Fontes de nitrogênio, polpa de banana e ágar no desenvolvimento in vitro de plântulas de orquídea

211Hortic. bras., v. 27, n. 2, abr.-jun. 2009

A cultura de tecidos em orquídeasconstitui técnica bastante relevan-

te dos pontos de vista comercial e eco-lógico. As plantas produzidas desta for-ma são altamente interessantes para pro-gramas de reintrodução de espécies na-tivas em áreas de preservação ambiental(Araújo, 2007). A cultura assimbióticaresulta em maiores percentuais de ger-minação em comparação com a germina-ção em condições naturais, que é de-pendente da infecção por fungosmicorrízicos simbiontes, muitas vezesespécie-específicos (Araújo, 2004). Aobtenção de orquídeas a partir da se-meadura in vitro é, atualmente, um pro-cesso rotineiro. No entanto, os conhe-cimentos sobre a melhor formulação domeio de cultura para cada espécie aindasão limitados. Um grande número de fa-

PASQUAL M; FIGUEIREDO MA; REZENDE JC;ARAÚJO AG; SANTOS FC; FERREIRA EA; JUNQUEIRA KP. 2009. Fontes de nitrogênio, polpade banana e ágar no desenvolvimento in vitro de plântulas de orquídea. Horticultura Brasileira 27: 211-216.

Fontes de nitrogênio, polpa de banana e ágar no desenvolvimento in vitrode plântulas de orquídeaMoacir Pasqual1; Milene A de Figueiredo3,6; Juliana C de Rezende2; Aparecida G de Araújo4,6; FláviaC Santos3,7; Ester A Ferreira2; Keize P Junqueira5,7

1UFLA-DAG, C. Postal 3037; 37200-000 Lavras-MG; 2Pesquisadora EPAMIG; 3Doutoranda UFLA; 4Pós-Doutoranda UFLA;5Doutoranda UnB; 6Bolsista CAPES; 7Bolsista CNPq; [email protected]

tores complexos influencia a germinaçãoe o crescimento in vitro de orquídeas,sendo altamente dependentes dogenótipo (Silva et al., 2002).

Os fatores que mais freqüentementedeterminam o sucesso damicropropagação são a origem doexplante e o meio nutritivo onde sãocultivados. Várias mudanças de padrãoforam propostas na tentativa de otimizaro crescimento in vitro. Essas modifica-ções visam principalmente a redução ouo incremento de alguns componentesque podem promover melhor crescimen-to em tecidos de orquídeas (Pasqual etal., 2001).

George et al. (2008) sugerem que aadição no meio de cultura de compos-tos orgânicos complexos como polpa debanana pode suplementar o teor de vi-

taminas, aminoácidos e reguladores decrescimento. De acordo com Arditti &Ernst (1993), a polpa de banana madurapode intensificar o crescimento deplântulas obtidas a partir de explantesin vitro. No mesmo sentido, Torres etal. (2001) citam que essa substânciapode promover diferentes efeitos nocultivo in vitro, tais como espessamentoe/ou crescimento das raízes, dependen-do da cultivar e da quantidade de polpade banana utilizada.

O ágar tem sido muito utilizado napropagação in vitro, pela sua grandeeficiência como agente geleificante, pro-movendo condições ideais de suportepara as plântulas no meio de cultura (Fa-ria et al., 2006). Segundo Grattapaglia &Machado (1998), há uma tendência mun-dial para se buscarem sistemas utilizan-

RESUMOForam realizados dois experimentos com o objetivo de estudar

os efeitos de fontes de nitrogênio, polpa de banana e ágar no desen-volvimento in vitro de orquídea Cattleya loddigesii. O primeiro expe-rimento constituiu-se de NH

4NO

3 (0; 25; 50; 75 e 100% da formula-

ção de 330 mg L-1) e KNO3 (0; 25; 50 e 100% da formulação de 380

mg L-1) acrescidas ao meio MS. No segundo experimento, os trata-mentos consistiram de concentrações de ágar (0; 2; 4; 6 e 8 g L-1), nomeio de cultura Knudson C, acrescido de polpa de banana nanica (0;50; 100; 150 e 200 g L-1) em todas as combinações possíveis. Após ainoculação as culturas foram mantidas em sala de crescimento comirradiância em torno de 35 µmol m-2 s-1, temperatura de 25±1°C efotoperíodo de 16 horas, por 90 dias. Com base no peso da matériafresca das plântulas, número de raízes, comprimento da parte aérea ecomprimento da maior raiz, a adição de 17,5 a 41,16% da formulaçãooriginal de NH

4NO

3 ao meio MS proporcionou melhor desenvolvi-

mento in vitro em plântulas de Cattleya loddigesii. Maior número defolhas foi obtido com a adição ao meio MS de 100% da formulaçãooriginal de NH

4NO

3 e 50% de KNO

3. A multiplicação in vitro de

plântulas de orquídea Cattleya loddigesii é viável em meio KnudsonC líquido com a utilização de 128,42 g L-1 de polpa de banana nanica.

Palavras-chave: Cattleya loddigesii, Orchidaceae, cultura de teci-dos, meios de cultura.

ABSTRACTNitrogen sources, banana pulp and agar in the orchid

seedlings in vitro development

Two experiments were carried out in order to evaluate the effectsof nitrogen sources, banana pulp and agar on Cattleya loddigesiiseedlings development in vitro. In the first experiment were testedNH

4NO

3 at 0; 25; 50; 75 and 100% (330 mg L-1 formulation) and

KNO3 0; 25; 50 and 100% (380 mg L-1 formulation) added to MS

medium. The second experiment consisted of different agarconcentrations (0; 2; 4; 6 and 8 g L-1), banana nanica pulp (0; 50; 100;150 and 200 g L-1) in all the possible combinations added to KnudsonC medium. After inoculation the plantlets were maintained in growthroom with irradiancy around 35 µmol m-2 s-1, 25±1°C temperatureand 16-hour photoperiod for 90 days. The NH

4NO

3 formulation

added to culture medium at 17,5 to 41,16% provides best developmentof Cattleya loddigesii plantlets based on plantlets fresh mass, numberof roots, largest root length and aerial part length. Larger number ofleaves was obtained at 100% of the original formulation of NH

4NO

3

and 50% of KNO3 in MS medium

. The best results for in vitro

multiplication of Cattleya loddigesii orchid seedlings occurred in liquidKnudson C medium with 128,42 g L-1 banana nanica pulp.

Keywords: Cattleya loddigesii, Orchidaceae, tissue culture, culturemedia.

(Recebido para publicação em 18 de janeiro de 2008; aceito em 6 de abril de 2009)(Received in January 18, 2008; accepted in April 6, 2009)

212 Hortic. bras., v. 27, n.2, abr.-jun. 2009

do meio líquido, em virtude da reduçãodo custo pela eliminação do ágar e maioragilidade na preparação do meio.

Os elementos minerais exigidos emmaiores quantidades para o crescimen-to de plantas são incluídos nos meiosnutritivos nas formas de saisinorgânicos, podendo o nitrogênio seradicionado como componente de suple-mentos orgânicos (Caldas et al., 1998).O nitrogênio, juntamente com a sacarose,é o principal componente em quantida-de no meio de cultura, contribuindo deforma efetiva tanto no metabolismo ce-lular como na regulação do seu poten-cial osmótico (Nagao et al., 1994).

Por apresentar-se nas formas decátion (amônio) e ânion (nitrito e nitra-to), o nitrogênio difere dos demaismacronutrientes (Caldas et al., 1998).Esses íons são de grande importânciano controle do pH do meio de cultura,atuam como agente tamponante e favo-recem a absorção de outros íons pre-sentes no meio (Nagao et al., 1994).

A preocupação com a conservaçãodos genótipos das orquídeas nativas,ameaçadas de extinção, em decorrênciada devastação acelerada dos ambientesnaturais, levou à realização do presentetrabalho, que objetivou estudar os efei-tos de diferentes concentrações deNH

4NO

3, KNO

3, ágar e polpa de banana

nanica no desenvolvimento in vitro deplântulas de orquídea Cattleyaloddigesii.

MATERIAL E MÉTODOS

Plantas adultas de Cattleyaloddigesii foram coletadas previamenteao enchimento do lago da UsinaHidroelétrica do Funil, situado no RioGrande, entre os municípios de Lavras ePerdões, em 2002. Essas plantas foramacondicionadas em vasos e permanece-ram em casa de vegetação até oflorescimento, em maio de 2003. Nesteestágio foi feita a autofecundação dasflores, as quais desenvolveram cápsu-las e, cerca de nove meses depois, fo-ram coletadas e levadas ao laboratório.

A assepsia constou de lavagem emágua corrente por cinco minutos, imersãoem solução de álcool 70% por um minu-to e desinfestação com hipoclorito desódio, na concentração de 1%, durante

20 minutos. Em seguida, as cápsulas fo-ram lavadas com água destiladaautoclavada por três vezes. Essa opera-ção foi realizada em câmara de fluxolaminar desinfestada com álcool 70%.

Com auxílio de estilete esterilizadofoi feita uma incisão na cápsula, liberan-do as sementes, que foram inoculadasem frascos contendo meio de culturaKnudson C (1946), acrescido de 2 g L-1

de carvão ativado e 100 g L-1 de polpade banana nanica madura. Os frascospermaneceram em sala de crescimentocom irradiância em torno de 35 µM m-2 s-

1, temperatura de 25±1°C e fotoperíodode 16 horas, até que houvesse o desen-volvimento dos protocormos e plântulas,explantes usados para realização dosexperimentos.

Experimento 1: Protocormos foraminoculados em meio MS (Murashige &Skoog, 1962) constituído de concentra-ções de NH

4NO

3 (0; 25; 50; 75 e 100% da

formulação de 330 mg L-1) e de KNO3 (0;

25; 50 e 100% da formulação de 380 mgL-1) em todas as combinações possíveis,suplementado de sacarose (30 g L-1).Utilizou-se o delineamento experimentalinteiramente casualizado, em esquemafatorial 4 x 5, com 5 repetições e 4protocormos por frasco. Foram analisa-dos o número de folhas e de raízes, com-primento da maior raiz e da parte aérea epeso da matéria fresca da plântula.

Experimento 2: Plântulas, com 1 a1,5 cm de comprimento e contendoraízes pequenas (±0,5 cm), foram inocu-ladas em meio de cultura Knudson C,acrescido de ágar (0; 2; 4; 6 e 8 g L-1) e depolpa de banana nanica madura (0; 50;100; 150 e 200 g L-1) em todas as com-binações possíveis, suplementado desacarose (20 g L-1) e carvão ativado (2 gL-1). Utilizou-se o delineamento experi-mental inteiramente casualizado, em es-quema fatorial 5 x 5, com 4 repetições e 4plântulas por frasco. As variáveis anali-sadas foram número de brotos, altura daparte aérea, massa seca da parte aérea,comprimento de raízes e massa seca deraízes.

Em ambos os experimentos, os meiostiveram o pH ajustado para 5,8±0,1, sen-do 60 mL vertidos em frasco de vidrocom capacidade de 250 cm3, antes doprocesso de autoclavagem a 121°C e 1,1atm por 20 minutos. Após o resfriamento,

os frascos foram levados à câmara defluxo laminar, onde foi feita a inoculaçãodos explantes, sob condiçõesassépticas. Após inoculação, os frascosforam mantidos em sala de crescimentocom irradiância em torno de 35 µmol m-2

s-1, temperatura de 25±1°C e fotoperío-do de 16 horas, por 90 dias.

A análise de variância foi realizadautilizando o procedimento GLM do“software” estatístico SAS® (SAS, 1990)por meio do método dos quadrados mí-nimos ponderados pelo inverso dasvariâncias de cada tratamento, dada aheterogeneidade das variâncias. Devi-do à perda de unidades experimentais,algumas combinações dos fatores nãopuderam ser estudadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Experimento 1: A interação entre osfatores mostrou significância apenaspara a variável número de folhas. So-mente as concentrações de NH

4NO

3 in-

fluenciaram significativamente as demaisvariáveis analisadas (Figuras 1 e 2).

A concentração de 21,31% deNH

4NO

3 apresenta-se como quantidade

ideal para peso da matéria fresca dasplântulas (Figura 1A), registrando-sedecréscimo a partir desse ponto. Esteresultado, de certa forma, difere dos ob-tidos por Araújo et al. (2005), relatandoque o incremento das concentrações deNH

4NO

3 e KNO

3 promoveu aumento no

peso da matéria fresca das plântulas deCattleya nobilior, tendo sido o maiorpeso obtido com adição de 100% deNH

4NO

3 e KNO

3 em meio Knudson C.

Para comprimento da parte aérea (Fi-gura 1B) a equação apresentou bom ajus-te dos dados (R2= 0,83) e uma vez deri-vada indicou o ponto de máximo na con-centração de 35% de NH

4NO

3, havendo,

a partir daí, decréscimo dos valores. Re-sultados similares foram obtidos porAraújo et al. (2005), que recomendam oincremento de 50% de NH

4NO

3 e KNO

3

no meio de cultura para comprimento daparte aérea em plântulas de Cattleyaleopoldii.

Pode-se inferir o efeito estimulantedo número de raízes até a concentraçãode 41,16% de NH

4NO

3, havendo a partir

daí decréscimo dos valores (Figura 1C).Houve aumento no comprimento da

M Pasqual et al.


maior raiz até a concentração de 17,5%de NH

4NO

3, havendo a partir daí redu-

ção da variável (Figura 1D). Araújo etal. (2005) também obtiveram resultadossemelhantes, trabalhando com plântulasde Cattleya nobilior.

Todas as variáveis estudadas, excetonúmero de folhas, seguiram a mesma ten-dência, o nitrato de amônio estimulouaumento até certo ponto, tornando-setóxico a partir do mesmo, com o aumentodas concentrações, provavelmente cau-sado pelos distúrbios nutricionais pelaadição desse sal ao meio de cultura.

Após desdobramento da interaçãoconcentração de NH

4NO

3 e de KNO

3

sobre a variável número de folhas, ape-nas a concentração de 50% de KNO

3 nas

Fontes de nitrogênio, polpa de banana e ágar no desenvolvimento in vitro de plântulas de orquídea

Figura 2. Número de folhas em plântulas de orquídea Cattleya loddigesii nas concentraçõesestudadas de NH

4NO

3 combinadas com a concentração de 50% de KNO

3 (number of leaves

on seedlings of Cattleya loddigesii orchid with the concentration of NH4NO

3 combined with

the level of 50% of KNO3). Lavras, UFLA, 2007.

Figura 1. Peso da matéria fresca (A), comprimento da parte aérea (B), número de raízes (C)e comprimento da maior raiz em plântulas deCattleya loddigesii em função de concentrações de NH

4NO

3 (D). (weight of the fresh matter (A), length of shoot (B), number of roots (C) and

length of the longest root in seedlings of Cattleya loddigesii according to concentrations of NH4NO

3 (D)). Lavras, UFLA, 2007.


concentrações de nitrato de amônio(NH

4NO

3) apresentou significância (Fi-

gura 2), observando-se aumento no nú-mero de folhas com o incremento deNH

4NO

3, até a máxima concentração uti-

lizada.

Sato et al. (2001), estudando a influ-ência da concentração de nitrato deamônio na micropropagação da mandio-ca (Manihot esculenta), verificaram queo número de folhas cresceu com o au-mento da concentração de NH

4NO

3, e

na concentração de 41,20 mM L-1 deNH

4+, que equivale ao dobro da concen-

tração de nitrato de amônio utilizada nomeio MS, o número de folhas foi maior(7 folhas), na presença de BAP.

Os resultados encontrados são con-cordantes com os de Sato et al. (2001)que afirmam que a maioria das plantasprioriza a absorção de NH

4+ a NO

3-. Além

do favorecimento do pH do meio (apro-ximadamente 5,8), a assimilação do íonamônio requer uma demanda energéticamenor em relação à assimilação do íonnitrato (Nagao et al., 1994).

Experimento 2: Observa-se na Figu-ra 3A que, na ausência de ágar, o au-mento da concentração de polpa de ba-nana até o limite de 128,4 g L-1 promoveincremento na taxa de multiplicação, re-gistrando-se 2,84 brotos por explante.Em concentrações superiores houvetendência de redução do número de bro-

tos. Ao se utilizar 2 g L-1 de ágar, houvedecréscimo no número de brotos namedida em que se aumentaram as con-centrações de polpa de banana. Por ou-tro lado, nessa concentração de ágar,verifica-se que na ausência de polpa debanana, o número de brotos é maior doque aquele observado em meio líquido.

Os resultados obtidos estão de acor-do com afirmações de Arditti & Ernst(1993), de que a adição de polpa de ba-nana no meio de cultivo aumenta o nú-mero de brotos na propagação in vitrode plântulas de orquídeas. Concordamem parte com Silva et al. (2005), que es-tudando a micropropagação de orquí-dea Brassolaeliocattleya ‘Pastoral’ x

M Pasqual et al.

Figura 3. Número de brotos(A), altura da parte aérea (B), massa seca da parte aérea (C) e comprimento das raízes em plântulas de orquídeaCattleya loddigesii nas diferentes concentrações de ágar e polpa de banana (D) (number of shoots (A), shoot height (B), dry mass of shoot (C)and length of roots in seedlings of Cattleya loddigesii orchid in different concentrations of agar and banana pulp (D)).Lavras, UFLA, 2007.


Figura 4. Massa seca das raízes em plântulas de orquídea Cattleya loddigesii cultivadas em diferen-tes concentrações de ágar e polpa de banana (dry mass of roots in seedlings of Cattleya loddigesiiorchid grown in different concentrations of agar and banana pulp). Lavras, UFLA, 2007.

Fontes de nitrogênio, polpa de banana e ágar no desenvolvimento in vitro de plântulas de orquídea

Laeliocattleya ‘Amber Glow’, registra-ram que 75 g L-1 de polpa de banana pro-moveram a formação de maior númerode brotos.

Ocorreu uma tendência de aumentono tamanho de brotos com o aumentodas concentrações de polpa de banana(Figura 3B). Maior altura da parte aéreaé obtida na concentração de 200 g L-1 depolpa da banana e 6 g L-1 de ágar. Nessaconcentração de ágar e na ausência depolpa de banana observa-se maior altu-ra da parte aérea das plântulas do queem meio líquido. De modo semelhante,bom crescimento in vitro de plântulasde Dendrobium nobile Lindl, em meiode cultura, com adição de 60 g L-1 depolpa de banana foi evidenciado porSong et al. (1999). A adição de polpapromove desenvolvimento da parte aé-rea no cultivo in vitro de orquídea, bemcomo emissão de brotos adventícios(Torres & Barbosa, 2001).

Melhor resultado para massa secada parte aérea (0,0264 g) é observado naausência de ágar com 126,7 g L-1 de pol-pa de banana (Figura 3C), concordandocom os resultados de Pasqual et al.(2008) que obtiveram maior massa secade parte aérea de abacaxi ornamental(Ananas lucidus L.) na ausência de ágare de reguladores de crescimento e estáde acordo com Adelberg et al. (1997),reportando que o cultivo em meio líqui-do apresenta crescimento mais vigoro-so de plântulas. A polpa de banana podesuplementar o teor de vitaminas,aminoácidos e reguladores de cresci-mento ao meio de cultura, promovendoaumento da massa fresca da plântula(George et al., 2008).

O incremento da concentração depolpa de banana, associado a 4 g L-1 deágar, promoveu aumento no comprimen-to das raízes das plântulas de forma li-near (Figura 3D). Maior comprimento dasraízes (2,85 cm) foi obtido na concentra-ção de 4 g L-1 de ágar e 200 g L-1 de polpada banana. Na ausência de ágar e polpade banana pode-se observar o menorcomprimento das raízes (0,70 cm). A va-riável massa seca das raízes tambémobteve melhor resultado com a utiliza-ção de 4 g L-1 de ágar e 200 g L-1 de polpade banana (Figura 4). Essa resposta podeser explicada pelo fato de concentraçõeselevadas de ágar dificultarem o contato

do explante com o meio, limitando a ab-sorção de sais minerais.

De forma similar ao que ocorreu comorquídea nesse experimento, oenraizamento in vitro do abacaxi orna-mental foi viável em meio MS líquido(Pasqual et al., 2008). A adição de 100 gL-1 de polpa de banana promoveu maiorcrescimento da parte aérea e da maiorraiz e o aumento da massa fresca deraízes de plântulas de orquídea Cattleyaloddigesii ‘Grande’ x Cattleya loddigesii‘Alba’ (Araújo et al., 2006). Analisandoo enraizamento in vitro de plântulas deDendrobium nobile Lindl, em diferen-tes meios de cultura, Song et al. (1999)verificaram que a combinação AduboPeters® (3 g L-1, 20 g L-1 de sacarose, 60g L-1 de polpa de banana) proporcionoumaior número de raízes. O uso de meioslíquidos viabiliza a absorção de nutrien-tes e minerais presentes no meio de cul-tura, favorecendo o acúmulo de matériafresca e seca no explante.

Com base no peso da matéria fresca dasplântulas, número de raízes, comprimentoda parte aérea e comprimento da maior raiz,a adição de 17,5 a 41,16% da formulaçãooriginal de NH

4NO

3 ao meio MS proporci-

ona o melhor desenvolvimento in vitro deplântulas de Cattleya loddigesii. Maiornúmero de folhas é obtido com a adição aomeio MS de 100% da formulação originalde NH

4NO

3 e 50% de KNO

3.

A multiplicação in vitro de plântulasde orquídea Cattleya loddigesii é viá-vel em meio Knudson C líquido com autilização de 128,42 g L-1 de polpa dabanana nanica.

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