FRANCISELLA TULARENSİS’İN MUHTEMEL REZERVUAR …acikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27901/tez.pdf · Ġncelenen rodent, koyun kanı ve su materyallerinin yerleĢim birimlerine göre

1

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

FRANCISELLA TULARENSİS’İN MUHTEMEL

REZERVUAR HAYVANLAR VE KOYUNLARDA

LABORATUVAR TANISI

Derya KARATAŞ YENİ

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN

Prof. Dr. Müjgan İZGÜR

2013-ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ

2

ANKARA ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

FRANCISELLA TULARENSİS’İN MUHTEMEL

REZERVUAR HAYVANLAR VE KOYUNLARDA

LABORATUVAR TANISI

Derya KARATAŞ YENİ

MİKROBİYOLOJİ ANABİLİM DALI

DOKTORA TEZİ

DANIŞMAN Prof. Dr. Müjgan İZGÜR

2013- ANKARA

3

İÇİNDEKİLER

Kabul ve Onay

ıı

Ġçindekiler ııı

Önsöz v

Simgeler ve Kısaltmalar vıı

ġekiller ve Resimler ıx

Çizelgeler x

1. GİRİŞ 1

1.1. Tarihçe 2

1.2. Etiyoloji 2

1.3. Epidemiyoloji 6

1.3.1. Ġnsanlarda Tularemi 7

1.3.2. Evcil Hayvanlarda Tularemi 8

1.3.3. Yabani Hayvanlarda Tularemi 10

1.3.4. Tularemi’nin Biyolojik Silah Olarak Önemi 11

1.3.5. Tularemi’nin BulaĢma Yolları 11

1.4. Patogenez 13

1.5. Tanı 15

1.5.1. Klinik ve Nekropsi Tanısı 15

1.5.2 Laboratuvar Tanısı 15

1.5.2.1. Laboratuvara Gönderilecek Örnek Seçimi 15

1.5.2.2. Kültür 16

1.5.3. Seroloji 16

1.5.3.1. Mikroaglutinasyon Testi 17

1.5.4. Moleküler Yöntemler 17

1.5.4.1. Polymerase Chain Reaction (PCR) 17

1.6. Hayvanlarda Tularemi TeĢhis ÇalıĢmaları 18

1.7. Sağaltım 20

1.8. Koruma 21

1.9. Biyogüvenlik ve Tularemi 22

2. GEREÇ VE YÖNTEM 24

2.1.

2.1.1.

Gereç

Örnekler

24

24

2.1.2. Besiyerleri 25

2.1.3. Standart SuĢlar 25

2.1.4. Antijenler ve Antiserumlar 25

2.1.4.1. Mikroaglutinasyon Test (MAT) Test Antijeni 25

2.1.4.2. Antiserum 26

2.1.5. PCR Malzemeleri 26

2.1.5.1. Sarf Malzemeleri 26

2.1.5.2. Primerler 27

4

2.1.5.3. Cihaz ve Ekipmanlar 28

2.2. Yöntem 29

2.2.1. Ġzolasyon ÇalıĢmaları 29

2.2.1.1. Besiyeri Sterilite Kontrolü 29

2.2.1.2. Besiyeri Üreme Kontrolü 29

2.2.1.3. Rodent Örneklerinden Etken Ġzolasyonu 30

2.2.1.4. Su Örneklerinden Etken Ġzolasyonu 30

2.2.2. Seroloji 33

2.2.2.1. Mikroaglutinasyon Test 33

2.2.3. PCR Analizi 34

2.2.3.1. Rodent Doku örnekleri Ġçin PCR Analizi 34

2.2.3.1.1. Ekstraksiyon 34

2.2.3.1.2. PCR KarıĢımının Hazırlanması 36

2.2.3.1.3. Amplifikasyon 37

2.2.3.2. Kültür Pozitif Su Örneği Ġçin PCR Analizi 37

2.2.3.2.1. Ekstraksiyon 38

2.2.3.2.2. PCR KarıĢımının Hazırlanması 38

2.2.3.2.2.3. Amplifikasyon 39

3. BULGULAR 41

3.1. Ġzolasyon Bulguları 41

3.1.1. Rodent Örneklerine Ait Ġzolasyon Bulguları 41

3.1.2. Su Örneklerine Ait Ġzolasyon Bulguları 41

3.2. Serolojik Bulgular 42

3.3. PCR Bulguları 45

3.3.1. Rodent Örneklerine Ait PCR Bulguları 45

3.3.2. Kültür Pozitif Su Örneğine Ait PCR Bulguları 45

4. TARTIŞMA 47

5. SONUÇ VE ÖNERİLER 53

ÖZET 54

SUMMARY

KAYNAKLAR

55

56

EKLER 60

Ek1- Ülkemizde Tularemi Epidemiyolojisi ve Güncel

Durum

61

2009-2010 Arasında Tanımlanan Olgularda Güncel Durum 63

Ek2- Dünya Sağlık Örgütü Ġnsanlarda Tularemi’den

Korunma Önerileri

ÖZGEÇMİŞ

65

66

5

ÖNSÖZ

Ülkemizde tularemi önceki yıllarda yalnızca Trakya, Marmara ve Batı Karadeniz

Bölgelerinde yaĢayan insanlarda tanımlanmıĢ olmasına karĢın, beĢeri alandaki

araĢtırmalarla günümüzde birçok bölgemizde epidemiler halinde görüldüğü tespit

edilmiĢtir. Bu yönüyle hastalığın önemli bir toplum sağlığı sorunu haline geldiği

görülmektedir. Tularemi genel olarak hayvan temasının daha fazla ve hijyenik

koĢulların uygun olmadığı kırsal alanlarda görülmekle birlikte, nadiren Ģehirlerde

yaĢayanlarda da hastalığa rastlanmaktadır.

Tularemi hastalığı üzerine yapılacak en doğru epidemiyolojik değerlendirme,

bakterinin ana rezervuarları olan memeliler, keneler, sinekler ve diğer tüm enfekte

hayvanlar üzerinde farklı bölgelerde yapılacak geniĢ çaplı araĢtırmalarla etkenin ilgili

konaklarda gösterilmesi ve bu bilgiler ıĢığında çalıĢmaların sürdürülmesi olmalıdır.

Veteriner hekimlikte tularemi tanısı ile ilgili bulgular oldukça kısıtlıdır ve pek

çok hastalıkla karıĢabilmektedir. Ülkemizde insanlarda bildirilen hiçbir tularemi

epidemisinde Francisella tularensis’in kaynağı tespit edilememiĢtir. Bu salgınların

genelinde bulaĢma yollarının su kaynaklı olduğu kayıtlara geçmiĢtir. Geçtiğimiz 50 yıl içerisinde,

ülkemizde tulareminin güncelleĢmesinde ve yeniden önem kazanmasında hangi

faktörlerin hazırlayıcı olduğu konusunda henüz bir veri bulunmamaktadır.

Tulareminin ülkemizde yayılıĢı üzerinde, rezervuarlar, vektörler ve iklimsel

değiĢiklerin nasıl etkileri olduğu konusunda çalıĢmalara ihtiyaç vardır. Bu sebeple F.

tularensis’in muhtemel rezervuar hayvanlar ve koyunlarda laboratuvar tanısına

yönelik bu tez çalıĢmasının yapılması planlanmıĢtır.

Bu tez çalıĢmalarının yürütülmesinde, yardım ve desteklerini esirgemeyen çok

değerli danıĢman hocam Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji

Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Müjgan ĠZGÜR baĢta olmak üzere, tez izleme

komitesindeki hocalarım Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji

öğretim üyesi Prof. Dr. Hakan YARDIMCI ve Ankara Üniversitesi Veteriner

Fakültesi Dahiliye Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Mehmet ġAHAL’a,

6

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı Prof. Dr. K. Serdar DĠKER ve öğretim üyeleri

Prof. Dr. Mehmet AKAN ve Doç. Dr. BarıĢ SAREYYÜPOĞLU’na, çalıĢma

süresince desteklerini esirgemeyen VKMAE Bakteriyolojik TeĢhis Laboratuvarı ġefi

Uzm. Veteriner Hekim Selahattin ġEN’e, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu çalıĢanlarından Doç Dr. Selçuk KILIÇ ve Dr. Bekir

ÇELEBĠ’ye çalıĢmalarım sırasında ebediyete uğurladığım çok sevgili annem,

Öğretmen Naime KARATAġ’a, çalıĢmama sonsuz destek veren ve her zaman

yanımda olan, sevgili babam Ziraat Teknikeri Ġhsan KARATAġ ve sevgili kardeĢim

Msc. Ġngilizce öğretmeni Esra SOMUNCU’ya, sevgili eĢim ve meslektaĢım Veteriner

Hekim Ferit Kemal YENĠ’ye ve manevi desteği için sevgili kızım Defne Feryal

YENĠ’ye teĢekkürlerimi sunarım.

7

SİMGELER VE KISALTMALAR

ABD Amerika BirleĢik Devletleri

ATCC American Type Culture Collection

BHI Brain Heart Infusion

bp Base pair

CFU Colony Forming Unit

cm Santimetre

CO2 Karbondioksit

dk Dakika

DNA Deoksiribonükleik asit

dNTP Deoksinükleotid Trifosfat

EDTA Etilendiamintetraasetikasid

g Gram

IgA Ġmmunglobulin A

IgG Ġmmunglobulin G

IgM Ġmmunglobulin M

iv Ġntravenöz

kDA Kilodalton

kg Kilogram

km Kilometre

L Litre

LVS Live Vaccine Strain

MAT Mikroaglutinasyon Test

mg Miligram

MgCl2 Magnezyum klorür

mM Milimolar

µg Mikrogram

µl Mikrolitre

NCTC National Collection of Type Cultures

PBS Fosfat tampon solüsyonu

PCR Polymerase Chain Reaction

RD1 Regions of Difference

8

sn Saniye

spp Species

subsp Subspecies

TAE Tris-asetik asit-EDTA

Taq Termus aquaticus

TBE Tris Borik Asit EDTA

TSB Trypticase Soy Broth

UV Ultraviyole

VKMAE Veteriner Kontrol Merkez AraĢtırma

Enstitüsü Müdürlüğü

9

ŞEKİLLER ve RESİMLER

Şekil 1.1. Tularemi’nin tabiattaki bulaĢma döngüsü (Anonim, 2011 c).

Resim 2.1. Pozitif kontrol suĢunun Francis besiyerinde görüntüsü

Resim 2.2. Ġncelenen su örneklerinin filtrasyonu

Resim 2.3. Su örneğinin filtrasyon iĢleminden sonra Francis besiyerine ekim

görüntüsü

Resim 3.1. Pozitif su örneğinin Francis besiyerinde görüntüsü

Resim 3.2. Kültür pozitif su örneğinin PCR sonrası elde edilen agaroz jel görüntüsü

Resim 3.3. Pozitif su örneğinin PCR sonrası F. tularensis alttür ayrımını gösteren

agaroz jel görüntüsü

10

ÇİZELGELER

Çizelge 1.1. Francisella tür ve alttürlerinin ayrımı.

Çizelge 1.2. F. tularensis’in alttipleri ve çeĢitli canlılardaki infeksiyöz dozları

Çizelge 2.1. Ġncelenen rodent, koyun kanı ve su materyallerinin yerleĢim birimlerine

göre dağılımı

Çizelge 2.2. Primerlerin baz dizileri bağlandıkları spesifik gen bölgeleri, PCR

ürünlerinin uzunlukları.

Çizelge 2.3. Alt tür tayininde kullanılan primerlerin baz dizileri bağlandıkları spesifik

gen bölgeleri, PCR ürünlerinin uzunlukları.

Çizelge 3.1. Ġncelenen koyun kan serumlarının mikroaglutinasyon test sonuçları.

11

1.GİRİŞ

Tularemi, kemiriciler baĢta olmak üzere hayvanların bir patojeni olan ve

hayvanlardan insanlara da bulaĢarak değiĢik klinik tablolara yol açan Francisella

tularensis’in neden olduğu zoonotik bir hastalıktır. Ülkemizde son yıllarda kaynak

suları ile iliĢkilendirilen salgınlara yol açması, dünya genelinde ise, zaman zaman

ortaya çıkan salgınlar ve biyolojik silah olma özelliği nedeniyle güncelleĢmiĢtir.

ABD’de hastalık isimlendirilirken, tulareminin yanı sıra “tavĢan ateĢi”,

“geyik sineği ateĢi”, “pazarcı hastalığı” denmekte; Rusya’da “avcı hastalığı”

Japonya’da ise, “Ohara hastalığı”, “yabani tavĢan ateĢi (yato-byo)” gibi isimler

verilmektedir (Willke, 2006).

F. tularensis laboratuvar bulaĢması yönünden çok dikkatli olunması gereken

bir etkendir. Eğer laboratuvar ortamında canlı bakteri ile çalıĢılıyorsa biyogüvenlik

düzeyi III (Biosafety level III) ortam koĢulları sağlanmıĢ olmalı, Ģüpheli örneklerle

çalıĢılıyorsa biyogüvenlik II düzeyinde çalıĢılması gerekmektedir (Çelebi, 2010).

Dünyada ve ülkemizde riskli bölge yerleĢim birimi hızla artan ve güncelliğini

koruyan bu hastalığın rezervuarı tam olarak bilinmemektedir. Son yıllarda ülkemizde

tularemi vakalarında artıĢ olması, bazı ekolojik dengelerin değiĢmesi ile izah

edilmeye çalıĢılmaktadır. YağıĢlı sezonlardan sonra kemirici popülasyonundaki

artıĢın tularemi vaka sayısının artmasına neden olduğu düĢünülmektedir. Tularemi,

2005 yılı öncesinde Marmara ve Batı Karadeniz Bölgelerinde yaygın olarak

görülürken, 2009-2010 yıllarının ilk yarısında özellikle Ġç Anadolu Bölgesi olmak

üzere diğer bölgelerden yeni vakalar bildirilmiĢtir. Kemirici hayvanların dıĢkılarıyla

veya ekskretleriyle temas, kaynak sularının tüketimi, avcılık ve vahĢi tavĢan etinin

yenmesi, hijyenik olmayan gıdaların tüketilmesi, ev ve çevresinde kemirici

sayısında belirgin artıĢ gözlenmesi ile doğayla iliĢkili aktiviteler gibi bağımsız

değiĢkenler hastalığın epidemiyolojik risk faktörleri arasında yer almasına neden

olmuĢtur (Anonim, 2011a).

12

1.1. Tarihçe

Tularemi hastalığı, F. tularensis’in neden olduğu kuzey yarım küreye özgü

bir zoonozdur. Hastalık Japonya ved Rusya’da 1800’lü yıllarda bilinmesine rağmen,

1911 San Francisco depreminden sonra McCoy tarafından Kaliforniya'nın Tulare

bölgesinde sincaplarda görülen veba benzeri bir hastalık olarak tanımlanmıĢtır.

Hastalığın etkeni Bacterium tularensis olarak izole edilmiĢtir. Edward Francis’in

hastalık hakkındaki araĢtırma ve katkıları nedeniyle Sovyetler tarafından bakterinin

adı F. tularensis olarak değiĢtirilmiĢtir. Ġlerleyen zamanlarda Avrupa ve SSCB’de

1930 ve 1940’da kontamine suya bağlı salgınların görülmesi hastalığın epidemik

özellikler taĢıyabileceğini de göstermiĢtir. Ülkemizde insanlarda Tularemi’nin tarihi,

seroloji ve klinik belirtiler ile bir olgunun tanımlandığı 1913 tarihine dayanmaktadır.

Ancak, klinik ve mikrobiyolojik olarak Tularemi, ilk olarak Lüleburgaz bölgesinde

askeri garnizon ve yakınındaki köylerde açığa çıkan insanlardaki salgın ile 1936

yılında tanımlanmıĢtır (Kılıç, 2006).

Günümüzde Türkiye’nin birçok bölgesi Tularemi yönünden endemik olarak

kabul edilmektedir. Zaman zaman insanlarda salgınlar baĢ göstermektedir.

1.2. Etiyoloji

F. tularensis, Gram boyama ile zayıf boyanan Gram negatif kokobasildir.

Kokobasillerin boyutları 0.2x0.2-0.7 µm’dir. Zorunlu aerob, hareketsiz, oksidaz

negatif ve katalaz zayıf pozitiftir. Sıvı besiyerinde üremesi çok güçtür. Bu zor üreyen

organizmanın üreyebilmesi için kanlı agara sistein veya sistin eklenmesi

gerekmektedir. F. tularensis, MacConkey agarda üremez. F. tularensis yüksek lipid

içeriğine sahiptir ve infekte hayvanlardan elde edilen virulent izolatlar kapsül

oluĢturur (Stewart, 1995; Winn ve ark., 2006).

Francisella’nın sınıflandırılması biyokimyasal reaksiyonları değiĢken, zayıf

veya geç reaksiyon Ģeklinde olduğu için karıĢıktır. Bu sebeple bu bakterilere

dünyanın değiĢik bölgelerinde farklı isimler verildiği gözlenmiĢtir. Biyokimyasal

13

testlerle F. tularensis subsp. tularensis ile F. tularensis subsp. holartica arasında tam

ve doğru bir ayrım yapılamaz. Etkenin alttürleri serolojik olarak birbirlerinden ayırt

edilemez (Otkun, 2009).

Günümüzde kullanılan terminolojiye göre; F. tularensis, Proteobacteria

sınıfında Gamaproteobacteria takımının, Francisellaceae familyasının Francisella

genusunda bulunan bir türdür, bu genusda diğer bir tür ise Francisella

philomiragia’dır (Sjostedt , 2005).

F. tularensis’ in dört alttürü bulunmaktadır;

• F. tularensis subsp. tularensis: F. tularensis A (Jellison tip A) veya F.

tularensis subsp. nearctica olarak geçmiĢ yıllarda isimlendirilmiĢlerdir. Genellikle

Kuzey Amerika'da karasal ortamlarda bulunan ve insanlar için en virulent (<10 CFU

bakteri ile infeksiyon oluĢturabilmektedir) alttür olarak bilinmektedir (Çelebi, 2004).

• F. tularensis subsp. holartica: F. tularensis B (Jellison tip B) veya F.

tularensis subsp. palearctica olarak geçmiĢ yıllarda isimlendirilmiĢlerdir.

TavĢanlarda hastalık yapmaz ve insanlarda yaptığı hastalık daha hafif seyirlidir.

Anavatanı Avrupa, Sibirya, Uzak Doğu, Kazakistan ve Kuzey Amerika olarak

bilinmektedir. Daha çok su kaynaklı salgınlardan sorumludur. Ana rezervuarları,

tavĢan, su ve kara kemiricileridir. Bunun yanında kene ve sivrisinekler aracılığıyla da

bulaĢabilir (Çelebi, 2004).

• F. tularensis subsp. mediasiatica: Virulansı zayıf olmakla birlikte, insan ve

tavĢanlarda hafif hastalık yapar. Yalnızca Orta Asya’da bulunan bir alttürdür

(Gurycová , 1998).

14

F. tularensis subsp. novicida: yalnızca Kuzey Amerika'daki kaynaklarında

saptanmıĢtır ve virulansı zayıf olan alttürdür (Çelebi, 2004).

F. philomiragia nadiren insanlarda hastalığa neden olmaktadır. DüĢük

virulanslıdır, konvansiyonel metotlarla identifikasyonu güçtür (Anonim, 2010).

Francisella türlerinin sınıflandırılması üreme, biyokimyasal, virulans ve

genotipik özelliklerine göre yapılmaktadır. F. tularensis alt türlerinin tümü

infeksiyonlar ile iliĢkili olmakla birlikte, F. tularensis subsp. tularensis ve F.

tularensis subsp. holarctica alt türlerine bağlı enfeksiyonlar daha sık görülmektedir

(Çelebi, 2004; Sjostedt, 2005).

F. tularensis’in inkubasyon periyodu 10 güne kadar sürebilir. ArtırılmıĢ CO2

konsantrasyonu bakterinin üremesini sitümüle eder. Çikolata agarda 3 günlük

inkübasyon sonrasında 2 mm çapında düzgün yüzeyli gri beyaz renkli hafif mukoid

ve yağlı görünümlü parlak yüzeyli koloniler Ģekillenir. F. tularensis subsp.

tularensis, F. tularensis subsp. holartica ve F. tularensis subsp. mediasiatica yavaĢ

üreyen nazlı bakteriler olup, genellikle iyi üreyebilmeleri için sülfidril bileĢiklerine

ihtiyaç duyarlar. Bu üç alttür doku gibi bakterinin üremesine yardımcı olacak besin

bakımından zengin örneklerden izole edilecekse koyun kanlı agara inokule edilir

(Kolaylı, 2009).

15

Çizelge 1.1. Francisella tür ve alttürlerinin ayrımı (Johansson ve ark., 2007).

Özellik

F. tularensis

F. philomiragia

F. tularensis

subsp.

tularensis

F. tularensis

subsp.

holartica

F. tularensis

subsp.

mediastiatica

F. tularensis

subsp.

novicida

Sistein ihtiyacı

+

+ + - -

Maltoz

+

+ - Zayıf +

Sukroz

-

- - + +

D-glukoz

+

+ - + Zayıf

Gliserol

+

- + Zayıf -

Sitrulin üreidaz üretimi

+

- + + Test edilmedi

Oksidaz üretimi

-

- - - +

TSI(Triple Sugar Iron

agar) da H2S üretimi

+

Hücre büyüklüğü

(µm) 0.2-0.7X0.2 0.2-0.7X0.2 0.2-0.7X0.2 0.7X1.7 0.7X1.7

16

F. tularensis çok nazlı üreyen bir bakteridir. Bakterinin üretilmesinde

genellikle sistein glukoz içeren kanlı agar (Francis besiyeri) kullanılması tavsiye

edilir. Bununla birlikte %9 ısıtılmıĢ koyun kanı eklenmiĢ cystein heart agar (CHAB),

sisteinle zenginleĢtirilmiĢ çukulata agar, non selective buffered charcoal agar yeast

extract agar (BCYE), %1 hemoglobin %1 isovitolateX eklenmiĢ GC (Chocolate

Agar) agar base II ve thioglycollate glucose blood agar (TGBA) gibi besiyerleri de

izolasyon için kullanılmaktadır. F. tularensis, koyun kanlı agar kullanılarak besinsel

içeriği zengin örneklerden (doku) izole edilebilir ancak, koyun kanlı agarda yapılan

pasajlar baĢarısızlıkla sonuçlanabilir. Bu sebeple bakterinin üretilmesinde mutlaka

sisteinle zenginleĢtirilmiĢ agar tavsiye edilir. (Johansson, 2007; Kolaylı, 2009).

F. tularensis sıvı besiyerinde iyi üreyemez, bu sebeple sıvı besiyerleri üreme

ortamları olarak tercih edilmezler. F. tularensis nazlı üreyen bir bakteri olduğundan

üretilebilmesi için besiyerlerine sisteinden zengin maddelerin eklenmesi

gerekmektedir ( Kolaylı , 2009).

1.3. Epidemiyoloji

Tularemi, yaklaĢık 100 yıldır insan patojeni olarak tanınan bir zoonotik

hastalıktır. Bakterinin doğal rezervuarları genellikle kemirici hayvanlar olarak

bilinmektedir. F. tularensis subsp. tularensis, özellikle tavĢan, sincap, sıçan, geyik ve

rakun gibi karada yaĢayan canlılarda bulunmaktadır. F. tularensis subsp. holartica

ise su sıçanı, kunduz gibi suda yaĢayan kemiricilerden izole edilmiĢtir. Bu hayvanlar

hastalandıklarında çoğunlukla ölümcül tablolar görülmektedir. Bakteri,

kemiricilerden bulaĢarak ya da kene, sinek, sivrisinek gibi kan emici artropodlarla

taĢınarak doğada döngüsünü sürdürmektedir. Bazı kene türleri vektör olarak görevini

sürdürmekle kalmadığı gibi, bakteriyi vücudunda aylarca taĢır. Ayrıca doğada bir

rezervuar olarak rol alır. F. tularensis subsp. holartica suda ve çamurda haftalarca

canlılığını sürdürebilmekte ve infektivitesini sürdürerek transmisyonunu devam

ettirebilir. F. tularensis’in rezervuar ve vektörleri bölgeden bölgeye değiĢiklik

gösterebilmektedir (Çelebi, 2004).

17

F.tularensis subsp. tularensis en yüksek mortalite oranına sahiptir ve yaptığı

enfeksiyonları genellikle Kuzey Amerika ile sınırlıdır. F.tularensis subsp. holartica

bütün kuzey yarım kürenin tamamında görülebilmektedir. F.tularensis subsp.

novicida ve F.tularensis subsp. mediasiatica ise daha yerel dağılımlar göstermektedir

(ġahin, 2009).

Hastalığın yeterince tanınmaması ve bildirim eksikliği nedeniyle dünyada

tularemi insidansı tam olarak bilinmemektedir. Avrupa ve Asya’da su kaynaklı,

artropod kaynaklı ve aerosol kaynaklı yüzlerce kiĢinin etkilendiği epidemiler ortaya

çıkmıĢtır. Tularemi hastalığı her mevsimde görülebilmesine karĢın yaz aylarında ve

kıĢ aylarında iki pik yapmaktadır. Yaz aylarındaki pik, doğadaki aktivitelerin artması

ve bunun sonucu olarak kene gibi vektörlere maruziyetin artmasıyla açıklanmaktadır.

KıĢ aylarındaki pik ise avcılık faliyetleri, yağıĢlarla birlikte su kaynaklı enfekte

hayvanlarla bulaĢa bağlanmaktadır (Çelebi, 2004).

1.3.1. İnsanlarda Tularemi

Tularemide insandan insana geçiĢ saptanmamıĢtır. Artropod ısırıkları, Ġnfekte

hayvan, infeksiyöz hayvana ait doku ya da sıvılar, kontamine su veya yiyecek

yenilmesi, infektif aerosollerin inhalasyonu Ģeklinde görülmektedir (Anonim, 2011b;

Tärnvik, 2007).

Tulareminin insanlardaki klinik tablosu bakterinin virulansına, giriĢ yoluna,

sistemik yayılım olup olmadığına ve konağın immun durumuna göre değiĢmektedir

(Eryılmaz, 2011).

Tularemi, asemptomatik Ģekilden akut sepsis ve ölüme kadar giden klinik

spektrum gösterebilir. Tulareminin inkübasyon süresi, 3-5 günden 21 güne kadar

değiĢmektedir. Ġnsanlarda Tularemi, ülseroglandüler, glandüler, okuloglandüler,

faranjiyal, tifiodial, pnömonik olmak üzere değiĢik formlarda görülebilir. Hastalarda

genel olarak; ateĢ, titreme, halsizlik, iĢtahsızlık, baĢ ağrısı gibi belirtiler hastalığın

18

baĢlangıç döneminden itibaren bulunabilir. AteĢ 30 günden fazla devam edebilir.

Lenf nodülü süpürasyonu en sık görülen komplikasyondur, antibiyotik tedavisine

rağmen görülebilir (Willke, 2006).

Tularemi, son yıllarda ortaya çıkan epidemilerde kontamine su ve gıda

tüketimi ile iliĢkilendirilen ve Türkiye'de yeniden güncelleĢen bir hastalık haline

gelmiĢtir. Ülkemizde giderek artan oranlarda bildirilen Tularemi olgularının çoğunun

orofaringeal formda olduğu tespit edilmiĢtir. Orofaringeal Tularemi, kontamine su

veya yiyeceklerin alınması sonucunda oluĢur. Bu formda tonsillerin ve servikal lenf

düğümlerinin büyümesiyle birlikte ciddi bir boğaz ağrısı ile karakterizedir (Uyar ve

ark., 2011).

1.3.2. Evcil Hayvanlarda Tularemi

Evcil hayvanlar arasında koyunlar tularemiye duyarlıdır, ancak hastalık kedi,

tavĢan, köpek, domuz ve atlarda da bildirilmiĢtir. Sığırların ise genellikle hastalığa

karĢı dirençli olduğu bilinmektedir. Enfeksiyonun prevalansını belirlemeye yönelik,

evcil hayvanlarda klinik hastalıkların sunumu ve prevalansına dair bilgiler oldukça

kısıtlıdır (Otlu, 2009).

Koyunlarda hastalık kene enfestasyonlarına bağlı olarak mevsimsel bir

özellik gösterir. Koyunlar diğer türlere oranla hastalığa en duyarlı olan hayvanlardır.

Keneler genellikle hayvanın boynu, kulak dipleri, koltuk altı ve memelerinde

yerleĢim göstermektedir. Hastalığın inkubasyon periyodu 1-10 gündür. Solunum

güçlüğü, yüksek ateĢ, depresyon, durgunluk, ishal sürünün gerisinde kalma, kilo

kaybı, sık ve az miktarda iĢeme gibi klinik belirtiler gösterir. Gebe hayvanlar abort

yapabilir. Morbidite yaklaĢık %20 olup %40’a kadar yükselebilir ve mortalite

özellikle kuzularda %50 ye ulaĢabilir (Otlu, 2009). Hastalık daha çok barınak

Ģartları uygunsuz, bakım ve beslenmesi düĢük, yoğun kene enfestasyonu olan

koyunlarda görülebilmektedir (Daly ve Miskimins, 2005).

19

Koyunlar Tularemi’nin rastlantısal konakçılarıdır. Hastalık bu hayvanlarda

ciddi ekonomik kayıplara sebep olmaktadır. Ekonomik kayıpların baĢlıca sebebini

koyunlarda görülen mortalite ve etkilenen hayvanlarla temasa geçen insanlarda

meydana getirdiği zararlar oluĢturmaktadır. Hastalıkta bulaĢ yolları genellikle tahmin

edilemez ve birden ortaya çıkar bu yüzden profilaksi yöntemleri terapi

yöntemlerinden daha pratiktir (Bell ve ark., 1978).

Kedilerde klinik bulgular köpeklerden daha çok belirgin olabilir. Bunun yanı

sıra hastalık kedilerde hiçbir klinik bulgu görülmeksizin veya lenfadenopati ve ateĢle

seyreden ılımlı bir enfeksiyon olarak da gözlenebilir. Bazen hastalığın çok Ģiddetli

olduğu durumlarda öldürücü halde seyredebilir. Kedilerde bulaĢma yönünden

hastalık genellikle infekte artropodlar aracılığıyla, enfekte hayvanlar ile direkt temas

ya da infekte hayvan dokularının yenmesi ile bulaĢır. Genel olarak yüksek ateĢ,

depresyon, lenf nodüllerinde büyüme, apse, dil veya ağızda ülser, gastroenterit,

karaciğer ve dalakta büyüme, ikterus, iĢtahsızlık, kilo kaybı, pnömoni ve Ģok görülür

(Otlu, 2009).

Köpekler gerek bakteriyi taĢımakla rezervuar olarak gerekse kenelere

konakçılık yaparak önemli rol oynarlar (Otlu, 2009). Köpeklerde doğal enfeksiyon

nadir olarak bildirilmiĢtir ve bu hayvanlar hastalığa karĢı nispeten dirençlidirler.

Seropozitif köpeklerin varlığının bildirilmesi hayvanların bakteri ile doğal hayatta

karĢı karĢıya geldiğini göstermektedir. Klinik enfeksiyonun bildirimi az olmasına

rağmen seropozitif köpeklerin varlığı, tabiatta enfeksiyonun nadir olmadığını

hastalığın hafif veya subklinik seyrettiği fikrini desteklemektedir. Bunun yanısıra

diğer klinik belirtiler ateĢ, depresyon, göz ve burundan mukopurulent (irinli mukus)

akıntı temas alanlarında püstüller, ĢiĢmiĢ lenf yumruları ve iĢtahsızlık belirtileri ile

seyreden klinik tablo ortaya çıkmıĢtır. Olguların çoğunda hayvanlar destek tedavileri

ile kendi kendilerine iyileĢirler. Genç köpekler yetiĢkinlere göre daha duyarlıdır.

Köpeklere F. tularensis ile kontamine dokuların yedirilmesi sonucu oluĢan deneysel

infeksiyonda gözlenen belirtiler doğal enfeksiyonda gözlenen belirtilerle aynı

özellikleri taĢımaktadır. Ġntradermal inokulasyon sonucu oluĢturulan deneysel

20

infeksiyonda ise ateĢ, infeksiyon bölgesinde püstül oluĢumu ve bölgesel lenf

yumrularında yangı gözlemlenmiĢtir (Ünver, 2009).

YetiĢkin domuzlar tularemiye karĢı kısmen dirençli olmalarından dolayı

hastalık latent seyretmektedir. Gençlerde ateĢ, solunum güçlüğü ve depresyon

belirtileri gözlemlenmektedir. Yavrularda deneysel enfeksiyonda yaklaĢık iki günlük

inkübasyon döneminin ardından koordinasyon bozukluğu, depresyon, iĢtahsızlık ve

sinirsel belirtiler görülmektedir (Otlu, 2009).

Atlar tularemiye karĢı nispeten dirençlidirler ve atlarda klinik belirtilerin

bildirimi oldukça azdır. Enfekte atlarda ateĢ, solunum güçlüğü, depresyon,

koordinasyon bozukluğu, ataksi, bacaklarda ödem, yoğun kene enfestasyonu ve

serokonversiyon gözlemlenmiĢtir (Otlu, 2009).

Sığırlarda tipik klinik belirtiler tam olarak bilinmemesine rağmen, yaygın

olarak seropozitif sığırların bildirilmesi doğal enfeksiyonun varlığını göstermektedir.

Sığırlarda kene enfestasyonu ile F. tularensis arasında bir iliĢkinin mevcut olduğu

sonucunu ortaya koyan bir çalıĢma mevcuttur (Feldman, 2003).

1.3.3. Yabani Hayvanlarda Tularemi

Lagomorphalar ve rodentler hastalığa karĢı oldukça duyarlıdır. Doğal enfekte

olan bu hayvanlar çoğunlukla ölü olarak bulundukları için, bu hayvanlarda klinik

belirtiler tam ortaya konulamamıĢtır. Etkeni taĢıyan kene veya geyik sineğinin

ısırdığı bölgelerde ülseratif lezyonlar belirlenmiĢtir. Deneysel enfeksiyonlarda

zayıflık, ateĢ, ülserler, apseler, lenf yumrularında ĢiĢme, depresyon, iĢtahsızlık,

davranıĢ değiĢiklikleri gözlemlenmiĢtir. Ölümler genellikle 8-14. günlerde meydana

gelmektedir (Anonim, 2003a).

21

1.3.4. Tulareminin Biyolojik Silah Olarak Önemi

F. tularensis’in biyolojik silah olarak geliĢtirilmesine yönelik ilk çalıĢmalar

1930’lu yıllarda baĢlamıĢtır. Ġlk biyolojik silah üretimi ve denemeleri Japon Ordusu

tarafından 1932-1945 yılları arasında Mançurya’da gerçekleĢtirilmiĢtir. Ayrıca II.

Dünya SavaĢı sırasında Doğu Avrupa’da Alman ve Rus Askerleri’nde görülen farklı

klinik tularemi formlarının, F.tularensis’in Ruslar tarafından askeri saldırı amaçlı

kullanımına bağlı olabileceği öne sürülmüĢtür SavaĢ sonrası farklı ülkelerde F.

tularensis üzerindeki biyolojik silah kullanımı açısından çalıĢmalar devam etmiĢtir.

F. tularensis, biyolojik silah olarak aerosol formda ortama verilebileceği gibi, gıda

veya küçük su kaynaklarına yönelik sabotaj amacı ile de kullanılabilir. Ayrıca,

enfekte vektörler aracılığı ile hem insan hem de hayvanlara karĢı kullanılabilir (Kılıç,

2006).

Dünya Sağlık Örgütü Uzmanlar Komitesi’ne göre, aerosol formdaki 50 kg

virulent F.tularensis toz materyalinin 5 milyon nüfuslu kente havadan salınmasıyla

250.000 kiĢinin etkileneceği ve 19.000 kiĢinin öleceği hesaplanmıĢtır. Diğer bir

öngörü de ise aynı miktar bakterinin 500.000 nüfuslu bir kentin üzerinde 2 km

boyunca bir uçak tarafından salınması sonucunda 125,000 kiĢide tularemi geliĢeceği

30.000 kiĢinin hayatını kaybedeceği tahmin edilmektedir (Kılıç, 2006).

1.3.5. Tulareminin Bulaşma Yolları

Tularemi ile ilgili insandan insana aktarım yönünden hiçbir kanıt yoktur. F.

tularensis subsp. holarctica genellikle akarsu, gölet, göl ve nehirlerden izole

edilmiĢtir. Fakat, F. tularensis subsp. tularensis bulaĢması, tavĢan, kene ve koyun ile

ilgilidir. Tularemi epizootiyoolojisiyle ilgili döngü henüz tam olarak anlaĢılmıĢ

değildir. Örnek olarak, F. tularensis için rezervuar kabul edilen çeĢitli duyarlı

hayvanlar hakkında kısıtlı bilgiler olduğu gibi, benzer Ģekilde, hayvanlar arasında,

insanlar ve hayvanlar arasında F. tularensis bulaĢmasında farklı eklembacaklıların

rolü henüz tam olarak anlaĢılabilmiĢ değildir (Sjöstedt, 2007).

22

F. tularensis hayvanlarda ölümcül hastalık tablosu oluĢturabilirken, bazı

kemiricilerde belirgin bir klinik semptom oluĢturmadan aylarca varlığını sürdürebilir.

Bakterinin doğadaki yayılımını, karasal ve su döngüsü (aquatik) olmak üzere iki

bölümde incelemek mümkündür. Karasal döngü içerisinde yabani tavĢanlar, küçük

kara kemiricileri, artropodlar F.tularensis yönünden ana rezervuar olarak

gösterilebilmektedir. Keneler doğadaki enfeksiyon odaklarında kalıcılığı sağlamak

açısından önemli bir rol oynamaktadır. Etkeni özellikle ısırmayla konakların dolaĢım

sistemine bulaĢtırabilmektedir. Etken vahĢi hayvanlar arasında, vahĢi hayvanlardan

da sığır, keçi, koyun, at, domuz, kedi ve köpek gibi evcil hayvanlara genellikle

keneler ve kan emici sinekler aracılığıyla taĢınmaktadır. Bazı kene türlerinin yalnız

vektör olarak değil, bakteriyi vücudunda ömür boyu taĢıyarak aynı zamanda

rezervuar olarak görev yaptığı düĢünülmektedir. Ġnsanlardaki kene kaynaklı

enfeksiyonların çoğunluğu yaz mevsiminde görülmektedir. At sinekleri ve

sivrisinekler yoluyla mekanik vektörlük insana etkenin geçiĢi üzerine rol

oynamaktadır. Su ile iliĢkili F. tularensis subsp. holartica’nın doğadaki döngüsünde

kemirgenler (sıçan türleri, kunduz) ana rezervuar olarak rol almaktadır. F. tularensis

dıĢ ortam koĢullarına çok dayanıklıdır. Suda serbest yaĢayan amiplerden

Acanthamoeba castellani içinde yaĢamını sürdürebilmesinin su kaynaklı bulaĢ ve

hastalığın bölgesel dağılımında büyük rol oynadığı düĢünülmektedir. Etken, hayvan

leĢlerinde, suda, toprakta aylarca kalabilmektedir. Ayrıca samanda altı ay ve 15°C de

dondurulmuĢ tavĢan etinde yıllarca varlığını sürdürebilmektedir. Ġnsanlara hastalık

hayvanlardan 3 yolla buluĢabilmektedir. Bunlardan deri ve mukozal yol ile

bulaĢmanın, enfekte hayvan ve hayvan ürünleriyle, idrar, dıĢkı, kan ya da temas sonu

meydana geldiği bilinmektedir. Bu yolla insanlara hastalık bulaĢabilmektedir. Deri

ve mukozal yol ile enfeksiyon geliĢimi için 10-50 bakteri yeterli olabilmektedir. Bir

diğer bulaĢma yolu olan oral yol, enfekte hayvan dokusu ve çıkartıları ile kontamine

olmuĢ sularla ve hasta hayvanların etlerinin iyi piĢirilmeden tüketilmesiyle olan

bulaĢma Ģeklidir. Son olarak tanımlanan diğer bulaĢ Ģekli ise solunum yoluyla

olandır. Kontamine olmuĢ saman, ot ve yapraklar ayrıca tahıl hasatları sırasında

depolarda çalıĢanların toz partiküllerinin solunumla bulaĢma olabilmektedir.

Laboratuvar çalıĢanları da solunum yolu ile bulaĢma açısından risk grubunda yer

almaktadır (Anonim, 2011a).

23

Şekil 1.1. Tularemi’nin tabiattaki bulaĢma döngüsü (Anonim, 2011 c).

1.4. Patogenez

F. tularensis’in vücuda giriĢ yolu ve türü ile ilgili olarak infektif dozu

değiĢim göstermektedir. Etkenin insan vücuduna giriĢinde, intradermal veya

inhalasyonla 10-50 bakteri hastalık oluĢtururken, sindirim yoluyla girdiğinde 8-10

bakteri infeksiyon yapabilmektedir. F. tularensisin alttipleri ve çeĢitli canlılardaki

infeksiyöz dozları gösterilmiĢtir (Tablo 1.6.).

Kene

Pire

Sivrisinek

k

İnsan

Ġnek

Koyun

Kedi

Köpek

F. tularensis ile enfekte

vahĢi hayvanlar; tavĢan,

hamster, fare, sıçan,

sincap

Av hayvanları ile temas

Kontamine su içme ve et

yeme

Aerosollerin inhalasyonu

Isırık

Kontamine

materyal ile

Temas

24

Çizelge 1.2. F. Tularensis’in alttipleri ve çeĢitli canlılardaki infeksiyöz

dozları (Çelebi, 2004).

Etken Ġnfeksiyon geliĢimi

için CFU sayısı

Letal Doz 50 (LD 50 ) için gerekli CFU sayısı

(bakteri subkutan yolla verilmiĢtir)

Ġnsan Fare domuz TavĢan

Francisella

tularensis subsp. tularensis

< 10 < 10 < 10 1-10

Francisella

tularensis subsp. holarctica

< 103

< 1 < 10 > 106

Francisella

tularensis subsp.

mediaasiatica

? ? ? > 10

Francisella

tularensis subsp. novicida

> 103

< 103

< 103

> 103

Etken deriden girdikten 3-5 gün sonra deride küçük papül oluĢmaktadır. Bu

oluĢumdan 2-4 gün sonra bölgede ülserasyon gözlenmektedir. Bakterinin girdiği

yerde üremesi suretiyle bölgesel lenf nodüllerine geldiği, sonrasında lenfohematojen

yolla yayılım gösterip, ilerleyen zamanlarda lenf nodülleri, akciğerler, karaciğer,

dalak ve böbrekler gibi organları tutmaktadır. Tularemi geçirildikten sonra, humoral

ve hücresel bağıĢıklık geliĢir. Hastalığın 2-3. haftasında F. tularensis’e karĢı IgM,

IgG ve IgA tipi antikorlar oluĢur ve aglütinasyon testinde yer alırlar. Ancak koruyucu

olmamaktadırlar. Hastalığın tam olarak iyileĢmesi için hücresel immünitenin

yardımına ihtiyaç vardır. Tularemide tam iyileĢmeyi sağlayan hücresel immun

yanıttır . CD4+ ve CD8+ T hücreleri bu bağıĢıklıkta yer alır. Ġntrasellüler bir patojen

olan F. tularensis, makrofaj, hepatosit, endotel hücreleri gibi hücreler içerisinde

yaĢayabilir. Sistemik infeksiyonun sonlanması T hücrelerinin fonksiyonlarına

bağlıdır (Willke, 2006).

25

1.5. Tanı

1.5.1. Klinik ve Nekropsi Tanısı

Hayvanlarda Tularemi hastalığının klinik belirtileriyle ilgili tam olarak bir

bilgi olmamakla birlikte, çoğunlukla postmortem muayene önem taĢımaktadır.

Nekropsi sırasında en sık bulgu olarak büyümüĢ dalak ve karaciğerde beyaz nekrotik

lezyonların Ģekillenmesi dikkati çeker. Eldeki bu bulgularla Tularemiye duyarlı bir

hayvan türüyle karĢılaĢılmıĢ olması muhtemeldir denilebilir (Sjöstedt, 2007).

1.5.2. Laboratuvar Tanısı

F. tularensis’in kültürlerden baĢarılı bir Ģekilde izolasyonu, serolojik tanısı

(mikroaglutinasyon test, ELISA) ve moleküler yöntemlerle araĢtırılması ile teĢhis

etmek mümkündür (Porsch ve ark., 2004).

Laboratuvar teĢhisi, klinik örneklerin uygun bir Ģekilde alınması ve uygun

Ģartlarda laboratuvara iletilmesi ile yakından iliĢkilidir. Kültür iĢlemleri yüksek

güvenlikli laboratuvar (BGD3) ve deneyimli personel gerektirmektedir (Çelebi,

2010).

1.5.2.1. Laboratuvara Gönderilecek Örnek Seçimi

Tanı için alınacak örnekler yapılacak test yöntemine göre farklılık gösterir.

Hayvanlardan nekropsi sonrasında alınacak numuneler, kültür ve PCR için; akciğer,

karaciğer, dalak, lenf düğümleri, deri lezyonları veya böbrek dokuları (taze veya

dondurulmuĢ)’ dır (Forsman ve ark., 2007). Herhangi bir salgın sırasında etkilenen

bölgede akarsu ve kuyulardan su örnekleri alınabilir. Alınan bu su örnekleri

Tularemi hastalığından ölen enfekte memelilerin karkasları akarsu kenarlarında veya

kuyularda kaldığında, su F. tularensis ile kontamine olabilmekte ve etken bir aydan

26

uzun süre canlılığını sürdürebilmektedir. Ġçme suyu ile hayvanlar enfekte olabilir.

Kontamine su da insan ve evcil hayvanlar için son derece bulaĢıcı olabilir, yerel

epidemiler oluĢabilir (Forsman ve ark., 2007).

1.5.2.2. Kültür:

Tulareminin laboratuvar tanısında “altın standart” halen kültür yöntemidir. F.

tularensis geç ve güç üreyen nazlı bir bakteridir. Aerobik bakteridir ama % 5 CO2’ li

ortam üremeleri stimüle eder. 35-37°C’de 2-5 günlük inkübasyon sonrası koloni

oluĢtururlar. Ġnkübasyon 10.güne kadar uzatılmalıdır. Kültürde bakterinin izole

edilmesi kesin tanının yanında antibiyotik duyarlılığının ve kökenlerin orijininin

belirlenmesi (moleküler epidemiyolojinin) açısından da oldukça önemlidir.

Kontamine örneklerden bakterinin izolasyonu için besiyerine antibiyotik eklenir

(Willke, 2006).

1.5.3. Seroloji

Tularemi tanısında 1920’li yıllardan bu yana en sık kullanılan tanı yöntemi

serolojik testlerdir. Hasta serumunda serolojik olarak etkene karĢı geliĢen antikorlar

veya akut evrede bakteriye ait antijenler aranabilir. Tüp veya mikro-pleytlerde

yapılan aglütinasyon testlerinde F. tularensis’e karĢı geliĢen antikorların aranması

uygulanması en kolay tanı yöntemidir. Serolojik testler arasında Mikroaglütinasyon

testi (MAT) en sık kullanılan yöntemdir. Antikorlar, hastalık çıkıĢında semptomların

baĢlangıcından sonraki 6-10 gün içinde serumda belirir ve 4-7 hafta içinde tepe

noktasına ulaĢır. MAT testi ile temel olarak IgM sınıfı, daha az oranda ise IgG ve

IgA antikorları saptanır. F. tularensis antikorları uzun bir süre düĢük titrelerde pozitif

olarak kalır (Anonim, 2011a).

27

1.5.3.1. Mikroaglutinasyon Testi

Tularemi tanısında safranin-O ile boyalı tularemi antijeni kullanılmaktadır.

Bir gecelik inkübasyondan sonra uygun ıĢık kaynağının altında siyah zemin üzerinde

konkav ayna yardımıyla aglütinasyon değerlendirilir. 7-10 gün arayla alınan çift

serum örneğinde dört katlı antikor titre artıĢı akut enfeksiyona iĢaret etmektedir

(Brown ve ark., 1980; Johansson ve ark., 2007).

1.5.4. Moleküler Yöntemler

1.5.4.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Taksonomik sınıflandırmalar, günümüzde DNA baz temelli yaklaĢımlara

dayandırılabilmektedir. Bu geliĢme genusun sistematiğine kılavuzluk eden

filogenetik modellerin oluĢturulmasını kolaylaĢtırmaktadır. Bunun sonucunda ise,

baĢarılı epidemiyolojik araĢtırmaların yanısıra, kesin ekolojik analizler de

yapılabilmektedir. Tularemi hastalığının ekolojisi halen tam olarak anlaĢılabilmiĢ

değildir. Hastalığın rezervuar ve vektörlerine iliĢkin pek çok bilgi boĢluğu

bulunmaktadır. Moleküler analizlerle F. tularensis’in alttürlerinin DNA dizin temelli

tiplendirilmesi evrimsel zaman içerisinde güncel hale gelen, baĢarılı ve laboratuvar

çalıĢanları açısından güvenli bir yöntem olarak karĢımıza çıkmaktadır (Keim ve ark.,

2007). Tularemide kültür iĢleminin biyogüvenlik düzeyi 3 (BGD-3) laboratuvar

ortamına ve deneyimli personele ihtiyaç duyması nedeniyle, son yıllarda klinik

örneklerde bakteriye ait spesifik gen bölgelerinin Polimerase Chain Reaction (PCR)

ile gösterilmesi önem kazanmıĢtır (Çelebi, 2010).

28

1.6. Hayvanlarda Tularemi Teşhis Çalışmaları

Hayvanlarda tularemi teĢhisi, genellikle etken izolasyonu, moleküler

yöntemler ve serolojik testlerle yapılabilmektedir. Tularemi hastalığının hayvanlarda

varlığını saptamaya yönelik çeĢitli ülkelerde farklı hayvan türleri üzerine araĢtırmalar

yapılmıĢtır. Beth ve ark. (2004), 6 yaĢındaki bir kedinin mandibular bölgesinde

oluĢan bir kitleden yaptıkları bakteriyolojik incelemeler sonucunda F. tularensis

subsp tularensis tespit etmiĢlerdir. Kedinin tedavi edildikten bir yıl sonra

tromboemboli ve hipertrofik kardiyomyopati nedeniyle ötenazi yapıldığını,

sonrasında yapılan bakteriyolojik incelemelerde herhangi bir tularemi etkenine

rastlanmadığını belirtmiĢler, bu durumun insanlarda tulareminin ülseroglandüler

formuna benzediğini vurgulamıĢlardır. Zhang ve ark. (2006), Çin’de yaptıkları bir

çalıĢmada Jilin, Xinjiang, Heilongjiang, Inner Mongolia ve Zhejiang isimli yerleĢim

birimlerinden 420 adet rodent toplamıĢlardır. Toplanan rodentlerin dalak

örneklerinden PCR yöntemiyle yaptıkları çalıĢmada, 20 sinde F. tularensis tespit

etmiĢlerdir. YerleĢim birimlerine göre oranlarını ise; Jilin %11.65, Xinjiang %10.00,

Heilongjiang %6.56, Inner Mongolia %1.77 ve Zhejiang 4.76% olarak tespit

etmiĢlerdir. Lindley (2002), Teksas’ta bulunan 3600 çayır köpeğinden 250 adedinin

30 gün içerisinde öldüğü bir salgın bilgisiyle, hasta ve ölen hayvanları F.tularensis

yönünden incelemiĢtir. Francisella spp. olarak etkeni izole etmiĢ, PCR ile yapılan

incelemeler sonucunda ise F. tularensis tip B olarak belirlendiğini bildirmiĢtir.

Petersen ve ark. (2002), egzotik hayvan tesisinde yakalanan yabani çayır köpekleri

(Cynomys) üzerine yaptıkları bir araĢtırmada, Çek Cumhuriyeti ve Texas pet

shoplarına dağıtılan çayır köpeklerini F. tularensis etkeni yönünden incelemiĢlerdir.

Dağıtım tesislerinde bulunan 63 çayır köpeğinin doku örneklerini moleküler

tekniklerle incelemiĢler ve tüm izolatların F. tularensis subsp. holartica olduğunu

tespit etmiĢlerdir. Ayrıca köpek serumlarında Mikroaglutinasyon test yöntemiyle

bazı köpeklerde 1:4096 gibi yüksek titreler tespit etmiĢlerdir. Tüm seropozitif çayır

köpekleri F. tularensis kronik taĢıyıcısı olarak düĢünülmüĢtür.

29

Ortaya çıkan hastalıkla ilgili sonuçların ciddiyeti göz önüne alındığında, ticari olarak

satılan çayır köpeklerinden insanlara bulaĢma riski olabileceğini bildirmiĢlerdir.

Baskerville ve ark.’nın 1978 yılında saba maymunları üzerine yaptığı bir

çalıĢmaya göre, F. tularensis SCHUS4 suĢunun intranazal verilmesiyle 4 gün

içerisinde hayvanlarda genel durum bozukluğu ile can çekiĢmelerin olduğu

belirtilmiĢtir. Klinik olarak, bol mukopurulent akıntı, rinit ve farenjit, üst solunum

yolları ile karakterize hastalık tablosu gözlemlemiĢlerdir. Histopatolojik incelemede,

akciğer enfeksiyonunun tüm maymunlarda, alt solunum yolları enfeksiyonunun etken

verildikten sadece 6 gün sonra geliĢtiği bulgular arasına kaydedilmiĢtir. Bununla

birlikte, bölgesel lenf düğümleri, dalak ve karaciğerin etkilenmiĢ olduğu, karaciğerde

çok sayıda makroskopik olarak lezyonlar oluĢtuğu, dalakta ise geniĢ nekrotik alanlar

gözlemlenmiĢtir.

Müller ve ark.

(2007), Almanyada ilk kez Avrupa kahverengi yaban

tavĢanında (Lepus europaeus) F. tularensis etkenini kültürel olarak tespit etmiĢlerdir.

Ayrıca, PCR yöntemiyle bu etkenin F. tularensis subsp. holartica olduğunu tespit

etmiĢlerdir. Bu çalıĢmada Almanya’da Tularemi epidemiyolojisi tartıĢılıp, insanlar

üzerindeki risk değerlendirmelerinin yapılması gerekliliği ortaya konulmuĢtur.

Mörner ve Mattson (1983), Ġsveç’in güneyinde Ystad’da ölü buldukları bir Ģahinin

karaciğer ve dalak örneklerinden fluoresan antikor tekniğiyle yaptıkları araĢtırmada

F. tularensis pozitif bulmuĢlardır. Ayrıca Ġsveç’in kuzeyinde bir köyde yetiĢkin bir

baykuĢta tedirgin davranıĢlar, kısıtlı hareketleri izlemiĢler, birkaç gün sonra

öldüğünü gözlemlemiĢlerdir. Bu baykuĢun organlarından sisteinli zenginleĢtirilmiĢ

besiyerine ekimler yaptıktan sonra çok küçük F. tularensis benzeri kolonilerin

oluĢtuğunu tespit etmiĢlerdir. Ġzolatları Moskova’da bulunan Tularemi referans

laboratuarına göndermiĢler ve kesin teĢhisin yapıldığını bildirmiĢlerdir. Bu

çalıĢmayla F. tularensis’in Ģahin ve baykuĢlar üzerine de öldürücü rol üstlendiği

belirtilmiĢtir.

30

Türkiye’de hayvanlarda Tularemi araĢtırmaları Veteriner Hekimlik alanında

yok denecek kadar azdır. Tularemi hastalığının koyunlarda araĢtırılması üzerine

Kafkas Üniversitesi’nden ġeyda (1996)’nın doktora tez çalıĢması bulunmaktadır.

ÇalıĢma, Kars ilinde yürütülmüĢ olup, il merkezi ve kırsalındaki koyunlarda

Tularemi insidensi %0.14 olarak belirlenmiĢtir.

1.7. Sağaltım

F. tularensis’in hücre içi patojen olması nedeniyle uzun süreli tedavi

gerektirebilir. Hayvanlarda da hastalığın tedavisi ve Ģiddetinin azaltılmasında

streptomisin, gentamisin, tetrasiklin, kloramfenikol ve florokinolonlar öncelikli

kullanılan antibiyotiklerdir. Tedaviye erken baĢlanılması ve erken teĢhisle hastalığın

Ģiddetini ve kayıplarını azaltmak mümkündür. Hastalığın seyrine göre antibiyotik

tedavisinin yanısıra destek tedavisi de uygulanabilir. Hayvanlarda Tularemi tedavisi

üzerine yapılan denemeler oldukça az bulunmaktadır. Bu sebeple insandaki

sonuçlara göre tedavi seçenekleri uygulanmaktadır. Kuzulara uygulanan

oksitetrasiklinin (6-10 mg/kg) penisilin ve streptomisinden daha etkin olduğu

bildirilmiĢtir. Farelerde Tularemi tedavisinde Siprofloksasin ve doksisiklin

kullanılabilir. Ġnvitro antibiyotik duyarlılık testlerinde insan ve hayvan kaynaklı

F.tularensis suĢlarının Tularemi tedavisinde kullanılan klasik antibiyotiklere

(streptomisin, tetrasiklin, kloramfenikol, aminoglikozitler) duyarlı olduğu ancak

kinolonların (siprofloksasin ve grepafloksasin) daha etkili olduğu bildirilmiĢtir

(Ünver, 2009 ).

Kedi ve köpeklerde Tularemi tedavisinde genellikle gentamisin (6.6 mg/kg),

doksisilin (5mg/kg), kloramfenikol ve (kedilerde 50mg/kg, köpeklerde 100mg/kg),

enrofloksasin (2.5 mg/kg) kullanılması önerilmektedir (Anonim,2003a).

F. tularensis subsp. tularensis ve F. tularensis subsp. holartica’nın

rifampisine duyarlı olduğunu ayrıca aminoglikozidler ve kinolonlarla kombine

olarak kullanımında daha da etkili olduğu tespit edilmiĢtir ( Ikaheimo ve ark., 2000).

31

Gentamisin ve enrofloksasin tedavileri 10 gün, doksisilin ve kloramfenikol

tedavileri ise 14 gün süreyle uygulanmalıdır. Böbrek yetmezliği var ise ilaçların dozu

ayarlanmalıdır (Ünver A, 2009).

1.8. Koruma

Ġnsanlarda meydana gelen Tularemi salgınları, enfekte hayvanlar ile doğrudan

temas ile ortaya çıkabilir, vektörler tarafından hastalığın taĢınması aerosol

inhalasyon, enfekte su ve gıda maddeleriyle etkenin ağızdan alımı sonucunda

oluĢabilir. Bazı salgınlar birkaç farklı yoldan ortaya çıkabilir (Forsman ve ark.,

2007). Günümüzde Tularemi üzerine lisanslı bir aĢı bulunmamaktadır. Bununla

birlikte, hastalığın laboratuvar çalıĢanlarına bulaĢmasının önlenebilmesi için aĢının

gerekliliği vurgulanmaktadır (Chu ve ark., 2007).

Tulareminin endemik olduğu bölgelerde hayvanların baĢta lagomorf ve

rodentler gibi hasta veya ölü hayvanlara temas etmemeleri sağlanmalıdır. Bu

bölgelerde kedi ve köpek gibi evcil hayvanlar mümkün olduğunca kapalı alanlarda

tutulmalıdır. Pet hayvanlarının lagomorflar ve rodentlerin doğal hayat alanlarına

girmelerine ve özellikle av köpeklerinin av sırasında tavĢanları yemelerine izin

verilmemelidir. Tularemi endemik doğal alanlardaki su kaynakları ve akarsulardan

evcil hayvanlar uzak tutulmalıdır. Tabiatta lagomorflar ve rodentlerde gözlemlenen

ölüm olaylarına rastlanıldığında ve evcil hayvanlarda yüksek ateĢ ve lenfadenopati

gözlemlendiğinde lokal veteriner veya sağlık birimlerine acilen bildirilmelidir.

Hayvanlarda Tularemi’nin kontrolü zordur. Kene enfestasyonunun azaltılması ve

erken teĢhis/tedavi uygulanması önemlidir. Koyunlarda Tularemi salgınlarında ilk

yapılacak iĢ artropod vektörlerin eliminasyonu amacıyla insektisit sprey ve solüsyon

uygulanmasıdır. Kenelerin yaygın olduğu bölgelerde hayvanlar çayır ve meralardan

uzak tutulmalı ve genel kene mücadelesi yapılmalıdır. Ayrıca etkenin biyolojik silah

olarak kullanılma potansiyeli de dikkate alınmalıdır. Hastalıktan iyileĢme sonucunda

uzun süreli bir doğal-aktif bağıĢıklığın kalması söz konusudur. Hayvanlar için canlı

attenüe bir aĢı geliĢtirilme aĢamasında olmasına rağmen günümüzde hayvanlarda

32

Tularemiye karĢı aktif koruma amacıyla üretilen bir aĢı mevcut değildir (Öztoprak,

2009).

1.9. Biyogüvenlik ve Tularemi

F. tularensis ile ilgili mikrobiyolojik tanı, araĢtırma ve antijen üretimi

alanında çalıĢacak tüm kurumların öncelikle tüm personelinin sağlıklı ve güvenli bir

ortamda çalıĢmasını sağlamak amacıyla “Risk Değerlendirme” programı yapılması

zorunludur. Risk değerlendirme kuralları; etkenin bulaĢma yolları, laboratuvar tesis

tasarımı hakkında bilgilendirme, laboratuvar kaynaklı enfeksiyonların önlenmesinde

uygulanabilecek stratejiler, çevre ve mesleki riskler konusunda personel eğitimi,

fiziksel ayırma ve enfeksiyöz etkeni çevreleme gibi kapsamlı bilgileri içermektedir

(Sewell, 1995).

F. tularensis, laboratuvar kaynaklı çalıĢmalarda önemli bir tehlike teĢkil

etmektedir. Uygun laboratuvar olanakları, eğitimli personel ve çalıĢma koĢullarının

bu patojen ile çalıĢan kurumlarda olması esastır (Titball ve ark., 2007). Doğal veya

deneysel olarak Tularemi yönünden enfekte hayvanlar veya bunların ektoparazitleri

ile laboratuvar çalıĢmaları sırasında çalıĢanlarda enfeksiyon geliĢtiği bildirilmiĢtir.

Laboratuvar kaynaklı Tularemi enfeksiyonlarında etkenin aerosol yolla alınmasının

ana bulaĢma kaynağı olduğu bilinmektedir (Pike, 1976).

F. tularensis ile çalıĢma protokolleri incelendiğinde;

Biyogüvenlik II uygulamalarında, koruyucu ekipmanlar ve laboratuvar alt

yapısı F. tularensis içeren veya içerme olasılığı olan insan ve hayvan kaynaklı

materyallerin çalıĢılması amaçlanmıĢtır. Laboratuvar personeli kesinlikle klinik ön

tanı hakkında bilgilendirilmelidir. Biyogüvenlik II laboratuvar koĢullarında serolojik

çalıĢmalar yapılabilir. Biyogüvenlik 3 laboratuvarları ve uygulama prosedürleri

Ģüpheli kültür, hayvan nekropsi ve deneysel hayvan çalıĢmalarındaki tüm iĢlemler

için önerilmektedir.

33

Kültür ve kontamine materyallerin otomatik tanımlama sistemleri için

hazırlayıcı çalıĢmaları da Biyogüvenlik III laboratuvarında yapılmalıdır. F. tularensis

ile çalıĢan veya çalıĢmayı planlayan bir laboratuvarın biyogüvenlik düzeyi F.

tularensis suĢunun virulansına, uygulanacak çalıĢmaya, deneysel yönteme ve ulusal

ya da uluslararası laboratuvar standartlarına bağlıdır (Kılıç, 2009).

Bu tez çalıĢması ile, halk sağlığı açısından önemli bir zoonoz olan

Tularemi’nin, muhtemel rezervuar hayvanlarda izolasyon ve PCR yöntemi ile teĢhisi,

koyunlarda ise serolojik yöntemlerle incelenmesi amaçlandı.

34

2. GEREÇ VE YÖNTEM

2.1. GEREÇ

2.1.1. Örnekler

Tularemi yönünden insanlar için mihrak bilgisi alınmıĢ bölgelerde ve su

depolarının kenarlarında ev ve ahırların çevrelerinden rodent materyali, su ve

koyunlardan kan örnekleri toplandı. Su örnekleri, köy çeĢmesi, dere su deposu ve ev

Ģebeke suyundan olmak üzere 4 adettir. Toplamda 445 örnek incelenmiĢtir. Bu

örneklerin yerleĢim birimlerine göre dağılımı çizelge 2.1. de gösterilmiĢtir.

Çizelge 2.1. Ġncelenen rodent, koyun kanı ve su materyallerinin yerleĢim

birimlerine göre dağılımı

Yerleşim Birimi Rodent Koyun Kanı Su

Van 3 - -

Ankara-Beypazarı 3 101

4

Ankara-Altındağ - 46

-

Bursa M.Kemalpaşa 10 159 -

Zonguldak Kurtköy

3

20 -

Ankara Bala

7 75 -

Sivas Gürün

9 - -

Yozgat 5 - -

Toplam 40 401 4

35

2.1.2. Besiyerleri

Rodent iç organlarından etken izolasyonu için; antibiyotikli Francis

medium kullanıldı. Besiyeri içeriği; Brain Heart infusion agar, %1 Dextroz (Difco),

%0.1 L-Cystein (Aldrich), koyun kanı (%8-9), antibiyotikler (penicillin G 1ml/100

IU, Cyclohexamide L/100mg, Polimixin B l/8x104) ve helikobakter suplementi

eklenerek hazırlandı (Anonim, 2003b; Johansson ve ark., 2007).

Su örneklerinden izolasyon çalıĢmasında ve rodent iç organlarından

etken izolasyonu için antibiyotikli Francis medium kullanıldı. Ġzole edilen suĢların

saklanması amacıyla da %20 Gliserin (Merck) ilave edilmiĢ Trypticase Soy Broth

(TSB, Oxoid)’dan yararlanıldı (Anonim, 2003b; Johansson ve ark., 2007).

2.1.3. Standart suşlar

ÇalıĢmada kültürden izole edilen suĢların tanımlanmasında ve besiyerinin test

edilmesinde, rodent ile su örneğinin moleküler incelemelerinde pozitif kontrol olarak

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Koleksiyonu’ndan sağlanan F. tularensis subsp.

holarctica (NCTC 10857) suĢu kullanıldı. ÇalıĢmada kültürden izole edilen suĢların

tanımlanması besiyerinin test edilmesinde, rodent ile su örneğinin moleküler

incelemelerinde pozitif kontrol olarak Türkiye Halk Sağlığı Kurumu

Koleksiyonu’ndan sağlanan F. tularensis subsp. holarctica (NCTC 10857) suĢu

kullanıldı. Moleküler incelemelerde alttür tayini için bir diğer pozitif kontrol olarak

F. tularensis subsp. tularensis (SCHU S4) suĢu kullanıldı..

2.1.4. Antijenler ve Antiserumlar

2.1.4.1. Mikroaglutinasyon test (MAT) antijeni

Antijen olarak, F. tularensis subsp. holarctica (NCTC 10857) aĢı suĢundan

hazırlanmıĢ ve safranin O ile boyalı Tularemi antijeni (Türkiye Halk Sağlığı

Kurumu’nda hazırlanmıĢ) mikroaglutinasyon testinde kullanıldı.

36

2.1.4.2. Antiserum

Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Ulusal Tanı Referans Laboratuvarında

hazırlanmıĢ F. tularensis antiserumu kullanıldı. F. tularensis antiserumu, lam

aglutinasyonunda, üreyen kolonilerin doğrulanması ve mikroaglutinasyon testinde

pozitif kontrol (titresi 1/160) olarak kullanıldı.

2.1.5. PCR malzemeleri

2.1.5.1. Sarf malzemeleri

PCR’da Etanol (%95’lik) (Merck), QIAamp DNA mini kit (Qiagen,

Almanya), Tris Borik asit EDTA (TBE) (AppliChem), 10xPCR Buffer (Qiagen), 25

mM MgCl2 (Qiagen), 10 mM dNTP karıĢımı (Qiagen), Taq DNA polimeraz

(Qiagen), Primerler (metabion), DNA marker (100 bp), BSA (Sigma –Aldrich)

(Qiagen), Agarose (Prona), Ethidium Bromide (Qiagen), 6x Loading Dye (Qiagen)

kullanıldı (Johansson ve ark., 2007).

37

2.1.5.2. Primerler

Etken tür tayininde kullanılan primer baz dizileri çizelge 2.2’de sunulmuĢtur.

Çizelge 2.2. Primerlerin baz dizileri bağlandıkları spesifik gen bölgeleri, PCR

ürünlerinin uzunlukları.

Primer

Adı Sekans

Hedef

Gen

Bölgesi

Ürün

Uzunluğu

Kaynak

Literatür

Tul 4-

435 (F)

5`-GCT GTA TCA TCA TTT

AAT AAA

CTG CTG-3’

tul 4 420 bp Sjöstedt ve ark.

(1992) Tul 4-

863 (R)

5`-TTG GGA AGC TTG TAT

CAT GGC ACT-3’

38

Etkenin alt tür tayininde kullanılan primerler çizelge 2.3’de sunulmuĢtur.

Çizelge 2.3. Alt tür tayininde kullanılan primerlerin baz dizileri bağlandıkları

spesifik gen bölgeleri, PCR ürünlerinin uzunlukları.

Primer

Adı Sekans

Hedef

Gen

Bölgesi

Ürün

Uzunluğu

Kaynak

Literatür

RD1 (F)

RD1 (R)

5′-TTT ATA TAG GTA AAT

GTT TTA CCT GTA CCA-3′

5′-GCC GAG TTT GAT GCT

GAA AA-3′

rd1 924 bp

Broekhuijsen

ve ark. (2003).

2.1.5.3. Cihaz ve Ekipmanlar

Manyetik karıĢtırıcı (MK 03 Ġnüvemix, Türkiye), 9 mm çapında petri,

otoklav (MLS 3020U; Sanyo,Japan), Hassas terazi (Presica 220, Switzerland), steril

laminar akımlı güvenlik kabini (Clean Air, Waerden, The Netherlands), hepafiltreli

yüz maskesi (3M, 9211 N95), koloni Mikroskobu (S7-PT, Olympus, Japan), latex

muayene eldiveni (Plusmed, Türkiye), tek kullanımlık plastik öze (Looplast, Italy),

buzdolabı (+4°C) (T 4042; Sanyo, Japan), su filtrasyon cihazı (Sartorius stedim

biotech), santrifüj (Labofuge 200 Heraeus, Germany), Vortex (Velp, Italy), penset,

asetat membran steril filtre( 0,20μm çaplı), bistür, Etüv-CO2 li inkubatör (sanyo,

Japan), donmaya dayanıklı 2ml.lik Kriovial tüp (TPP, Germany), 96’lık U tabanlı

pleyt, Otomatik Pipet (BIOHIT, Proline Isolab), Steril pipet ucu (Eppendorf

39

Reference, Germany), vorteks (Fine Vortex), DNA Thermal Cycler (Biometra), Jel

elektroforez cihazı ve güç kaynağı (Wealtec elite 3000 plus), UV transillüminatörlü

bilgisayarlı görüntüleme sistemi (Gene Genius, Syngene, Bio Imaging System) ve

Termal printer (Sony) kullanıldı.

2.2 YÖNTEM

2.2.1. İzolasyon çalışmaları

2.2.1.1. Besiyeri Sterilite Kontrolü

Besiyeri kontaminasyon kontrolü amacıyla, hazırlanan Francis besiyeri

gruplarından birer örnek 37°C’de 24 saat süreyle inkübe edilmek suretiyle sterilite

açısından kontrol edildi.

2.2.1.2. Besiyeri Üreme Kontrolü

Hazırlanan Francis besiyerine standart pozitif suĢ kullanarak ekimler yapıldı.

37°C’de %10 CO2’li etüvde inkübe edilerek, besiyerinde üremeler kontrol edildi

(Resim 2.1.).

40

Resim 2.1. Pozitif kontrol suĢunun (F. tularensis subsp. holartica NCTC

10857) Francis besiyerinde görüntüsü.

2.2.1.3. Rodent örneklerinden etken izolasyonu

F. tularensis yönünden bakteriyemik rodentlerin tespit edilmesi amacıyla 40

rodentin karaciğer ve dalak örneklerinden antibiyotik katkılı defibrine koyun kanlı

Francis mediuma ekimler yapıldı. Besiyerine ekim iĢlemlerinden sonra 37°C’de

%10 CO2 li etüvde kültürler 10 gün süre ile inkubasyona bırakıldı. Besiyeri gün aĢırı

düzenli olarak kontrol edildi. ġekillenen kolonilerin geliĢme zamanı, koloni

morfolojisi, fiziksel özellikleri değerlendirildi (Johansson ve ark., 2007).

2.2.1.4. Su örneklerinden etken izolasyonu

Etken izolasyonu için toplanan her biri 500 ml olan numune kaplarındaki 4

ayrı kaynaktan alınan su numunesi kullanıldı. Su örneklerinin (500-1000 ml)

filtrasyon iĢleminde kullanılan filtrasyon cihazı alkol ile ıslatıldı ve alev ile alkolün

yanması sağlandı. Su numuneleri selüloz asetat membran steril filtrelerden (0,20

41

μm çaplı) geçirildi. Antibiyotik katkılı defibrine koyun kanlı Francis mediuma

ekimler yapıldı (Johansson ve ark., 2007, Ulu Kılıç ve ark., 2011). Ġnkubasyon

sonrasında üreyen koloniler F. tularensis müspet standart immunserum ile lam

aglutinasyon teste tabi tutuldu (Resim 2.2.).

Resim 2.2. Ġncelenen su örneklerinin filtrasyonu

Fitreleme iĢlemi bittikten sonra steril pens yardımı ile tutulan membran

filtre, süzgeç üzerinden alındı. Alınan filtre, kirli yüzeyi üste gelecek Ģekilde

hazırlanan antibiyotik katkılı defibrine koyun kanlı Francis medium besiyeri

üzerine yerleĢtirildi ve 37°C’de %10 CO2’li etüvde 10 gün süre ile inkubasyona

bırakıldı. Kültürler üreme açısından günlük olarak kontrol edildi (Resim 2.3.).

42

Resim 2.3. Su örneğinin filtrasyon iĢleminden sonra Francis besiyerine

ekim görüntüsü

Ġnkubasyon sonrası Ģekillenen kolonilerin makroskobik ve mikroskobik

morfolojileri incelendi. ġüpheli kolonilerden F. tularensis antiserumu ile lamda

aglutinasyon testi ve moleküler tekniklerle izolatın doğrulanması yapıldı. Pasajlarda

Ģekillenen koloniler %20 gliserol içeren BHI buyyon içine alındı, krioviallerde -80

°C de saklandı. Bir kısmı da 1 ml distile su içeren ependorf tüplere alınarak PCR’da

kullanılmak üzere -20°C de saklandı.

43

2.2.2. Seroloji

2.2.2.1. Mikroaglutinasyon Test

Koyun kan serumlarında F. tularensis’e özgü aglutininler, F. tularensis

(NCTC 10857) suĢundan hazırlanmıĢ antijenin (%0,004 safranin-O içeren)

kullanıldığı mikroaglutinasyon test yöntemi (MAT) ile araĢtırıldı (Brown ve ark

(1980).

Koyunların vena jugularisinden 9 ml.lik vakumlu jelli tüplere kanlar alındı.

Kan numuneleri, 1500 devirde 5 dakika santrifüj edilerek serumları ayrıldı. Serumlar

2 ml.lik cryotüplere aktarıldı. Koyunlarda Tularemi tanısında safranin-O Ġle Boyalı

Tularemi antijeni ile mikroaglütinasyon test metodu kullanıldı. Öncelikle U tabanlı

pleytin ilk çukuruna 40 µl, diğer 6 çukura 25 µl Serum fizyolojik konuldu. Sekizinci

çukura tularemi antikoru pozitif olduğu bilinen 25µl serum konuldu (pozitif kontrol

1/160 titrede), daha sonra ilk çukura 10 µl hasta serumu (HS) eklendi. Pipetle

karıĢtırıldıktan sonra ilk çukurdan diğer çukura 25 µl aktarıldı. Benzer Ģekilde diğer

çukurlarda serum dilusyonlarına devam edildi. Altıncı çukurdaki dilüsyondan sonra

25 µl.lik kısım atıldı. Yedinci çukura hasta serumu konulmadı (negatif kontrol). Tüm

sekiz çukura 25 µl boyanmıĢ antijen eklendi. 1/10-1/640 arası sulandırmalar elde

edildi. Pleytin üzeri kapatıldı. NemlendirilmiĢ ortamda pleyt kutu içerisinde içinde

etüve kaldırıldı. Etüvde bir gecelik 37˚C’lik inkübasyondan sonra uygun ıĢık

kaynağının altında siyah zemin üzerinde konkav ayna yardımıyla aglütinasyon

değerlendirildi. Değerlendirme; pozitif ve negatif kontroller ile antijen kontrolüne

göre yapıldı. Antijen-antikor kompleksinin dantela tarzında çökmesi ve

süpernatantın tümüyle berrak olması pozitif reaksiyon olarak değerlendirildi. Açık

kırmızı renkli dilüentin çevrelediği merkezde toplanmıĢ düzgün kenarlı düğme

Ģeklinde çökme negatif reaksiyon Ģeklinde değerlendirildi (Brown ve ark., 1980,

Gürcan ve ark., 2009).

44

2.2.3. PCR Analizi

Kültür pozitif su örneği ve rodent karaciğer, dalak örneklerinden moleküler

tanı amacıyla konvansiyonel PCR (Polymerase Chain Reaction) yöntemi kullanıldı.

Sırasıyla ekstraksiyon, amplifikasyon, elektroforez ve görüntüleme iĢlemleri

gerçekleĢtirildi.

Rodent örneklerinin PCR çalıĢmasında bakteri DNA’sı, QIAamp DNA mini

kit (Qiagen, Almanya) kullanılarak saflaĢtırıldı. F. tularensis’in moleküler

tekniklerle doğrulanmasında; tür düzeyinde tanımlanması ve alt türlerin tayinine

yönelik olmak üzere iki aĢamalı PCR yontemi kullanıldı. Ġlk aĢamada, alınan rodent

örneklerinden direkt olarak genetik materyalin saptanması ve kültür pozitif su

örneğinin doğrulanması amacıyla 17 kDa membran proteinini kodlayan tul4 geni

araĢtırıldı (Sjostedt 1992).

Kültür pozitif su örneğinde, F.tularensis alt turlerinin ayırımı icin de

“Farklılık Bölgeleri 1 (Regions of Difference; RD1)”i hedef gen dizileri amplifiye

edildi (Broekhuijsen ve ark., 2003), (Sjöstedt ve ark., 1992).

2.2.3.1. Rodent doku örnekleri için PCR Analizi

2.2.3.1.1. Ekstraksiyon

DNA ekstraksiyonunda ticari QIAamp DNA mini kit (Qiagen, Almanya)

kullanılarak saflaĢtırıldı. Protokol olarak kit prosedürü içerisinde bulunan dokulardan

DNA Purifikasyonu protokolü seçildi. Bu prosedüre göre DNA ekstraksiyonu

aĢağıda belirtildiği gibi yapıldı.

45

25mg (karaciğer ve dalak) organ parçasından alınıp, bistüri ile küçük parçalara

bölündü. Üzerine 1-2ml kadar steril distile su ekleyerek mikser yardımıyla

tamamen parçalandı.

Bu karışımı 2 ml'lik eppendorfa alınıp yaklaşık üzerine 180 mikrolitre ATL buffer

eklendi.

20 mikrolitre proteinaz K eklendi vortex yapılarak ısı bloğuna 56 derece (organ

tamamen lize olana dek) kaldırıldı. İşlem süresince 20 dakika aralıklarla ısı

bloğundan alınıp vortexlendi, tekrar ısı bloğuna kaldırıldı.

200 mikrolitre AL buffer eklendi, vortex yapıldı.

200 mikrolitre %96'lık ethanol ekleyerek vortex yapıldı.

Hazırlanan lizat spin column tüpe aktarıldı.

8000 g de 1 dak. santrifüj edildi, koleksiyon tüpü atılarak yeni 2 ml lik koleksiyon

tüpü takıldı

500 mikrolitre AW1 bufferdan eklendi, 8000 g de 1 dak. santrifüj edildi. Koleksiyon

tüpü atılarak spin column koleksiyon tüpüne takıldı.

500 mikrolitre AW2 bufferdan eklendi ve 140000 g de 3 dak. santrifüj edildi.

Koleksiyon tüpünü atılarak spin column 1,5 ml'lik eppendorfa takıldı.

200 mikrolitre AE buffer eklendi ve oda ısısında 1 dak. inkubasyonu takiben, 8000 g

de 1 dak. santrifüj edildi.

Spin column atılarak 1.5 ml.lik ependorf içerisinde saf DNA elde edildi.

46

2.2.3.1.2. PCR Karışımının Hazırlanması

PCR karıĢımı, her bir örnek için;

Distile su 33.1 µl

10X PCR Buffer 5 µl

25 mM MgCl2 5 µl

BSA 1 µl 45µl

10 mM dNTP mix 0.5 µl

Primer I 0.1 µl

Primer II 0.1 µl

Taq DNA polimeraz 0.2 µl

olacak Ģekilde hazırlandı.

Bu ana karıĢımdan tüplere 45’er µl dağıtıldı ve her tüpe 5 µl örnek DNA sı

eklenerek her bir tüp için toplam reaksiyon hacmi 50 µl’ye tamamlandı. Bu karıĢıma

göre hazırlanan örnekler çoğalma için önceden programlanmıĢ ısı döngü (thermo

cycler) cihazına yerleĢtirildi.

PCR uygulamasının her aĢamasında kontaminasyonun önlenmesi ve toksik

maddelerden korunmak amacıyla eldiven kullanıldı. Tepkime türlerinin DNA

kontaminasyonundan korunması amacıyla; tepkime karıĢımlarının hazırlanması,

örneklerin PCR için hazırlanması, amplifikasyon ve elektroforez aĢamaları ayrı

odalarda yapıldı. Odalar arasında araç gereç ve kimyasal çözelti alıĢveriĢi yapılmadı.

Deney sırasında tek kullanımlık pipet uçları ve tüpler kullanıldı. Tepkime

karıĢımlarının hazırlanması ve örneklerin PCR için hazırlanması aĢamaları

biyogüvenlik sınıf II kabinlerinde gerçekleĢtirildi. ÇalıĢmadan önce kabinlerin içi ve

kullanılan aletler en az yarım saat ultraviole ile ıĢınlandı, %10 luk sodyum hipoklorit

ve %70 lik etil alkolle silindi.

47

Tepkime karıĢımlarının hazırlanması sırasındaki kontaminasyonları

belirlemek için, her bir amplifikasyon setinde F. tularensis DNA pozitif ve ayrıca hiç

DNA içermeyen negatif kontroller (tepkime karıĢımında kalıp DNA nın

bulunmaması) kullanıldı.

2.2.3.1.3. Amplifikasyon

Amplifikasyon iĢlemi sırasında hedef DNA baĢlangıçta 94°C’de 4 dk

bekletilerek denatüre edildi. Bu aĢamadan sonra;

95°C’de 40 sn denatürasyon

64°C’de 30 sn primerlerin bağlaması

72°C’de 45 sn primerlerin yeni DNA zincirinin sentezlenmesi olmak üzere toplam

30 döngü yapıldı. En son aĢamada 72°C’de 5 dk bekletilerek reaksiyon tamamlandı.

Amplifikasyon sonrasında reaksiyon tüpleri değerlendirme aĢamasına kadar 4°C’de

bekletildi.

Birinci amplifikasyondaki değerlendirme sonrasında, negatif sonuç alınan

örnekler için aynı amplifikasyon iĢlemi yeniden tekrarlandı.

Bu primerlerin kullanıldığı PCR amplifikasyonu ürünleri için %2 lik agaroz

jel elektroforezinde 420 bp lik bölgede bantın görülmesi Francisella spp. PCR (+),

bantın gözlenmemesi PCR (-) olarak değerlendirildi ( Sjöstedt A ve ark 1992).

2.2.3.2. Kültür Pozitif Su Örneği İçin PCR Analizi

Kültür pozitif su örneğinin doğrulanması amacıyla, rodent örneklerinde

olduğu gibi konvansiyonel PCR yöntemi kullanıldı. Sırasıyla ekstraksiyon,

amplifikasyon, elektroforez ve görüntüleme iĢlemleri gerçekleĢtirildi. Ancak sudan

izole edilen izolata uygulanan PCR prosedürü aĢağıda belirtildiği gibi uyguılandı.

48

2.2.3.2.1. Ekstraksiyon

Su örneğinden DNA elde edilmesinde ön çalıĢmada Zhai ve ark. (2002)’nın

kullandığı kaynatma yöntemi seçildi. Bu amaçla;

1. Besiyerinde şekillenen koloniden 500 µl PBS (phosphate-buffered saline)

Ġçeren ependorf tüplerine alındı ve iyice karıĢtırıldı.

2. Hazırlanan karışım örnek 10 dk kaynatıldı.

3. Tüpler 2500xg de 5 dk santrifüj edilerek bakterilerin dibe çökmesi sağlandı.

4. Üstteki sıvı steril bir ependorf tüpüne alınarak -20 °C’de saklandı.

2.2.3.2.2. PCR Karışımının Hazırlanması

PCR karıĢımı, her bir örnek için;

Distile su 34.1 µl

10XPCR Buffer 5 µl

25 mM MgCl2 3 µl

BSA 1 µl 45 µl

10 mM dNTP mix 1 µl

Primer I 0.1 µl

Primer II 0.1 µl

Taq DNA polimeraz 0.25 µl

olacak Ģekilde hazırlandı.

Bu ana karıĢımdan tüplere 45’er µl dağıtıldı ve her tüpe 5 µl örnek DNA’sı

eklenerek toplam reaksiyon hacmi 50 µl’ye tamamlandı. Bu karıĢıma göre hazırlanan

49

örnekler çoğalma için önceden programlanmıĢ ısı döngü (thermo cycler) cihazına

yerleĢtirildi.

PCR uygulamasının her aĢamasında kontaminasyonun önlenmesi ve toksik

maddelerden korunmak amacıyla eldiven kullanıldı. Tepkime türlerinin DNA

kontaminasyonundan korunması amacıyla; tepkime karıĢımlarının hazırlanması,

örneklerin PCR için hazırlanması, amplifikasyon ve elektroforez aĢamaları ayrı

odalarda yapıldı. Odalar arasında araç gereç ve kimyasal çözelti alıĢveriĢi yapılmadı.

Deney sırasında tek kullanımlık pipet uçları ve tüpler kullanıldı. Tepkime

karıĢımlarının hazırlanması ve örneklerin PCR için hazırlanması aĢamaları

biyogüvenlik sınıf II kabinlerinde gerçekleĢtirildi. ÇalıĢmadan önce kabinlerin içi ve

kullanılan aletler en az yarım saat ultraviole ile ıĢınlandı, %10’luk sodyum

hipoklorit ve %70’lik etil alkolle silindi.

Tepkime karıĢımlarının hazırlanması sırasındaki kontaminasyonları

belirlemek için, her bir amplifikasyon setinde F. tularensis DNA pozitif ve ayrıca hiç

DNA içermeyen negatif kontroller (tepkime karıĢımında kalıp DNA nın

bulunmaması) kullanıldı.

2.2.3.2.3. Amplifikasyon

Amplifikasyon iĢlemi sırasında hedef DNA baĢlangıçta 94°C’de 4 dk

bekletilerek denatüre edildi. Bu aĢamadan sonra;

94°C’de 50 sn denatürasyon

60°C’de 40 sn primerlerin bağlanması

72°C’de 1dk 20 sn primerlerin yeni DNA zincirinin sentezlenmesi olmak üzere

toplam 40 döngü yapıldı. En son aĢamada 72°C de 7 dk bekletilerek reaksiyon

tamamlandı. Amplifikasyon sonrasında reaksiyon tüpleri değerlendirme aĢamasına

kadar 4°C de bekletildi.

50

Amplifikasyondaki değerlendirme sonrasında, negatif sonuç alınan örnekler

için aynı amplifikasyon iĢlemi yeniden tekrarlandı.

Rodent ve su örneği için Elektroforez ve Görüntüleme iĢlemi aynı aĢamalar

uygulanarak gerçekleĢtirildi.

Ġlk aĢama olan kültür sonucunda pozitiflik belirlenen su örneğinden genetik

materyalin saptanması amacıyla 17 kDa membran proteinini kodlayan tul4 geni

araĢtırıldı. Bu aĢamada %2 lik agaroz jel elektroforezinde 420 bp lik bölgede bantın

görülmesi Francisella spp. PCR (+), bantın gözlenmemesi PCR (-) olarak

değerlendirildi.( Sjöstedt A ve ark 1992).

Ġkinci aĢamada pozitif su örneğinde, F. tularensis alt türlerinin ayırımı için

“Farklılık Bolgeleri 1 (Regions of Difference; RD1)” i hedef gen dizileri amplifiye

edildi (Broekhuijsen 2003) Amplifikasyon iĢlemi sırasında hedef DNA baĢlangıçta

94°C’de 4 dk bekletilerek denatüre edildi. Bu aĢamadan sonra;

94°C’de 50 sn denatürasyon

60°C’de 40 sn primerlerin bağlaması

72°C’de 1dk 20 sn primerlerin yeni DNA zincirinin sentezlenmesi olmak üzere

toplam 40 döngü yapıldı. En son aĢamada 72°C’de 5 dk bekletilerek reaksiyon

tamamlandı. Amplifikasyon sonrasında reaksiyon tüpleri değerlendirme aĢamasına

kadar 4°C’de bekletildi.

51

3. BULGULAR

3.1. İzolasyon Bulguları

3.1.1. Rodent Örneklerine Ait İzolasyon Bulguları

F. tularensis yönünden bakteriyemik rodentlerin belirlenmesi amacıyla

toplanan 40 rodentin karaciğer ve dalak örnekleri 10 gün süreyle kültüre edildi.

Besiyerleri gün aĢırı kontrol edildi. Toplanan 40 rodent materyalinden Francisella

spp. izole edilemedi.

3.1.2. Su Örneklerine Ait izolasyon bulguları

F. tularensis yönünden su kaynaklı bulaĢmayı göstermek amaçlı toplanan 4

su numunesi 10 gün süreyle kültüre edildi. 4 su örneğinden 1’inde (ev Ģebeke suyu)

Francisella spp. izole edildi. Bu kültürde 3. günden baĢlayarak ilerleyen günlerde

üremeler gözlendi. ġekillenen kolonilerin morfolojisi değerlendirildiğinde genelde

gri-beyaz renkli, hafif mukoid görünümlü, parlak yüzeyli koloniler gözlendi (Resim

3.1.). Francis mediumda izolasyonu Ģekillenen Beypazarı Macun kırsalında ev

Ģebekesinden alınan su örneğinin besiyeri inkubasyonundan sonra oluĢan Ģüpheli

koloniler müspet tularemi immunserumu ile lam aglutinasyon testine tabi tutularak F.

tularensis spp. olarak doğrulandı.

52

Resim 3.1. Pozitif su örneğinin Francis besiyerinde görüntüsü.

3.2. Serolojik Bulgular

Mikroaglutinasyon test sonucunda incelenen toplamda 401 koyun kan

serumundan 156 (%38,9)’sında titre saptanırken, 245 (%61,1) serumda titre

belirlenemedi (Çizelge 3.1.).

Toplanan koyun kan serumu örneklerinin yerleĢim birimlerine göre

dağılımında;

Ankara Altındağ’dan 46 koyun kan serum örneği alındı. Bu serumlardan 13

ünde 1/20, 4’ünde 1/40 titre belirlendi. Seropozitiflik oranı %36,95 olarak bulundu.

53

Ankara Beypazarı ilçesi Macunköy’den 101 koyun kan serum örneği alındı.

Bu serumlardan 5 inde 1/20, 12’sinde 1/10 titre belirlendi. Seropozitiflik oranı

%16.83 olarak bulundu.

Ankara Bala ilçesi AfĢar Kasabasından 75 koyun kan serum örneği alındı.

Bu serumlardan 19’unda 1/20, 18’sinde 1/40, 18’inde 1/80, 6’sında 1/160 ve 1’inde

1/320 titre belirlendi. Seropozitiflik oranı %87,4 olarak bulundu.

Bursa Mustafa Kemal PaĢa Ġlçesi kırsalından 159 koyun serum örneği alındı.

Bu serumlardan 32’sinde 1/10, 21’inde 1/20 ve 5’inde 1/40 titre belirlendi.

Seropozitiflik oranı % 36.47 olarak bulundu.

Zonguldak Merkez Kurtköy’den alınan 20 koyun kan serum örneğinden ise

yalnızca 1’inde 1/10 titrede belirlenmiĢ olup, %5 oranında seropozitiflik saptandı.

54

Çizelge 3.1. Ġncelenen koyun kan serumlarının mikroaglutinasyon test sonuçları.

Yerleşim

Birimi

Örnek

Sayısı

Titre

Veren

Örnek

Sayısı

Tularemi Titre Oranı

Toplam

%

Oranları

1/1

0

1/2

0

1/4

0

1/8

0

1/1

60

1/3

20

1/6

40

1/6

40

Ankara/

Altındağ

46

17 -- 13 4 -- -- -- -- %36,95

Ankara/

Bala

75 63 -- 19 18 18 6 1 1 %87,4

Ankara/

Beypazarı

101 17 12 5 -- -- -- -- -- %16,83

Zonguldak/

Kurtköy

20 1 1 -- -- -- -- -- -- %5

Bursa/

M.Kemalpaşa

159 58 32 21 5 -- -- -- -- %36,47

Toplam

401

156

45

58

27

18

6

1

1

%38,90

Titre Veren

Örneklerin

% Oranları

% 3

8,9

% 2

8,8

5

% 3

7,1

8

% 1

7,3

0

% 1

1,5

4

% 3

,85

% 0

,64

%0

,64

55

3.3. PCR Bulguları

3.3.1. Rodent Örneklerine Ait PCR Bulguları

ÇalıĢılan rodent numunelerinden Francisella spp. yönünden PCR pozitiflik

belirlenemedi. Sonuçların kültür bulguları ile paralel olduğu belirlendi.

3.3.2. Kültür Pozitif Su Örneklerine Ait PCR Bulguları

Alınan 4 su örneğinden, kültür sonucunda pozitifliği belirlenen 1 örnekte,

cinse özgül (tul4) primerler ile yapılan PCR sonunda 420 bp lik bölgede bantın

görülmesi ile F. tularensis spp. olarak pozitiflik belirlendi ( Resim 3.2.).

Resim 3.2. Kültür pozitif su örneğinin PCR sonrası elde edilen agaroz jel

görüntüsü

56

F. tularensis spp. olarak pozitiflik tespit edilen örneğin, RD1 primerleri ile

yapılan alt tür ayırımı sonunda ise 924 bp lik bölgede bantın görülmesi ile etkenin F.

tularensis alt tür holarctica olduğu belirlendi. Su örneklerinden yapılan kültürlerin

izolasyonunda F. tularensis üremesi gözlenen örneğin, PCR ile de pozitifliği

doğrulanmıĢ oldu (Resim 3.3.).

Resim 3.3. Pozitif su örneğinin PCR sonrası F.tularensis alttür ayrımını

gösteren agaroz jel görüntüsü.

57

4. TARTIŞMA

Tulareminin doğal rezervuarı çoğunlukla kemiricilerdir. Hastalığa yakalanan

bu hayvanlarda genellikle ölümcüldür. Koyun, keçi, sığır gibi çiftlik hayvanları ve kedi, köpek, at

gibi diğer evcil hayvanlar rastlantısal konaklardır.

Etken, kontamine gıda ve suların tüketilmesi, enfekte hayvanlar, kemirgenler, kene ve diğer

vertebrasızlarla direkt temas veya enfekte aerosollerin inhalasyonu ile insanlara bulaĢır (Forsman ve ark.,

2007). Tez kapsamında gerçekleĢtirilen çalıĢmada, F. tularensis'in koyunlarda ve

muhtemel rezervuar hayvanlarda varlığı araĢtırıldı. Aynı zamanda su örneği de

izolasyon amaçlı incelendi.

Arata ve ark. (1973), Tularemi hastalığı üzerine Ġran’da çeĢitli hayvanlarda

enfeksiyon varlığını tespit etmek amacıyla yürüttükleri bir araĢtırmada 47 yerleĢim

biriminden toplamda 61 türe ait 33 kemirgen, 21 yarasa, 5 böcekcil, 2 tavĢan 4600

yabani memeliden 3548 dalak örneği almıĢlardır. Alınan örneklerin hiçbirinden F.

tularensis izolasyonu yapılmadığını, ancak 100 koyun 100 sığır ve 39 yabani

memeliden elde edilen kan serumu örneklerinin aglütinasyon ve pasif

hemaglütinasyon testleriyle de incelenmesi sonucu 3 sığır 8 koyun ve 1 kirpi

örneğinin pozitif sonuç verdiğini bildirmiĢlerdir. Özsan ve ark. (1976),

yabani

hayvanlarda Tularemi hastalığının varlığını tespit etmek amacıyla yaptıkları

çalıĢmada, Ankara, Konya, Urfa ve NevĢehir illerinden topladıkları 41 mus musculus

(ev faresi), 623 Citellus, 55 microtus (sıçan), 70 Rattus rattus (keme), 442 Meriones

(koĢar fare), 56 kaplumbağa, 89 yabani tavĢan, 1 kirpi, 1 hamster ve 1 adet su yılanı

olmak üzere toplam 1379 yabani hayvandan alınan çeĢitli örneklerden F. tularensis

izolasyonu gerçekleĢtirememiĢlerdir. Ancak canlı olarak yakalanmıĢ citellusların

serum örneklerini aglütinasyon testine tabi tutmuĢlar, yalnız 1’inde 1/40 titre elde

etmiĢlerdir. Canlı ve ölü olarak yakalanan yabani hayvanların karaciğer, dalak ve

böbrek süspansiyonlarından kobaylara zerk etmiĢler, çalıĢmaya katılan 234 kobaydan

3’ünün aglutinasyon test sonucunu 1/40-1/80 arasında olumlu sonuç verdiğini

58

gözlemiĢlerdir. Bu araĢtırmalarla söz konusu hayvanların muhtemel F. tularensis

konakçıları olmalarının mümkün olduğu sonucuna ulaĢmıĢlardır.

Bu çalıĢma ile farklı bölgelerden toplanan 40 rodentin dalak ve karaciğer

örneklerinden Francis besiyerinde izolasyon çalıĢmaları gerçekleĢtirilmiĢtir.

Örneklerde F.tularensis etken izolasyonu yapılamamıĢtır. Yine 40 rodentin karaciğer

ve dalak örneklerinden konvansiyonel PCR test yöntemiyle ile doğrulama çalıĢması

yapılmıĢ, sonuçların tümü negatif bulunmuĢtur. Rodentlerin toplandığı yerleĢim

birimlerinde zaman zaman insanlar Tularemi hastalığına yakalandıkları için

buralardan örnek materyal toplanmıĢtır. ÇalıĢmalar sırasında örnek alınan yerleĢim

birimlerinde rodent sayılarında artıĢ olduğu bilgilerine ulaĢılmıĢtır. Ancak, Tularemi

infeksiyonlarından prevalansının yüksek olduğu salgınlarda dahi rezervuar

hayvanlardan izolasyonun çok zor olduğu ve rezervuar hayvanların bir kısmının

etken vücuda girdikten kısa bir süre sonra öldüğü ve ölü hayvana doğada rastlamanın

güçlüğü ifade edilmektedir (Sjöstedt, 2007). Ayrıca literatürlerde de bildirildiği üzere

etkenin marazi maddelerden direkt olarak izolasyonunun güçlüğü konusunda bu

çalıĢmayla paralel sonuçlar alınmıĢtır (Tekin ve ark.,2009).

Tularemi’nin hayvanlarda ve insanlarda eĢ zamanlı epidemiler yaptığına dair

bilgiler bulunmaktadır. Gürcan ve ark. (2006) Edirne Demirköy’de bir Tularemi

salgınında, 226 kiĢiden alınan kan serum örneklerinin MAT ile incelenmesi sonucu

10 kiĢide değiĢen titrelerde antikor varlığı tespit etmiĢlerdir. AraĢtırıcılar hastalığın

kaynağını belirlemeye yönelik, hasta kiĢilere ait 25 tavĢan, 27 inek ve 19 koyundan

aldıkları kan örneklerini yine aynı yöntemle değerlendirmiĢlerdir. Sonuçta, 1 tavĢan

ve 19 inekte F. tularensis’e karĢı düĢük titrelerde antikor belirlenirken, koyunların

tümü negatif bulunmuĢtur. Ayrıca hayvanlardan toplanan 3 kene ile araĢtırma

süresinde ölen bir tavĢanın karaciğer ve dalak örneklerinden kültürel, hasta kiĢilerin

evlerinden yakaladıkları 8 ev faresine (rattus rattuus) ait karaciğer ve dalak

örneklerinin ise hem kültürel hem de PCR ile değerlendirmiĢlerdir. Sonuçların F.

tularensis açısından negatif bulunduğunu belirlemiĢlerdir. AraĢtırıcılar bazı

hastalardan aldıkları tonsil svap örnekleri, 1 hastadan alınan lenf nodülü aspiratı ve

bir Ģebeke ile 3 kaynaktan alınan su örneklerini de kültürel olarak ve PCR ile

incelemiĢler, örnekler kültürel olarak negatif bulunurken lenf nodülü aspiratı ile bir

59

kaynaktan alınan su örneğinde PCR ile F. tularensis tespit etmiĢlerdir. Bu bulgular

ıĢığında salgının kaynağı olarak tavĢanların görülemeyeceğini, bir yıl önce tüm

Trakya’da tarla ve ev civarlarında rodentlerin arttığının belirlendiğini, her ne kadar

ev fareleri ve rodentlerden etken izolasyonu yapılmamıĢsa da salgının bu hayvanların

kontamine ettiği sular aracılığıyla meydana gelebilmiĢ olabileceğini ifade etmiĢlerdir.

Ġlk su kaynaklı tularemi bildirimi Karpoff ve Antoroff (1936) Rusya’da

yapılmıĢtır. Bunu takiben Hussein Kemal ve Oz (1938) Türkiye’den ilk bildirimi

gerçekleĢtirmiĢtir. Suya kontaminasyon yolları tam olarak açığa çıkartılmıĢ olmasa

da fare ile taĢınan bu etkenin Karkas veya diğer kontamine materyaller ile suyu

kontamine ettiği düĢünülmektedir (Bow ve Brown 1944). Sudaki kirlenmenin anlık

olması ve su içerisinde yüksek oranda seyrelmiĢ olması, örneklerin geç alınması gibi

faktörlere bağlı olarak etken izolasyon Ģansı düĢüktür. Bu çalıĢma dönemi içerisinde

Beypazarı ilçesinde çıkan salgın sırasında alınan 4 su numunesinde yapılan etken

izolasyonu sonucunda 1 su numunesinde etken varlığının tespiti ve PCR ile etkenin

F. tularensis susp. holartica olarak doğrulanması bulaĢma yollarını göstermede

önemli bir bulgudur.

Kılıç (2009) Çankırı ÇerkeĢ ilçesi Kadıözü köyünde meydana gelen Tularemi

salgınını araĢtırmıĢtır. Su kaynaklarından alınan örneklerde kültür ve PCR

yöntemleriyle F. tularensis varlığını araĢtırmıĢ köylülerin ortak kullandığı su kaynağı

örneğinde PCR ile F. tularensis saptanmıĢ ancak etken izolasyonu

gerçekleĢtirilememiĢtir.

Ekonomileri tarım ve hayvancılığa bağlı olan toplumlarda kemirgenler ve evcil hayvanlarla

sürekli bir temas söz konusudur. Tularemi hastalığının koyunlarda ve diğer yabani

hayvanlarda serolojik olarak incelenmesi amacıyla yapılan çalıĢmalarda farklı

bulgular elde edilmiĢtir. F. tularensis' in izolasyon güçlüğü sebebiyle infeksiyonun

laboratuvar tanısında serolojik yöntemlerin rutinde daha fazla önem kazandığı

görülmüĢtür (Çelebi, 2010).

60

Jellison ve Kohls (1950) ABD’de yaptıkları bir çalıĢmada 148 kuzudan

yapılan serolojik incelemeler sonucunda %25 oranında 1/20 ve üzeri titre

belirlemiĢler ve bu titreyi F. tularensis yönünden seropozitif kabul etmiĢlerdir.

Ayrıca aynı dönemde meradan dönen yetiĢkinler üzerinde de aynı çalıĢma yapılmıĢ

283 koyundan %28.3 seropozitiflik tespit etmiĢlerdir.

Bu çalıĢmada Tulareminin koyunlarda serolojik olarak incelenmesi için,

infeksiyonun insanlarda endemik olarak görüldüğü ve son çalıĢmalarda yaygın

olduğu tespit edilen yerleĢim birimlerinden koyun kan serumları toplandı. Ankara-

Altındağ, Ankara-Beypazarı, Ankara Bala, Bursa M. KemalpaĢa, Zonguldak Kurtköy

kırsalından toplamda 401 koyundan kan örneği alındı. Toplanan 401 koyun kan

serumu serolojik olarak incelendiğinde, 156 koyunda 1/10 ile 1/640 arasında titreler

belirlendi. Bunlardan 111’i çeĢitli literatürlerde anlamlı kabul edilen 1/20 (%27.6) ve

üzeri titre vermiĢtir.

O’Toole ve ark. (2008) 1997 ve 2007 yılları arasında Wyoming ve South

Dakota’da 3 ayrı yerli koyun sürüsünde F. tularensis varlığını araĢtırmıĢlardır. Bu

10 yıl süren çalıĢma sırasında incelenen sürünün hastalık salgınları sırasında yoğun

kene artıĢına maruz kaldığı araĢtırıcılar tarafından bildirilmiĢtir. Söz konusu

sürülerde, geç dönemde abort, halsizlik ve ölüm gözlemlenmiĢtir. Nekropsilerde

akciğer, karaciğer ve dalakta fokal nekrotik odaklar belirlenmiĢtir ve tanıda kültürden

izolasyon, seroloji, floresan antikor testi ve PCR yöntemi kullanılmıĢtır. Bu üç ayrı

sürüden ilki, Nisan 1997'de Johnson County, Wyoming bölgesinde bulunan 3000

baĢ koyun sürüsüdür. Sürünün takibinde 3-5 kuzu günlük olarak hastalığa

yakalanmıĢ ya da ölü olarak bulunmuĢ, koyunlarda geç dönem abortların Ģekillendiği

görülmüĢtür. Toplamda sürüde abort yapan koyun sayısı 20 olarak tespit edilmiĢ, bu

çalıĢmadan 1 ay sonra aynı sürüdeki koyunlardan serum alınmıĢ ve

mikroaglutinasyon test yöntemiyle incelenmiĢtir. Sürüdeki salgınlardan dolayı

hastalığa maruziyeti belirlemek için seropozitiflik oranını 1/128 kabul etmiĢler, 16

koyunda 1/128 ile 1/512 arasında titre verdiği tespit edilmiĢtir. AraĢtırmaya katılan

Johnson County, Wyoming bölgesindeki ikinci sürüde ölüm gerçekleĢen bir kuzunun

iç organlarından etken izolasyonu gerçekleĢtirilmiĢtir. Üçüncü seçilen sürü ise, South

61

Dakota’da 2007 yılının mayıs ayında 2 aylık kuzularda hastalık ve ölümler ortaya

çıktığı bir sürüdür. Sürüdeki 425 kuzudan 15-20’si, 275 koyundan ise 70’inde ölüm

gerçekleĢtiği araĢtırmacılar tarafından belirtilmiĢtir. Sürüdeki koyun ve kuzularda

zayıflık gözlemlenmiĢ, 2 kuzuda da anemi tablosunun ortaya çıktığı belirtilmiĢtir. Bu

anemik kuzulardan serum örneği alınmıĢ, alınan serum örneklerinden

mikroaglutinasyon test yöntemi çalıĢılması sonucunda, kuzulardan 1’inde 1/128 titre

belirlenmiĢtir. Sürüde ölen kuzulardan bir kuzuya nekropsi yapılmıĢ ve mezenterik

lenf yumrularında ĢiĢliklerle, pulmoner konjesyon gözlemlemiĢlerdir. Ayrıca

nekropsisi yapılan kuzuların iç organlarından PCR pozitiflik belirlenmiĢtir. ÇalıĢma

sonucunda, koyunlarda akut ölümler ve abortların Tularemi kaynaklı olabileceği ve

klinik iĢaretlerle birlikte, etken izolasyonu, PCR gibi laboratuvar tanı yöntemleriyle

desteklenmesi gerektiği vurgulanmıĢtır.

Seçilen bölgeler arasında Ankara Bala’da %84 oranında 1/20 ile 1/640

arasında Tularemi titresi saptandı. Bu veri, son yıllarda ülkemizde görülen insan

tularemi salgınları ıĢığında koyunlardaki en yüksek seropozitiflik bulgusudur. Bu

yönüyle koyunların hastalığa duyarlılığı, hastalık düzeyini saptama ve insanlarla

koyunlar arası teması belirleme amaçlı önemli bir bulgu niteliği kazanmıĢtır.

Mikroaglutinasyon testiyle elde edilen bu titrelerin diğer bakteriyel enfeksiyonlara

bağlı olarak özellikle Brucellosis’ten ileri gelebileceğini de unutmamak gerekir

(Ġzgür ve ark.,1992). Ancak bu çalıĢmada Brucellosis ve bu hastalıkla ilgili

uygulanmıĢ aĢı konusunda tam olarak bilgi alınamadığından bu yönüyle bir

değerlendirme yapılamamıĢtır. ġeyda (1996), Kars Yöresinde 1600 koyuna ait kan

serumu örneğinin mikroaglutinasyon yöntemiyle incelenmesi sonucu 50 hayvanda

1/20 titre üzerini seropozitif olarak bildirmiĢtir. Senol ve ark. (1999) Bir erkek

hastanın koyun derisi yüzmesinden 2 gün sonra vücudunda lezyonlar görüldüğünü,

alınan lezyon ve kan örneği kültürünün negatif sonuç verdiğini ancak hasta kan

serumu örneğinde tüp aglütinasyon testiyle F. tularensis’e karĢı 1/160 pozitiflik

belirlenerek olgunun ülseroglandüler Tularemi olduğunu ortaya koymuĢlardır.

Gwatkın ve ark (1942) yoğun kene enfestasyonu olan 850 baĢ bir koyun sürüsü

üzerinde araĢtırma yapmıĢlar, bu sürüdeki 850 koyundan 24’ünün öldüğü, 5-6’sının

ise hastalık sonunda iyileĢmiĢ olduğunu görmüĢlerdir. Ġncelenen tüm hayvanlarda

muayene sırasında çok yoğun kene enfestasyonu olduğu belirtilmiĢtir. Etkenin

62

varlığını ortaya koymak için ölü koyunlardan 1 koyunda F. tularensis izolasyonu

gerçekleĢtirebilmiĢlerdir. Hastalandıktan sonra yeniden iyileĢen bir koyunda ise

üzerindeki kenelerden etken izolasyonu gerçekleĢtirebilmiĢlerdir. Ayrıca iyileĢen 2

koyundan serolojik olarak aglutinasyon teste tabi tutmuĢlar,serolojik olarak

incelemeye alınan 2 koyundan 1’inde 1/400 aglutinasyon titresi bulmuĢlardır.

Sürüyle ilgilen bir çobanın hastalandığını, hastalanan çobanın hastalığından 8-9 gün

öncesinde sürüdeki koyunlardan 3’ünü yüzdüğünün bilgisini almıĢlardır. Bu

çalıĢmalar, tularemi hastalığında insanlarla koyunlar arası teması belirlemeye örnek

teĢkil etmekle birlikte bakterinin koyunlara keneler tarafından aktarılabildiği

sonucuna varılmıĢtır.

ÇalıĢma sırasında Ankara Beypazarı ilçesi Macunköy kırsalında insanlarda

Tularemi salgını ortaya çıkmıĢtır. Bölgeden; 2 rodent, ortak kullanımdan 4 su örneği,

90 koyun kan serumu alınmıĢtır. Rodentlerden etken izole edilememiĢtir. Salgın

sırasında tularemiye yakalanan insanların evinden alınan su örneklerinden 1 örnekte

etken izolasyonu yapılmıĢtır. Özellikle hastalığa yakalanan insanlarla ortak su

kaynaklarını kullanan koyunlardan, 17 sinde 1/10-1/40 arasında titre belirlenmiĢtir.

Serolojik olarak titre artıĢını belirleme amacıyla 4 hafta sonra kulak küpe numaraları

alınan 17 koyundan tekrar kan serumu alınmıĢ, titrelerde belirgin farklılıklar

gözlemlenmemiĢtir.

63

5. SONUÇ VE ÖNERİLER

Bu çalıĢma ile farklı yerleĢim birimlerinde, insanlarda ortaya çıkan Tularemi

salgınlarında koyunlarda hastalığın serolojik yönden incelenmesi ve epidemiyle

seyreden bölgelerde çeĢitli türden rodentlerde ve suda etken teĢhisine yönelik

incelemeler yapılmıĢtır. Bu yönleriyle bu tez çalıĢması farklı illerden toplanan

materyaller açısından Türkiye genelinde veteriner hekimlikte ilk kapsamlı araĢtırma

niteliğindedir. Ayrıca elde edilen serolojik sonuçlar dünyada yapılan araĢtırmalarda

koyunlarda bilinen en yüksek aglutinasyon titreleri arasındadır. Ancak titre oranı

yüksek çıkan bölgelerde bakterinin rezervuarları ve olası vektörlerini saptamadan

hastalık konusunda kesin olarak yorum yapmak imkansızdır. Rodentlerde yapılan

incelemelerde etken izolasyonu mümkün olamamıĢtır. Rodentlerde etken vücuda

alındıktan kısa süre sonra ölümler Ģekillenebilmektedir. Yabani hayatta ölü rodente

rastlayabilme ihtimali çok düĢüktür. Canlı ve genelde sağlıklı olarak yakalanan

rodent materyallerinde ise izolasyon Ģansı yapılan çalıĢmalarda da belirtildiği üzere

çok düĢük olabilmektedir. Ġncelenen rodent örneklerinde etken izolasyonunun

olamaması sebebiyle muhtemel rezervuar hayvan olarak değerlendirilemeyeceği

yorumunu yapmak imkansızdır. Yine Tularemi salgını baĢ gösteren yerleĢim

birimlerinde su kaynaklı pozitiflik belirlenmiĢtir.

Bu kapsamlı çalıĢmada bu konuların önemi, yapılan rodent ve su örneklerinde

izolasyon çalıĢması, PCR çalıĢmaları ve koyunlarda serolojik bulgularla

vurgulanmaya çalıĢılmıĢtır. Yapılan izolasyon ve PCR bulgularının paralelliği

gözlemlenmiĢtir. Bu sebeple, PCR çalıĢmaları ile incelenecek örneklerde etkenin

varlığı kısa zamanda sonuca ulaĢabilme açısından önemlidir. Bundan sonraki

çalıĢmalarda pilot bölgelerin seçilerek periyodik yoklamaların yapılması, kemirici

mücadelelerinin rutin olarak uygulanması ve insanların kontrol edilmesi önerilir.

Ayrıca su kaynaklı bulaĢmasının olabileceği düĢünülerek, insan, hayvan ve sularda

eĢ zamanlı çalıĢmaların yapılması Tulareminin epidemiyolojik açıdan

değerlendirilmesinde oldukça yarar sağlayacaktır.

64

ÖZET

Francisella tularensis’ in Muhtemel Rezervuar Hayvanlar ve Koyunlarda

Laboratuvar Tanısı

Francisella tularensis’ in neden olduğu zoonotik bir enfeksiyon olan

tularemi, son yıllarda ülkemizde oluĢan insanlarda salgınlar görülmesi ile yeniden

önem kazanmıĢtır. Etkenin bulaĢı, sıklıkla kontamine su, besin, enfekte hayvanlarla

temas, rezervuar görevi üstlenen yabani ve evcil hayvanlar ve kene ısırığıyla

olmaktadır.

Bu çalıĢmada, rodentlerde ve bulaĢma yollarını gösterme amacıyla sularda F.

tularensis etkeninin varlığı, kültürel, PCR ve koyunlarda ise serolojik metotlarla

araĢtırılmıĢtır.

Kültürel yoklamalar için, Ankara Beypazarı, Sivas gürün, Yozgat, Van, Bursa

kırsalından toplamda 6 yerleĢim biriminden 40 adet rodent materyali ve Ankara

Beypazarı ilçesinden 4 su numunesi toplanmıĢtır. Kültürel ve PCR çalıĢmalarında,

Rodentlerde herhangi bir pozitif bulguya rastlanmazken, su örneklerinden 4

numuneden 1 pozitiflik saptanmıĢ ve PCR ile doğrulanmıĢtır.

AraĢtırmada serolojik yoklamalar için Ankara Bala, Beypazarı, Altındağ,

Zonguldak Kurtköy, Bursa Mustafa Kemal PaĢa kırsallarından toplamda 5 yerleĢim

biriminden 401 adet koyun kan serumu toplanmıĢtır. .

Serolojik olarak; mikroaglutinasyon test (MAT) testinden yararlanılmıĢtır.

ÇalıĢmada kullanılan 401 serumun 156’sında (%38,9) 1/10 ile 1/640 arasında titre

belirlenmiĢ, bunlardan 111 (%27,6)’inde tularemide anlamlı kabul edilen 1/20

seropozitiflik saptanmıĢtır.

Anahtar Kelimeler: Francisella tularensis, su, rodent, koyun.

65

SUMMARY

Laboratory Diagnosis of Francisella Tularensis in Possible Reservoir Animals

and Sheep.

Tularemia, which is a zoonotic infection caused by Francisella tularensis, has

gained importance again since it has started to be seen in people recently. Infecting

of the active usually becomes by means of contaminated water, food, contact with

infected animals, wild animals and pets which are reservoir and tick biting.

In this study the existence of F.tularensis active in rodents and in water in

order to show the means of infecting was searched by cultural and PCR method and

it was searched by serological methods in sheep..

40 rodent material were collected from 6 settling centers such as Ankara

Beypazarı, Sivas Gürün, Yozgat, Van, Bursa and 4 water sample were collected from

Ankra Beypazarı for the cultural examining. Though it wasn’t indicated any positive

diagnosis in rodents in cultural and PCR studies, 1 positivity was indicated from 4

water samples and it was confirmed by PCR.

401 blood serum were collected from 5 settling centers totally such as

Ankara Bala, Beypazarı, Altındağ, Zonguldak Kurtköy, Bursa Mustafa Kemal PaĢa

for the serological examining.

Microaglutination Test (MAT) was used serologically. Titer was indicated

between (%38,9) 1/10 and 1/640 in 156 serum from 401 serum and seropositivity

was identified 1/20 from 111(%27,6) of these which is accepted as meaningful in

tularemia.

Anahtar Kelimeler: Francisella tularensis, rodent, sheep, water.

66

KAYNAKLAR

ANONİM (2003a).TularemiaFacts.Erişim: [https://www.avma.org/KB/Resources/

Backgrounders/Pages/Tularemia-facts.aspx]. Erişim Tarihi: 02.02.2013.

ANONİM (2003b). CDC basic laboratory protocols fort he presumptive identification of

Francisella tularensis Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,Ga. Erişim:

[http://www.bt.cdc.gov/agent/tularemia/lab-testing.asp+ Erişim Tarihi:03.02.2013

ANONİM (2010). Tularemia: Current, comprehensive information on pathogenesis,

microbiology, epidemiology, diagnosis, treatment, and prophylaxis.

Erişim:[http://www.cidrap.umn.edu/cidrap/content/bt/tularemia/biofacts/tularemia

factsheet.html+. Erişim Tarihi:29/01/2012.

ANONİM (2011a). T.C. Sağlık Bakanlığı, Tularemi Hastalığının Kontrolü İçin Saha Rehberi

Ankara. Erişim Adresi:

[http://sbu.saglik.gov.tr/Ekutuphane/kitaplar/TularemiSahaRehberi.pdf+. Erişim

Tarihi:29/12/2012.

ANONİM (2011b). The Merck Veterinary Manual, Tularemia. 9 th ed. Whitehouse

Station,Nj.Merc and co, USA Erişim adresi:

[http://www.merckvetmanual.com/mvm/index.jsp.cfil=htm/bc/52400.htm&word=tul

aremia]. Erişim tarihi: 08/05/2012.

ANONİM (2011c). Tularemi.Erişim:*ftp://karamansm.gov.tr/BULASICI/Tularemi

%20Bilgi%20Notu.doc+ Erişim Tarihi: 20.01.2013.

ARATA M, CHAMSA A, FARHANG-AZAD, MEŠČERJAKOVA I, NERONOV V, SAIDI S. (1973).

First detection of tularemia in domestic and wild mammals in Iran. Bull. Wld. Hlth.

Org., 49(6): 597–603.

BASKERVILLE A, HAMBLETON P, DOWSETT AB (1978). The pathology of untreated and

antibiotic-treated experimental tularaemia in monkeys. Br J Exp Pathol., 59(6): 615–

623.

BELL JF. WİKEL SK, HAWKİNS WW, OWEN CR. (1978). Enigmatic resistance of sheep (Ovis

aries) to infection by virulent Francisella tularensis. Can J Comp Med., 42:310-5.

BETH A. VALENTİNE, BRAD M. DEBEY, ROBERT J. SONN, LARRY R. STAUFFER, LEON G.

PİELSTİCK (2004). Localized cutaneous infection with Francisella tularensis resembling

ulceroglandular tularemia in a cat. J. Vet. Diagn. Invest., 16:83–85.

BOSTANCI S (2010). Koruma ve Kontrol, III. Türkiye Zoonotik Hastalıklar Sempozyum Kitabı,

Ankara.

BOW MR, BROWN J.H. (1944), Water-Borne Tulara:Mıa In Western Canada Can. M.A.J.,

50:14-16.

BROEKHUIJSEN M, LARSSON P, JOHANSSON A, ET AL. (2003). Genome-wide DNA microarray

analysis of Francisella tularensis strains demonstrate extensive genetic conservation

within the species but identifies regions that are unique to the highly virulent

F.tularensis subsp. tularensis. J. Clin. Microbiol., 41(7): 2924-31.

67

BROWN SL, MCKİNNEY FT, KLEİN GC, JONES WL. (1980). Evaluation of Safranin-O Stained

Antigen Microagglutination test for Francisella tularensis antibodies. J. Clin.

Microbiol., 11(2):146-148.

ÇELEBİ B (2010). Tularemi: Laboratuvar Tanı, III. Türkiye Zoonotik Hastalıklar Sempozyum

Kitabı, p.: 13-18.

ÇELEBİ G. (2004). Tularemi Sempozyumu, Erişim adresi: *http://www.klimik.org.tr/

bilgimerkezi/tularemi/tularemi-yrd-doc-dr-guven-celebi-zonguldak-karaelmas-

universitesi-tip-fakultesi-infeksiyon-hastaliklari-ve-klinik-mikrobiyoloji-anabilim-dali/]

Erişim Tarihi: 21.12.2012.

CHU M, ELKINS K, NANO F, TITBALL RW. (2007). Considerations for Handling F.tularensis, In

Tranvick A (ed), WHO Guidelines on Tularemia.WHO/ CDS/EPR/2007.7. p.: 41-5.

DALY R, MISKIMINS D. (2005). Tularemia in Animals in South Dakota, Erişim adresi:

http://www.vetsci.sdstate.edu./vetext/tularemia. Erişim tarihi: 09.06.2011.

ERYILMAZ S, ÖZ F N, BAYHAN G İ, TİMUR Ö M, TEKE T, TANIR G. (2011). Eritema

Nodosumla Başvuran Tularemi Olgusu. J. Pediatr. Inf. 5 (1): 295-342.

FELDMAN KA. (2003). Tularemia, J. Am. Vet. Med. Assoc., 222: 6725-30.

FORSMAN M, GRUNOW R, KOSOY M, KRAUSE G. (2007). Surveillance And Outbreak

Management, In: Who Guidlines On Tularemia. p.: 35-43.

GURYCOVA D (1998). First isolation of Francisella tularensis subsp. tularensis in Europe. Eur.

J. Epidemol., 14: 797-802.

GÜRCAN Ş. (EDİTÖR) (2009). Francisella tularensis ve Tularemi, Nobel Tıp Kitabevleri:

İstanbul, p.: 161-168.

GÜRCAN S, ESKİOCAK M, VAROL G, UZUN C, TATMAN-OTKUN M, SAKRU N, KARADENİZLİ A,

KARAGÖL C, OTKUN M. (2006). Tularemia reemerging in European part of Turkey

after 60 years. Jpn. J. Infect. Dis., 59:391-393

GWATKIN R, PAINTER R H, MOYNIHAN I W. (1942). Tularemia in Sheep. Canadian Journal of

Comparative Medicine,6:163-168

HUSSEİN OZ (1936) in BOW MR, BROWN J.H. (1944). Water-Borne Tulara:Mıa In Western

Canada Can. M.A.J., 50:14-16.

IKÄHEIMOA I, SYRJÄLÄ H, KARHUKORPI J, SCHILDT R, KOSKELA M. (2000). In vitro antibiotic

susceptibility of Francisella tularensis isolated from humans and animals. J.

Antimicrob. Chemother, 46(2): 287-90.

İZGUR M, ARDA M , ARDA M, ERDEĞER J. (1992). Sığır Brusellosis’inin Teşhisinde EDTA ve

56°C de Aglutinasyon Testlerinin Kullanılması. A.Ü. Vet. Fak. Derg., 39(1-2):191-200.

JELLISON WL, KOHLS GM. (1950). Persistence of agglutinins against Pasteurella tularensis in

serums of naturally infected sheep. J Am Vet Med Assoc., 117(884):405-8.

JOHANSSON A, PETERSEN J, SJÖSTEDT A. (2007). Laboratory diagnostics and discrimination

of subspecies and strains In: WHO Guidlines On Tularemia, Ed.: Tranvick

A p.: 27-34.

KARPOFF ANTOROFF (1936) in BOW MR, BROWN J.H. (1944), Water-Borne Tulara:Mıa In

Western Canada Can. M.A.J., 50:14-16.

KEIM P, JOHANSSON A, WAGNER DM. (2007). Molecular epidemiology, evolution, and

ecology of Francisella. Ann N Y Acad Sci., 1105: 30-1866.

68

KILIÇ S. (2006). Biyolojik Silah Olarak Bakteriler. Türk Hij. Den. Biyol. Derg., 63: 21 – 46.

KILIÇ S. (2009). Biyogüvenlik ve Tularemi. In: Francisella tularensis ve Tularemi Gürcan Ş.

ed., Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul, p. :5.

KOLAYLI F. (2009). Francisella tularensis Kültürü ve Antibiyotik Duyarlılık Testleri In:

Francisella tularensis ve Tularemi Ed.: Ş. Gürcan, Nobel Tıp Kitabevleri,İstanbul p.:

161-168.

LINDLEY, C. (2002). Outbreak of Tularemia among commercially distributed prairie dogs.

M.M.W.R. 51: 688-699.

MÖRNER T AND MATTSON R. (1983). Tularemia in a rough-legged buzzard

(Buteo lagopus) and a ural owl (Strix uralensis). J Wild Dis. Oct; 19(4): 360-1.

MÜLLER, W, BOCKLĠSCH H, SCHÜLER

G, HOTZEL

H, NEUBAUER H, OTTO

P(2007). Detection of Francisella tularensis subsp. holartica in a European

brown hare (Lepus europaeus) in Thuringia, Germany. 123: p. 225–229.

OTKUN M. (2009). Mikrobiyolojik Özellikler In: Francisella tularensis ve Tularemi

Ed.: ġ. Gürcan, Nobel Tıp Kitabevleri, Ġstanbul p. 75.

OTLU S. (2009). Hayvanlarda Tularemi araĢtırmaları ve dünyadaki durum. In:

Francisella tularensis ve Tularemi Ed.: ġ. Gürcan, Nobel Tıp Kitabevleri,

Ġstanbul, p. 161-8.

O’TOOLE D, WILLIAMS E S, WOODS LW, MILLS K, BOERGER-FIELDS A,

MONTGOMERY DL, JAEGER, EDWARDS WH, CHRISTENSEN D,

MARLATT W. (2008). Tularemia in range sheep: an overlooked syndrome? J.

Vet. Diagn. Invest. 20:508–513. ÖZSAN K, FAZLI A, AKTAN M, BEYOĞLU K. (1976). Ankara, Konya, Urfa ve Nevşehir’de

Yakalanan Yabani Hayvanlarda Tularemi Brusellosis ve Borreliosis Yönünden

Araştırma. Mikrobiyol. Bul. ;10(5):414-421.

ÖZTOPRAK N.(2009). Koruma ve Kontrol In: Francisella tularensis ve Tularemi

Ed.: ġ. Gürcan, Nobel Tıp Kitabevleri, Ġstanbul, p. 161-8. PETERSEN JM, SCHRİEFER ME, CARTER LG, ZHOU Y, SEALY T, BAWİEC D, YOCKEY B, URİCH S,

ZEİDNER NS, AVASHİA S, KOOL JL, BUCK J, LİNDLEY C, CELEDA L, MONTENEİRİ JA,

GAGE KL, CHU MC. (2004). Laboratory analysis of tularemia in wild-trapped,

commercially traded prairie dogs, Emerg. Infect. Dis. 10(3):419-25.

PIKE RM. (1976). Laboratory associated infections : summary and analysis of 3921 ceses.

Health Lab. Sci., 13(2):105-14.

PORSCH OZCÜRÜMEZ M, KİSCHEL N, PRİEBE H, SPLETTSTÖSSER W, FİNKE EJ, GRUNOW

R.(2004). Comparison of Enzyme-linked immunosorbent assay, Western blotting,

microagglutination, indirect immunofluorescence assay, and flow cytometry for

serological diagnosis of tularemia. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 11(6):1008-15.

SENOL M, OZCAN A, KARĠNCAOGLU Y, AYDĠN A, OZEROL IH. (1999).

Tularemia: a case transmitted from a sheep. Cutis. 63(1):49-51. ŞAHİN İ. (2009). Tulareminin Bulaş Yolları In: Francisella tularensis ve Tularemi Ed.: Ş.

Gürcan, Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul p. 75.

SEWELL DL. (1995). Laboratory associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Rev.,

8(3); 389-405.

69

ŞEYDA T. (1996). Kars Bölgesinde Koyunlarda Tularemi İnfeksiyonunun İnsidensi Üzerinde

Serolojik ve Kültürel Çalışmalar. Doktora Tezi. Kafkas Üniv. Sağlık Bilimleri Enstitüsü.

SJOSTEDT A. (2005). Francisella. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol. II. ,

Ed.: Brenner Dj, Kreig Nr, Staley Jt, Garrity Gm. New York, p.: 199-210.

SJOSTEDT A. (2007). Epidemiology. In: WHO Guidlines on Tularemia, Ed.: Tranvick A. p.: 5-8

SJÖSTEDT A, KUOPPA K, JOHANSSON T, SANDSTRÖM G. (1992). The 17 kDa lipoprotein and

encoding gene of Francisella tularensis LVS are conserved in strains of Francisella

tularensis. Microb. Pathog., 13: 243–249.

STEWART S. J. (1995). Francisella. In: Manuel of clinical microbiology. Ed: MURRAY P. R.,

BARON E.J., PFALLER M.A., TENOVER F.C., YOLKEN R.H. American Society for

Microbiology Press, Washington D.C., p. 545-548

TÄRNVİK A (2007). Introduction. In: Who Guidelines on Tularemia.

TEKİN M, ÇAM O H, ACAR G, KAYTANCI E, HANEGE F M. (2009) Boyunda kitle ile prezente

olan Tularemi olgusu. Göztepe Tıp Dergisi, 26(1):46-50.

TITBALL RW, SJOESEDT A, PAVELKA MS, NANO F. (2007). Biosafety and Selectable Markers.

Ann. N. Y. Acad. Sci., 1105: 405-417.

ULU KILIÇ A, KILIÇ S, ŞENCAN İ, ŞENTÜRK G.Ç, GÜRBÜZ Y, TÜTÜNCÜ E.E, ÇELEBİ B, KICIMAN

Ö, ERGÖNÜL Ö. (2011). İç Anadolu Bölgesinde Francisella tularensis alt tür

holartica’ya Bağlı Su Kaynaklı Bir Tularemi Salgını. Mikrobiyol. Bul., 45(2):234-247.

UYAR M, CENGİZ B, ÜNLÜ M, ÇELEBİ B, KILIÇ S, ERYILMAZ A. (2011). Orta Anadolu Bölgesi

İllerinden Hastanemize Başvuran Orofaringeal Tularemi Olgularının Değerlendirilmesi.

Mikrobiyol. Bul., 45(1): 58-66.

ÜNVER A. (2009). Hayvanlarda Tularemi. In: Gürcan ġ. ed. Francisella tularensis

ve Tularemi, Nobel Tıp Kitabevleri, Ġstanbul, p.: 75. WILLKE A. (2006). Tularemi. ANKEM Derg. 20: 222-226.

WINN W.C ALLEN SD, JANDA WM, KONEMAN EW, PROCOP GW, SCHRECKENBERGER PC,

WOODS GL (EDS). (2006). Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic

Microbiology. F.tularensis, p.: 491-97.

ZHAI

ZHANG F,LIU W, CHU M.C. , HE J, DUAN Q, WU X-M,ZHANG P-H, ZHAO Q-M, YANG H, XIN Z-

T, CAO WC. (2006). Francisella tularensis’in rodents China. Emerg. Infect. Dis., 12(6):

994–996.

70

EKLER

71

Ek1

Ülkemizde Tularemi Epidemiyolojisi ve Güncel Durum (1936-2009)

Türkiye’de tulareminin varlığı seroloji ve klinik belirtiler ile bir olgunun fark

edildiği 1913 tarihine dayanmaktadır. Sonraki yıllarda Marmara ve Batı Karadeniz

bölgesinde olmak üzere farklı bölgelerde tularemi salgınları bildirilmiĢtir. Son

zamanlarda özellikle ülkemizin iç bölgelerinde yer alan birçok bölgede insanlarda

tularemi salgınları ortaya çıkmıĢtır. Ülkemizde tularemi Türkiye Halk Sağlığı

Kurumu verilerine göre (1936-2009), epidemiyolojik olarak üç döneme ayrılarak

incelenmiĢtir (Anonim, 2011).

I. Dönem (1936-1953): 1936 yılında Trakya bölgesinde ilk tulareminin

Antalya yöresinde ülkemizde bugüne kadar tanımlanmıĢ salgının görüldüğü 18 yıllık

dönemi kapsamaktadır. Trakya, Doğu Anadolu ve Akdeniz Bölgesi olmak üzere üç

coğrafik bölge ile Konya ve Ankara yörelerinde sporadik olgular görülmüĢtür. I.

Dönemde toplam toplam 374 olgu saptanmıĢtır.

II. Dönem (1988-2004): Marmara bölgesi (Bursa ve civarında) baĢta olmak

üzere Batı Karadeniz bölgesinde tularemi salgınlarında eklendiği ve sporadik

vakaların da görüldüğü 16 yıllık dönemi kapsamaktadır. Bu dönemin son yıllarında

Orta Karadeniz ile Doğu Anadolu (Kars Bölgesi) Bölgesinde de tularemi salgınları

tanımlanmıĢ olup, dönem içerisinde T.C Sağlık Bakanlığı’nda yaklaĢık 1000 tularemi

olgusu kaydedilmiĢtir.

III. Dönem (2005-2009): Bu dönemde salgınlar ve sporadik olgular Ģeklinde

farklı coğrafik bölgelerde bildirimlerin yoğunlaĢtığı bildirilmiĢtir.1936-2004 yılları

arasında 1000’den fazla olgu ve bir ölüm bildirilmiĢtir. Ġlerleyen dönemlerde 2005-

2009 yılları arasındaki beĢ yıllık süreçte 1091 olgu saptanmıĢtır. Bu süreçte 2005-

2009 yılları arasında yıllık ortalama vaka sayısı 2182 olarak bildirilmiĢtir.

72

2005-2010 (dokuz aylık) yıllarındaki insanlardaki tularemi vaka sayısı

(Anonim, 2011a)

Sağlık Bakanlığı tarafından II. dönemde tularemi görülen bölge ve olgu

sayılarındaki belirgin artıĢ ve bu hastalığın halk sağlığı açısından önemli bir problem

haline gelmesiyle tularemi, “Bildirimi Zorunlu Hastalıklar” listesine alınmıĢtır.

Tulareminin “Bildirimi Zorunlu Hastalıklar” listesine alınmasından sonra salgınlara

ait verilerden değil, epidemiyolojik açıdan çok daha sistematik, analize uygun

karĢılaĢtırılabilir verilerin elde edilmesi, aynı zamanda hastalığın klinik ve yayılım

eğilimini tespit edebilecek verilerin elde edilmesi mümkün olmuĢtur (Anonim,

2011).

73

2009-2010 arasında Tanımlanan Olgularda Güncel Durum

Ülkemizde insan tularemi olgularında bildirilen il sayısında her yıl katlanarak

artıĢ gözlenmekte olduğu Sağlık Bakanlığı’nca tespit edilmiĢtir. Özellikle 2009

yılının ekim ayından itibaren Ġç Anadolu ve Ġç Anadolu Bölgesinin Ege bölgesine

komĢu iller gibi daha önceden olgu bildirimlerin olmadığı yerleĢim birimlerinden az

sayıda sporadik olguların görüldüğü yerlerde çok sayıda vaka bildirilmiĢtir. Tularemi

olgu sayısında ve mihraklarda belirgin sayıda artıĢların görülmesinin yanında, çoğu

ilde de hastalığın ilk kez tanımlanmıĢ olması yönüyle de epidemiyolojik açıdan çok

önemlidir. Sağlık Bakanlığı’nın verilerine göre bu süreçte hastalık ilk kez 10 ilde

görülmüĢtür. Ġlerleyen yıllarda ülkemizde tularemi olgusu bildirilen il sayısı 44’e

ulaĢmıĢtır. Bildirilen vaka sayılarında artıĢla birlikte Tulareminin, Marmara ve Batı

Karadeniz bölgeleri dıĢında daha güneye doğru inme eğilimi gösterdiği ve ormanlık

olmayan bölgelerde görülmeye baĢlandığı dikkat çekmektedir. Hastalığın ülkemizde

bu denli yaygınlaĢmasıyla bazı illerde tularemi olgusunun hiç bildirilmemiĢ olması

hastalığın tanısının konulamadığı ve insanlarda yanlıĢ tanı konulduğunu (tüberküloz

lenf adenit gibi) düĢündürmektedir (Anonim, 2011a).

74

2010 yılına ait Tularemi salgını veya serolojik olarak tanımlanmıĢ olguların

görüldüğü iller (Anonim, 2011a).

Özellikle Ġç Anadolu bölgesinde halen devam eden salgınlar; ülkemizde I. ve

II. dönemlerde gözlenen hastalığın epidemiyolojisinde önemli bir değiĢim gösterdiği

vurgulanmaktadır. Tularemide karasal ve su döngüsü olmak üzere iki ekolojik döngü

söz konusudur. Ülkemizde F. tularensis subsp. holarctica’ ya bağlı su ile iliĢkili

kemiricilerden, kunduz, misk sıçanı ve diğer rodent türleri ve tavĢanların rezervuar

olarak yer aldığı bir döngünün varlığı düĢünülmektedir. Doğu Avrupa ve Rusya’da

tularemi olguları çoğunlukla sucul rezervuar ile insan temasının sağlandığı sulak tip

yerlerde, ormanlık bölgeler, çayırlık alanlar, dere kenarındaki köyler, pirinç tarımı

yapılan yerler, dağlar arasındaki suların kesiĢtiği geniĢ vadilerde, büyük ırmakların

kenarlarındaki taĢkın bölgelerinde, göllerin kıyıları ve de bataklık yerlerde

görülmektedir Anonim (2011).

75

Ek 2

Dünya Sağlık Örgütünün Tularemi’den Korunma Önerileri (Bostancı, 2010).

Orofaringeal Tularemi

KaynatılmamıĢ suların içilmemesi

Suyun klrolandıktan sonra kullanılması

Su kaynakları ile vektör hayvanların temasının engellenmesi

Respiratuvar veya Ülseroglanduler Tularemi

Enfeksiyöz aerosoller, enfekte hayvanlarla direk temas ve artropodların ısrımasına karĢı

önlem alınması

Yabani tavĢan gibi hayvanların avlanması ve etlerinin tüketilmesinden kaçınılması

Yabani ve evcil hayvanlarla temas sonrasında ellerin yıkanması

Salgın durumunda kedi köpek gibi evcil hayvanlarla yakın temastan kaçınılması, evcil

hayvanların düzenli olarak hastalık belirtileri açısından takibinin yapılması

Özellikle çiftçi veya bahçıvanlar gibi enfekte toz ve aerosollere maruz kalan kiĢilerin maske

kullanması

Kene gibi kan emen artropodlardan korunmak için uzun kollu ve paçalı giysiler giyilmesi ve

kene kovucu repellent kullanılması

Endemik bölgelerde temas riski yüksek olan kiĢilere aĢılama yapılmalı

Yiyecek Kaynaklı Tularemi

Gıda ambarlarının vektör hayvanlarla temasının engellenmesi

Hayvan dıĢkısı ile kontamine olmuĢ gıdaların yenmemesi

Yıkama sırasında oluĢan aerosoller ve tozlar enfeksiyöz olabileceği için gıdaların dikkatli

Yıkanması

76

ÖZGEÇMİŞ

I-Bireysel Bilgiler

Adı : Derya

Soyadı : KarataĢ Yeni

Doğum yeri ve tarihi : Aydın, 14/12/1981

Uyruğu : T.C.

Medeni Durumu : Evli

ĠletiĢim adresi ve telefonu : Ahmet Ģefik Kolaylı cd. Esertepe mh. Veteriner Kontrol

Merkez AraĢtırma Enstitüsü Lojmanları K blok no:3 Etlik/ANKARA

05058083740

II-Eğitimi

1999 – 2004 Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi

1995 – 1998 Sivas Kongre Lisesi

1992 – 1995 BehrampaĢa Ortaokulu

1987 – 1992 Kızılırmak ĠlkOkulu

Yabancı Dili: Ġngilizce

III-Ünvanları

Veteriner Hekim

IV- Mesleki Deneyim

2006 – 2008 Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı, Bitlis Ġl Tarım Müdürlüğü-Veteriner

Hekim

2008-2010 Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı, Koruma ve Kontrol Genel Müdürlüğü

Hayvan Hareketleri ve Karantina Hizmetleri Daire BaĢkanlığı-Veteriner Hekim

77

2010-2013 Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı Merkez Veteriner Kontrol

AraĢtırma Enstitüsü Müdürlüğü, Bakteriyoloji TeĢhis laboratuarı-Veteriner Hekim

V- Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar

Veteriner Hekimleri Mikrobiyoloji Derneği

VI- Bilimsel İlgi Alanları

Yayınları:

KARATAġ YENĠ D. (2013) Tularemi. Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi

24 (1).

Posterleri:

1.KARATAŞ YENİ D, ĠZGÜR M. (2012). Türkiye’de Koyunlarda Tulareminin

Serolojik Olarak Ġncelenmesi ve Brusella ile Çapraz Reaksiyonlarının Belirlenmesi.

2. KARATAŞ YENİ D, İZGÜR M. (2013). Türkiye’de Tulareminin rodentlerde

laboratuar tanısı ve koyunlarda serolojik olarak incelenmesi.

Seminerleri:

1. (2009). Avrupa Birliği Mevzuatına Göre Bruselloz ve Tüberkülozun Yasal

Durumlarının Değerlendirilmesi.

2. (2009). Avrupa Birliği Mevzuatına Göre Bruselloz'un Serolojik Metodlar ve AĢı

Uygulamaları Yönünden Değerlendirilmesi.

Yer Aldığı Projeler:

F.tularensisin Muhtemel rezervuar hayvanlar ve koyunlarda laboratuar tanısı.

Tarımsal AraĢtırmalar Genel Müdürlüğü Projesi: TAGEM/HSYGAD/12/A02/01

(Proje Yürütücüsü), 2012.

Yaygın Salmonella Serovarlarının Moleküler Teknikler ile Tiplendirilmesi Tarımsal

AraĢtırmalar Genel Müdürlüğü Projesi: (Yardımcı AraĢtırmacı), 2012.