtemperatur
17.5.2 PCR-Aufreinigung
Zur Aufreinigung von DNA aus der PCR Reaktionsmischung und zur Aufreinigung von
anderen enzymatischen Reaktionen wird das QIAquick PCR Purification Kit von Qiagen
verwendet.
17.5.3 DNA-Aufreinigung aus dem Agarosegel
In preparativen Gelen variiert die Agarose Konzentration zwischen 0.7 % und 1 %. Die DNA-
Banden werden mit einem sterilen Skalpell herausgeschnitten.
17.5.4 Gelextraktion
Nach dem QIAEX II Agarose Gel Extraktionsprotokoll von Quiagen wird das Gelfragment
gelöst, die DNA bei hohen Salzkonzentrationen an Kiselgelpartikel gebunden und mit Wasser
eluiert.
17.5.5 Freeze ′N Squeeze Technik
• Das Gelfragment wird in ein Freeze′N Squeeze DNA Gel Extraktionsgefäß gegeben.
• Es wird bei -20 °C für 20 min gefroren
• Es wird für 6 min mit 10000 rpm zentrifugiert
Das Zentrifugat enthält die DNA und kann entweder direkt benutzt werden oder man
konzentriert die DNA noch durch Ethanol-Fällung.
Molekularbiologische Arbeiten 141
17.6 DNA-Modifikationen
17.6.1 Restriktionsverdauung
Um die DNA zu verdauen werden Restriktionsendonucleasen vom Typ II benutzt. Die DNA-
Verdauung wird für eine bis vier Stunden bei 37 °C in dem vom Hersteller gelieferten
Restriktionspuffer vollzogen. Analytische Reaktionen wurden bei 37 °C für eins bis vier
Stunden inkubiert.
Die aus einer Mini- oder Maxipreparation erhaltene Plasmid-DNA wird von den Enzymen
NdeI und XhoI verdaut.
Das Reaktionsvolumen (10 µl) für die Restriktionsanalyse besteht aus folgenden
Komponenten:
• 1 µl DNA
• 2 U von jedem Enzym
• 1 µl 10 x Puffer
• Wasser
Die Enzymmenge, welche für die Verdauung von 1 µg DNA eingesetzt werden muss
errechnet sich nach folgender Formel:
sdesPlasmidasseMolekularmDNAderaufnsstellenRestriktio DNAasse der λMolekularmPlasmiddemaufnsstellenRestriktioDNAµg
U
×
×=
λ
Bevor die Proben auf das Agarosegel geladen werden, werden 0.2 Volumina eines
Ladepuffers hinzugegeben.
Molekularbiologische Arbeiten 142
17.6.2 Ligation
T4 DNA-Ligase (Qbiogene) katalysiert die Verknüpfung von zwei DNA-Strängen zwischen
dem 5'-Phosphat und den 3'-Hydroxygruppen von benachbarten Nucleotiden. Das
Temperaturoptimum der Enzymaktivität der T4 DNA-Ligase liegt bei 25 C. Für die Ligation
wird die Temperatur zwischen diesem Optimum und der Temperatur für das Annealing
ausbalanciert.
Die Ligation von sticky end DNA-Fragmenten wird bei 16 °C über Nacht durchgeführt. Die
Ligationsansätze enthalten 0.1 Volumina Ligase Puffer (10 x) und 5 U T4 DNA-Ligase. Das
Vektor zu Insert-Verhältnis beträgt 1:1, 1:2 oder 1:3.
17.6.3 Chemisch kompetente Zellen
• Austreichen von Zellen aus einer Glycerin-Gefrierkultur auf eine Agarplatte mit LB
und geeignetem Antibiotikum. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
• Anwachsen einer Einzelkolonie von der Agarplatte (voriger Schritt) in 2 ml LB (mit
geeignetem Antibiotikum) über Nacht bei 37 °C.
• Inokulieren von 10 ml LB- oder SOC-Medium mit der vorherigen Übernachtkultur
im Verhältnis von 1:30 und bis zu einer OD ≤ 600 bei 37 °C inkubieren.
• Auf Eis kühlen und mit 4000 rpm bei 4 °C zentrifugieren.
• Dekantieren des Überstandes und behutsame Resuspendierung der Zellen in 3.5 ml
kaltem TB-Puffer.
• Auf Eis für 10 Minuten inkubieren.
• Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 800 µl kaltem
Puffer.
• Hinzufügen von 56 µl DMSO (7 %) und für 10 Minuten auf Eis inkubieren.
Molekularbiologische Arbeiten 143
17.6.4 Transformationsprotokoll
• Kompetente Zellen werden auf Eis aufgetaut.
• Es werden 1-5 µL DNA zu 200 µL selbsthergestellten chemisch kompetenten Zellen
gegeben oder 1-2 µL DNA zu 50 µL chemisch kompetenter Zellen von Invitrogen
gegeben.
• Es wird für 30 min auf Eis inkubiert.
• Hitzeschock bei 42 °C für 30 sec. Anschließend werden die Zellen auf Eis für zwei
Minuten abgeschreckt.
• Hinzufügen von 250-800 µL SOC Medium.
• Schütteln bei 37 C für 1 Stunde.
• Ausplattieren auf Agarplatte.
17.7 DNA-Seqenzierung
Die notwendige Menge an DNA wird aus der Miniplasmidminipreparation aus den jeweiligen
E. coli-Klonen gewonnen und durch PCR amplifiziert (Tab. 35).
Tab. 35: PCR-Protokoll zur Sequenzierung der PCR-Reaktion.
Sequenzierungs-PCR
Templat 1 µl
Primer 1 (Nr. 16) 2 µl
Primer 2 (Nr. 17) 2 µl
10 x Puffer 10 µl
Hot Star-Polymerase 1 µl
dNTPs (2 mM) 10 µl
H2O 74 µl
Molekularbiologische Arbeiten 144
Tab. 36: PCR-Programm zur Sequenzierung.
Sequenzierungs-PCR
Temp. [°C] Zeit [sec.] Zyklen
96 900 1
96 60
54.5 60
72 120
40
72 1200 1
• QIAquick PCR Purification Kit für PCR Aufreinigung.
• Analytisches Agarosegel.
• Bestimmung der Konzentration
benötigte Mengen: 10-50 ng/µL (10 ng pro 100 bp für die Sequenzierung).
• Die Sequenzierungen werden von der Medigenomix GmbH durchgeführt.
Die Sequenzen werden mit der Software Vector NTI Advance, Version 9, InforMax
Inc. ausgewertet.
Molekularbiologische Arbeiten 145
17.8 Agarosegel-Elektrophorese
Die Agarosegel-Elektrophorese wird für die analytische und preparative Abtrennung von
DNA-Fragmenten verwendet.
Die Konzentration des Agarosegels variiert zwischen 0.7 und 2 % (w/v) in Abhängigkeit von
der Größe der zu analysierenden Fragmente. Ein 0.8 %iges Agarosegel ist für die meisten
Anwendungen ausreichend. Für analytische Gele ist die erforderliche Menge von Agarose
gelöst in einem 1 x TBE-Puffer. Für preparative Gele benutzt man einen 1 x TAE-Puffer. Das
Auflösen geschieht mittels Erwärmen in einer Mikrowelle. Nach Erkalten der Lösung auf
60 °C werden 1-3 µL Ethidiumbromid hinzugefügt und das Gel wird in eine
Elektrophoresezelle (Bio-Rad Laboratories) gegossen. Der DNA-Lösung wird ein Ladepuffer
in der Größenordnung von 1/3 bis 1/5 des Volumens der DNA hinzugefügt. Die DNA haltige
Lösung wird auf das Gel geladen. Standards für den Größenvergleich sind in Abb. 66
beschrieben. Die angelegte Spannung für die Elektrophorese variiert von 40 V für preparative
Gele bis 90 Volt für Kontrollgele. Nach Beendigung eines Gels werden die DNA Banden
unter UV-Licht visualisiert.
Abb. 66: EZ Load molecular rulers; Bio Rad Laboratories
Molekularbiologische Arbeiten 146
17.8.1 SDS-PAGE
Für die Abtrennung der Proteine werden Polyacrylamidgele benutzt. SDS wird zur
Denaturierung der Proteine hinzugefügt. Die Minigel-Twin Apparatur von Biometra GmbH
wird zur Gelherstellung benutzt. Die Proteinproben werden im Verhältnis 6:1 mit einem
Probenpuffer verdünnt und auf 95 °C für 5 bis 10 Minuten erhitzt. Zur Bestimmung der
Molekularmassen wird ein molekularer Gewichtsstandard (Tab. 32) verwendet. Die Gele
laufen in einem 1 x Ladefpuffer bei konstanter Spannung von 180 V. Für das Färben und
Entfärben werden die Lösungen aus Tab. 31 verwendet. Zuerst wird die Färbelösung
hinzugefügt und für 2–3 Minuten in einer Mikrowelle erhitzt. Die Entfärbelösung wird in der
gleichen Art und Weise angewendet um den Hintergrund zu entfernen. Für die Generierung
geeigneter Gele ist eine zusätzliche Inkubation bei Raumtemperatur erforderlich. Zudem ist
eine frisch hergestellte Entfärbelösung zu empfehlen.d
17.8.2 Protein-Assay
Für die Bestimmung der Gesamtproteinmenge wird der Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad
Laboratories) verwendet. Es basiert auf der Methode von Brandford. Das
Absorptionsmaximum der Säurelösung vom Farbstoff Coomassie Brilliant Blau G-250 wird
von 465 nm auf 595 nm verschoben, wenn eine Bindung zum Protein stattfindet. Der
Farbstoff bindet primär zu basischen und aromatischen Aminosäureresten. Als Standard wird
Rinderserum Albumin (BSA) benutzt.
• Verdünnen von einem Teil Farbstoff mit vier Teilen Wasser und Filtration der
Lösung.
• Pipettieren von 10 µl in Well einer Mikrotiterplatte (0.05 mg/ml – 0.5mg/ml Protein)
• Hinzufügen von 200 µl verd. Farbstoff und gut durchmischen.
• Messung der Absorption bei 595 nm.
17.8.3 Sterilisation
Alle Materialien werden mit dem UT20P Sterilisationsofen (Kendro Laboratory Products
GmbH) sterilisiert. Die Lösungen und Medien für molekularbiologische und mikrobiologische
Experimente werden bei 121 C für 20 Minuten autoklaviert. Der biologische Abfall wird für
15 Minuten bei 134 C autoklaviert. Hitzeempfindlichen Substanzen werden steril filtriert.
Literatur 147
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Anhang 156
19 Anhang
Tabelle 1: Untersuchte Substrate in der Baeyer-Villiger-Oxidation mit dem Wildtyp der CHMO und mit der Mutanten I-K2-F5.
CHMO I-K2-F5 (S)
Substrat [α]20D ee [%] [α]20
D conv. [%] ee [%]
O
- 89.3 - +++ 94
OCl
- >99 - +++ 99
O
- 5 - +++ 91
O
- 99 - +++ >99
O
+ 95 -a +++ >99
O
+ >99 - a +++ >99
O
OH
- 96 - +++ >99
Anhang 157
O
OH
+ >99 - ++ >99
CHMO I-K2-F5 (S)
O
- 99 +++ >99
O
O
n.c n.c.
O
- 17 - +++ >97
O
- 88 - +++ 78
O
- 62 - +++ 96
OO
+ 53 - +++ 83
O
-/- 44/>99 -/- +++/+++ 65/>99
O
-/- 95/>99 -/- +++/+++ >99/80
Persönliche Mitteilung von Professor Dr. Marko D. Mihovilovic (Technische Universität Wien).
+++ >90% Umsatz ++ 90>x>50% Umsatz + < 50% Umsatz n.c. no conversion n.d. not determined (a) bestätigt durch [α]20