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FilmwaageBiophysik-Praktikum
Literatur:• Albrecht et al., Polymorphism of Phospholipid
Monolayers ,Journal de Physique 39
(1978) 301ff (siehe Anhang)
• Cevc, Gregor; Phospholipids handbook, Marcel Deccer Inc., New
York, 1993, Möhwald,H.;“Phospholipid monolayers“ Seite 579 (siehe
Anhang)
• Adam, G.; Läuger, P.; Stark, G.; Physikalische Chemie und
Biophysik, 2. Aufl.,
Springer, Berlin, 1988
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1. Zur Motivation
Amphiphile Moleküle wie Phospholipide oder Fettsäuren bilden an
der Wasser-Luft-
Grenzfläche monomolekulare Schichten, wobei die hydrophile
Kopfgruppe mit der Subphase,
die hydrophobe Schwanzgruppe mit der Atmosphäre in Verbindung
steht. Ein wichtigesHilfsmittel zur Untersuchung der physikalischen
Eigenschaften und zur Übertragung einer
oder mehrerer Schichten auf feste Substrate (z. B. einen
Glasobjektträger, wie in Abschnitt 4beschrieben) ist die
Filmwaage.
Phospholipide, aus denen die Plasmamembran von Zellen besteht,
sind dabei von
besonderem Interesse. Abb. 1.1 zeigt, wie man sich diese Membran
heute im Prinzip vorstellt:
Abb. 1: Schematische Darstellung einer Zellmembran
In einem fluiden Lipidbilayer, einem quasizweidimensionalen
Gebilde aus zwei Monolayern,das viele verschiedene Lipidsorten
enthält, "schwimmen" Proteine, die Funktionsträger der
Membran. Mit ihnen sind Erkennungsfunktionen (z. B.
Hormonrezeptoren, Antikörper-
Antigen-Bindung) und selektive Transportmechanismen (z. B. die
Na/K-Pumpe) der Zellerealisiert.
Dem Biophysiker sind nun die mit Hilfe der Filmwaage
präparierten Monolayer
willkommene, natürlich stark vereinfachte Modellsysteme für die
Zellmembran. Man versuchtz. B. Proteine in Monolayer einzubauen, um
deren laterale Beweglichkeit in Abhängigkeit
vom Phasenzustand der Membran zu untersuchen oder eine
Antigen-Antikörper-Bindungnachzuvollziehen.
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Untersuchungen der thermodynamischen Eigenschaften von
Lipidmonolayern
(Abschnitt 3 und Albrecht et al. 1978) geben Aufschluß über das
Phasenverhaltenquasizweidimensionaler Systeme. Man kann z. B.
Keimbildung und Kristallwachstum
untersuchen oder Umwandlungswärmen messen usw. Dabei zeigen sich
Analogien zum
Dreidimensionalen, aber auch charakteristische
Unterschiede.Lipidschichten können auf feste Substrate übertragen
werden (Abschnitt 4), um ihre
Charakterisierung mit oberflächenspezifischen Meßmethoden zu
vereinfachen, oder um siefür Untersuchungen in Biosensoranwendungen
einzusetzen.
2. Aufbau und Funktion einer Filmwaage
2.1 Beschreibung der FilmwaageDas Funktionsprinzip einer
Filmwaage sind in Abb. 2.1 dargestellt.
Abb. 2: Funktionsprinzip einer Filmwaage
Ein innen mit Teflon beschichteter, temperierbarer Trog enthält
die Subphase, meist
hochreines Wasser oder evtl. auch Puffer. (Teflon ist hier das
geeignetste Material, denn esgibt keine Lösungsmittel oder Ionen an
die Subphase ab und ist im gereinigten Zustand
hydrophob.) Eine Chloroform/Methanol-(3:1)-Lösung des Lipids
wird aus einer
Mikroliterspritze auf die Wasseroberfläche getropft
("gespreitet"). Das Lösungsmittelverdunstet rasch und es bildet
sich eine Lipidmonoschicht. Durch die bewegliche Barriere
kann die dem Monolayer zur Verfügung stehende Oberfläche
variiert werden; bei derKompression durchläuft der Monolayer zum
Dreidimensionalen analoge Aggregatzustände
gasförmig ungeordnet, fluid, kristallin. Aufgrund der besonderen
molekularen Struktur der
Lipide können aber auch wesentlich komplexere sogenannte
flüssigkristalline Phasenauftreten. Der Lateraldruck p kann direkt
aus der Kraft auf die Barriere berechnet werden.
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Technisch einfacher ist die Bestimmung des Lateraldrucks aus der
Reduktion der
Oberflächenspannung gemäß
p = m0 - m
als Differenz zwischen Oberflächenspannung des Wassers ohne (m0)
bzw. mit (m) Lipidfilm
definiert. p wird über die an einem Filterpapierblättchen
angreifenden Kräfte durch ein
Wilhelmy-Meßsystem gemessen.
Die Steuerung erlaubt die Kompression bzw. Expansion des
Monolayers mitdefinierter Geschwindigkeit. Außerdem kann im
"Konstant-Druck-Modus" der Lateraldruck
konstant gehalten werden, indem bei Druckänderung die Barriere
nachgeführt wird. DieseBetriebsart ist erforderlich zur Aufnahme
von Isobaren und bei der Beschichtung von festen
Substraten, wo der durch die Beschichtung verursachte
Flächenverlust ausgeglichen werden
muß.
Abb. 3: Schema der Filmwaage für Präparationen nach der
Langmuir-Blodgett-Methode.
2.2 Reinigung der Filmwaage
Bevor mit den eigentlichen in Abschnitt 3 und 4 beschriebenen
Versuchen begonnenwerden kann, muß der Teflontrog sauber sein, denn
Verunreinigungen sammeln sich
bevorzugt an der Wasser-Luft-Grenzfläche an, genau dort also, wo
er am meisten stört.Zum Reinigen der Filmwaage (FW) wird mehrmals
abgesaugt und mit Millipore-
Wasser (hochreines, entmineralisiertes Wasser) wieder
aufgefüllt.
Achtung !!! Die FW soll niemals längere Zeit ohne Wasser stehen
bleiben !!!
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Daß der Trog sauber ist, sieht man daran, daß der Wasserfilm
beim Absaugen schließlich
aufreißt und sich zusammenschnürt, ohne Tropfen zu hinterlassen.
Sollte das auch nachmehrmaligem Wasserwechsel nicht der Fall sein,
muß eine 1-2%ige HELLMANEX-Lösung
(Küvettenreiniger) eingefüllt werden, auf etwa 40 oC geheizt
werden und danach etwa 20
Minuten stehen. Nach Absaugen und mehrmaligem Spülen sollte der
Trog dann betriebsbereitsein.
Während der Messungen empfiehlt es sich, die Flowbox geschlossen
zu halten, umVerunreinigungen zu vermeiden.
3. Thermodynamik von Lipidmonolayern
3.1 Ein wenig Theorie
Lipidmonolayer an Wasseroberflächen kann man durch „Spreiten“
erzeugen: man löst dasLipid in der gewünschten Konzentration in
Chloroform (CHCl3)und bringt einen Tropfen
dieser Lösung mit definiertem Volumen auf die Wasseroberfläche
auf. Da die
Oberflächenspannung des Wassers zu Luft wesentlich größer ist
als die Summe derOberflächenspannungen von Chloroform zu Wasser und
Chloroform zu Luft, werden die
Randwinkel der Tropfen zu Null und das Chloroform breitet sich
völlig auf dem Wasser aus.Hier verdampft es und hinterlässt nur das
Lipid auf der Oberfläche. Bei bekannter Einwaage
m und Molekulargewicht FM des Lipids ist somit seine molare
Oberflächenkonzentration G
bekannt.
†
G =N
L ⋅ AS
N: Anzahl der Lipide, N=m/(FM*L)
AS: verfügbare Subphasenoberfläche
L: Avogadro konstante, N=6,022*1023 /mol
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Unter der Bedingung, dass sich nur unmessbar wenig Lipide in der
Subphase lösen (die
Versuche also rasch durchgeführt werden), gilt für den lateralen
Druck der Lipide an derWasseroberfläche (Spreitungsdruck) folgende
Beziehung (Adam, G 1988):
†
p (G) = R ⋅ T ⋅ G• ⋅ lnG•
G• -G
G• : Sättigungskonzentration des Lipids an der
OberflächeR: universelle Gaskonstante, R=8,314 J/(mol*K)
T: Temperatur
Ist die Oberflächenkonzentration G wesentlich kleiner als die
Sättigungskonzentration G•,
wird π(G) annähernd:
†
p (G) = -R ⋅ T ⋅ G• ⋅ ln(1-G
G•) ª R ⋅ T ⋅ G = R ⋅ T ⋅ N
L ⋅ ASoder
†
p =k ⋅ T
A
A: molekulare Fläche, A=N/ASK: Boltzmannkonstante, k=
1,381*10-23 J/K
Man sieht hieran, dass die Zustandsgleichung der Lipide in
geringer Konzentration an derWasser/Luft-Grenzfläche wie die des
idealen Gases nicht wechselwirkender Teilchen in drei
Dimensionen aussieht.In höheren Konzentrationen, dass heisst
wenn jedem Molekül weniger Platz zur Verfügung
steht, beginnt eine Wechselwirkung der Lipide miteinander und
die Zustandsgleichung lässt
sich durch eine, der dreidimensionalen Van der Waals-Gleichung
analogen Formel darstellen:
†
p + a( )A
Ê
Ë Á ˆ
¯ ⋅ A -b( ) = k ⋅ T
a und b sind dabei die „zweidimensionalen Van der
Waals-Konstanten“. Die Abhängigkeitdes lateralen Drucks π von der
molekularen Fläche A bei konstanter Temperatur an der
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Wasser/Luft-Grenzfläche (das sog. Druck/Flächen-Diagramm oder
auch π/A-Isotherme) lässtsich dann in Analogie zum
dreidimensionalen p/V-Diagramm darstellen. Dabei durchläuft der
Film mehrere Phasenzustände.
In diesem Abschnitt sollen anhand einiger
Druck-Flächen-Diagramme (p-A-Diagramme) des
Phospholipids Dipalmitoyl-Phosphatidyl-Cholin (DPPC, siehe Abb
3.3) die Phasenzustände
dieses Monolayers untersucht werden, Analogien und Unterschiede
zum Dreidimensionalendiskutiert und Umwandlungswärme für die
Hauptumwandlung mit Hilfe des Gesetzes von
Clausius Clapeyron berechnet werden.Abb. 3.1 zeigt eine
Klassifikation der möglichen Monolayerphasen; es wird
unterschieden zwischen isotroper Gas- bzw. fluider Phase,
anisotroper fluider Phase und
verschiedenen kristallinen Phasen. Sie unterscheiden sich in
Symmetrie und Ordnungsgrad.Biologische Relevanz hat das insofern,
als die laterale Beweglichkeit von Membranproteinen
um mehrere Größenordnungen abnimmt, wenn die Membran vom fluiden
in den kristallinenZustand übergeht. Diffusionskontrollierte
Vorgänge, wie z. B. die Zusammenlagerung von
Membranproteinen zur Bildung eines Rezeptorkomplexes, laufen
dann viel langsamer ab.
Auch kondensierte flüssige Phasen sind möglich und werden in
biologischen Membranen als2D-Kompartimente für gelöste
Membranproteine diskutiert.
Abb. 3.1 Klassifikation möglicher Monolayerphasen (aus Albrecht
et al. 1978)
Abb. 3.2 zeigt p-A-Diagramme (= Isothermen) der Phosphatidsäure
DMPA bei verschiedenen
Temperaturen. Der nahezu horizontal verlaufende Teil der Kurven
entspricht der sogenannten
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Hauptumwandlung des Lipides, dem Übergang vom fluiden in den
kristallinen Zustand,
vergleichbar mit dem Koexistenzgebiet flüssig/fest im
Dreidimensionalen. Es handelt sichdabei um einen Phasenübergang 1.
Ordnung (für T < TC, TC = kritische Temperatur). Die
Umwandlungswärme pro Molekül DqM (M steht für "Main Transition")
kann mit dem Gesetz
von Clausius Clapeyron
DqM = TM (dpM /dT)*(Af -Ac) (3.1)
berechnet werden. Weitere Details zur Thermodynamik und zur
Interpretation von p-A-
Diagrammen dieser quasizweidimensionalen Systeme finden sich in
(Albrecht et al. 1978).
Abb. 3.2 Strukturformel von Dimyristoyl-Phosphatidyl-Acid (DMPA)
bei verschiedenenTemperaturen(aus Albrecht et al. 1978) und
Druck-Flächen-Diagramm.
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DPPC
TR-DHPEAbb. 3.3 Strukturformeln der Phospholipide
Dipalmitoyl-Phosphatidyl-Cholin (DPPC,
FW=790g/mol und Texas Red®
1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine,
triethylammonium salt (TR-DHPE, FW=1382 g/mol).
3.2 Eichung des Druckmeßsystems mit Arachidinsäure
Um Absolutwerte des Lateraldruckes p in einem Monolayer messen
zu können, muss
das Druckmeßsystem entweder absolut z.B. mit Gewichten oder mit
einer Eichsubstanz - hierArachidinsäure (Formel:CH3-(CH2)18-COOH) –
geeicht werden. Arachidinsäure weist nahezu
temperaturunabhängig bei p = 25.6 mN/m einen Phasenübergang auf.
Dabei richten
sich die vorher bezüglich der Normalen zur Oberfläche geneigten
Kohlenwasserstoffketten
parallel zur Normalen auf. Für ein quantitatives p-A-Diagramm
braucht man außerdem noch
die Fläche pro Molekül. Diese berechnet sich leicht aus der
Oberfläche des Troges, derMenge des gespreiteten Lipids und dessen
Molgewicht.
Normalerweise werden von Lipiden und Fettsäuren 1 mg/ml-Lösungen
in
Chloroform/Methanol (3:1) hergestellt. Mit einer
Mikroliterspritze wird eine definierte Menge
davon Tropfen für Tropfen knapp über der Oberfläche abgegeben.
Man sieht dabei, wie sichder Tropfen augenblicklich über die
Oberfläche verteilt ("spreitet") - es entsteht eine
Monoschicht des Lipids.
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40
30
20
10
0
later
aler D
ruck
[mN/
m]
0.280.240.200.16molekulare Fläche [nm 2]
Cadmium-Arachidat
Arachidinsäure
Abb. 3.10: p,A-Diagramme von Arachidinsäure und
Cadmium-Arachidat. Durch die
Zugabe von Cadmiumionen (5x10-4 molar) zur Subphase kann der
Phasenübergangsdruck
der Arachidinsäure von 25,4!mN/m auf 0!mN/m gesenkt werden.
Berechnet die zu spreitende Menge aus einem angenommenen
Flächenbedarfvon 40 Å/Molekül für Arachidinsäure in der
"Gasphase".
Achtung: Vor und nach jedem Spreiten die Mikroliterspritze mit
der dafürvorgesehenen Chloroform/Methanollösung spülen!
F: Bestimmt den Flächenbedarf/Molekül an den beiden Knickpunkten
des p-A-Diagrammes!
3.3 Druck-Flächen-Diagramme von DPPCDas Phospholipid DPPC wurde
für diesen Versuch gewählt, weil die verschiedenen
Phasen im p -A-Diagramm sehr gut sichtbar werden. Für die
Bestimmung der
Umwandlungswärme pro Molekül DqM beim Hauptübergang von DPPC
müssen p-A-
Diagramme bei T ª 20 oC, 25 oC und 30 oC aufgenommen werden. Die
Temperatur wird am
Thermostat reguliert, die tatsächlichen Werte jedoch mit dem
IR-Thermometer direkt überdem Trog ermittelt.
F: Welche Größen müssen gemessen werden, um DqM bestimmen zu
können? (Glg. 3.1)
Vor Beginn sollten ausserdem folgende Fragen geklärt werden:
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F: Wie ist der Zusammenhang zwischen Filmwaagenoberfläche,
Barrierenstellung undZählerstand?F: Welche Menge DPPC ist zu
spreiten (aus einer 1 mg/ml-Lösung), wenn der Flächenbedarfpro
Molekül in der Gasphase etwa 80 Å2 beträgt?
F: Wie schnell darf komprimiert werden (= darf sich die Barriere
bewegen), damit da/dt £ 5
Å2/min bleibt? Was passiert wohl, wenn man zu schnell
komprimiert oder expandiert? (Mandenke daran, was im
Dreidimensionalen geschieht!)
Wenn die Filmwaage sauber und die Temperatur eingestellt ist,
wird die berechneteMenge DPPC gespreitet (Druck beobachten !!) und
komprimiert. Auf dem Bildschirm sieht
man, wie der Monolayer die verschiedenen Phasen durchläuft.
Bereiche zuordnen! Bei einemDruck von etwa 30 mN/m solltet Ihr
einen leichten Knick im p-A-Diagramm sehen. Stoppt
dann die Kompression.
Zur Kontrolle, ob die Barriere dicht schließt, daß also kein
Lipid verloren geht bzw.
der Monolayer stabil ist, kann die Steuerung auf den
"Konstant-Druck-Modus" umgeschaltetwerden. Wenn kein Lipid verloren
geht, sollte die Barriere stehen, andernfalls wird sie
nachgeführt und die berechneten Flächen wären nicht korrekt.Für
die beiden anderen p-A-Diagramme kann man entweder den Monolayer
absaugen
und neu spreiten oder einen einzigen Monolayer für alle drei
Versuche verwenden, d. h.
mehrmals expandieren und komprimieren.
F: Vor- und Nachteile der beiden Verfahren? Welches Verfahren
ist vorzuziehen? Was istjeweils dabei besonders zu beachten, damit
die p-A-Diagramme vergleichbar sind?
Diskussion der p-A-Diagramme:
F: Warum verläuft die Isotherme im Bereich des
Koexistenzgebietes fluid/kristallin nichtexakt horizontal?
Unterschied 3-dimensional und 2-dimensional? Welche Rolle spielt
dieKompressionsgeschwindigkeit? Welche Rolle spielen
Verunreinigungen?
F : Man berechne DqM, die Umwandlungswärme pro Molekül und D Q
M, die
Umwandlungswärme pro Mol DPPC, für alle p-A-Diagramme (mit
Fehlerabschätzung)! Ist
das viel oder wenig, verglichen mit typischen Schmelzwärmen im
Dreidimensionalen?
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4. Übertragung von Monolayern auf feste Substrate (Langmuir
Blodgett-Technik)
4.1 Vorbemerkung und Prinzip
In diesem Abschnitt soll eine wichtige Präparationstechnik für
den an
Lipidmembranen interessierten Biophysiker kennengelernt werden:
die Übertragungmonomolekularer Lipidschichten von der
Filmwaagenoberfläche auf feste Substrate - in
unserem Versuch auf einen gereinigten
Glasobjektträger.Anwendungen für diese Technik sind denkbar, z. B.
in der Biosensorik, wo man
derartige Monolayer als Matrix für darin eingebaute biologische
Rezeptoren verwenden will.
Mischt man dem Lipid einen kleinen Prozentsatz (1-2 mol%)
fluoreszenzmarkiertenLipids bei (in unserem Versuch: TR-DHPE, siehe
Abb 3.3), so kann man die Struktur des
Monolayers im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 4.1) direkt
untersuchen. Das mit Farbstoff
markierte Lipid hat nämlich die Tendenz, sich bevorzugt in der
fluiden Phase des Monolayerszu lösen - diese Bereiche erscheinen
daher im Mikroskop hell, die kristallinen dagegen
dunkel. Es konnte gezeigt werden, daß die Struktur des
übertragenen Monolayers tatsächlichidentisch ist mit der des
Monolayers auf der Filmwaage.
Abb.:4 Schema der Fluoreszenzfilmwaage. Mit einem in
xyz-Richtung beweglichen Schlitten
lässt sich der Mikroskopaufbau über dem Monolayer
positionieren.
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4.2 MethodeAbb. 4.2 zeigt den Beschichtungsvorgang bei
hydrophilem bzw. hydrophobem
Substrat. Man beachte die unterschiedliche Art der Anlagerung
der Lipidmoleküle und die
Form des Miniskus. Der als Substrat verwendete Glasobjektträger
ist hydrophil, wenn erfrisch gereinigt und im Plasmacleaner mit
Argon-Ionen "gesputtert" wurde. Wasser benetzt
dieses Substrat also vollständig. Ein bei der Beschichtung
ablesbares Kriterium für dieSauberkeit des Substrates liefert der
Miniskus der Wasseroberfläche: ist es sauber, so verläuft
er exakt horizontal und gleitet kontinuierlich über die
Substratoberfläche.
Abb. 3.7: Schematische Darstellung der
Langmuir-Blodgett-Methode. DieÜbertragungsrate liegt typischerweise
bei 100 µm/s. (A) Beim Eintauchen eines hydrophilen
Substrates wird kein Film übertragen. (B) Beim Herausziehen
desselben Substrates
beschichtet sich das Substrat mit einer Monoschicht. (C)
Übertrag einer Monoschicht auf ein
hydrophobes Substrat durch Eintauchen. (D) Beim Herausziehen
desselben Substrates wird
eine zweite Monoschicht übertragen.
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Zunächst wird der Monolayer mit der gewünschten Zusammensetzung
gespreitet und
durch Zusammenfahren der Barriere der gewünschte Lateraldruck
eingestellt. Im "Druck-Konstant-Modus" hält ihn die Steuerung dann
während des Beschichtungsvorgangs konstant,
indem sie durch Nachführen der Barriere den Flächenverlust
ausgleicht. Dieses Nachführen
kann als Maß für die beschichtete Fläche benutzt werden,
natürlich nur dann, wenn vor demEinfahren des Substrates
konrolliert wurde, ob der Monolayer stabil und die Filmwaage
dicht
ist, d. h. die Barriere steht.
4.3 Monolayer aus DPPC mit TR-DHPE bei 25 oC
In diesem Versuch soll die Struktur, d. h. die Art und Form der
kristallinen und fluidenBereiche eines Monolayers aus DPPC mit
TR-DHPE bei T ª 25 oC im Koexistenzgebiet
untersucht werden.
Dazu werden von einem Monolayer nacheinander mehrere (mindestens
drei) Substratebeschichtet.
F: Stimmen Flächenverlust des Monolayers und beschichtete
Oberfläche des Substratesüberein?
F : Was ist für das Verhältnis heller und dunkler Flächen für
die verschiedenenKompressionsstadien des Monolayers zu
erwarten?
F: Man diskutiere Zahl, Form und Größe der kristallinen
Bereiche! Wodurch könnte mandiese Parameter beeinflussen? (Viel
Information zu diesem Thema findet sich in derDissertation von W.
Heckl, 1988).
Viel Spaß!